KR101216874B1 - 조혈을 강화하기 위한 ｈｉｆ 알파 안정제의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 조혈과 철 대사를 조절 또는 강화하고, 철 결핍증과 만성 질환 빈혈증을 치료 또는 예방하기 위한 방법과 화합물에 관한다.

만성 질환 빈혈증

Description

조혈을 강화하기 위한 ＨＩＦ 알파 안정제의 용도{USE OF HIF ALPHA STABILIZERS FOR ENHANCING ERYTHROPOIESIS}

본원은 2003년 6월 6일에 제출된 U.S. 가출원 60/476,704; 2004년 4월 29일에 제출된 U.S. 가출원 60/566,488; 2004년 4월 29일에 제출된 U.S. 가출원 60/566,237; 2004년 5월 10일에 제출된 U.S. 가출원 60/569,797에 우선권을 주장한다.

본 발명은 조혈과 철 대사를 조절 또는 강화하고, 철 결핍증과 만성 질환 빈혈증을 치료 또는 예방하기 위한 방법과 화합물에 관한다.

빈혈증은 일반적으로, 혈액에서 감소된 산소 수준을 유발하는 헤모글로빈 또는 적혈구에서 비정상을 의미한다. 빈혈증은 또한, 만성 질환, 예를 들면, 만성 감염, 신생물 질환, 골수의 결과적인 염증성 억제를 수반하는 질환을 비롯한 만성 염증성 질환 등과 연관하여 발생할 수도 있다. 만성 질환 빈혈증은 가장 일반적인 의학적 증상중의 하나이다.

만성 질환 빈혈증(ACD)은 빈번하게, 철 결핍증과 연관된다. ACD는 철의 불충분한 이용가능성(가령, 철 결핍 빈혈증) 또는, 전체 체내 철이 충분하지만 헤모글로빈 생산의 요구가 결함된 경우(가령, 기능성 철 결핍증)에 기인할 수 있다. 철은 골수의 조혈 선조세포에서 적혈구 헤모글로빈의 생산에 요구된다.

만성 질환 빈혈증 환자에서 다수의 생리 결핍, 예를 들면, 에리트로포이에틴(EPO) 생산 감소, 골수의 EPO 반응 감소, 장으로부터 철 흡수 감소를 비롯한 철 대사 감소, 철 트랜스-상피세포 운반 감소, 헤파에스틴(hephaestin) 또는 셀룰로플라스민에 의한 제2철 상태로의 철 산화 감소, 트랜스페린과 트랜스페린 수용체에 의한 철 결합과 흡입 감소, 헴 합성을 비롯한 철 이용이 수행되는 골수로의 철 운반 감소가 관찰된다. 개별적으로 또는 협력적으로, 이들 생리 결핍은 비효율적인 또는 손상된 조혈의 원인이 되며, 감소된 헤모글로빈 생산과 감소된 산소 운반과 연관된 소적혈구성 빈혈증과 혈색소감소성(hypochromic) 적혈구를 유발할 수 있다.

만성 질환 빈혈증은 염증성 사이토킨, 예를 들면, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), IL-6, 인터페론-γ(IF-γ)의 증가된 생산과 연관된다(Means(1995) Stem cells 13:32-37; Means(1999) Int J Hematol 70:7-12).. 여러 in vitro와 in vivo 동물 모델 시스템에서, 염증성 사이토킨은 EPO 생산, EPO 반응성, 철 대사의 통합적 조절을 매개하는 능력에 부정적인 영향을 주었다(Roodman et al.(1989) Adv Exp Med Biol 271:185-196; Fuchs et al.(1991) Eur J Hematol 46:65-70; Jelkmann et al.(1994) Ann NY Acad Sci 718:300-311; Vannucchi et al.(1994) Br J Hematol 87:18-23; Oldenburg et al.(2001) Aliment Pharmacol Ther 15:429-438). 에리트로포이에틴 투여는 TNF-α에 지속적으로 노출된 생쥐에서 빈혈증을 반전시키지 못하였다(Clibon et al.(1990) Exp Hematol 18:438-441). 증가된 수준의 염증성 사이토킨, 예를 들면, TNF-α, IL-1β, INF-γ은 만성 질환 빈 혈증 환자에서 관찰되는 결함성 EPO 생산과 EPO 저항성의 원인이 된다(Jelkmann etal.(1991) Ann NY Acad Sci 718:300-311; Macdougall and Cooper(2002) Neprol Dial Transplant 17(11):39-43). 이런 이유로, 염증과 연관된 다양한 사이토킨, 예를 들면, 염증성 사이토킨은 적혈구 선조세포(erythroid progenitor)의 저해, EPO 생산의 저해, 조혈을 위한 철 방출과 철 이용가능성의 손상을 비롯한 만성 질환 빈혈증의 병인의 여러 측면에 관여한다.

따라서, 만성 질환 빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법이 요구된다. 만성 질환 빈혈증을 치료하기 위하여 현재 사용되고 있는 재조합 EPO의 결핍을 극복하는 방법이 요구된다. 특히, 만성 질환 빈혈증과 연관된 억제된 EPO 생산과 감소된 EPO 반응성을 극복하는데 유효한 방법과 화합물; 철 대사의 조절을 강화시키고 변형되거나 비정상적인 철 대사와 이용의 결함을 극복하는데 유효한 방법과 화합물; EPO 생산, EPO 반응성과 신호전달, 철 이용가능성, 이용, 흡입, 운반, 가공 등에 관련된 대사 경로를 개선함으로써 전체 또는 완전 조혈을 강화시키는데 유효한 방법과 화합물이 요구된다. 만성 질환 빈혈증 개체에서 사이토킨-유도된 효과의 결과를 극복하거나 완화시키는 방법이 용구된다.

철 결핍증은 전세계적으로 가장 일반적인 영양 결핍증의 하나이며, 전세계 빈혈증의 주요 원인이다. 철 균형은 조혈 속도와 철 저장(iron store)의 크기에 의해 근본적으로 조절된다. 철 결핍증은 빈혈증 없이 또는 빈혈증과 함께 발병할 수 있으며, 손상된 인지 발달(cognitive development)과 연관된다.

철 결핍증은 체내에서 불충분한 철 공급(수준 또는 저장), 또는 철의 불충분 한 이용가능성 또는 이용으로 정의된다. 이는 영양 결핍, 예를 들면, 식이에서 철의 부족; 예로써 수술(위절제후)이나 질병(크론병)에 따른 철 흡수불량; 또는 손상이나 외상, 월경, 헌혈, 자락(phlebotomy)(다양한 절차, 수술에서)으로부터 발생하거나 예로써 유년기 또는 청년기에 급격한 성장, 임신, 에리트로포이에틴 치료 등에 따른 증가된 철 수요로부터 발생된 만성이나 급성 혈액 손실에 기인한 철 공급의 고갈 또는 증가된 철 손실로 인하여 유발될 수 있다.

철 결핍증은 기능성 철 결핍증, 예를 들면, 개체에서 철 저장소를 이용하는 능력의 손상으로 특성화되는 철 결핍증일 수도 있다. 철은 적혈구의 정상적인 혈색소화(hemoglobinization)를 가능하게 할 만큼 충분한 비율로 이용가능하지 않고, 감소된 망상적혈구와 적혈구 헤모글로빈 함량을 유발한다. 기능성 철 결핍증은 철 저장이 겉보기에 정상이거나 증가하지만 예로써 낮은 수준의 트랜스페린 포화 비율에 의한 측정에서 손상된 철 이용가능성을 보이는 건강한 개체에서도 관찰된다. 이런 유형의 철 결핍증은 급성 또는 만성 염증과 빈번하게 연관된다.

임의 종류의 철 결핍증은 철-결핍된 또는 철-제한된 조혈을 유발할 수 있는데, 여기서 적혈구 수는 감소하고, 순환 적혈구는 정상보다 작고(소적혈구성) 충분한 헤모글로빈이 부재하며, 따라서 엷은 색채를 띤다(저색소성).

철 결핍증, 예를 들면, 기능성 철 결핍증 개체는 철 결핍 빈혈증을 초래하는 손상된 헤모글로빈 합성, 감소된 트랜스페린 포화 %, 감소된 헤모글로빈과 헤마토크리트 수준이 나타날 수 있다. 철 결핍 빈혈증은 전세계에서 가장 일반적인 빈혈증이다. 철은 헤모글로빈의 필수 성분이다; 철이 없으면, 골수는 헤모글로빈을 효 과적으로 생산할 수 없다. 철 결핍 빈혈증은 철 공급이 고갈되거나 손상된 개체에서 발생하거나, 또는 철이 저장 상태로 존재하긴 하지만 예로써 헤모글로빈 생산에 이용되지 않는 기능성 철 결핍증 개체에서 발생할 수 있다.

상기한 바에 비추어, 철 대사와 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 방법; 철 대사를 강화시키는 방법이 필요하다. 기능성 철 결핍증을 비롯한 철 결핍증을 치료 또는 예방하고 방법; 소적혈구증 및 철 결핍 빈혈증과 같은 연관된 이상을 치료 또는 예방하는 방법이 필요하다.

본 발명은 완전하고 효과적인 조혈에 기여하는 대사와 생리 경로를 강화시키고, 특히 만성 질환 빈혈증을 치료하기 위한 방법과 화합물을 제시한다. EPO 생산과 반응성에 대한 염증성 사이토킨의 억제/저해 효과를 극복하는 방법과 화합물 역시 제시한다. 이에 더하여, 본 발명은 철 대사를 강화시키는 방법과 화합물; 손상된 철 대사, 예를 들면, 기능성 철 결핍증, 철 결핍 빈혈증, 소적혈구증, 철-결함성 조혈 등을 비롯한 철 결핍증과 연관된 이상을 치료 또는 예방하는 방법과 화합물을 제시한다.

본 발명의 요약

본 발명은 개체에서 강화된 또는 완전한 조혈을 유도하는 방법과 화합물에 관한다. 특히, 이들 방법은 개체에서 HIFα를 안정시킴으로써 강화된 또는 완전한 조혈을 유도하는 단계를 포함한다. 구체적으로, HIF 프롤릴 하이드록실라아제를 저해함으로써 강화된 조혈을 유도하는 방법을 고려한다. 특정 구체예에서, 이들 방법은 본 발명의 화합물의 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 개 체는 세포, 조직, 기관, 기관 시스템, 또는 전체 생물체이다. 특정 구체예에서, 생물체는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.

한 측면에서, 본 발명의 방법은 조혈 선조세포, 예를 들면, 조혈 줄기 세포(HSC), CFU-GEMM(콜로니-형성-단위-과립구/적혈구/단핵구/거핵구(megakaryocyte)) 세포 등으로부터 적혈구의 분화에 필요한 인자의 생산을 증가시킨다. 조혈을 자극하는 인자에는 에리트로포이에틴이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 다른 측면에서, 이들 방법은 철 흡입, 운반, 이용에 요구되는 인자의 생산을 증가시킨다. 이런 인자에는 적혈구 아미노레불리네이트 합성효소, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 셀룰로플라스민 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 적혈구 분화에 요구되는 인자를 증가시키고 철 흡입, 운반, 이용에 요구되는 인자를 추가로 증가시킨다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 에리트로포이에틴에 대한 조혈 선조세포의 반응성을 강화시킨다. 상기한 바와 같이, 이들 선조세포에는 HSC, CFU-GEMM 등이 포함된다. 이들 선조세포의 반응성은 예로써 에리트로포이에틴 수용체, 에리트로포이에틴 신호전달에 관여하는 세포내 인자, 에리트로포이에틴과 수용체의 상호작용을 조장하는 분비된 인자의 발현을 변화시킴으로써 증폭할 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명의 방법은 염증 사이토킨, 예를 들면, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β) 등에 의해 유도된 조혈의 저해를 극복하는데 이용될 수 있다. 특정 측면에서, 이들 방법은 외적으로 투여된 에리트로포이에틴을 이용한 치료에 저항하는 빈혈증을 치료하는데 이용될 수 있다. 이런 빈혈증은 만성 박테리아 심장내막염, 골수염, 류머티스 관절염, 류머티스 열, 크론병, 궤양성 대장염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 만성 염증 또는 자가면역 질환에 의해 유발될 수 있다.

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 만성 질병 빈혈증을 치료하는데 이용될 수 있다. 구체적으로, 만성 질병 빈혈증 개체에서 강화된 또는 완전한 에리트로포이에틴을 유도하는 방법이 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, 이들 방법은 새로운 적혈구를 생성하는데 이용되는 철의 양을 증가시킨다.

다른 측면에서, 본 발명은 골수의 EPO 반응성을 강화시키는 방법을 제시한다.

특히, EPO의 IL-1β 억제를 저해하는 방법에서처럼, EPO의 TNFα 억제를 저해하는 방법을 제시한다.

본 발명은 만성 질환 빈혈증의 치료/예방 방법; 철 가공의 조절 방법; 철 및/또는 철 가공에서 결핍과 연관된 상태의 치료/예방 방법에 관한다.

한 측면에서, 본 발명은 개체에서 만성 질환 빈혈증을 치료하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정화시켜 개체에서 만성 질환 빈혈증을 치료하는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 만성 질환 빈혈증 개체에서 특이적인 생리 효과를 달성하는 방법 역시 제시한다; 특히, 만성 질환 빈혈증 개체에서 망상적혈구, 평균 혈구 세포 용적, 평균 혈구 헤모글로빈, 헤마토크리트, 헤모글로빈, 적혈구 수치 등을 증가시키는 방법을 제시하는데, 이들 각 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정 화시켜 개체에서 원하는 생리 효과를 달성하는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 측면에서, 만성 질환 빈혈증은 예로써 염증, 자가면역 질환, 철 결핍증, 소적혈구증, 악성 종양 등과 연관된다.

다양한 구체예에서, 개체는 세포, 조직, 또는 기관이다. 다른 구체예에서, 개체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다. 개체가 세포인 경우에, 본 발명에서 세포는 원핵 또는 진핵의 분리된 세포이다. 개체가 조직인 경우에, 본 발명에서 조직은 내생적 조직과 시험관내 조직, 예를 들면, 배양액에서 성장된 조직이다. 바람직한 구체예에서, 개체는 동물, 특히, 쥐, 토끼, 소, 양, 돼지, 뮤린, 말, 영장류 종을 비롯한 포유동물 종의 동물이다. 가장 바람직한 구체예에서, 개체는 인간이다.

HIFα의 이용은 당분야에 공지된 임의의 방법으로 달성될 수 있으며, HIFα와 상호작용하거나, HIFα에 결합하거나 또는 HIFα를 변화시키는 임의의 작용제, 또는 예로써 HIFα가 기질인 효소를 비롯한 HIFα와 상호작용하는 인자의 이용을 수반할 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명은 구성적으로 안정한 HIFα 변이체, 예를 들면, 안정적인 HIF 뮤테인 등, 또는 이런 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다. 다른 측면에서, 본 발명은 HIFα를 안정시키는 작용제를 투여하여 HIFα 안정화를 고려한다. 작용제는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 안티센스 서열; 폴리펩티드; 항체; 다른 단백질; 탄수화물; 지방; 지질; 유기와 무기 물질, 예를 들면, 소형 분자 등으로 구성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 HIFα를 안정시키는 작용제를 개체에 투여하여 HIFα 안정화를 고려하는데, 여기서 작용제 는 HIFα를 안정시키는 화합물, 예를 들면, 소형 분자 화합물 등이다.

다양한 측면에서, HIFα는 HIF1α, HIF2α, 또는 HIF3α이다. 바람직한 측면에서에서, HIFα 안정화는 HIF 하이드록실라아제 활성을 저해하는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, HIF 하이드록실라아제는 EGLN1, EGLN2, EGLN3에서 선택된다.

한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 평균 혈구 용적을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 개체에서 본 발명은 평균 혈구 헤모글로빈 수준을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에서 소적혈구증을 감소시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 소적혈구성 빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 개체에서 철 결핍증과 연관된 상태를 치료 또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 철 가공을 개선하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 약화된 철 이용가능성과 연관된 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 개체에서 사이토킨-유도된 효과를 극복하는 방법에 관한다. 특히, 본 발명은 한 측면에서, 개체에서 EPO 생산의 사이토킨-억제를 극복하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 더 나아가, 본 발명은 개체에서 철 이용가능성의 사이토킨-억제를 극복하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 사이토킨-연관된 빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 개체에서 사이토킨의 존재하에 EPO 생산을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 사이토킨은 TNF-α와 IL-1β에서 선택된다.

한 측면에서, 본 발명은 개체에서 사이토킨-유도된 VCAM 발현을 감소시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 사이토 킨은 TNF-α 또는 IL-1β이다. 한 측면에서, 상기 방법은 개체의 내피 세포에서 사이토킨-유도된 VCAM 발현의 감소에 적용된다. 다른 측면에서, 개체는 염증 질환, 자가면역 질환, 만성 질환 빈혈증에서 선택되는 상태를 보인다.

다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 사이토킨-유도된 E-셀렉틴 발현을 감소시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 사이토킨은 TNF-α 또는 IL-1β이다. 한 측면에서, 상기 방법은 개체의 내피 세포에서 사이토킨-유도된 E-셀렉틴 발현의 감소에 적용된다. 다른 측면에서, 개체는 염증 질환, 자가면역 질환, 만성 질환 빈혈증에서 선택되는 상태를 보인다.

본 발명은 철 가공과 철 대사를 조절/강화하는 다양한 방법을 제시한다. 한 측면에서, 본 발명은 개체에서 철 운반, 흡입, 이용, 흡수를 증가시키는 방법을 제시하는데, 이들 각 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 개체에서 트랜스페린 발현, 트랜스페린 수용체 발현, IRP-2 발현, 훼리틴(ferritin) 발현, 셀룰로플라스민 발현, NRAMP2 발현, 피토 바이오 펩티드(sproutin) 발현, ALAS-2 발현을 증가시키는 방법을 제시하는데, 이들 각 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 헵시딘 발현을 감소시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 또한, 개체에서 헴 (heme) 합성을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

특정 측면에서, 본 발명은 개체에서 혈청 철, 트랜스페린 포화, 가용성 트랜스페린 수용체 수준, 혈청 훼리틴 수준을 증가시키는 방법을 제시하는데, 이들 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 골수로의 철 운반을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 산소결핍 유도 인자(HIF)의 알파 아단위를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 본 발명의 발명은 본원에 기술된 임의의 질환이나 상태로 고생하는 개체, 바람직하게는 인간 개체를 위한 치료 또는 약물의 제조에 적용된다. 임상 상태와 연관된 다양한 파라미터는 연령, 성별 등에 따라 달라진다. 한 측면에서, 개체는 정상 범위 미만, 예를 들면, 50-200 ㎍/ℓ미만의 혈청 훼리틴 수준을 보유한다; 따라서, 200 ng/㎖ 미만, 150 ng/㎖ 미만, 100 ng/㎖ 미만, 75 ng/㎖ 미만, 50 ng/㎖ 미만의 혈청 훼리틴 수준을 보유하는 개체는 본 발명에 제시된 방법 또는 약물을 이용한 치료에 적합한 개체일 수 있다. 대안으로, 적합한 개체는 정상 범위 이하, 예를 들면, TIBC 300-360 ㎍/㎗ 이하의 전체 철-결합 능력(TIBC)을 입증함으로써 확인할 수도 있다.

다른 구체예에서, 개체는 정상 범위 미만, 예를 들면, 50-150 ㎍/㎗ 미만의 혈청 철 수준을 보유한다. 적합한 개체를 확인하는 다른 적합한 파라미터에는 30- 50% 미만의 트랜스페린 포화 척도, 40-60% 미만의 골수 철적모구(sideroblast) 척도, 대략 10 내지 11 g/㎗ 미만의 헤모글로빈 수준 등이 포함된다. 상기 파라미터는 예로써 표준 혈액학적 검사, 혈액 화학, 전혈구 수치(CBC) 분석에서처럼 측정되고, 전형적으로 여러 혈액 파라미터의 척도로서 표시되며, 예로써 적혈구 수치, 백혈구 수치, 혈소판 수치, 적혈구 지수를 측정하는 자동화 장치에 의한 혈액 분석으로 수득된다. 측정은 자동화 시스템, 예를 들면, CELL DYN 4000 분석장치(Abbott Laboratories, Abbott Park IL), Coulter GenS 분석장치(Beckman Coulter, Inc., Fullerton CA), Bayer ADVIA 120 분석장치(Bayer Healthcare AG, Leverkusen, Germany) 등을 비롯한 혈액학적 및/또는 생화학적 혈액 분석의 표준 측정 수단으로 수행될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명은 개체에서 철 결핍증을 치료 또는 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 결핍증을 치료 또는 예방하는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 철 결핍증은 기능성 철 결핍증이거나, 빈혈증과 연관되거나, 염증, 감염, 면역결핍 질환, 신생물 질환에서 선택되는 질환과 연관되거나, 또는 만성 질환 빈혈증, 철 결핍 빈혈증(IDA), 소적혈구성 빈혈증에서 선택되는 질환과 연관된다.

본 발명의 개체는 철 결핍증 또는 철 결핍증의 발병 위험을 지시하는 임의의 임상적으로 수용되는 표준 척도를 보이는 개체이다. 가령, 특정 구체예에서, 개체는 낮은 혈청 훼리틴 수준(<20 ng/㎖), 또는 감소된 트랜스페린 포화 %, 예를 들면, 16% 이하(성인에서)를 보인다. 50 ng/㎖ 미만, 40 ng/㎖ 미만, 30 ng/㎖ 미만, 20 ng/㎖ 미만의 혈청 훼리틴 수준이 특히 고려된다. 개체가 기능성 철 결핍증인 철 결핍증을 앓고 있거나 철 결핍증의 위험이 있는 경우에, 혈청 훼리틴 수준은 정상 범위 이상, 예를 들면, 200 ng/㎖ 이상으로 상승될 수 있다. 철 결핍증은 철-제한된/철-결핍된 조혈(트랜스페린 포화 %가 15 내지 20% 미만으로 하락할 때 전형적으로 관찰되는 헤모글로빈 합성의 손상)의 발생을 통하여 관찰될 수 있다. 이들 철 파라미터는 상기한 임의의 표준 CBC 또는 생화학적 분석을 이용하거나, 또는 철 분석을 주목적으로 하는 자동화 장치, 예를 들면, Unimate 5 Iron과 Unimate 7 UIBC 키트(Roche, Switzerland)의 이용으로 측정할 수 있다.

본 발명의 치료 또는 예방 방법으로부터 혜택을 얻을 수 있는 개체는 철 결핍 빈혈증을 앓고 있거나 철 결핍 빈혈증의 위험이 있는 개체, 예를 들면, 10-15% 또는 10% 미만의 트랜스페린 포화 %를 보유하는 개체이다.

한 측면에서, 철 결핍증을 앓고 있거나 철 결핍증의 위험이 있는 개체는 기능성 철 결핍증을 앓고 있거나 기능성 철 결핍증의 위험이 있는 개체이다. 28 pg/세포 이하의 망상적혈구 헤모글로빈 함량은 이런 질환을 지시할 수 있다. 다른 측면에서, 기능성 철 결핍증을 앓고 있거나 기능성 철 결핍증의 위험이 있는 개체는 5% 초과의 5% 저색소성 적혈구를 보인다.

특정 구체예에서, 개체는 만성 질환 빈혈증을 앓고 있거나 만성 질환 빈혈증의 위험이 있는 개체이다. 이런 개체는 경등도 또는 중증도 빈혈증, 예를 들면, 대략 10-13 g/㎗, 바람직하게는 10-11 g/㎗의 헤모글로빈 수준을 보일 수 있다. 다른 구체예에서, 더욱 급성 빈혈증, 예를 들면, 5 g/㎗ 미만, 3 g/㎗ 미만을 비롯한 10 g/㎗ 미만의 헤모글로빈 수준을 보인다. 일부 구체예에서, 만성 질환 빈혈증을 앓고 있거나 만성 질환 빈혈증의 위험이 있는 개체는 철 분포에서 비정상을 보인다. 이런 비정상은 대략 60 ㎍/㎗ 미만의 혈청 철 수준, 또는 정상 범위 이상, 예를 들면, 200 ng/㎖ 이상, 300 ng/㎖ 이상 또는 400 ng/㎖ 이상의 혈청 훼리틴 수준일 수 있다.

특정 측면에서, 개체는 소적혈구성 빈혈증을 앓고 있거나 소적혈구성 빈혈증의 위험이 있는 개체이다. 이런 개체는 예로써 전혈구 수치 분석의 일부로서 측정된 80 펨토리터(femtoliter) 이하의 평균 혈구 용적을 보인다. 다른 측면에서, 개체는 90 +/-8 펨토리터의 정상 수치 이하의 평균 혈구 용적을 보유한다. 개체는 다양한 측면에서, 감소된 평균 세포 헤모글로빈 수치, 예를 들면, 30 +/- 3 pg 헤모글로빈/세포 이하의 평균 세포 헤모글로빈 수치, 또는 감소된 평균 세포 헤모글로빈 농도, 예를 들면, 33 +/- 2% 이하의 평균 세포 헤모글로빈 농도를 보유할 수 있다.

또한, 개체에서 기능성 철 결핍증을 치료 또는 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 기능성 철 결핍증을 치료 또는 예방하는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 철 대사 또는 철 대사 과정을 조절 또는 강화하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 대사 또는 철 대사 과정을 조절 또는 강화하는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체에서 철 흡입, 철 흡수, 철 운반, 철 저장, 철 가공, 철 동원, 철 이용에서 선택되는 철 대사 과정을 조절 또는 강화하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 대사 과정을 조절 또는 강화하는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

또한, 개체에서 철 흡수를 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 흡수를 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 철 흡수는 장에서 진행되거나, 식이 철의 흡수이거나, 또는 십이지장 상피세포에서 진행된다.

또한, 아래의 방법을 고려한다: 개체에서 철 운반을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 운반을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 철 저장을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 저장을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 철 흡입을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 흡입을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 철 가공을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 가공을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 철 동원을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 동원을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 철 이용을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 이용을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 조혈을 위한 철 이용가능성을 증가시키 는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 조혈을 위한 철 이용가능성을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 조혈을 위한 철 이용가능성이 증가하면 헴 합성(heme synthesis)을 위한 철 이용가능성이 증가하거나, 헤모글로빈 생산을 위한 철 이용가능성이 증가하거나, 또는 적혈구 생산을 철 이용가능성이 증가한다.

더 나아가, 본 발명은 개체에서 철 조절 인자의 발현을 조절하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 철 조절 인자의 발현을 조절하는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명은 특정 철 조절 인자의 발현을 증가시키는 방법을 포함한다: 개체에서 트랜스페린 수용체 발현을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 트랜스페린 수용체 발현을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 트랜스페린 발현을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 트랜스페린 발현을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 셀룰로플라스민(ceruloplasmin) 발현을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 셀룰로플라스민(ceruloplasmin) 발현을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 NRAMP2(s1c11a2) 발현을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 NRAMP2(s1c11a2) 발현을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 십이지장 시토크롬 b 환원효소 1 발현을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 십이지장 시토크롬 b 환원효 소 1 발현을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 개체에서 5-아미노레불리네이트 합성효소(5-aminolevulinate synthase) 발현을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 5-아미노레불리네이트 합성효소(5-aminolevulinate synthase) 발현을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 혈청 철을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 혈청 철을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 개체는 인간이고, 혈청 철 수준은 50 내지 150 ㎍/㎗ 수치로 상승한다.

다른 측면에서, 본 발명은 개체에서 전체 철-결합 능력(TIBC)을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 TIBC를 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 측면에서, 개체는 인간이고, 전체 철-결합 능력은 300 내지 360 ㎍/㎗ 수치로 증가된다.

또한, 개체에서 혈청 훼리틴 수준을 조절하는 방법과 화합물을 제시한다. 특정 구체예에서, 개체는 인간이고, 혈청 훼리틴 수준은 15 g/ℓ 이상으로 상승한다. 다른 구체예에서, 개체는 성인 남성이고, 혈청 훼리틴 수준은 대략 100 ㎍/ℓ 수치로 상승한다. 다른 구체예에서, 개체는 성인 여성이고, 혈청 훼리틴 수준은 대략 30 ㎍/ℓ 수준으로 상승한다.

한 측면에서, 본 발명은 개체에서 트랜스페린 포화를 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 트랜스페린 포화를 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 측면에서, 트랜스페린 포화는 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%에서 선택되는 수준 이상으로 증가된다. 본 발명은 개체에서 트랜스페린 포화 비율을 증가시키는 방법을 포함한다. 한 구체예에서, 개체는 인간이고, 트랜스페린 포화 비율은 18% 이상의 수치로 증가된다. 다른 구체예에서, 트랜스페린 포화 비율은 25 내지 50% 수치로 증가된다.

트랜스페린 비율은 전형적으로, 아래의 공식: (혈청 철)(100)/(TIBC)으로 산정된다.

또한, 개체에서 가용성 트랜스페린 수용체 수준을 증가시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 가용성 트랜스페린 수용체 수준을 증가시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 더 나아가, 본 발명은 개체에서 예로써 혈청 트랜스페린 수용체 수준에 의한 측정에서 전체 적혈구 골수량을 증가시키는 방법을 제시한다. 한 측면에서, 개체는 인간이고, 혈청 트랜스페린 수용체 수준은 면역검사에 의한 측정에서 4 내지 9 ㎍/ℓ로 상승한다.

또한, 개체에서 헵시딘 발현을 감소시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정시켜 개체에서 헵시딘 발현을 감소시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 개체에서 철 결핍증과 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 철 결핍증과 연관된 질환을 치료 또는 예방하는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 철 결핍증은 기능성 철 결핍증이다. 다양한 구체예 에서, 질환은 염증, 감염, 면역결핍 질환, 신생물 질환에서 선택되거나, 또는 만성 질환 빈혈증, 철 결핍 빈혈증, 소적혈구성 빈혈증에서 선택된다.

본 발명은 철 결핍증을 앓고 있거나 철 결핍증의 위험이 있는 개체에서 조혈을 강화시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 조혈을 강화시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 철 결핍증은 기능성 철 결핍증이다.

본 발명은 기능성 철 결핍증을 앓고 있거나 기능성 철 결핍증의 위험이 있는 개체에서 조혈을 강화시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 조혈을 강화시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 만성 질환은 염증, 감염, 면역결핍 질환, 신생물 질환에서 선택된다.

이에 더하여, 만성 질환 빈혈증을 앓고 있거나 만성 질환 빈혈증의 위험이 있는 개체에서 조혈을 강화시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 조혈을 강화시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

한 구체예에서, 본 발명은 EPO 치료에 저항하는 개체에서 조혈을 강화시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 조혈을 강화시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

또한, 개체에서 만성 질환 빈혈증을 치료 또는 예방하는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 만성 질환 빈혈증을 치료 또는 예방하는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

특정 측면에서, 만성 질환 빈혈증은 염증, 감염, 면역결핍 질환, 신생물 질환에서 선택되는 상태와 연관된다.

구체적으로, 본 발명은 아래의 방법을 고려한다: 만성 질환을 앓는 개체에서 망상적혈구를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 망상적혈구를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 만성 질환을 앓는 개체에서 헤마토크리트를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 헤마토크리트를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 만성 질환을 앓는 개체에서 헤모글로빈을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 헤모글로빈을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 만성 질환을 앓는 개체에서 적혈구 수치를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 적혈구 수치를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 만성 질환을 앓는 개체에서 평균 혈구 용적을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 평균 혈구 용적을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 만성 질환을 앓는 개체에서 평균 혈구 헤모글로빈을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 평균 혈구 헤모글로빈을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 만성 질환을 앓는 개체에서 혈청 철을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 혈청 철을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포 함한다; 만성 질환을 앓는 개체에서 트랜스페린 포화를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 트랜스페린 포화를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 이들 방법에서, 만성 질환은 특정 구체예에서, 염증, 감염, 면역결핍 질환, 신생물 질환에서 선택되거나, 또는 만성 질환 빈혈증, 철 결핍 빈혈증, 철 결핍증, 기능성 철 결핍증, 소적혈구성 빈혈증에서 선택된다.

아래의 방법을 추가로 제시한다: 철 결핍증을 앓는 개체에서 망상적혈구를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 망상적혈구를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 철 결핍증을 앓는 개체에서 헤마토크리트를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 헤마토크리트를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 철 결핍증을 앓는 개체에서 헤모글로빈을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 헤모글로빈을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 철 결핍증을 앓는 개체에서 적혈구 수치를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 적혈구 수치를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 철 결핍증을 앓는 개체에서 평균 혈구 용적을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 평균 혈구 용적을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 철 결핍증을 앓는 개체에서 평균 혈구 헤모글로빈을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 평균 혈구 헤모글로빈을 증가시키는 화 합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 철 결핍증을 앓는 개체에서 혈청 철을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 혈청 철을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 철 결핍증을 앓는 개체에서 트랜스페린 포화를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 트랜스페린 포화를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 이들 방법에서, 특정 구체예에서 철 결핍증은 기능성 철 결핍증이다.

더 나아가, 아래의 방법을 고려한다: 기능성 철 결핍증을 앓는 개체에서 망상적혈구를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 망상적혈구를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 기능성 철 결핍증을 앓는 개체에서 헤마토크리트를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 헤마토크리트를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 기능성 철 결핍증을 앓는 개체에서 헤모글로빈을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 헤모글로빈을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 기능성 철 결핍증을 앓는 개체에서 적혈구 수치를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 적혈구 수치를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 기능성 철 결핍증을 앓는 개체에서 평균 혈구 용적을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 평균 혈구 용적을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 기능성 철 결핍증을 앓는 개체에서 평균 혈구 헤모글로빈을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 평균 혈구 헤모글로빈을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 기능성 철 결핍증을 앓는 개체에서 혈청 철을 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 혈청 철을 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다; 기능성 철 결핍증을 앓는 개체에서 트랜스페린 포화를 증가시키는 방법, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 트랜스페린 포화를 증가시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

한 측면에서, 본 발명은 개체에서 조혈의 사이토킨-유도된 손상의 결과를 극복 또는 완화시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 조혈의 사이토킨-유도된 손상의 결과를 극복 또는 완화시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 측면에서, 조혈의 사이토킨-유도된 손상은 EPO 생산의 억제, 또는 철 대사의 손상이다. 상기한 방법에서, 사이토킨은 염증성 사이토킨이다. 다른 구체예에서, 사이토킨은 TNF-α, IL-1β, IFN-γ에서 선택된다.

또한, VCAM-1 발현 및/또는 E-셀렉틴 발현의 사이토킨 유도를 감소시키는 방법을 제시하는데, 상기 방법은 HIFα를 안정화시켜 개체에서 VCAM-1 발현 및/또는 E-셀렉틴 발현의 사이토킨 유도를 감소시키는 화합물의 효과량을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 상기한 방법에서, 사이토킨은 염증성 사이토킨이다. 다른 구체예에서, 사이토킨은 TNF-α, IL-1β, IFN-γ에서 선택된다.

본 발명의 치료 또는 예방 방법에서, 본 발명의 화합물은 복합 치료의 일부로서 투여될 수 있고, 다른 치료제, 예를 들면, EPO, 철, 비타민(가령, B 비타민) 등의 투여를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 HIFα를 안정시키는 화합물 및 적어도 한가지 다른 보충물질을 포함하는 키트를 제시한다. 한 측면에서, 보충물질은 에리트로포이에틴, 철, B 비타민에서 선택되는데, 본 발명은 HIFα를 안정시키는 화합물 및 에리트로포이에틴, 철, B 비타민에서 선택되는 적어도 한가지 보충물질을 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다.

본 발명은 증가된 사이토킨 수준과 연관된 만성 질환 빈혈증을 치료 또는 예방하는 화합물과 방법을 제시한다. 특히, 본 발명은 사이토킨 수준이 증가된 개체에서 사이토킨-유도된 효과의 결과, 예를 들면, EPO 생산의 사이토킨 억제, 다양한 세포 부착 인자의 사이토킨-유도된 발현을 극복 또는 완화하는데 이용되는 방법과 화합물을 제시한다.

한 구체예에서, 본 발명은 EPO 생산의 사이토킨 억제를 극복하는데 이용되는 방법과 화합물을 제시한다. 이들 방법과 화합물은 예로써 배양된 Hep3B 세포에서 EPO 생산의 TNFα 및/또는 IL-1β 억제를 극복하는 능력으로 측정된 EPO 생산의 TNFα 및/또는 IL-1β 억제를 극복하는데 유효하다.

한 구체예에서, 본 발명은 다양한 세포 부착 인자의 발현에서 사이토킨-유도된 증가를 감소시키는데 이용되는 방법과 화합물을 제시한다. 이들 방법과 화합물은 예로써 내피 세포(HUVEC 등)에서 VCAM-1 또는 E-셀렉틴의 발현 수준에서 감소로 측정된 내피 세포 부착 인자, 예를 들면, VCAM-1과 E-셀렉틴의 발현에서 TNFα, IL-1β, IFN-γ-유도된 증가를 극복하는데 이용될 수 있다.

본 발명은 개체에서 철 결핍증을 치료 또는 예방하는데 이용되는 방법과 화합물을 제시한다. 특히, 이들 방법과 화합물은 철 대사를 강화시키거나, 또는 손상된 철 대사, 예를 들면, 손상된 철 흡수, 저장, 가공, 운반, 동원, 이용 등과 연관된 질병이나 질환을 치료 또는 예방하는데 이용될 수 있다.

한 측면에서, 본 발명의 방법과 화합물은 철 대사, 예를 들면, 운반, 이용, 저장 등에 관여하는 인자의 발현을 조절한다. 가령, 이들 방법과 화합물은 예로써 간 세포(가령, Hep3B, HepG2), 신장 세포(가령, HK-2) 또는 림프구(가령, THP-1)에서 트랜스페린 수용체의 증가된 발현, 또는 인간 개체에서 증가된 가용성 트랜스페린 수용체 수준으로 측정된 트랜스페린 수용체의 발현을 증가시킨다. 본 발명의 방법과 화합물은 생쥐 신장과 Hep3B 세포에서 증가된 유전자 발현으로 측정된 셀룰로플라스민 유전자 발현을 증가시킨다. 한 측면에서, 본 발명은 예로써 생쥐 간에서 헵시딘의 감소된 유전자 발현으로 측정된 헵시딘 유전자 발현을 감소시키는 방법과 화합물을 제시한다. 다른 측면에서, 본 발명의 방법과 화합물은 예로써 생쥐 장에서 증가된 유전자 발현으로 측정된 NRAMP2, 십이지장 시토크롬 b 환원효소 1 등을 비롯한 인자의 발현을 증가시키는데 이용된다. 본 발명의 방법과 화합물은 예로써 생쥐 장에서 증가된 유전자 발현으로 측정된 헴 합성 경로에서 일차 효소이며 헴 합성을 위한 속도-제한 효소인 5- 아미노레불리네이트 합성효소의 발현을 증가시킨다.

본 발명의 방법과 화합물은 철 대사를 강화시키는데 이용될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법과 화합물은 손상된 철 대사의 쥐 모델에서 증가된 혈청 철 수준, 증가된 트랜스페린 포화 비율, 감소된 소적혈구증으로 측정된 철 대사를 강화시킨다.

본 발명은 강화된 조혈을 유도하는데 이용되는 방법과 화합물을 제시한다. 특히, 본 발명의 방법과 화합물은 예로써 손상된 조혈의 쥐 모델과 인간 개체에서 망상적혈구 수치, 헤마토크리트, 적혈구 수치의 증가, 또는 손상된 조혈의 쥐 모델에서 증가된 헤모글로빈 수준으로 측정된 조혈을 강화시킨다.

본 발명의 방법과 화합물은 손상된 조혈의 쥐 모델에서 증가된 평균 혈구 헤모글로빈 수준과 증가된 평균 혈구 용적으로 측정된 소적혈구증을 감소시킨다.

본 발명의 방법은 HIFα를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 이런 안정화는 예로써 HIF 하이드록실라아제 활성의 저해를 통하여 달성될 수 있다. 본 발명의 바람직한 화합물은 HIF 프롤릴 하이드록실라아제 a활성을 저해하는 화합물이다. 이런 저해는 직접적 또는 간접적이고, 경쟁성 또는 비-경쟁성일 수 있다. 다양한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 2-옥소글루타레이트 모방물질, 철 킬레이트제, 프랄린 동족체에서 선택된다. 한 측면에서, 2- 옥소글루타레이트 모방물질은 화학식 I, Ia 또는 Ib의 헤테로환형 카르보닐 글리신이다. 철 킬레이트제는 화학식 III의 히드록삼산(hydroxamic acid)이다. 본원에 예시된 특정 구체예에서, 화합물은 화합물 D이다.

본 발명의 전형적인 화합물은 [(1-클로로-4-하이드록시-이소퀴놀린-3-카르보 닐)-아미노]-아세트산(화합물 A); [(4-하이드록시-7-페녹시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노]-아세트산(화합물 B); [(4-하이드록시-7-페닐설파닐-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노]-아세트산(화합물 C); 3-[4-(3,3-디벤질-우레이도)-벤젠설포닐]-[2-(4-메톡시-페닐)-에틸]-아미노-N-하이드록시-프리피온아마이드(화합물 D) 등이다. 본 발명에 따른 추가 화합물 및 본 발명의 추가 화합물을 확인하기 위한 방법은 아래에 제시한다.

도 1A와 1B에서는 본 발명의 방법과 화합물이 EPO 생산에 대한 TNF-α의 억제 효과를 극복한다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 2A와 2B에서는 본 발명의 방법과 화합물이 TNF-α로 전-처리된 세포에서 EPO 생산에 대한 TNF-α의 억제 효과를 극복한다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 3A와 3B에서는 본 발명의 방법과 화합물이 EPO 생산에 대한 IL-1β의 억제 효과를 극복한다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 4A와 4B에서는 본 발명의 방법과 화합물이 IL-1β로 전-처리된 세포에서 EPO 생산에 대한 IL-1β의 억제 효과를 극복한다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 5에서는 본 발명의 방법과 화합물이 TNF-α와 연관된 VCAM-1 발현을 감소시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 6A, 6B, 6C에서는 본 발명의 화합물로 생쥐의 처리이후, 트랜스페린 수용 체와 철 운반체(도 6A), 장 철 운반 단백질(도 6B), 5-아미노레불리네이트 합성효소(도 6C)의 증가된 발현을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 7에서는 본 발명의 방법과 화합물이 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 망상적혈구 수치를 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 8에서는 본 발명의 방법과 화합물이 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 헤마토크리트를 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 9에서는 본 발명의 방법과 화합물이 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 헤모글로빈 수준을 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 10에서는 본 발명의 방법과 화합물이 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 적혈구 수치를 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 11에서는 본 발명의 방법과 화합물이 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 소적혈구증을 감소시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 12에서는 본 발명의 방법과 화합물이 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 평균 혈구 헤모글로빈을 증가시키고 혈색소감소(hypochromia)를 개선한다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 13에서는 본 발명의 방법과 화합물이 정상 동물 및 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 헤마토크리트를 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 14에서는 본 발명의 방법과 화합물이 정상 동물 및 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 헤모글로빈 수준을 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 15에서는 본 발명의 방법과 화합물이 정상 동물 및 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 적혈구 수치를 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 16에서는 본 발명의 방법과 화합물이 정상 동물 및 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 평균 혈구 용적을 개선한다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 17에서는 본 발명의 방법과 화합물이 정상 동물 및 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 평균 혈구 헤모글로빈 수준을 개선한다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 18A와 18B에서는 본 발명의 방법과 화합물이 정상 동물 및 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 혈청 철 수준(도 18A) 및 트랜스페린 포화(도 18B)를 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 19에서는 본 발명의 방법과 화합물이 정상 동물 및 만성 질환 빈혈증의 동물 모델에서 NRAMP2(s1c112a)와 피토 바이오 펩티드(CYBRD1, 십이지장 시토크롬 b 환원효소 1)의 유전자 발현을 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 20에서는 건강한 인간 개체에 본 발명 화합물의 투여이후 증가된 망상적혈구를 보여주는 데이터를 도시한다.

도 21에서는 본 발명의 화합물이 투여된 건강한 인간 개체에서 증가된 적혈구 수치를 보여주는 데이터를 도시한다.

도 22에서는 건강한 인간 개체에 본 발명 화합물의 투여이후 증가된 가용성 트랜스페린 수용체 수준을 보여주는 데이터를 도시한다.

도 23에서는 본 발명의 화합물이 투여된 건강한 인간 개체에서 감소된 혈청 페리틴 수준을 보여주는 데이터를 도시한다.

도 24A와 24B에서는 본 발명의 방법과 화합물이 TNF-α와 연관된 VCAM-1과 E-셀렉틴 발현을 감소시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 25에서는 본 발명의 방법과 화합물이 TNF-α와 IL-1β와 연관된 VCAM-1 발현을 감소시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 26에서는 본 발명의 방법과 화합물이 TNF-α, IL-1β, IFN-γ와 연관된 E-셀렉틴 발현을 감소시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

도 27A와 27B에서는 본 발명의 방법과 화합물 및 IL-6이 간세포에서 EPO 수준을 상승적으로 증가시킨다는 것을 입증하는 데이터를 도시한다.

본 발명의 조성물과 방법을 기술하기에 앞서, 본 발명은 특정 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터 및 시약에 한정되지 않으며, 변화될 수 있는 것으로 생각된다. 또한, 본원에 이용된 용어는 본 발명의 특정 실시예의 설명을 목적으로 할 뿐이며, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 이용된 바와 같이, 단수 형태는 달리 명시하지 않는 경우에 복수의 의미를 포함하는 것으로 이해한다. 따라서, 예로써 “단편”은 복수의 단편을 포함하고; “화합물”은 본 명세서에 기술되고 당업자에게 공지된 하나 이상의 화합물 및 그 등가물을 의미한다.

달리 정의하지 않는 경우에, 본원에 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의 방법과 재료들이 본 발명을 실시 또는 시험하는데 이용될 수 있지만, 바람직한 방법, 장치 및 재료들은 하기에 기재한다. 본원에 언급된 모든 간행물은 본 발명과 관련하여 이용될 수 있는 간행물에 보고된 방법, 시약, 도구를 기재하고 개시할 목적으로 본원에 참조로 한다. 본원에 개시된 어떠한 내용도 본 발명의 개시가 선행 발명에 의한 개시를 앞서는 것으로 인정되지 않는다.

달리 명시하지 않는 경우에, 본 발명의 실시는 당업계의 기술 범위내의 통상적인 화학, 생화학, 분자생물학, 면역학 및 약학적 방법으로 수행된다. 이런 기술은 참고문헌에 상세하게 기술되어 있다(참조: Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.; Colowick, S. et al., eds., Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T. et al., eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., eds. (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 4th edition, John Wiley & Sons; Ream et al., eds. (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag).

정의

본 명세서에서, “만성 질환 빈혈증”은 예로써 연장된 감염, 염증, 신생물 질환 등의 결과로서 발생하는 임의의 빈혈증을 의미한다. 발생된 빈혈증은 단축된 적혈구 수명 및 대식세포에서 철의 격리로 특성화되는데, 이는 새로운 적혈구를 생성하는데 이용가능한 철의 양을 감소시킨다. 만성 질환 빈혈증과 연관된 상태에는 만성 박테리아 심장내막염, 골수염, 류머티스 관절염, 류머티스 열, 신생물 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 추가의 상태에는 염증성 감염(가령, 폐농양(pulmonary abscess), 결핵, 골수염 등), 염증성 비-감염성 질환(가령, 류머티스 관절염, 전신성 루프스 홍반, 크론병, 간염, 염증성 장 질환 등) 및 다양한 암, 종양, 악성 종양(가령, 암종, 육종, 림프종 등)을 비롯한 감염, 염증, 신생물과 연관된 다른 질병과 질환이 포함된다.

본 명세서에서, “질병”, “질환”, “상태”는 포괄적으로 이용되며, 정상으로부터 이탈된 임의의 상태를 의미한다.

본 명세서에서, “에리트로포이에틴”은 예로써 인간 에리트로포이에틴(GenBank Accession No. AAA52400; Lin et al.(1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:7580- 7584), EPOET1N 인간 재조합 에리트로포이에틴(Amgen, Inc., Thousand Oaks CA), ARANESP 인간 재조합 에리트로포이에틴(Amgen), PROCRIT 인간 재조합 에리트로포이에틴(Ortho Biotech Products, L.P., Raritan NJ) 등을 비롯한 임의의 재조합 또는 자연 발생 에리트로포이에틴을 의미한다.

본 명세서에서, “HIFα”는 산소결핍 유도 인자 단백질의 알파 아단위를 의미한다. HIFα는 인간 HIF-1α(Genbank Accession No. Q16665), HIF-2α(Genbank Accession No. AAB41495), HIF-3α(Genbank Accession No. AAD22668); 뮤린 HIF-1α(Genbank Accession No. Q61221), HIF-2α(Genbank Accession No. BAA20130과 AAB41496), HIF-3α(Genbank Accession No. AAC72734); 쥐 HIF-1α(Genbank Accession No. CAA70701), HIF-2α(Genbank Accession No. CAB96612), HIF-3α(Genbank Accession No. CAB96611); 소 HIF-1α(Genbank Accession No. BAA78675)를 비롯한 임의의 인간 또는 다른 포유동물 단백질, 또는 이의 단편이다. HIFα는 개구리(Xenopus laevis) HIF-1α(Genbank Accession No. CAB96628), 초파리(Drosophila melanogaster) HIF-1α(Genbank Accession No. JC4851), 병아리 HIF-1α(Genbank Accession No. BAA34234)를 비롯한 임의의 비-포유동물 단백질 또는 이의 단편일 수도 있다.

HIFα 유전자 서열은 예로써 다른 종에서 HIFα 유전자의 서열을 회수하고 결정하는 프로브로서 상기한 HIFα 유전자 서열의 전체 또는 일부를 이용함으로써, 통상적인 클로닝 기술로 획득될 수도 있다.

HIFα의 단편은 아미노산 401 내지 603(Huang et al., supra), 아미노산 531 내지 575(Jiang et al.(1997) J Biol Chem 272:19253-19260), 아미노산 556 내지 575(Tanimoto et al., sierra), 아미노산 557 내지 571(Srinivas et al.(1999) Biochem Biophys Res Commun 260:557-561), 아미노산 556 내지 575(Ivan and Kaelin(2001) Science 292:464-468)로부터 인간 HIF-1α에 의해 정의되는 영역을 보유한다. 더 나아가, HIFα의 단편에는 예로써 HIFα 고유 서열의 L₃₉₇TLLAP와 L₅₅₉EMLAP에서 발생하는 바와 같이, 적어도 1회 빈도의 모티프 LXXLAP를 보유하는 임의의 단편이 포함된다.

본 명세서에서, “HIF 프롤릴 하이드록실라아제”와 “HIF PH”는 HIF 단백질에서 프롤린 잔기를 수산화시킬 수 있는 임의의 효소를 의미한다. 적절하게는, HIT PH에 의해 수산화된 프롤린 잔기에는 인간 HIF-1α 고유 서열의 L₃₉₇TLLAP와 L₅₅₉EMLAP에서 발생하는 바와 같이, 모티프 LXXLAP에서 발견되는 프롤린이 포함된다. HIF PH에는 Taylor(2001, Gene 275:125-132)에 의해 기술된 Aravind and Koonin, 2001, Genome Biol 2:RESEARCH0007;, Epstein et al., 2001, Cell 107:43-54; Bruick and McKnight, 2001, Science 294: 1337-1340에서 특성화된 Eg1-Nine(EGLN) 유전자 계통의 구성원이 포함된다. HIF 프롤릴 하이드록실라아제 효소의 실례는 인간 SM-20(EGLN1)(GenBank Accession No. AAG33965; Dupuy et al.(2000) Genomics 69:348-54), EGLN2 동종형 1(GenBank Accession No. CAC42510; Taylor, supra), EGLN2 동종형 2(GenBank Accession No. NP_060025), EGLN3(GenBank Accession No. CAC42511; Taylor, supra); 생쥐 EGLN1(GenBank Accession No. CAC42515), EGLN2(GenBank Accession No. CAC42511), EGLN3(SM-20)(GenBank Accession No. CAC42517); 쥐 SM-20(GenBank Accession No. AAA19321) 등이다. 부가적으로, HIF PH에는 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) EGL-9(GenBank Accession No. AAD56365)와 초파리(Drosophila melanogaster) CG1114 유전자 산물(GenBank Accession No. AAF52050)이 포함된다. HIF 프롤릴 하이드록실라아제에는 적어도 한가지 구조적 또는 기능적 특성을 유지하는 상기한 전장 단백질의 임의의 단편 역시 포함된다.

본 명세서에서, “프롤릴 하이드록실라아제 저해물질” 또는 “PHI”는 아미노산 잔기를 수산화시키는 효소의 활성을 감소시키거나 조절하는 임의의 화합물을 의미한다. 프롤린 잔기가 수산화되는 효소 활성이 바람직하긴 하지만, 아르기닌을 비롯한 다른 아미노산의 수산화 역시 고려된다. 본 발명의 방법에 이용될 수 있는 화합물에는 예로써 철 킬레이트제, 2-옥소글루타레이트 모방물질, 변형된 아미노산, 예를 들면, 프랄린, 동족체가 포함된다.

특정 구체예에서, 본 발명은 2-옥소글루타레이트의 구조적 모방체의 용도를 제시한다. 이들 화합물은 2-옥소글루타레이트와 경쟁적으로, 철과 비경쟁적으로 표적 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 효소 계통 구성원을 저해한다(Majamaa et al.(1984) Eur J Biochem 138:239-245; Majamaa et al.(1985) Biochem J 229: 127-133). 본 발명에 특정하게 이용된 PHI는 예로써 Majamaa et al., supra; Kivirikko and Myllyharju(1998) Matrix Biol 16:357-368; Bickel et al.(1998) Hepatology 28:404-411; Friedman et al.(2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:4736-4741; Franklin(1991) Biochem Soc Trans 19) :812-815; Franklin et al.(2001) Biochem J 353:333-338, International Publication Nos. WO 03/053977과 WO 03/049686에서 기술한다. [(1-클로로-4-하이드록시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노]-아세트산(화합물 A); [(4-하이드록시-7-페녹시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노]-아세트산(화합물 B); [(4-하이드록시-7-페닐설파닐-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노]-아세트산(화합물 C); 3-[4-(3,3-디벤질-우레이도)-벤젠설포닐]-[2-(4-메톡시-페닐)-에틸]-아미노-N-하이드록시-프리피온아마이드(화합물 D)를 비롯한 전형적인 PHI는 본 발명의 실시예에서 본 발명의 방법을 예시하는데 이용된다.

본 발명은 개체에서 강화된 또는 완전한 조혈을 유도하는데 이용되는 방법과 화합물에 관한다. 특히, 이들 방법은 개체에서 HIFα를 안정시켜 강화된 또는 완전한 조혈을 유도하는 단계를 포함한다. 특히, HIF 프롤릴 하이드록실라아제를 저해하여 강화된 조혈을 유도하는 방법을 고려한다. 특정 구체예에서, 이들 방법은 본 발명의 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 인간은 세포, 조직, 기관, 기관 시스템 또는 전체 생물체이다.

만성 질환 빈혈증은 입원 환자에서 가장 일반적인 형태의 빈혈증이다. 만성 질환 빈혈증은 염증성 감염(가령, 폐농양(pulmonary abscess), 결핵, 골수염 등), 염증성 비-감염성 질환(가령, 류머티스 관절염, 전신성 루프스 홍반, 크론병, 간염, 염증성 장 질환 등), 다양한 암, 종양, 악성 종양(가령, 암종, 육종, 림프종 등), 만성 박테리아 심장내막염, 골수염, 류머티스 관절염, 류머티스 열, 신생물 질환을 비롯한 염증성 또는 악성 질환을 앓는 환자에서 발병한다.

한 측면에서, 본 발명은 강화된 또는 완전한 조혈을 유도하여 만성 질환 빈혈증을 치료하는 방법을 제시한다. 만성 질환 빈혈증은 만성 감염과 만성 염증뿐만 아니라, 예로써 류머티스 관절염, 류머티스 열, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 전신성 루프스 홍반, 맥관염, 신생물 질환을 비롯한 만성 질환과 연관된다. 감소된 또는 비효율적인 조혈은 만성 질환 빈혈증에서 공통적으로 나타나는 병리이다. 감소된 또는 비효율적인 조혈은 예로써 억제된 EPO 생산, 골수에서 감소된 EPO 반응, 비정상적인 철 가공(가령, 비정상적인 또는 비효율적인 철 흡입, 동원, 저장, 흡수)를 비롯한 조혈 경로에서 다양한 대사 비정상에 기인할 수 있다.

만성 질환 빈혈증과 연관된 질환의 생리 특징은 EPO 생산, EPO 반응성, 철 대사의 공동 조절을 매개하는 능력에 부정적인 영향을 주는 염증성 사이토킨(Means(1995) Stem Cells 13:32-37; Means(1999) Int J Hematol 70:7-12), 예를 들면, 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β), 인터페론-γ(IFN-γ)의 증가된 생산이다(참조: Roodman et al.(1989) Adv Exp Med Biol 271:185-196; Fuchs et al.(1991) Eur J Hematol 46:65-70; Jelkmann et al.(1991) Ann NY Acad Sci 718:300-311; Vannucchi et al.(1994) Br J Hematol 87:18-23; Oldenburg et al.(2001) Aliment Pharmacol Ther 15:429-438). 본 발명은 EPO 생산, EPO 신호전달, 철 이용에 관련된 대사와 생리 경로를 개선하여 완전한 또는 강화된 조혈 및 만성 질환 빈혈증의 감소 또는 완화를 유도하는 방법을 제시한다.

본 발명은 만성 질환 빈혈증에 대한 기존의 치료법, 예를 들면, 재조합 EPO 투여에 비하여 이점을 제공한다. 감소된 EPO 생산은 감소된 조혈의 유일한 특징이며, 재조합 EPO의 투여는 만성 질환 빈혈증 환자에서 나타나는 감소된 조혈과 연관된 다른 결핍증을 해결하지 못하는 것으로 인정된다(참조: Clibon et al.(1990) Exp Hematol 18:438-441; Macdougall and Cooper(2002) Neprol Dial Transplant 17(11):39-43). 이들 결핍증에는 장으로부터 철 흡수; 트랜스-상피세포 운반; 헤파에스틴(hephaestin) 또는 셀룰로플라스민에 의한 철의 제2철 상태로의 산화; 트랜스페린과 트랜스페린 수용체에 의한 철의 결합과 흡입; 헴 합성을 비롯한 철 이용이 진행되는 골수로의 철 운반을 비롯한 완전한 또는 전체 조혈에 기여하는 철 대사의 다양한 측면뿐만 아니라 예로써 골수의 감소된 EPO 반응성이 포함된다. 상기한 이유로 많은 환자들에서 재조합 EPO 투여에 대한 저항이 나타나는데, 이런 경우에 재조합 EPO 투여에 대한 반응은 고용량의 재조합 EPO에서도 감소하거나 부재한다.

만성 질환 빈혈증에서 염증성 사이토킨의 우세는 적절한 헴 합성을 위하여 철을 필요로 하는 새로 생성된 적혈구 선조세포가 쉽게 접근하지 못하는 세포 구획 내에 주로 대식세포에서 감소된 혈청 철 수준과 증가된 철 저장을 유발한다. 본 발명은 완전한 전체 조혈에 기여하는 대사 경로를 강화시키는 방법을 제시한다. 한 구체예에서, 치료제는 효능을 더욱 강화시키는 보조물질, 예를 들면, 철과 B 비타민과 공동으로 투여된다.

만성 질환 빈혈증은 증가된 수준의 훼리틴과 연관된다. 높은 수준의 훼리틴에도 불구하고, 만성 질환 빈혈증 개체는 철을 효율적으로 이용할 수 없다. 높은 수준의 훼리틴은 요독성 만성 신장 질환 환자에서 빈번하게 나타나는 만성 질환 빈혈증과 가성-염증 상태와 연관된 기능성 철 결핍증인 골수로의 철 재활용 감소와 강화된 철 저장을 지시한다. 본 발명의 방법과 화합물은 훼리틴 수준을 감소시킴으로써, 저장된 철을 감소시키고 트랜스페린과 트랜스페린 수용체를 통한 철 재활용을 강화시킨다. 감소된 혈청 훼리틴 수준은 강화된 철 이용과 골수로의 강화된 철 재활용을 지시하고, 따라서 헴 생산과 조혈을 위한 철 이용가능성을 증가시킨다.

산소결핍에 대한 게놈 반응에는 산소 결핍의 급성과 만성 효과를 완화시키는 유전자 발현과 세포 생리에서 변화가 포함된다. 산소결핍 유도 인자(HIP)는 산소-조절된 알파 아단위(HIFα)와 구성적으로 발현된 베타 아단위(HIFβ)로 구성되는 전사 인자이다. HIFα는 HIF-특이적 프롤린 하이드록실라아제(HIF-PH)에 의한 특정 프롤린 잔기의 수산화로 인하여 노목식(normoxic) 환경에서 불안정하다. 하지만, 산소가 제한되는 경우에, 예를 들면, 하이폭식(hypoxic) 환경에서, HIF-PH는 HIFα를 수산화시킬 수 없는데, 상기 아단위가 분해되지 않고, 활성 HIF 복합체가 형성되고 핵으로 전좌되며 유전자 전사를 활성화시킨다.

특정 측면에서, 본 발명은 산소결핍을 제약학적으로 모방함으로써 만성 질환 빈혈증을 치료하는 방법을 제시한다. 특정 측면에서, 이들 방법은 염증성 사이토킨의 억제 효과에 저항하는 방식으로 EPO 생산을 강화시킨다. EPO 생산은 산소결핍 또는 적은 산소에 의해 정상적으로 유도되지만 발현과 분비는 염증성 사이토킨, 예를 들면, TNF-α, IL-1β, IFN-γ의 존재하에 여전히 침체되고 만성 질환 환자에서 우세하다(참조: Means(1995) Stem Cells 13:32-37; Means(1999) Int J Hematol 70:7-12; Roodman et al.(1989) Adv Exp Med Biol 271:185-196; Fuchs et al.(1991) Eur J Hematol 46:65-70; Jelkmann et al.(1991) Ann NY Acad Sci 718:300-311; Vannucchi et al.(1994) Br J Hematol 87:18-23). 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질은 염증성 사이토킨의 존재하에 관찰되는 수준 이상으로 EPO를 분비하는 Hep3B 세포의 능력에서 입증된 바와 같이, EPO 생산에 대한 염증성 사이토킨의 억제 효과를 적어도 부분적으로 극복한다(참조: 도 1A, 1B, 2A, 2B, 3A, 3B, 4A, 4B). 철 킬레이트제, 데스훼리옥사민(desferrioxamine)과 같은 작용제 역시 에리트로포이에틴-저항성 빈혈증, 예를 들면, 만성 질환 빈혈증의 연구에서 일부 효능을 보였다(참조: Salvarani et al.(1996) Rheumatol Int 16:45-48; Goch et al.(1995) Eur J Hematol 55:73-77).

다른 특징에서, 본 발명은 염증성 사이토킨의 존재하에 EPO 수용체에 의한 개선된 신호전달 방법을 제시한다. 만성 질환 환자에서 염증성 사이토킨의 우세는 많은 환자가 재조합 EPO에 강화된 조혈로 반응하지 못한다는 사실에 의해 입증되는 바와 같이, EPO 신호전달의 감소된 효능을 유발한다. 이는 골수 구조 및/또는 미세환경에서 결함뿐만 아니라 EPO 생활성에 대한 감소된 민감성에 의해 발생하는 것으로 생각된다(참조: Clibon et al.(1990) Exp Hematol 18:438-441; Macdougall and Cooper(2002) Neprol Dial Transplant 17(11):39-43). 특정 구체예에서, 본 발명은 EPO 수용체를 통한 신호 전달에 대한 적합 세포의 민감성을 복구함으로써 전체적이고 완전한 조혈을 유도하는 방법을 제시한다.

철 결핍증은 전세계적으로 가장 일반적인 영양 결핍증의 하나이며, 전세계 빈혈증의 주요 원인이다. 철 균형은 조혈 속도와 철 저장(iron store)의 크기에 의해 근본적으로 조절된다. 철 결핍증은 빈혈증 없이 또는 빈혈증과 함께 발병할 수 있으며, 손상된 인지 발달(cognitive development)과 연관된다.

철 결핍증은 체내에서 불충분한 철 공급(수준 또는 저장), 또는 철의 불충분한 이용가능성 또는 이용으로 정의된다. 이는 영양 결핍, 예를 들면, 식이에서 철의 부족; 예로써 수술(위절제후)이나 질병(크론병)에 따른 철 흡수불량; 또는 손상이나 외상, 월경, 헌혈, 자락(phlebotomy)(다양한 절차, 수술에서)으로부터 발생하거나 예로써 유년기 또는 청년기에 급격한 성장, 임신, 에리트로포이에틴 치료 등에 따른 증가된 철 수요로부터 발생된 만성이나 급성 혈액 손실에 기인한 철 공급의 고갈 또는 증가된 철 손실로 인하여 유발될 수 있다.

철 결핍증은 기능성 철 결핍증, 예를 들면, 개체에서 철 저장소를 이용하는 능력의 손상으로 특성화되는 철 결핍증일 수도 있다. 철은 적혈구의 정상적인 혈색소화(hemoglobinization)를 가능하게 할 만큼 충분한 비율로 이용가능하지 않고, 감소된 망상적혈구와 적혈구 헤모글로빈 함량을 유발한다. 기능성 철 결핍증은 철 저장이 겉보기에 정상이거나 증가하지만 예로써 낮은 수준의 트랜스페린 포화 비율에 의한 측정에서 손상된 철 이용가능성을 보이는 건강한 개체에서도 관찰된다. 이런 유형의 철 결핍증은 급성 또는 만성 염증과 빈번하게 연관된다.

임의 종류의 철 결핍증은 철-결핍된 또는 철-제한된 조혈을 유발할 수 있는데, 여기서 적혈구 수는 감소하고, 순환 적혈구는 정상보다 작고(소적혈구성) 충분한 헤모글로빈이 부재하며, 따라서 엷은 색채를 띤다(저색소성).

철 결핍증, 예를 들면, 기능성 철 결핍증 개체는 철 결핍 빈혈증을 초래하는 손상된 헤모글로빈 합성, 감소된 트랜스페린 포화 %, 감소된 헤모글로빈과 헤마토크리트 수준이 나타날 수 있다. 철 결핍 빈혈증은 전세계에서 가장 일반적인 빈혈증이다. 철은 헤모글로빈의 필수 성분이다; 철이 없으면, 골수는 헤모글로빈을 효과적으로 생산할 수 없다. 철 결핍 빈혈증은 철 공급이 고갈되거나 손상된 개체에서 발생하거나, 또는 철이 저장 상태로 존재하긴 하지만 예로써 헤모글로빈 생산에 이용되지 않는 기능성 철 결핍증 개체에서 발생할 수 있다.

철 대사는 철 대사의 특정 과정을 증가 또는 감소시킴으로써 세포, 조직, 기관, 기관 시스템, 또는 전체 생물체가 철 항상성을 유지하는 전체 과정을 포괄한다. 철 대사 또는 철 대사 과정은 철 가공, 운반, 흡입, 이용, 저장, 동원, 흡수 등을 수반하는 과정을 포괄한다. 철 대사와 가공의 특정 측면에는 세포막을 통한 철의 이동 및 세포에 의한 철의 유지 또는 분비를 조장하는 철 운반체와 효소의 발현; 혈액에서 철 운반에 관여하는 단백질의 발현에서 변화; 트랜스페린과 트랜스페린 수용체의 발현에서 변화; 철 흡수에 관여하는 단백질의 발현 및/또는 활성에서 변화; 철 연관된 전사와 전사 조절 단백질의 발현과 활성에서 변화; 신체 또는 배양액, 예를 들면, 세포간(즉, 세포외), 세포내, 혈액, 골수 등에서 철 분포의 변화 등이 포함된다.

특정 측면에서, 본 발명은 철 흡입, 운반, 가공, 이용을 개선하는 방법을 제시한다. 만성 질환 빈혈증은 헴 합성과 헤모글로빈 형성에 부정적인 영향을 주어 조혈을 감소시키는 철 이용에서 결함과 연관된다(참조: Oldenburg et al.(2001) Aliment Pharmacol Ther 15:429- 438). 만성 질환 환자에서 감소된 혈청 철 수준, 철 동원, 철 저장의 연관된 증가는 장기적인 염증 상태에서 대식세포의 미생물 방어 기전과 관련될 수 있다(참조: Fuchs et al.(1991) Eur J Hematol 46:65-70). 일부 측면에서, 본 발명은 HIFα를 안정화시킴으로써 철의 효과적인 대사를 증가시키는 방법을 제시한다.

예로써 적혈구 5-아미노레불리네이트 산 합성효소(ALAS)(헴 합성에서 일차적인 속도-제한 단계)(Bottomley and Muller-Eberhard(1988) Semin Hematol 25:282-302; Yin et al.(1998) Blood, Cells, Molecules, and Diseases 24(3):41-533), 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 철 운반체(철 운반에 관여), 셀룰로플라스민 등을 비롯한 다수의 단백질이 철 대사를 매개한다. 트랜스페린과 트랜스페린 수용체 발현에서 증가는 적혈구 선조세포에 의한 철 흡입을 자극하고 대식 세포에 의한 철 흡입과 운반을 조장한다(Goswami et al.(2002) Biochem Cell Biol 80:679-689). 셀룰로플라스민은 제1철의 제2철로의 산화를 증가시켜 트랜스페린에 대한 결합이 진행되도록 한다(Goswami et al.(2002) Biochem Cell Biol 80:679-689). 특정 측면에서, 본 발명의 방법은 적혈구 5-아미노레불리네이트 합성효소, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, NRAMP2, 피토 바이오 펩티드(십이지장 시토크롬 b 환원효소 1), 셀룰로플라스민을 비롯한 철 대사에 관여하는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시킴으로써 철 대사를 증가시킨다. 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 헵시딘의 발현이나 활성을 감소시키고 훼리틴의 발현을 조절함으로써 철 대사를 증가시킨다.

한 구체예에서, 본 발명은 산물이 철 흡입, 저장, 운반, 흡수 등을 비롯한 철 대사와 가공에 관여하는 유전자의 발현을 증가시키는 방법과 화합물을 제시한다. 이런 유전자에는 트랜스페린 수용체, 셀룰로플라스민, NRAMP2, 5-아미노레불리네이트 합성효소, 피토 바이오 펩티드(CYBRD1) 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 철 대사와 가공에 관여하는 유전자의 치료 상향조절은 철 이용가능성을 효과적으로 증가시키고, 따라서 만성 질환 빈혈증, 철 결핍 빈혈증, 기능성 철 결핍증 등을 앓는 환자에서 긍정적인 효과를 유도한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 철 조절과 연관된 단백질인 헵시딘의 발현을 감소시키는 방법과 화합물을 제시한다.

적절한 철 대사는 철 반응-요소 결합 단백질(IRP)에 의해 부분적으로 조절되는데, 상기 단백질은 예로써 훼리틴(철 저장), 미토콘드리아 아코니타아제(aconitase)(에너지 대사), 적혈구-아미노레불리네이트 합성효소, 트랜스페린 수용체를 인코딩하는 mRNA의 5'- 및/또는 3'-UTR에서 발견되는 철-반응성 요소(IRE)이다. 예로써 훼리틴 전사체에서처럼, 5'-IRE에 대한 IRP 결합은 상기 mRNA의 번역을 저해한다; 반면에, 예로써 트랜스페린 전사체에서처럼 3'-IRE에 대한 결합은 mRNA를 분해로부터 보호한다. IRP-2는 세포 내에서 구성적으로 만들어지긴 하지만 분해되고, 따라서 철-충만 상태에서 불활성화된다. 하지만, IRP-2는 철 고갈 및/또는 하이폭식 상태에서 안정화된다(Hanson et al.(1999) J Biol Chem 274:5047-5052). IRP-2가 철의 장기 저장을 주도하는 훼리틴의 발현을 감소시키고 트랜스페린과 트랜스페린 수용체의 발현을 증가시키기 때문에, IRP-2는 철 흡입, 운반, 이용을 조장하고 조혈을 강화시킨다(Klausner et al.(1993) Cell 72:19-28). 최근에, IRE는 5-아미노레불리네이트 합성효소, NRAMP2 철 운반체(s1c11a2, DCT1, DMT1, mk(생쥐에서 소적혈구성 빈혈증 유전자 좌위)), 십이지장에서 식이 공급원으로부터 철 흡수를 매개하는 철 운반체를 비롯하여 조혈에 필수적인 다른 유전자에서도 보고되었다(Haile(1999) Am J Med Sol 318:230-240; Gunshin et al.(2001) FEBS Lett 509:309-316).

본 발명의 방법은 산소결핍 상태를 모방함으로써, HIFα 이외에 IRP-2를 잠재적으로 안정화시켜 내인성 EPO 생산 및 기능적 적혈구의 생산에서 강화된 철 흡입, 운반, 이용을 수반하는 상승효과를 유도한다.

성인에서, 식이 철의 철 흡수는 평균적으로, 남성에서 6%이고, 비-임신 여성에서 13%이다. NRAMP2(DMT1, DCT1, s1c11a2)는 비-트랜스페린 결합된 철의 막통과 운반에 관여하는 편재성으로 발현되는 이가 금속 운반체이다. NRAMP2는 위장 내강에서 십이지장 상피세포로, 적혈구모세포 엔도솜에서 세포질로 철 운반과 연관된 철 운반 단백질이다. 식이 철 기아를 겪는 동물에서, NRAMP2(s1c11a2) 발현은 인접 십이지장의 원주형 흡수 내피(columnar absorptive epithelium)에서 상피세포의 정점(apical pole)에서 급격하게 증가하였다(참조: Canonne-Hergaux et al.(1999) Blood 93:4406-4417). 돌연변이된 NRAMP2 유전자를 보유하는 저색소성과 소적혈구성 빈혈성 생쥐(mk 생쥐)를 비롯한 유전자 설치류 모델은 상기 유전자를 철 결핍증과 연관된 빈혈증과 연계시켰다. MK 생쥐는 철 흡수와 적혈구 철 이용에서 심각한 결함을 보인다.

특정 측면에서, 본 발명의 방법과 화합물은 식이 철의 철 흡수를 증가시키는데 유용하다. 본 발명은 철 운반 흡수와 연관된 유전자의 발현을 증가시키는데 이용되는 방법과 화합물을 제시한다. 특히, 본 발명의 화합물은 장에서 NRAMP2의 발현을 증가시키는데 유효하였다. 증가된 NRAMP2(s1c11a2) 발현은 장으로부터 철, 예를 들면, 식이 철의 철 흡수를 증가시키는데 바람직하다.

이에 더하여, 본 발명은 본 발명의 화합물로 치료된 동물의 장에서 증가된 피토 바이오 펩티드(Sproutin) 유전자 발현을 입증하는 데이터를 제시한다. 피토 바이오 펩티드 장내 철 환원효소(Dcytb와 Cybrd1(CYBRD1, 십이지장 시토크롬 b 환원효소 1))는 제2철 환원효소이며, 철 흡수와 연관된 세포외 제2철의 제1철로의 환원을 촉진한다. 피토 바이오 펩티드는 철-기아된 동물의 십이지장 융모의 점점 영역에서 NRAMP2와 동시-발현된다(참조: McKie et al.(2001) Science 291:1755-1759).

본 발명의 방법과 화합물은 셀룰로플라스민 유전자 발현을 증가시키는데 유효하다. 셀룰로플라스민(페록시다아제-1)은 저장 위치(가령, 훼리틴)로부터 방출된 환원된 철을 산화 형태로 전환시킨다. 산화된 철은 혈장 운반 단백질, 트랜스페린에 결합할 수 있다. 셀룰로플라스민 결핍은 간과 다른 조직에서 철의 축적과 연관된다. 여러 증거에서 셀룰로플라스민은 간으로부터 철의 유출을 촉진하고 철의 철-결핍 세포로의 유입을 촉진하는 것으로 확인되었다(참조: Tran et al.(2002) J Nutr 132:351-356).

본 발명의 화합물은 생쥐 간에서 헵시딘 mRNA의 발현을 감소시켰다. 염증은 IL-6 생산을 유도하는데, 이는 간세포에서 헵시딘 생산을 유도하는 작용을 한다. 헵시딘은 대식세포 철 방출과 장내 철 흡수를 저해하고 철 이용가능성을 감소시키며 예로써 저철혈증(hypoferremia)을 유발한다. 감소된 헵시딘 발현은 세포내피(reticuloendothelial) 세포로부터 증가된 철 방출 및 증가된 장내 철 흡수와 연관된다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 헵시딘 발현을 감소시키고 장내 철 흡수를 증가시키며 저철혈증을 감소시키는데 유효하다.

간염 바이러스(HCV) 감염과 연관된 빈혈증을 치료하는 방법이 특정하게 고려된다. HCV 감염에 대한 현재의 치료법에는 인터페론-α와 리바비린의 병용이 포함된다. 이런 병용 요법은 헤모글로빈 농도에서 감소 및 빈혈증과 연관된다. 한 측면에서, HCV 감염과 연관된 빈혈증을 치료하는데 이용되는 방법과 화합물을 제시한다. 다른 측면에서, MCV 감염에 대한 인터페론-α 요법과 연관된 빈혈증을 치료하는데 이용되는 방법과 화합물을 제시한다. 다른 측면에서, 본 발명은 HCV 감염에 대한 리바비린 요법과 연관된 빈혈증을 치료하는데 유효한 방법과 화합물을 제시한다. 조혈 줄기 세포(HSC), CFU-GEMM(콜로니-형성 단위-과립구/적혈구/단핵구/거핵구)을 비롯한 조혈 선조세포로부터 적혈구의 분화에 요구되는 인자의 생산을 증가시키는 방법 역시 고려된다. 조혈을 촉진하는 인자에는 에리트로포이에틴이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 다른 측면에서, 이들 방법은 철 흡입, 운반, 이용에 요구되는 인자의 생산을 증가시킨다. 이런 인자에는 적혈구 아미노레불리네이트 합성효소, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 셀룰로플라스민, 훼리틴 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 적혈구의 분화에 요구되는 인자 및 철 흡입, 운반, 이용에 요구되는 인자를 증가시킨다.

에리트로포이에틴에 대한 조혈 선조세포의 반응성을 강화시키는 방법 역시 고려된다. 상기한 바와 같이, 이런 선조세포에는 HSC, CFU-GEMM 등이 포함된다. 이들 선조세포의 반응성은 예로써 에리트로포이에틴 수용체, 에리트로포이에틴 신호전달에 관여하는 세포내 인자, 에리트로포이에틴과 수용체의 상호작용을 조장하는 분비 인자의 발현을 변화시킴으로써 증폭될 수 있다. 본 발명은 예로써 EPO 수용체 발현을 증가시킴으로써 골수의 EPO 반응성을 강화시키는 방법을 제시한다.

방법

본원에서 다양한 방법이 제시된다. 한 측면에서, 이들 방법은 HIFα를 안정시키는 작용제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.

HIFα의 안정화는 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 달성할 수 있으며, HIFα와 상화작용하거나, HIFα에 결합하거나 또는 HIFα를 변화시키는 임의의 작용제, 또는 예로써 HIFα가 기질인 효소를 비롯하여 HIFα와 상호작용하는 인자의 이용을 수반할 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명은 구성적으로 안정한 HIFα 변이체, 예를 들면, 안정한 HIF 뮤테인 등, 또는 이런 변이체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제시한다(참조: U.S. Patent Nos. 6,562,799, 6,124,131; U.S. Patent No. 6,432,927). 다른 측면에서, 본 발명에서 HIFα 안정화는 HIFα를 안정시키는 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 작용제는 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 안티센스 서열(참조: International Publication No. WO 03/045440); 폴리펩티드; 항체; 다른 단백질; 탄수화물; 지방; 지질; 유기와 무기 물질, 예를 들면, 소형 분자 등으로 구성될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 예로써 HIFα를 안정시키는 작용제를 개체에 투여함으로써 상기 개체에서 HIFα 안정화를 고려하는데, 여기서 상기 작용제는 HIFα를 안정시키는 화합물, 예를 들면, 소형 분자 화합물이다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 계통으로부터 선택된 적어도 한가지 효소의 활성을 저해함으로써 HIFα를 안정화시키는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 효소는 HIP 하이드록실라아제 효소, 예를 들면, EGLN-1, EGLN-2, EGLN-3 등이다(참조: Taylor(2001) Gene 275:125-132; Epstein et al.(2001) Cell 107:43-54; Bruick and McKnight(2001) Science 294:1337- 1340). 하지만, 효소는 예로써 프로콜라겐 리실 하이드록실라아제, 프로콜라겐 프롤릴 3-하이드록실라아제, 프로콜라겐 프롤릴 4-하이드록실라아제 α(I)과 α(II), 티민 7-하이드록실라아제, 아스파르틸(아스파라기닐)β-하이드록실라아제, ε-N-트리메틸리신 하이드록실라아제, γ-부티로베타인 하이드록실라아제 등을 비롯한 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 효소 계통으로부터 선택되는 임의의 효소일 수 있다(참조: Majamaaet al.(1985)BiochemJ229:127-133; Myllyharju and Kivirikko(1997) EMBO J 16: 1173-1180; Thornburg et al.(1993) 32: 14023 14033; Jia et al.(1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231).

특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 HIFα를 안정시키는 작용제의 효과량을 개체에 투여함으로써 만성 질환 빈혈증을 치료하거나 철 대사를 조절하는 단계를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 작용제는 본 발명의 화합물이다. 한 측면에서, 상기 화합물은 HIFα의 특정 잔기, 예를 들면, 프롤린 잔기, 아스파라긴 잔기 등의 수산화를 저해함으로써 HIFα를 안정시킨다. 바람직한 구체예에서, 잔기는 프롤린 잔기이다. 특정 구체예에서, 잔기는 HIF-1α에서 P₅₆₄ 잔기 또는 다른 HIFα 동족형에서 상동성 프롤린, 또는 HIF-1α에서 P₄₀₂ 잔기 또는 다른 HIFα 동족형에서 상동성 프롤린일 수 있다. 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 HIFα 아스파라긴 잔기, 예를 들면, HIF-1α에서 N₈₀₃ 잔기 또는 다른 HIFα 동족형에서 상동성 아스파라긴 잔기의 수산화를 저해하는 단계를 포함할 수 있다.

화합물

바람직한 방법에서, 본 발명의 방법은 HIFα를 안정시키는 화합물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 전형적인 화합물은 국제 출원 WO 03/049686과 국제 출원 WO 03/053997에서 개시한다. 구체적으로, 본 발명의 화합물은 아래와 같다.

특정 구체예에서, 본 발명의 화합물은 HIF 하이드록실라아제 활성을 저해하는 화합물이다. 다양한 구체예에서, 활성은 HIF 프롤릴 하이드록실라아제, 예를 들면, EGLN1, EGLN2, 또는 EGLN3 등에 기인한다. 다른 구체예에서, 활성은 HIF 아스파라기닐 하이드록실라아제, 예를 들면, FIH에 기인한다. 본 발명의 바람직한 화합물은 HIF 프롤릴 하이드록실라아제 활성을 저해하는 화합물이다. 이런 저해는 직접적 또는 간접적이고, 경쟁성 또는 비-경쟁성일 수 있다.

한 측면에서, 본 발명의 화합물은 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 효소의 활성을 저해하거나 조절하는 임의의 화합물이다. 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 효소에는 하이드록실라아제 효소가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 하이드록실라아제 효소는 표적 기질 잔기를 수산화시키며, 예로써 프롤릴, 리실, 아스파라기닐(아스파라길, 아스파르틸) 하이드록실라아제 등이 포함된다. 하이드록실라아제는 때때로, 표적 기질, 예를 들면, HIF 하이드록실라아제, 프로콜라겐 하이드록실라아제 등, 기질 내에서 표적된 잔기, 예를 들면, 프롤릴 하이드록실라아제, 리실 하이드록실라아제 등, 또는 둘 모두, 예를 들면, HIF 프롤릴 하이드록실라아제, 프로콜라겐 프롤릴 하이드록실라아제 등으로 기술된다. 대표적인 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 효소에는 HIF 하이드록실라아제, 예를 들면, HIF 프롤릴 하이드록실라아제(가령, EGLN1, EGLN2, EGLN3), HIF 아스파라기닐 하이드록실라아제(가령, 인자 저해 HIF(FIH)) 등; 프로콜라겐 하이드록실라아제, 예를 들면, 프로콜라겐 리실 하이드록실라아제, 프로콜라겐 프롤릴 하이드록실라아제(가령, 프로콜라겐 프롤릴 3-하이드록실라아제, 프로콜라겐 프롤릴 4-하이드록실라아제 α(I)과 α(II)) 등; 티민 7-하이드록실라아제; 아스파르틸(아스파라기닐)β-하이드록실라아제; ε-N-트리메틸리신 하이드록실라아제; γ-부티로베타인 하이드록실라아제 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 효소 활성에 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제와 연관된 임의의 활성이 포함될 수 있긴 하지만, 기질 내에서 아미노산 잔기의 수산화가 특정하게 고려된다. 기질 내에서 프롤린 및/또는 아스파라긴 잔기의 수산화가 특정하게 포함되긴 하지만, 다른 아미노산의 수산화 역시 고려된다.

한 측면에서, 하나이상의 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 효소에 저해 활성을 보이는 본 발명의 화합물은 하나이상의 다른 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 효소에도 저해 활성을 보인다, 예를 들면, HIF 하이드록실라아제의 활성을 저해하는 화합물은 콜라겐 프롤릴 하이드록실라아제의 활성을 추가적으로 저해하고, HIF 프롤릴 하이드록실라아제의 활성을 저해하는 화합물은 HIF 아스파라기닐 하이드록실라아제 등의 활성을 추가적으로 저해한다.

산소와 Fe²⁺를 요구하는 반응인 프롤린 수소화에 의해 HIFα가 변형되기 때문에, 본 발명의 한 측면에서, HIFα 수소화를 주도하는 효소는 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 계통의 구성원이다. 이런 효소에는 프로콜라겐 리실 하이드록실라아제, 프로콜라겐 프롤릴 3-하이드록실라아제, 프로콜라겐 프롤릴 4-하이드록실라아제 α(I)과 α(II), 티민 7- 하이드록실라아제, 아스파르틸(아스파라기닐)β-하이드록실라아제, ε-N-트리메틸리신 하이드록실라아제, γ-부티로베타인 하이드록실라아제 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이들 효소는 하이드록실라아제 활성을 위하여 산소, Fe²⁺, 2-옥소글루타레이트, 아스코르브산을 요구한다(참조: Majamaa et al.(1985) Biochem J 229:127-133; Myllyharju end Kivirikko(1997) EMBO J 16:1173-1180; Thornburg et al.(1993) 32:14023 14033; Jia et al.(1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:7227-7231).

한 측면에서, 본 발명의 화합물은 HIFα를 안정시키는 화합물이다. 적절하게는, 상기 화합물은 HIF 하이드록실라아제 활성의 저해를 통하여 HIFα를 안정시킨다. 따라서, 본 발명의 화합물은 하이드록실라아제 활성의 앞서 확인된 조절물질로부터 선택된다. 가령, 프롤릴 4-하이드록실라아제의 소형 분자 저해물질이 확인되었다(참조: Majamaa et al.(1984) Eur t J Biochem 138:239-245; Majamaa et al.(1985) Biochem J 229:127-133; Kivirikko and Myllyharju(1998) Matrix Biol 16:357-368; Bickel et al.(1998) Hepatology 28:404411; Friedman et al.(2000) Proc Natl Acad Sci USA 97:47364741; Franklin et al.(2001): Biochem J 353:333-338). 본 발명은 본원에 제시된 방법에서 이들 화합물의 이용을 고려한다.

일부 측면에서, 본 발명의 화합물에는 예로써 2-옥소글루타레이트의 구조적 모방체가 포함된다. 이들 화합물은 2-옥소글루타레이트와 경쟁적으로, 철과 비경쟁적으로 표적 2-옥소글루타레이트 디옥시게나아제 효소 계통 구성원을 저해한다(Majamaa et al.(1984) Eur J Biochem 138:239-245; Majamaa et al. Biochem J 229:127-133).

특정 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 화합물은 화학식 I 화합물, 생리학적 활성 염, 이로부터 유래된 프로드러그에서 선택된다:

A는 1-2개의 할로겐, 시아노, 니트로, 트리플루오르메틸, (C₁-C₆)-알킬, (C₁-C₆)-하이드록시알킬, (C₁-C₆)-알콕시, -O-[CH₂]_x-C_fH_(2f+1-g)Hal_g, (C₁-C₆)-플루오르알콕시, (C₁-C₈)-플루오르알케닐옥시, (C₁-C₈)-플루오르알키닐옥시, -OCF₂Cl, -O-CF₂-CHFCl, (C₁-C₆)-알킬멀캡토, (C₁-C₆)-알킬설피닐, (C₁-C₆)-알킬설포닐, (C₁-C₆)-알킬카르보닐, (C₁-C₆)-알콕시카르보닐, 카바모일, N-(C₁-C₄)-알킬카바모일, N,N-디-(C₁-C₄)-알킬카바모일, (C₁-C₆)-알킬카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알킬, 페닐, 벤질, 페녹시, 벤질옥시, 아닐리노, N-메틸아닐리노, 페닐멀캡토, 페닐설포닐, 페닐설피닐, 설파모일, N-(C₁-C₄)-알킬설파모일, 또는 N,N-디-(C₁-C₄)-알킬설파모일에 의해 선택적으로 치환되거나, 또는 할로겐, 시아노, 니트로, 트리플루오르메틸, (C₁-C₆)-알킬, (C₁-C₆)-알콕시, -O-[CH₂]_x-C_fH_(2f+1-g)Hal_g, -OCF₂Cl, -O-CF₂-CHFCl, (C₁-C₆)-알킬멀캡토, (C₁-C₆)-알킬설피닐, (C₁-C₆)-알킬설포닐, (C₁-C₆)-알킬카르보닐, (C₁-C₆)-알콕시카르보닐, 카바모일, N-(C₁-C₄)-알킬카바모일, N,N-디-(C₁-C₄)-알킬카바모일, (C₁-C₆)-알킬카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알킬, 설파모일, N-(C₁-C₄)-알킬설파모일, 또는 N,N-디-(C₁-C₄)-알킬설파모일에서 선택되는 1-5개의 동일하거나 상이한 치환기를 아릴 부분에 보유하는 치환된 (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₁)-아르알킬옥시, (C₆-C₁₂)-아릴, 또는 (C₇-C₁₁)-아르알킬 라디칼에 의해 선택적으로 치환되는 1,2-아릴리덴, 1,3-아릴리덴, 1,4-아릴리덴, 또는 (C₁-C₄)-알킬렌이고; 대안으로,

A는 -CR⁵R⁶이고, R⁵와 R⁶은 서로 독립적으로, 수소, (C₁-C₆)-알킬, (C₃-C₇)-사이클로알킬, 아릴, 또는 α-아미노산의 α-탄소 원자의 치환기에서 선택되고, 여기서, 아미노산은 고유 L-아미노산 또는 이의 D-이성체이고,

B는 -CO₂H, -NH₂, -NHSO₂CF₃, 테트라졸릴, 이미다졸릴, 3-하이드록시이속사졸릴, CONHCOR"', -CONHSOR"', 또는 CONHSO₂R"'이고, 여기서 R"'은 (C₆-C₁₂)-아릴, 헤테로아릴, OH, SH, (C₁-C₄)-알킬, (C₁-C₄)-알콕시, (C₁-C₄)-티오알킬, (C₁-C₄)-설피닐, (C₁-C₄)-설포닐, CF₃, Cl, Br, F. I, NO₂, -COOH, (C₂-C₅)-알콕시카르보닐, NH₂, 모노-(C₁-C₄-알킬)-아미노, 디-(C₁-C₄-알킬)-아미노, 또는 (C₁-C₄)-퍼플루오르알킬에 의해 선택적으로 단일 치환된 아릴, 헤테로아릴, (C₃-C₇)-사이클로알킬, 또는 (C₁-C₄)-알킬이고; 대안으로,

B는 CO₂-G 카르복시 라디칼이고, 여기서 G는 알코올 G-OH의 라디칼이고, (C₁-C₂₀)-알킬 라디칼, (C₃-C₈)-사이클로알킬 라디칼, (C₂-C₂₀)-알케닐 라디칼, (C₃-C₈)-사이클로알케닐 라디칼, 레티닐 라디칼, (C₂-C₂₀)-알키닐 라디칼, (C₄-C₂₀)-알케니닐 라디칼(상기 알케닐, 사이클로알케닐, 알키닐과 알케니닐 라디칼은 하나이상의 복수 결합을 보유한다), (C₆-C₁₆)-카르보사이클릭 아릴 라디칼, (C₇-C₁₆)-카르보사이클릭 아르알킬 라디칼, 헤테로아릴 라디칼, 또는 헤테로아르알킬 라디칼(상기 헤테로아릴 라디칼 또는 헤테로아르알킬 라디칼의 헤테로아릴 부분은 5-6개 고리 원자를 보유한다)에서 선택되며; G에서 정의된 라디칼은 하나이상의 하이드록실, 할로겐, 시아노, 트리플루오르메틸, 니트로, 카르복실, (C₁-C₁₂)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬, (C₅-C₈)-사이클로알케닐, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₆)-아르알킬, (C₂-C₁₂)-알케닐, (C₂-C₁₂)-알키닐, (C₁-C₁₂)-알콕시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알킬, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시, (C₁-C₈)-하이드록시알킬, -O-[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g, -OCF₂Cl, -O-CF₂-CHFCl, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐, 신나모일, (C₂-C₁₂)-알케닐카르보닐, (C₂-C₁₂)-알키닐카르보닐, (C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴옥시카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알콕시카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알콕시카르보닐, (C₂-C₁₂)-알케닐옥시카르보닐, (C₂-C₁₂)-알키닐옥시카르보닐, 아실옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐옥시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시카르보닐옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알콕시카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알케닐옥시카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알키닐옥시카르보닐옥시, 카바모일, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N,N-디(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일, N-(C₆-C₁₆)-아릴카바모일, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₆-C₁₆)-아릴카바모일, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일, N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)알킬)-카바모일, N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₆-C₁₆)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, 카바모일옥시, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일옥시, N,N-디-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일옥시, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일옥시, N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일옥시, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일옥시, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일옥시, N-((C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, 아미노, (C₁-C₁₂)-알킬아미노, 디-(C₁-C₁₂)-알킬아미노, (C₃-C₈)-사이클로알킬아미노, (C₂-C₁₂)-알케닐아미노, (C₂-C₁₂)-알키닐아미노, N-(C₆-C₁₂)-아릴아미노, N-(C₇-C₁₁)-아르알킬아미노, N-알킬-아르알킬아미노, N-알킬-아릴아미노, (C₁-C₁₂)-알콕시아미노, (C₁-C₁₂)-알콕시-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐아미노, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐아미노, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐아미노, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐아미노, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐-N-(C₁-C_1O)-알킬아미노, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐-N-(C₁-C₁₀)알킬아미노, (C₇-C₁₁)-아르알킬카르보닐-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐아미노-(C₁-C₈)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐아미노-(C₁-C₈)알킬, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐아미노-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₂)-아르알킬카르보닐아미노(C₁-C₈)-알킬, 아미노-(C₁-C_1O)-알킬, N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, N,N-디-(C₁-C_1O)-알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, (C₃-C₈)사이클로알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, (C₁-C₁₂)-알킬멀캡토, (C₁-C₁₂)-알킬설피닐, (C₁-C₁₂)-알킬설포닐, (C₆-C₁₆)-아릴멀캡토, (C₆-C₁₆)-아릴설피닐, (C₆-C₁₂)-아릴설포닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬멀캡토, (C₇-C₁₆)-아르알킬설피닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬설포닐, 설파모일, N-(C₁-C_1O)-알킬설파모일, N,N-디(C₁-C_1O)-알킬설파모일, (C₃-C₈)-사이클로알킬설파모일, N-(C₆-C₁₂)-알킬설파모일, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬설파모일, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₆-C₁₂)-아릴설파모일, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬설파모일, (C₁-C_1O)-알킬설폰아미도, N-((C₁-C_1O)-알킬)-(C₁-C_1O)-알킬설폰아미도, (C₇-C₁₆)-아르알킬설폰아미도, 또는 N-((C₁-C_1O)-알킬-(C₇-C₁₆)-아르알킬설폰아미도이고; 아릴이거나 또는 아릴 부분을 보유하는 라디칼은 1-5개의 동일하거나 상이한 하이드록실, 할로겐, 시아노, 트리플루오르메틸, 니트로, 카르복실, (C₁-C₁₂)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₆)-아르알킬, (C₁-C₁₂)-알콕시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알킬, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시, (C₁-C₈)-하이드록시알킬, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐, (C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴옥시카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알콕시카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알콕시카르보닐, (C₂-C₁₂)-알케닐옥시카르보닐, (C₂-C₁₂)-알키닐옥시카르보닐, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐옥시, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐옥시, 신나모일옥시, (C₂-C₁₂)-알케닐카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알키닐카르보닐옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐옥시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시카르보닐옥시, (C₇-C₁₆)-아르아킬옥시카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알콕시카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알케닐옥시카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알키닐옥시카르보닐옥시, 카바모일, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N,N-디(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일, N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일, N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)알킬)-카바모일, N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, 카바모일옥시, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일옥시, N,N-디-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일옥시, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일옥시, N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일옥시, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일옥시, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일옥시, N-((C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, 아미노, (C₁-C₁₂)-알킬아미노, 디-(C₁-C₁₂)-알킬아미노, (C₃-C₈)-사이클로알킬아미노, (C₃-C₁₂)-알케닐아미노, (C₃-C₁₂)-알키닐아미노, N-(C₆-C₁₂)-아릴아미노, N-(C₇-C₁₁)-아르알킬아미노, N-알킬-아르알킬아미노, N-알킬-아릴아미노, (C₁-C₁₂)-알콕시아미노, (C₁-C₁₂)-알콕시-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐아미노, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐아미노, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐아미노, (C₇-C₁₆)-알킬카르보닐아미노, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐-N-(C₁-C_1O)-알킬아미노, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐-N-(C₁-C₁₀)알킬아미노, (C₇-C₁₁)-아르알킬카르보닐-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐아미노-(C₁-C₈)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐아미노-(C₁-C₈)알킬, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐아미노-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐아미노(C₁-C₈)-알킬, 아미노-(C₁-C_1O)-알킬, N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, N,N-디-(C₁-C_1O)-알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, (C₃-C₈)사이클로알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, (C₁-C₁₂)-알킬멀캡토, (C₁-C₁₂)-알킬설피닐, (C₁-C₁₂)-알킬설포닐, (C₆-C₁₂)-아릴멀캡토, (C₆-C₁₂)-아릴설피닐, (C₆-C₁₂)-아릴설포닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬멀캡토, (C₇-C₁₆)-아르알킬설피닐, 또는 (C₇-C₁₆)-아르알킬설포닐에 의해 아릴에서 치환되고;

X는 O 또는 S이고;

Q는 O, S, NR' 또는 단일 결합이고,

여기서, Q가 단일 결합이면, R⁴는 할로겐, 니트릴 또는 트리플루오르메틸이고; 또는 Q가 O, S 또는 NR'이면, R⁴는 수소, (C₁-C₁₀)-알킬 라디칼, (C₂-C₁₀)-알케닐 라디칼, 또는 (C₂-C₁₀)-알키닐 라디칼이고, 이때 알케닐 또는 알키닐 라디칼은 1-2개의 C-C 복수 결합, 화학식 -[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g의 치환되지 않은 플루오르알킬 라디칼, (C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬 라디칼, (C₁-C₆)-알콕시-(C₁-C₄)-알콕시-(C₁-C₄)-알킬 라디칼, 아릴 라디칼, 헤테로아릴 라디칼, (C₇-C₁₁)-아르알킬 라디칼, 또는 화학식 Z(-[CH₂]v-[O]w-[CH₂]t-E)의 라디칼을 보유하고,

E는 헤테로아릴 라디칼, (C₃-C₈)-사이클로알킬 라디칼, 또는 화학식 F의 페닐 라디칼이고:

v는 0-6이고,

w는 O 또는 1이고,

t은 O-3이고,

R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰과 R¹¹은 동일하거나 상이하고, 수소, 할로겐, 시아노, 니트로, 트리플루오르메틸, (C₁-C₆)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬, (C₁-C₆)-알콕시, -O-[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g, -OCF₂Cl, -O-CF₂-CHFCl, (C₁-C₆)-알킬멀캡토, (C₁-C₆)-하이드록시알킬, (C₁-C₆)-알콕시-(C₁-C₆)-알콕시, (C₁-C₆)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, (C₁-C₆)-알킬설피닐, (C₁-C₆)-알킬설포닐, (C₁-C₆)-알킬카르보닐, (C₁-C₈)-알콕시카르보닐, 카바모일, N-(C₁-C₈)-알킬카바모일, N,N-디-(C₁-C₈)-알킬카바모일, 또는 불소, 염소, 브롬, 트리플루오르메틸, (C₁-C₆)-알콕시, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₄)-알킬카바모일, (C₁-C₆)-알킬카르보닐옥시, 페닐, 벤질, 페녹시, 벤질옥시, NR^YR^Z(R^Y와 R^Z는 수소, (C₁-C₁₂)-알킬, (C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₂)-아르알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₈)-알킬, (C₃-C_1O)-사이클로알킬, (C₃-C₁₂)-알케닐, (C₃-C₁₂)-알키닐, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₁)-아르알킬, (C₁-C₁₂)-알콕시, (C₇-C₁₂)아르알콕시, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐, (C₆-C₂)-아릴카르보닐, 또는 (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐에서 독립적으로 선택되고; 대안으로 R^Y와 R^Z는 서로 결합하여 -[CH₂]h이고, 여기서 CH₂ 기는 0, S, N-(C₁-C₄)-알킬카르보닐이미노, 또는 N-(C₁-C₄)-알콕시카르보닐이미노에 의해 치환될 수 있다), 페닐멀캡토, 페닐설포닐, 페닐설피닐, 설파모일, N-(C₁-C₈)-알킬설파모일, 또는 N,N-디-(C₁-C₈)-알킬설파모일로 선택적으로 치환된 (C₇-C₁₁)-아르알킬카바모일이고; 대안으로,

R⁷과 R⁸, R⁸과 R⁹, R⁹와 R¹⁰, 또는 R¹⁰과 R¹¹은 서로 결합하여 -[CH₂]n- 또는 -CH=CH-CH=CH-에서 선택되는 사슬이고, 상기 사슬의 CH₂ 기는 0, S, SO, SO₂, 또는 NR^Y로 선택적으로 치환되고; n은 3, 4 또는 5이고; E가 헤테로아릴 라디칼이면 상기 라디칼은 R⁷-R¹¹에서 정의된 치환기에서 선택되는 1-3개의 치환기를 보유할 수 있고, E가 사이클로알킬 라디칼이면 상기 라디칼은 R⁷-R¹¹에서 정의된 치환기에서 선택되는 1개의 치환기를 보유할 수 있으며; 또는

Q가 NR'이면, R⁴는 택일적으로 R"이고, 여기서 R'과 R"는 동일하거나 상이하고, 수소, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₁)-아르알킬, (C₁-C₈)-알킬, (C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₂)-아르알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₈)-알킬, (C₁-C_1O)-알킬카르보닐, 선택적으로 치환된 (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐, 또는 선택적으로 치환된 (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐이며; 대안으로, R'과 R"는 서로 결합하여 -[CH₂]h-이고, 여기서 CH₂ 기는 0, S, N-아실이미노, 또는 N-(C₁-C₁₀)-알콕시카르보닐이미노로 치환될 수 있고, h는 3 내지 7이고;

Y는 N 또는 CR³이고;

R¹, R²와 R³은 동일하거나 상이하고, 수소, 하이드록실, 할로겐, 시아노, 트리플루오르메틸, 니트로, 카르복실, (C₁-C₂₀)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₁₂)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알콕시, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₁₂)-알콕시, (C₃-C₈)-사이클로알킬옥시-(C₁-C₁₂)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬시-(C₁-C₁₂)-알콕시, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₈)-알킬-(C₁-C₆)-알콕시, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬옥시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알콕시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알콕시, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₆)-아르알킬, (C₇-C₁₆)-아르알케닐, (C₇-C₁₆)-아르알키닐, (C₂-C₂₀)-알케닐, (C₂-C₂₀)-알키닐, (C₁-C₂₀)-알콕시, (C₂-C₂₀)-알케닐옥시, (C₂-C₂₀)-알키닐옥시, 레티닐옥시, (C₁-C₂₀)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알킬, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₈)-알콕시, (C₇-C₁₆)-아르알콕시-(C₁-C₆)-알콕시, (C₁-C₁₆)-하이드록시알킬, (C₆-C₁₆)-아릴옥시-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₈)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, (C₇-C₁₂)-아르알킬옥시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, (C₂-C₂₀)-알케닐옥시-(C₁-C₆)-알킬, (C₂-C₂₀)-알키닐옥시-(C₁-C₆)-알킬, 레티닐옥시-(C₁-C₆)-알킬, -O-[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g, -OCF₂Cl, -O-CF₂-CHFCl, (C₁-C₂₀)-알킬카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐, 신나모일, (C₂-C₂₀)-알케닐카르보닐, (C₂-C₂₀)-알키닐카르보닐, (C₁-C₂₀)-알콕시카르보닐, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴옥시카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알콕시카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알콕시카르보닐, (C₂-C₂₀)-알케닐옥시카르보닐, 레티닐옥시카르보닐, (C₂-C₂₀)-알키닐옥시카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₆)-알콕시카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알콕시-(C₁-C₆)-알콕시카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₆)-알콕시카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알콕시-(C₁-C₆)-알콕시카르보닐, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐옥시, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐옥시, 신나모일옥시, (C₂-C₁₂)-알케닐카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알키닐카르보닐옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐옥시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시카르보닐옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알콕시카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알케닐옥시카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알키닐옥시카르보닐옥시, 카바모일, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N,N-디(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일, N,N-디사이클로-(C₃-C₈)-알킬카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일, N-((C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₆)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₆)-알킬-N-((C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₆)-알킬)-카바모일, N-(+)-디하이드로아비에틸카바모일, N-(C₁-C₆)-알킬-N-(+)-디하이드로아비에틸카바모일, N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₆-C₁₆)-아릴카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일, N-((C₁-C₁₈)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-((C₆-C₁₆)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, CON(CH₂)h(CH₂ 기는 O, S, N-(C₁-C₈)-알킬이미노, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬이미노, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₄)-알킬이미노, N-(C₆-C₁₂)-아릴이미노, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬이미노, 또는 N-(C₁-C₄)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬이미노로 대체될 수 있고, h는 3 내지 7이다), 화학식 R의 카바모일 라디칼:

R^x와 R^v는 각각 독립적으로 수소, (C₁-C₆)-알킬, (C₃-C₇)-사이클로알킬, 아릴, 또는 L-과 D-아미노산이 속하는 α-아미노산의 α-탄소의 치환기에서 선택되고,
s는 1-5이고,
T는 OH 또는 NR^*R^**이고, R^*, R^**와 R^***은 동일하거나 상이하고, 수소, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₁)-아르알킬, (C₁-C₈)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬, (+)-디하이드로아비에틸, (C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₂)-아르알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₈)-알킬, (C₁-C₁₀)-알카노일, 선택적으로 치환된 (C₇-C₁₆)-아르알카노일, 또는 선택적으로 치환된 (C₆-C₁₂)-아로일에서 선택되며; 대안으로,

R^*과 R^**는 서로 결합하여 [CH₂]h이고, 상기 CH₂ 기는 O, S, SO, SO₂, N-아실아미노, N-(C₁-C₁₀)-알콕시카르보닐이미노, N-(C₁-C₈)-알킬이미노, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬이미노, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₄)-알킬이미노, N-(C₆-C₁₂)-아릴이미노, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬이미노, 또는 N-(C₁-C₄)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬이미노로 대체될 수 있고, h는 3 내지 7이고;

카바모일옥시, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일옥시, N,N-디-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일옥시, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일옥시, N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일옥시, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일옥시, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일옥시, N-((C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, 아미노, (C₁-C₁₂)-알킬아미노, 디-(C₁-C₁₂)-알킬아미노, (C₃-C₈)-사이클로알킬아미노, (C₃-C₁₂)-알케닐아미노, (C₃-C₁₂)-알키닐아미노, N-(C₆-C₁₂)-아릴아미노, N-(C₇-C₁₁)-아르알킬아미노, N-알킬-아르알킬아미노, N-알킬-아릴아미노, (C₁-C₁₂)-알콕시아미노, (C₁-C₁₂)-알콕시-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₁-C₁₂)-알카노일아미노, (C₃-C₈)-사이클로알카노일아미노, (C₆-C₁₂)-아로일아미노, (C₇-C₁₆)-아르알카노일아미노, (C₁-C₁₂)-알카노일-N-(C₁-C_1O)-알킬아미노, (C₃-C₈)-사이클로알카노일-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₆-C₁₂)-아로일-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₇-C₁₁)-아르알카노일-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₁-C₁₂)-알카노일아미노-(C₁-C₈)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알카노일아미노-(C₁-C₈)알킬, (C₆-C₁₂)-아로일아미노-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₆)-아르알카노일아미노(C₁-C₈)-알킬, 아미노-(C₁-C_1O)-알킬, N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, N,N-디-(C₁-C_1O)-알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, (C₃-C₈)사이클로알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, (C₁-C₂₀)-알킬멀캡토, (C₁-C₂₀)-알킬설피닐, (C₁-C₂₀)-알킬설포닐, (C₆-C₁₂)-아릴멀캡토, (C₆-C₁₂)-아릴설피닐, (C₆-C₁₂)-아릴설포닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬멀캡토, (C₇-C₁₆)-아르알킬설피닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬설포닐, (C₁-C₁₂)-알킬멀캡토-(C₁-C₆)-알킬, (C₁-C₁₂)-알킬설피닐-(C₁-C₆)-알킬, (C₁-C₁₂)-알킬설포닐-(C₁-C₆)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴멀캡토-(C₁-C₆)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴설피닐-(C₁-C₆)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴설포닐-(C₁-C₆)-알킬, (C₇-C₁₆)-아르알킬멀캡토-(C₁-C₆)-알킬, (C₇-C₁₆)-아르알킬설피닐-(C₁-C₆)-알킬, (C₇-C₁₆)-아르알킬설포닐-(C₁-C₆)-알킬, 설파모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬설파모일, N,N-디-(C₁-C₁₀)-알킬설파모일, (C₃-C₈)-사이클로알킬설파모일, N-(C₆-C₁₂)-아릴설파모일, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬설파모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₆-C₁₂)-아릴설파모일, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬설파모일, (C₁-C₁₀)-알킬설폰아미도, N-((C₁-C₁₀)-알킬)-(C₁-C₁₀)-알킬설폰아미도, (C₇-C₁₆)-아르알킬설폰아미도, 또는 N-((C₁-C₁₀)-알킬-(C₇-C₁₆)-아르알킬설폰아미도에서 선택되며; 아릴 라디칼은 하이드록실, 할로겐, 시아노, 트리플루오르메틸, 니트로, 카르복실, (C₂-C₁₆)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₁₂)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알콕시, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₁₂)-알콕시, (C₃-C₈)-사이클로알킬옥시-(C₁-C₁₂)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬옥시-(C₁-C₁₂)-알콕시, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₈)-알킬-(C₁-C₆)-알콕시, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알킬옥시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알콕시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₈)-알콕시, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₆)-아르알킬, (C₂-C₁₆)-알케닐, (C₂-C₁₆)-알키닐, (C₁-C₁₆)-알콕시, (C₁-C₁₆)-알케닐옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알킬, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₆)-알콕시, (C₇-C₁₆)-아르알콕시-(C₁-C₆)-알콕시, (C₁-C₈)-하이드록시알킬, (C₆-C₁₆)-아릴옥시-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₆)-아르알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₆)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, (C₇-C₁₂)-아르알킬옥시-(C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬, -O-[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g, -OCF₂Cl, -O-CF₂-CHFCl, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐, (C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴옥시카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알콕시카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알콕시카르보닐, (C₂-C₁₂)-알케닐옥시카르보닐, (C₂-C₁₂)-알키닐옥시카르보닐, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₆)-알콕시카르보닐, (C₇-C₁₆)-아르알콕시-(C₁-C₆)-알콕시카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₆)-알콕시카르보닐, (C₃-C₈)-사이클로알콕시-(C₁-C₆)-알콕시카르보닐, (C₁-C₁₂)-알킬카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알킬카르보닐옥시, (C₆-C₁₂)-아릴카르보닐옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬카르보닐옥시, 신나모일옥시, (C₂-C₁₂)-알케닐카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알키닐카르보닐옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐옥시, (C₁-C₁₂)-알콕시-(C₁-C₁₂)-알콕시카르보닐옥시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시카르보닐옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시카르보닐옥시, (C₃-C₈)-사이클로알콕시카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알케닐옥시카르보닐옥시, (C₂-C₁₂)-알키닐옥시카르보닐옥시, 카바모일, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N,N-디(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일, N,N-디사이클로-(C₃-C₈)-알킬카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일, N-((C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₆)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₆)-알킬-N-((C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₆)-알킬)-카바모일, N-(+)-디하이드로아비에틸카바모일, N-(C₁-C₆)-알킬-N-(+)-디하이드로아비에틸카바모일, N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₆-C₁₆)-아릴카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일, N-((C₁-C₁₈)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-((C₆-C₁₆)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, CON(CH₂)h(CH₂ 기는 O, S, N-(C₁-C₈)-알킬이미노, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬이미노, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬-(C₁-C₄)-알킬이미노, N-(C₆-C₁₂)-아릴이미노, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬이미노, 또는 N-(C₁-C₄)-알콕시-(C₁-C₆)-알킬이미노로 대체될 수 있고, h는 3 내지 7이다); 카바모일옥시, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일옥시, N,N-디-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일옥시, N-(C₃-C₈)-사이클로알킬카바모일옥시, N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일옥시, N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일옥시, N-(C₁-C_1O)-알킬-N-(C₆-C₁₂)-아릴카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-(C₇-C₁₆)-아르알킬카바모일옥시, N-((C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₁-C₁₀)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, N-(C₁-C₁₀)-알킬-N-((C₇-C₁₆)-아르알킬옥시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일옥시, 아미노, (C₁-C₁₂)-알킬아미노, 디-(C₁-C₁₂)-알킬아미노, (C₃-C₈)-사이클로알킬아미노, (C₃-C₁₂)-알케닐아미노, (C₃-C₁₂)-알키닐아미노, N-(C₆-C₁₂)-아릴아미노, N-(C₇-C₁₁)-아르알킬아미노, N-알킬-아르알킬아미노, N-알킬-아릴아미노, (C₁-C₁₂)-알콕시아미노, (C₁-C₁₂)-알콕시-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₁-C₁₂)-알카노일아미노, (C₃-C₈)-사이클로알카노일아미노, (C₆-C₁₂)-아로일아미노, (C₇-C₁₆)-아르알카노일아미노, (C₁-C₁₂)-알카노일-N-(C₁-C_1O)-알킬아미노, (C₃-C₈)-사이클로알카노일-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₆-C₁₂)-아로일-N-(C₁-C₁₀)알킬아미노, (C₇-C₁₁)-아르알카노일-N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노, (C₁-C₁₂)-알카노일아미노-(C₁-C₈)-알킬, (C₃-C₈)-사이클로알카노일아미노-(C₁-C₈)알킬, (C₆-C₁₂)-아로일아미노-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₆)-아르알카노일아미노(C₁-C₈)-알킬, 아미노-(C₁-C_1O)-알킬, N-(C₁-C₁₀)-알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, N,N-디-(C₁-C_1O)-알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, (C₃-C₈)사이클로알킬아미노-(C₁-C_1O)-알킬, (C₁-C₁₂)-알킬멀캡토, (C₁-C₁₂)-알킬설피닐, (C₁-C₁₂)-알킬설포닐, (C₆-C₁₆)-아릴멀캡토, (C₆-C₁₆)-아릴설피닐, (C₆-C₁₆)-아릴설포닐, (C₇-C₁₆)-아르알킬멀캡토, (C₇-C₁₆)-아르알킬설피닐, 또는 (C₇-C₁₆)-아르알킬설포닐에서 선택되는 1 내지 5개의 치환기에 의해 치환되고; 대안으로,

R¹과 R², 또는 R²와 R³은 [CH₂]o 사슬을 형성하고, 이는 포화되거나 C=C 이중 결합에 의해 불포화되고, 여기서 1개 또는 2개의 CH₂ 기는 0, S, SO, SO₂, 또는 NR'로 선택적으로 치환되고, R'은 수소, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₁-C₈)-알킬, (C₁-C₈)-알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₇-C₁₂)-아르알콕시-(C₁-C₈)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴옥시-(C₁-C₈)-알킬, (C₁-C_1O)-알카노일, 선택적으로 치환된 (C₇-C₁₆)-아르알카노일, 또는 선택적으로 치환된 (C₆-C₁₂)-아로일이고, o는 3, 4 또는 5이고; 대안으로,

R¹과 R², 또는 R²와 R³은 그들을 보유하는 피리미딘 또는 피리다진과 결합하여 5,6,7,8-테트라하이드로이소퀴놀린 고리, 5,6,7,8-테트라하이드로퀴놀린 고리, 또는 5,6,7,8-테트라하이드로신놀린 고리를 형성하고; 대안으로,

R¹과 R², 또는 R²와 R³은 탄소환 또는 헤테로환 5- 또는 6-원 방향족 고리를 형성하고; 대안으로,

R¹과 R², 또는 R²와 R³은 그들을 보유하는 피리미딘 또는 피리다진과 결합하여 티에노피리딘, 푸라노피리딘, 피리도피리딘, 피리미디노피리딘, 이미다조피리딘, 티아졸로피리딘, 옥사졸로피리딘, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 또는 신놀린에서 선택되는 선택적으로 치환된 헤테로환 고리를 형성하고, 여기서 퀴놀린, 이소퀴놀린 또는 신놀린은 가급적 화학식 Ia, Ib, Ic를 충족시키고:

화학식 Ia, Ib, Ic

삭제

각 경우에 독립적으로 치환기 R¹² 내지 R²³은 R¹, R², R³과 동일한 의미를 갖고; 대안으로,

라디칼 R¹과 R²는 그들을 보유하는 피리딘과 결합하여 화학식 Id 화합물을 형성하고:

V는 S, O, 또는 NR^k이고, R^k는 수소, (C₁-C₆)-알킬, 아릴, 또는 벤질에서 선택되고; 아릴 라디칼은 앞서 정의된 바와 같은 1개 내지 5개의 치환기로 선택적으로 치환되고,

각 경우에 독립적으로 R²⁴, R²⁵, R²⁶, R²⁷은 R¹, R², R³과 동일한 의미를 갖고;
f는 1 내지 8이고;
g는 0 또는 1 내지 (2f+1)이고;
x는 0 내지 3이고;
h는 3 내지 7이다.

화학식 I에 따른 전형적인 화합물은 European Patent No. EP0650960과 EP0650961에서 기술한다. EP0650960과 EP0650961에 기술된 모든 화합물, 특히, 특 허청구범위와 작업 실시예에 기재된 화합물은 본원에 참고로서 포함된다. 화학식 I의 전형적인 화합물에는 [(3-하이드록시-피리딘-2-카르보닐)-아미노]-아세트산과 [(3-메톡시-피리딘-2-카르보닐)-아미노]-아세트산이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

부가적으로, 화학식 I에 따른 전형적인 화합물은 U.S. Patent No. 5,658,933에서 기술한다. U.S. Patent No. 5,658,933에 기술된 모든 화합물, 특히, 특허청구범위와 작업 실시예에 기재된 화합물은 본원에 참고로서 포함된다. 화학식 I의 전형적인 화합물에는 3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-(((헥사데실옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드 하이드로클로라이드, 3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-(((1-옥틸옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드, 3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-((헥실옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드, 3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-(((부틸옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드, 3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-(((2-노닐옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드 라셈체, 3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-(((헵틸옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드, 3-벤질옥시피리딘-2-카르복실산 N-(((옥틸옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드, 3-벤질옥시피리딘-2-카르복실산 N-(((부틸옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드, 5-(((3-(1-부틸옥시)-프로필)-아미노)-카르보닐)-3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-((벤질옥시카르보닐)-메틸)-아마이드, 5-(((3-(1-부틸옥시)-프로필)-아미노)-카르보닐)-3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-(((1-부틸옥시)-카르보닐)-메틸)-아마이드, 5-(((3-(라우릴옥시)-프로필)아미노)-카르보닐)-3-메톡시피리딘-2-카르복실산 N-(((벤질옥시) 카르보닐)-메틸)-아마이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

화학식 I에 따른 추가의 화합물은 U.S. Patent No. 5,620,995에 기술된 치환된 헤테로환 카르복사마이드; U.S. Patent No. 6,020,350에 기술된 3-하이드록시피리딘-2 카르복사미도에스테르; U.S. Patent No. 5,607,954에 기술된 설폰아미도카르보닐피리딘-2 카르복사마이드; U.S. Patent No. 5,610,172와 5,620,996에 기술된 설폰아미도카르보닐-피리딘-2 카르복사마이드와 설폰아미도카르보닐-피리딘-2-카르복사마이드이다. 이들 특허에 기술된 모든 화합물, 특히, 특허청구범위와 작업 실시예에 기재된 화합물은 본원에 참고로서 포함된다.

화학식 Ia에 따른 전형적인 화합물은 U.S. Patent No. 5,719,164와 5,726,305에서 기술한다. 이들 특허에 기술된 모든 화합물, 특히, 특허청구범위와 작업 실시예에 기재된 화합물은 본원에 참고로서 포함된다. 화학식 Ia의 전형적인 화합물에는 N-((3-하이드록시-6-이소프로폭시-퀴놀린-2-카르보닐)-아미노)-아세트산, N-((6-(1-부틸옥시)-3-하이드록시퀴놀린-2-일)-카르보닐)-글리신, [(3-하이드록시-6-트리플루오르메톡시-퀴놀린-2-카르보닐)-아미노]-아세트산, N-((6-클로로-3 하이드록시퀴놀린-2-일)-카르보닐)-글리신, N-((7-클로로-3-하이드록시퀴놀린-2-일)-카르보닐)-글리신, [(6-클로로-3-하이드록시-퀴놀린-2-카르보닐)-아미노-아세트산이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

화학식 Ib에 따른 전형적인 화합물은 U.S. Patent No. 6,093,730에서 기술한다. U.S. Patent No. 6,093,730에 기술된 모든 화합물, 특히, 특허청구범위와 작업 실시예에 기재된 화합물은 본원에 참고로서 포함된다. 화학식 Ib의 전형적인 화합물에는 N-((1-클로로-4-하이드록시-7-(2-프로필옥시) 이소퀴놀린-3-일)-카르보닐)- 글리신, N-((1-클로로-4-하이드록시-6-(2-프로필옥시) 이소퀴놀린-3-일)-카르보닐) 글리신, N-((1-클로로-4-하이드록시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노)-아세트산(화합물 A), N-((1-클로로-4-하이드록시-7-메톡시이소퀴놀린-3-일)-카르보닐)-글리신, N-((1-클로로-4-하이드록시-6-메톡시이소퀴놀린-3-일)-카르보닐)-글리신, N-((7-부틸옥시)-1-클로로-4-하이드록시이소퀴놀린-3-일)-카르보닐)-글리신, N-((6-벤질옥시-1-클로로-4-하이드록시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노)-아세트산, ((7-벤질옥시-1-클로로-4-하이드록시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노)-아세트산 메틸 에스테르, N-((7-벤질옥시-1-클로로-4-하이드록시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노)-아세트산, N-((8-클로로-4-하이드록시이소퀴놀린-3-일)-카르보닐)-글리신, N-((7-부톡시-4-하이드록시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노)-아세트산이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 화학식 I 관련 화합물에는 6-사이클로헥실-1-하이드록시-4-메틸-lH-피리딘-2-원, 7-(4-메틸-피페라진-1-일메틸)-5-페닐설파닐메틸-퀴놀린-8-올, 4-니트로-퀴놀린-8-올, 5-부톡시메틸-퀴놀린-8-올, [(4-하이드록시-7-페녹시-이소퀴놀린-3 카르보닐)-아미노]-아세트산(화합물 B), [(4-하이드록시-7-페닐설파닐-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노-아세트산(화합물 C)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 더 나아가, 본 발명은 예로써 위치 A와 B가 결합하여 헥사논산, 시아노메틸, 2-아미노에틸, 벤조산, 1H-벤조이미다졸-2-일메틸 등을 형성하는 추가의 전형적인 화합물을 제시한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 방법에 이용되는 화합물은 화학식 III 화합물 또는 이의 제약학적으로 수용가능한 염에서 선택된다:

a는 1 내지 4의 정수이고;

b는 O 내지 4의 정수이고;

c는 O 내지 4의 정수이고;

Z는 (C₃-C₁₀)-사이클로알킬, 하나이상의 Y¹로 독립적으로 치환된 (C₃-C₁₀)-사이클로알킬, 3-10원 헤테로사이클로알킬, 하나이상의 Y¹로 독립적으로 치환된 3-10원 헤테로사이클로알킬, (C₅-C₂₀) 아릴, 하나이상의 Y¹로 독립적으로 치환된 (C₅-C₂₀) 아릴에서 선택되고, 5-20원 헤테로아릴, 하나이상의 Y¹로 독립적으로 치환된 5-20원 헤테로아릴에서 선택되고;

Ar¹은 (C₅-C₂₀) 아릴, 하나이상의 Y²로 독립적으로 치환된 (C₅-C₂₀) 아릴에서 선택되고, 5-20원 헤테로아릴, 하나이상의 Y²로 독립적으로 치환된 5-20원 헤테로아릴에서 선택되고;

각 Y¹은 지질친화성 기능기, (C₅-C₂₀) 아릴, (C₆-C₂₆) 알크아릴, 5-20원 헤테로아릴, 6-26원 알크-헤테로아릴에서 독립적으로 선택되고;

각 Y²는 R', -OR', -OR", -SR', -SR", NR'R', -NO₂, -CN, -할로겐, -트리할로메틸, 트리할로메톡시, -C(0)R', -C(0)0R', -C(0)NR'R', -C(0)NR'OR', -C(NR'R')=NOR', -NR'-C(0)R', -SO₂R', -SO₂R", -NR'-SO₂-R', NR'-C(0)-NR'R', 테트라졸-5-일, -NR'-C(0)-OR', -C(NR'R')=NR', -S(0)R', -S(0)-R", NR'-C(S)-NR'R'에서 독립적으로 선택되고;

각 R'은 -H, (C₁-C₈) 알킬, (C₂-C₈) 알케닐, (C₂-C₃) 알키닐에서 독립적으로 선택되고;

각 R"은 (C₅-C₂₀) 아릴 및 하나이상의 -OR', -SR', -NR'R', -NO₂, -CN, 할로겐 또는 트리할로메틸기로 독립적으로 치환된 (C₅-C₂₀) 아릴에서 독립적으로 선택되고; 대안으로,

c가 O이고, Ar이 N' 치환된 우레아-아릴이면, 화합물은 화학식 IIIa 화합물 또는 이의 제약학적으로 수용가능한 염이다:

a, b, Z는 상기한 바와 동일하고;

R³⁵와 R³⁶은 각각 독립적으로, 수소, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알케닐, (C₂-C₈)알키닐, (C₃-C₁₀)사이클로알킬, (C₅-C₂₀)아릴, (C₅-C₂₀)치환된 아릴, (C₆-C₂₆) 알크아릴, (C₆-C₂₆) 치환된 알크아릴, 5-20원 헤테로아릴, 5-20원 치환된 헤테로아릴, 6-26원 알크-헤테로아릴, 6-26원 치환된 알크 헤테로아릴에서 선택되고;

R³⁷은 수소, (C₁-C₈) 알킬, (C₂-C₈) 알케닐, (C₂-C₈) 알키닐에서 독립적으로 선택된다.

화학식 III의 전형적인 화합물은 International Publication No. WO 00/50390에서 기술한다. WO 00/50390에 기술된 모든 화합물, 특히, 특허청구범위와 작업 실시예에 기재된 화합물은 본원에 참고로서 포함된다. 화학식 III의 전형적인 화합물에는 3-[4-(3,3-디벤질-우레이도)-벤젠설포닐]-2-(4-메톡시-페닐)-에틸-아미노-N-하이드록시-프리피온아마이드(화합물 D), 3-4-[3-(4-클로로-페닐)-우레이도]-벤젠설포닐-[2-(4-메톡시-페닐)-에틸]-아미노-N-하이드록시-프리피온아마이드, 3-4-[3-(1,2-디페닐-에틸)-우레이도]-벤젠설포닐-[2-(4-메톡시-페닐)-에틸]-아미노-N-하이드록시-프리피온아마이드 등이 포함된다.

본 발명의 화합물을 확인하는 방법 역시 제시한다. 특정 측면에서, 본 발명의 화합물은 HIFα를 안정시키는 화합물이다. HIFα를 안정시키거나 활성화시키는 화합물의 능력은 예로써, 샘플에서 HIFα의 직접 측정, von Hippel Lindau 단백질( 참조: International Publication No. WO 00/69908)과 연관된 HIFα 감소를 측정하는 HIFα의 간접 측정, 또는 HIF 반응성 표적 유전자 또는 리포터 구조체의 활성화(참조: U.S. Patent No. 5,942,434)로 측정할 수 있다. 화합물의 존부하에 HIF 및/또는 HIF-반응성 표적 단백질의 수준을 측정하고 비교하여 HIFα를 안정시키거나 HIF를 활성화시키는 화합물을 확인한다.

다른 측면에서, 본 발명의 화합물은 HIF 하이드록실라아제 활성을 저해하는 화합물이다. 하이드록실라아제 활성에 대한 검사는 당분야에서 표준이다. 이런 검사는 하이드록실라아제 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 측정할 수 있다. 가령, 효소 기질, 예를 들면, 표적 단백질, 합성 펩티드 모방체, 또는 이들의 단편에 존재하는 수산화된 잔기, 예를 들면, 프롤린, 아스파라긴 등을 측정할 수 있다(참조: Palmerini et al.(1985) J Chromatogr 339:285-292). 화합물의 존재하에 수산화된 잔기, 예를 들면, 프롤린 또는 아스파라긴의 감소는 하이드록실라아제 활성을 저해하는 화합물을 지시한다. 대안으로, 수산화 반응의 다른 산물, 예를 들면, 2-옥소글루타레이트로부터 숙시네이트의 형성을 측정할 수 있다(참조: Cunliffe et al.(1986) Biochem J 240:617-619). Kaule and Gunzler, 1990, Anal Biochem 184:291-297에서는 2-옥소글루타레이트로부터 숙시네이트의 형성을 측정하는 전형적인 절차를 기술한다.

앞서 기술된 바와 같은 절차는 HIF 하이드록실라아제 활성을 조절하는 화합물을 확인하는데 이용될 수 있다. 표적 단백질에는 HIFα 또는 이의 단편, 예를 들면, H1F(556-575)가 포함된다. 효소에는 예로써 임의의 공급원으로부터 획득된 HIF 프롤릴 하이드록실라아제(참조: GenBank Accession No. AAG33965 등) 또는 HIF 아스파라기닐 하이드록실라아제(참조: GenBank Accession No. AAL27308 등)가 포함된다. 효소는 가공되지 않은 세포 용해질 또는 부분적으로 정제된 형태에 존재할 수도 있다. 가령, HIF 하이드록실라아제 활성을 측정하는 절차는 Ivan et al.(2001, Science 292:464-468; 2002, Proc Natl Acad Sci USA 99:13459-13464)과 Hirsila et al.(2003, J Biol Chem 278:30772-30780)에서 기술한다; 추가의 방법은 International Publication No. WO 03/049686에서 기술한다. 화합물의 존부하에 효소 활성을 측정하고 비교하여 HIFα의 수산화를 저해하는 화합물을 확인한다.

본 발명의 화합물은 강화된 조혈, 강화된 철 대사, 또는 예로써 기능성 철 결핍증, 만성 질환 빈혈증, 철 결핍증, 소적혈구증 또는 소적혈구성 빈혈증을 비롯한 철 결핍을 수반하는 상태, 또는 염증, 감염, 면역결핍 또는 신생물 질환과 연관된 상태의 치료적 개선으로 입증된 바와 같이, 시험관내에서 또는 생체내에서 측정가능 효과를 유도한다.

측정가능 효과는 아래의 파라미터 중에서 임의의 한가지일 수 있다: 증가된 헤모글로빈, 헤마토크리트, 망상적혈구, 적혈구 수치, 혈장 EPO 등; 만성 피로, 창백, 현기증 등의 완화를 비롯한 관찰된 증상의 완화로 확인되는 개선된 철 대사; 또는 예로써 표준 혈구 수치 분석에서, 증가된 혈청 철 수준, 변화된 혈청 훼리틴 수준, 트랜스페린 포화 %, 전체 철 결합 능력, 개선된 망상적혈구 수치, 헤모글로빈, 헤마토크리트.

제약학적 조제 및 투여 경로

본 발명의 조성물은 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 직접적으로 또는 부형제를 함유하는 제약적 조성물에 담겨 전달될 수 있다. 본 발명의 치료 방법은 대사 장애, 특히, 글루코오스 조절과 연관된 질환, 예를 들면, 당뇨병, 고지혈증 등을 앓고 있거나 이런 질환의 위험이 있는 개체에 본 발명 화합물의 효과량을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 개체는 포유동물 개체, 가장 바람직한 구체예에서, 개체는 인간이다.

화합물 또는 약물의 효과량은 통상적인 실험으로 용이하게 결정할 수 있으며, 효과적이고 간편한 투여 경로와 조제 방법 역시 용이하게 결정할 수 있다. 다양한 조제 방법과 약물 전달 시스템이 당분야에서 이용가능하다(Gennaro, A. R., ed. (1990) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18'h ed., Mack Publishing Co.,Easton PA).

적당한 투여 경로에는 예로써, 경구, 직장, 국소, 비강, 폐, 안구, 장, 장관외 투여가 포함된다. 장관외 투여를 위한 일차 경로는 정맥내, 근육내, 피하 투여이다. 이차 투여 경로는 복강내, 동맥내, 관절내, 심장내, 뇌조내, 피내, 병소내, 안구내, 흉막강내, 수막강내, 자궁내, 심실내 투여이다. 약물의 물리적, 화학적, 생리학적 특성과 함께, 치료 징후는 국소 또는 전신 전달이 바람직한 지의 여부뿐만 아니라 이용되는 조제 유형과 투여 경로를 결정한다.

본 발명 화합물의 제약학적 약형(dosage form)은 순간 방출, 조절 방출, 지속 방출, 또는 표적 약물-전달 시스템에 담겨 제공된다. 통상적으로 이용되는 약형은 예로써, 용액과 현탁액, (마이크로)에멀젼, 연고, 겔과 패치, 리포솜, 정제, 당 의정, 연성과 경성 쉘 캡슐, 좌약, 소란, 이식물, 무정형이나 결정형 분말, 에어로졸, 냉동 건조된 제조물이다. 이용되는 투여 경로에 따라, 약물의 적용 또는 투여를 위하여 특수 장치, 예를 들면, 주사기와 바늘, 흡입기, 펌프, 주사 펜, 도포기 또는 특수 플라스크가 필요할 수도 있다. 제약학적 약형은 주로, 약물, 부형제, 용기/밀폐 시스템으로 구성된다. 불활성 성분인 한가지이상의 부형제는 약물의 제조, 안정성, 투여, 안정성을 개선하거나 용이하게 하기 위하여 본 발명의 화합물에 첨가될 수 있으며, 원하는 약물 방출 프로필을 달성하는 수단을 제공할 수 있다. 이런 이유로, 약물에 첨가되는 부형제의 유형은 다양한 인자, 예를 들면, 약물의 물리적, 화학적 특성, 투여 경로, 제조 절차 등에 좌우될 수 있다. 제약학적으로 수용가능한 부형제는 당분야에서 용이하게 입수가능하며, 다양한 약전에 기재되어 있다(참조: USP, JP, EP, BP, FDA web page(www.fda.gov), Inactive Ingredient Guide 1996, and Handbook of Pharmaceutical Additives, ed. Ash; Synapse Information Resources, Inc. 2002).

본 발명 화합물의 제약학적 약형은 당분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들면, 통상적인 혼합, 체로 거름, 분해, 용해, 과립화, 당의정-제조, 정제화, 현탁, 사출성형, 분무-건조, 분쇄, 유화, (나노/마이크로)캡슐화, 피포 또는 냉동 건조 과정으로 제조할 수 있다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 제약학적 용도의 조제물로 활성 분자의 가공을 용이하게 하는 한가지이상의 생리학적으로 수용가능한 불활성 성분을 함유할 수 있다.

적절한 조제는 원하는 투여 경로에 좌우된다. 정맥내 주사를 위하여, 조성물 은 필요한 경우에 생리학적으로 적합한 완충액, 예를 들면, 인산염, 히스티딘 또는 조제 pH 조정을 위한 구연산염 및 삼투조절제(tonicity agent), 예를 들면, 염화나트륨 또는 덱스트로스를 이용하여 수용액으로 조제된다. 경점막 또는 비강 투여를 위하여, 침투 강화제를 함유하는 반고체, 액체 조제물, 또는 패치가 바람직하다. 침투제는 당분야에 널리 공지되어 있다. 경구 투여를 위하여, 화합물은 액체 또는 고체 약형의 즉시 또는 조절/지속 방출 조제물로서 조제될 수 있다. 개체에 의한 경구 섭취에 적합한 약형은 정제, 알약, 당의정, 경성과 연성 쉘 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액, 에멀젼 등이다. 화합물은 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 통상적인 좌약 염기를 함유하는 직장 조성물, 예를 들면, 좌약 또는 유지 관장제로 조제될 수도 있다.

고체 경구 약형은 충전제, 붕해제, 결합제(건성 또는 습성), 용해 지연제, 윤활제, 유동화제, 항부착제, 양이온성 교환 수지, 습윤제, 항산화제, 보존제, 착색제, 향미료를 비롯한 윤활제를 이용하여 수득할 수 있다. 이들 부형제는 합성 공급원 또는 자연 공급원으로부터 획득할 수 있다. 이런 부형제의 실례는 셀룰로오스 유도체, 구연산, 이인산칼슘, 젤라틴, 탄산마그네슘, 마그네슘/소디움 라우릴 설페이트, 만니톨, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 실리케이트, 이산화규소, 나트륨 벤조에이트, 솔비톨, 전분, 스테아르산 또는 이의 염, 당(즉, 덱스트로스, 수크로오스, 락토오스 등), 활석, 트래거캔스 고무, 식물성 오일(수소처리됨), 왁스이다. 에탄올과 물은 과립 보조제로서 기능한다. 특정한 경우에, 예로써 미각 차폐(taste-masking) 필름, 위산 저항성 필름 또는 방출-지연 필름으로 정제의 코팅 이 바람직하다. 착색제, 당, 유기 용제 또는 물과 혼합된 천연과 합성 중합체가 정제를 코팅하여 당의정을 만드는데 주로 이용된다. 정제에 비하여 캡슐이 선호되는 경우에, 약물 분말, 현탁액 또는 이의 용액을 친화성 경성이나 연성 쉘 캡슐에 담아 전달할 수 있다.

한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 피부 패치, 반-고체 또는 액체 조제물, 예를 들면, 겔, (마이크로)에멀젼, 연고, 용액, (나노/마이크로)-현탁액 또는 거품을 통하여 국소적으로 투여될 수 있다. 약물의 피부와 피부 아래 조직으로의 침투는 예로써 침투 강화제의 이용; 물, 유기 용제, 왁스, 오일, 합성과 천연 중합체, 계면활성제, 유화제를 비롯한 친지성, 친수성, 양친화성 부형제의 적절한 선택과 조합; pH 조정; 복합체의 이용으로 조절할 수 있다. 다른 기술, 예를 들면, 이온영동(iontophoresis)을 이용하여 본 발명 화합물의 침투를 조절할 수도 있다. 예로써 전신 노출을 최소로 하는 국소 전달이 요구되는 상황에서는 경피 또는 국소 투여가 선호된다.

흡입 투여 또는 비강 투여를 위하여, 본 발명에 이용되는 화합물은 일반적으로 추진제, 예를 들면, 메탄과 에탄으로부터 유래된 할로겐화 탄소, 이산화탄소 또는 임의의 다른 적합한 가스의 이용으로 압력 팩 또는 흡입기로부터 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 반고체 에어로졸 형태로 간편하게 전달된다. 국소 에어로졸의 경우에, 부탄, 이소부탄, 펜탄과 같은 탄화수소가 유용하다. 압력 에어로졸의 경우에, 적절한 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공함으로써 결정된다. 가령, 흡입기 또는 취입기에 이용되는 젤라틴의 캡슐 또는 카트리지를 조제할 수 있다. 이들 은 전형적으로, 화합물과 적절한 분말 기부, 예를 들면, 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유한다.

주사에 의한 장관외 투여용으로 조제된 조성물은 일반적으로 무균이고, 단위 약형, 예를 들면, 앰플, 주사기, 주사기 펜, 또는 복수-투여 용기로 제공될 수 있는데, 후자는 일반적으로 보존제를 포함한다. 조성물은 현탁액, 용액, 또는 유성이나 수성 운반제에 녹인 에멀젼과 같은 형태를 취하고, 조제 약물, 예를 들면, 완충액, 삼투조절제, 점도 강화제, 계면활성제, 부유제와 분산제, 항산화제, 생체적합성 중합체, 킬레이트제, 보존제를 함유한다. 주사 부위에 따라, 운반제는 물, 합성이나 식물성 오일 및/또는 유기 보조-용제를 포함한다. 냉동 건조된 분말 또는 농축액과 같은 특정한 경우에, 장관외 조제물은 투여에 앞서 재구성되거나 희석된다. 본 발명 화합물의 조절 방출 또는 지속 방출을 제공하는 저장소 조제물(depot formulation)은 나노/마이크로 입자, 또는 나노/마이크로 또는 비-미세 결정의 주사가능 현탁액을 함유한다. 중합체, 예를 들면, 폴리(락트산), 폴리(글리콜산), 또는 이들의 공중합체는 당분야에 공지된 것들 이외에, 조절/지속 방출 매트릭스로서 기능할 수 있다. 다른 저장소 전달 시스템은 절개를 요하는 이식물과 펌프의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 분자의 정맥내 주사에 적합한 담체는 당분야에 널리 공지되어 있는데, 여기에는 이온화된 화합물을 형성하기 위한 염기, 예를 들면, 수산화나트륨, 삼투조절제로서 수크로오스 또는 염화나트륨을 함유하는 물-기초한 용액이 포함된다, 예를 들면, 완충액은 인산염 또는 히스티딘을 함유한다. 보조-용제, 예 를 들면, 폴리에틸렌 글리콜이 첨가될 수 있다. 이들 물-기초한 시스템은 본 발명의 화합물을 용해시키는데 효과적이고, 전신 투여 직후에 낮은 독성을 유발한다. 용액 시스템의 성분 비율은 용해도와 독성 특성을 파괴시키지 않으면서 폭넓게 변할 수 있다. 더 나아가, 이들 성분의 실체 역시 변할 수 있다. 가령, 낮은 독성 계면활성제, 예를 들면, 폴리소르베이트 또는 폴록사머뿐만 아니라 폴리에틸렌 글리콜 또는 다른 보조-용제가 이용될 수 있으며, 생체적합성 중합체, 예를 들면, 폴리비닐 피롤리돈이 첨가될 수 있고, 다른 당과 폴리올이 덱스트로스를 대체할 수 있다.

본 발명의 치료 방법에 유용한 조성물에서, 치료 효과량은 당분야에 공지된 다양한 기술을 이용하여 초기에 산정할 수 있다. 동물 연구에 이용된 최초량은 세포 배양 검사에서 확립된 효과 농도에 기초한다. 인간 개체에 적합한 용량 범위는 예로써 동물 연구와 세포 배양 검사에서 획득된 데이터를 이용하여 결정할 수 있다.

본 발명의 화합물, 작용제 또는 약물의 치료 효과량은 개체에서 증상의 완화 또는 생존의 영장을 결과하는 화합물, 작용제 또는 약물의 양을 지칭한다. 이들 분자의 독성 및 치료 효능은 세포 배양물 또는 실험 동물에서의 표준 제약 절차, 예를 들면, LD50(집단의 50%를 치사시키는 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량)을 측정함으로써 결정할 수 있다. 독성 효과 대 치료 효과의 용량 비율은 치료 지수이며, LD50/ED50의 비율로 표현될 수 있다. 치료 지수가 높은 작용제가 바람직하다.

치료 효과량은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에 의해 추구되는 조직, 신체, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응, 예를 들면, 글루코오스 대사의 조절, 상승되거나 증가된 혈당 수준의 감소, 변형된 글루코오스 대사와 연관된 질환, 예를 들면, 당뇨병의 치료 또는 예방 등을 유도하는 화합물 또는 제약학적 조성물의 양이다.

적절하게는, 용량은 독성이 전혀(거의) 없이 ED50을 포함하는 순환계 농도 범위에 속한다. 용량은 이용된 투여 형태 및 이용된 투여 경로에 따라서 상기 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 조제, 투여 경로, 투여량, 투여 간격은 환자 상태의 특이성에 따라 당분야에 공지된 방법으로 선택할 수 있다.

투여량 및 투여 간격은 개별적으로 조절하여 원하는 효과, 예를 들면, 글루코오스 대사의 조절, 혈당 수준의 감소 등을 달성할 만큼 충분한 활성 부분의 혈장 수준, 즉 최소 유효 농도(MEC)를 제공할 수 있다. MEC는 각 화합물마다 달라지긴 하지만, 예로써 시험관내 데이터와 동물 실험으로부터 예측할 수 있다. MEC 달성에 필요한 투여량은 개별 특성 및 투여 경로에 좌우된다. 국소 투여 또는 선택적 복용의 경우, 약물의 효과적인 국소 농도는 혈장 농도와 무관할 수도 있다.

투여되는 작용제 또는 조성물의 양은 치료되는 개체의 성별, 연령, 체중; 통증의 심각도; 투여 방식; 처방 의사의 판단을 비롯한 다수의 요인에 따라 달라질 수 있다.

원하는 경우에, 본 발명의 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나이상의 단위 약형을 포함하는 팩 또는 디스펜서 장치로 제공될 수 있다. 이들 팩 또는 장치는 예로써 블리스터(blister) 포장과 같은 금속이나 플라스틱 호일, 또는 인 바이알(in vial)과 같은 유리와 고무 마개를 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여 지침서가 첨부될 수 있다. 또한, 적절한 제약 담체에서 조제된 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은 제조하고, 적절한 용기에 담고, 지시된 증상의 치료를 위한 라벨을 부착할 수 있다.

본 발명의 이들 구체예는 본원의 개시에 비추어 당업자에게 명확하게 인지될 수 있다.

본 발명은 본 발명을 예시하는 아래의 실시예를 참조하면 더욱 명확하게 이해될 수 있다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하는 목적으로만 제공된다. 본 발명은 예시된 구체예의 범위에 한정되지 않으며, 이들 구체예는 본 발명의 단일 측면을 예시한다. 기능적으로 동등한 방법은 본 발명의 범위에 속한다. 상기 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 발명의 다양한 개변은 당업자에게 명백하다. 이들 변형은 특허청구범위의 범위에 속한다.

실시예 1: EPO 생산에 대한 TNF-α의 억제 효과 극복

Hep3B 세포는 화합물 A 또는 화합물 B의 존부하에 다양한 농도(0, 0.4, 2, 10 ng/㎖)의 TNF-α로 3일동안 처리하였다. 분비된 EPO 수준은 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트(R&D Systems, catalog no. DEP00)를 이용하여 결정하였다. 화합물의 부재하에 TNF-α로 Hep3B 세포의 처리는 용량-의존 방식으로 EPO 생산을 감소시켰다. TNF-α의 부재하에 다양한 농도의 화합물 A(도 1A) 또는 화합물 B(도 1B)로 처리된 Hep3B 세포는 EPO 생산에서 용량-의존성 증가를 보였다. TNF-α의 존재하에 둘중 한 화합물의 첨가는 EPO 생산에 대한 TNF-α의 저해 효과를 감소시켰다. 프롤릴 하이드록실라아제 저해에 의한 EPO 생산에 대한 TNF-α의 저해 효과 극복은 낮은 농도(가령, 0.4 ng/㎖)와 높은 농도(가령, 10 ng/㎖)의 TNF-α의 존재하에 관찰되었다. 이런 이유로, EPO 생산에 대한 염증성 사이토킨 TNF-α의 저해 효과는 본 발명의 화합물과 방법을 이용한 프롤릴 하이드록실라아제 활성의 저해에 의해 극복되었다. 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 염증성 사이토킨 TNF-α의 존재하에 EPO 생산을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 더 나아가, 본 발명의 방법과 화합물은 EPO 생산을 증가시키는데 유효하기 때문에, 예로써 급성이나 만성 염증 또는 만성 질환의 다른 빈혈증과 같은 TNF-α와 연관된 질환을 앓는 개체에서 빈혈증을 치료하는데 유효하다.

염증성 사이토킨 TNF-α에 대한 세포 노출이후(즉, TNF-α에 미리 노출된 세포에서) EPO 생산에 대한 본 발명 화합물의 효과를 검사하기 위한 일련의 실험을 수행하였다. 이런 이유로, 이들 실험에서 TNF-α 신호전달은 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질의 첨가에 앞서 개시된다. Hep3B 세포는 다양한 농도(0, 0.4, 2, 10 ng/㎖)의 TNF-α로 2시간동안 처리하고, 이후 다양한 농도의 화합물 A 또는 화합물 B를 배양 세포에 첨가하였다. 분비된 EPO 수준은 화합물 첨가이후 3일 시점에 상기한 바와 같이 측정하였다.

도 2A와 2B에 도시된 바와 같이, 화합물 A와 화합물 B는 TNF-α로 Hep3B 세포의 2시간 전처리이후 EPO 생산에 대한 TNF-α의 억제 효과를 극복하였다. 상기 데이터는 본 발명의 화합물과 방법이 TNF-α에 노출된 세포에서 EPO 생산을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 또한, 이들 결과는 본 발명의 화합물로 처리가 EPO 생산이 TNF-α에 의해 억제되는 개체에서 EPO 생산을 증가시키고 빈혈증을 치료하는데 유용한 수단을 제공한다는 것을 암시한다.

본 발명 화합물의 첨가는 EPO 생산에 대한 TNF-α의 저해 효과를 현저하게 감소시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 화합물과 방법은 증가된 TNF-α와 연관된 빈혈증, 예를 들면, 염증성 질환을 치료하거나 예방하는데 유효하다.

실시예 2: EPO 생산에 대한 IL-1β의 억제 효과 극복

Hep3B 세포는 화합물 A 또는 화합물 B의 존부하에 다양한 농도(0, 0.4, 2, 10 ng/㎖)의 IL-1β로 3일동안 처리하였다. 분비된 EPO 수준은 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트(R&D Systems, catalog no. DEP00)를 이용하여 결정하였다. 화합물의 부재하에 IL-1β로 Hep3B 세포의 처리는 용량-의존 방식으로 EPO 생산을 감소시켰다. IL-1β의 부재하에 다양한 농도의 화합물 A(도 3A) 또는 화합물 B(도 3B)로 처리된 Hep3B 세포는 EPO 생산에서 용량-의존성 증가를 보였다. IL-1β의 존재하에 둘중 한 화합물의 첨가는 EPO 생산에 대한 IL-1β의 저해 효과를 감소시켰다. 프롤릴 하이드록실라아제 저해에 의한 EPO 생산에 대한 IL-1β의 저해 효과 극복은 낮은 농도(가령, 0.4 ng/㎖)와 높은 농도(가령, 10 ng/㎖)의 IL-1β의 존재하에 관찰되었다. 이런 이유로, EPO 생산에 대한 염증성 사이토킨 IL-1β의 저해 효과는 본 발명의 화합물과 방법을 이용한 프롤릴 하이드록실라아제 활성의 저해에 의해 극복되었다. 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 염증성 사이토킨 IL-1β의 존재하 에 EPO 생산을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 더 나아가, 본 발명의 방법과 화합물은 EPO 생산을 증가시키는데 유효하기 때문에, 예로써 급성이나 만성 염증 또는 만성 질환의 다른 빈혈증과 같은 IL-1β와 연관된 질환을 앓는 개체에서 빈혈증을 치료하는데 유효하다.

염증성 사이토킨 IL-1β에 대한 세포 노출이후(즉, IL-1β에 미리 노출된 세포에서) EPO 생산에 대한 본 발명 화합물의 효과를 검사하기 위한 일련의 실험을 수행하였다. 이런 이유로, 이들 실험에서 IL-1β 신호전달은 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질의 첨가에 앞서 개시된다. Hep3B 세포는 다양한 농도(0, 0.4, 2, 10 ng/㎖)의 IL-1β로 2시간동안 처리하고, 이후 다양한 농도의 화합물 A 또는 화합물 B를 배양 세포에 첨가하였다. 분비된 EPO 수준은 화합물 첨가이후 3일 시점에 상기한 바와 같이 측정하였다.

도 4A와 4B에 도시된 바와 같이, 화합물 A와 화합물 B는 IL-1β로 Hep3B 세포의 2시간 전처리이후 EPO 생산에 대한 IL-1β의 억제 효과를 극복하였다. 상기 데이터는 본 발명의 화합물과 방법이 IL-1β에 노출된 세포에서 EPO 생산을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 또한, 이들 결과는 본 발명의 화합물로 처리가 EPO 생산이 IL-1β에 의해 억제되는 개체에서 EPO 생산을 증가시키고 빈혈증을 치료하는데 유용한 수단을 제공한다는 것을 암시한다.

본 발명 화합물의 첨가는 EPO 생산에 대한 IL-1β의 저해 효과를 현저하게 감소시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 화합물과 방법은 증가된 IL-1β와 연관된 빈혈증, 예를 들면, 염증성 질환을 치료하거나 예방하는데 유효하다.

실시예 3: TNF-α 유도된 VCAM-1 발현의 저해

림프구에 대한 내피 세포 부착성(adhesiveness)은 혈관 세포 부착 분자(VCAM)-1의 내피 세포 발현에 의해 부분적으로 발생한다. 내피 세포에서 VCAM-1 발현은 다양한 염증성 사이토킨, 예를 들면, TNF-α에 의해 유도된다. TNF-α 유도된 VCAM-1 발현에 대한 HIF 프롤릴 하이드록실라아제 저해의 효과를 조사하기 위하여, HUVEC(인간 배꼽 정맥 내피 세포)는 다양한 농도의 화합물 B 또는 화합물 C의 존부하에 TNF-α로 하루동안 자극하였다. 이후, VCAM 발현을 측정하였다.

도 5에 도시된 바와 같이, TNF-α(1 ng/㎖)는 HUVEC 세포에서 VCAM-1 발현을 유도하였다. 하지만, TNF-α 자극된 세포에 화합물 B 또는 화합물 C의 첨가는 TNF-α 유도된 VCAM-1 발현의 용량-의존성 저해를 결과하였다. 상기 데이터는 본 발명의 화합물과 방법이 염증성 사이토킨 TNF-α와 연관된 VCAM-1 발현을 감소시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 더 나아가, 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 다양한 염증성 질환과 자가면역 질환, 예를 들면, 만성 질환 빈혈증과 연관된 VCAM-1 발현을 저해하는데 유효하다는 것을 암시한다.

실시예 4: IL-1β 유도된 VCAM-1 발현의 저해

내피 세포에서 VCAM-1 발현은 염증성 사이토킨 IL-1β에 의해서도 유도된다. IL-1β 유도된 VCAM-1 발현에 대한 HIF 프롤릴 하이드록실라아제 저해의 효과를 조사하기 위하여, HUVEC(인간 배꼽 정맥 내피 세포)는 다양한 농도의 화합물 B 또는 화합물 C의 존부하에 IL-1β로 하루동안 자극하였다. 이후, VCAM 발현을 측정하였다.

IL-1β(1 ng/㎖)는 HUVEC 세포에서 VCAM-1 발현을 유도하였다. 하지만, IL-1β 자극된 세포에 화합물 B 또는 화합물 C의 첨가는 IL-1β 유도된 VCAM-1 발현의 용량-의존성 저해를 결과하였다(데이터 제시하지 않음). 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 염증성 사이토킨 IL-1β와 연관된 VCAM-1 발현을 감소시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 더 나아가, 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 다양한 염증성 질환과 자가면역 질환, 예를 들면, 만성 질환 빈혈증과 연관된 VCAM-1 발현을 저해하는데 유효하다는 것을 암시한다.

실시예 5: 내피 세포에서 TNF-α와 IL-1β 유도된 VCAM-1 발현의 저해

HUVEC는 운반제 대조 또는 다양한 농도(0, 20, 40, 80 μM)의 화합물 B 또는 화합물 C로 24시간동안 처리하였다. 세포는 세척하고, 이후 1 ng/㎖ TNF-α 또는 1 ng/㎖ IL-1β로 4시간동안 자극하였다. 이후, 세포 표면 VCAM-1 발현을 세포-기초한 ELISA로 측정하였다.

도 25에 도시된 바와 같이, 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질로 전처리는 염증성 사이토킨 TNF-α와 IL-1β에 의해 유도된 세포 표면 VCAM-1 발현을 감소시켰다. 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 TNF-α와 IL-1β의 염증 기능을 저해하고, 이종세포 백혈구 부착을 매개하는데 중요한 세포 표면 부착 분자의 발현을 저해한다는 것을 암시한다. 본 발명 화합물 처리에 의한 백혈구 부착의 저해는 염증 캐스케이드를 감소시키는데 효과적인 수단을 제공하고, 따라서 염증을 감소시키고, EPO 생산을 제한하고 조혈을 억제하는 염증 효과를 감소시킨다.

실시예 6: TNF-α 유도된 E-셀렉틴 발현의 저해

내피 E-셀렉틴은 염증 현상에서 혈관 내피 세포에 대한 백혈구의 초기 부착을 매개하는 세포 부착 분자의 셀렉틴 계통에 속한다. IL-1, INF-α, 리포폴리사카라이드는 각각 E-셀렉틴의 발현을 유도한다(참조: Bevilacqua et al.(1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:9238-9242; Bevilacqua and van Furth(1993) J Leukoc Biol 54:363-378). TNF-α 유도된 E-셀렉틴 발현에 대한 HIF 프롤릴 하이드록실라아제 저해의 효과를 조사하기 위하여, HUVEC는 다양한 농도의 화합물 B 또는 화합물 C의 존부하에 1 ng/㎖ TNF-α로 하루동안 자극하였다. 이후, E-셀렉틴과 VCAM 발현을 측정하였다.

도 24A와 24B에 도시된 바와 같이, 화합물 B와 화합물 C는 HUVEC에서 TNF-α 유도된 VCAM과 E-셀렉틴 발현의 용량-의존성 저해를 보였다. 도 24A와 24B에 도시된 데이터는 다양한 농도의 화합물 B(도 24A) 또는 화합물 C(도 24B)에 대한 반응으로 관찰된 VCAM과 E-셀렉틴 발현의 저해 비율로 표시한다. VCAM과 E-셀렉틴 발현의 60% 이상 저해는 50 μM 화합물 B 또는 화합물 C로 처리된 HUVEC에서 관찰되었다. 상기 데이터는 본 발명의 방법과 화합물이 염증성 사이토킨 TNF-α와 연관된 내피 세포에서 VCAM과 E-셀렉틴 발현을 감소시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 더 나아가, 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 다양한 염증성 질환과 자가면역 질환, 예를 들면, 만성 질환 빈혈증과 연관된 VCAM과 E-셀렉틴 발현을 저해하는데 유효하다는 것을 암시한다. 이에 더하여, 본 발명의 방법과 화합물에 의한 VCAM과 E-셀렉틴을 비롯한 부착 분자의 내피 세포 발현의 저해는 혈관 염증에서 초기 현상을 감소시키는 수단을 제공한다.

실시예 7: IL-1β 유도된 E-셀렉틴 발현의 저해

IL-1β 유도된 E-셀렉틴 발현에 대한 HIF 프롤릴 하이드록실라아제 저해의 효과를 조사하기 위하여, HUVEC는 다양한 농도의 화합물 B 또는 화합물 C의 존부하에 1 ng/㎖ IL-1β로 하루동안 자극하였다. 이후, E-셀렉틴 발현을 측정하였다.

화합물 B와 화합물 C는 HUVEC에서 IL-1β 유도된 E-셀렉틴 발현의 용량-의존성 저해를 보였다(데이터 제시하지 않음). 이들 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 염증성 사이토킨 IL-1β와 연관된 내피 세포에서 E-셀렉틴 발현을 감소시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 더 나아가, 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 다양한 염증성 질환과 자가면역 질환, 예를 들면, 만성 질환 빈혈증과 연관된 E-셀렉틴 발현을 저해하는데 유효하다는 것을 암시한다. 이에 더하여, 본 발명의 방법과 화합물에 의한 VCAM과 E-셀렉틴을 비롯한 부착 분자의 내피 세포 발현의 저해는 혈관 염증에서 초기 현상을 감소시키는 수단을 제공한다.

실시예 8: TNF-α, IL-1β, IFN-γ 유도된 E-셀렉틴 발현의 저해

HUVEC는 운반제 대조 또는 다양한 농도의 화합물 B 또는 화합물 C로 24시간동안 처리하였다. 세포는 세척하고, 이후 1 ng/㎖ TNF-α, 1 ng/㎖ IL-1β, 또는 각각 1 ng/㎖의 TNF-α, IL-1β, IFN-γ의 조합으로 4시간동안 자극하였다. 이후, 세포 표면 E-셀렉틴 발현을 세포-기초한 ELISA로 측정하였다.

도 26에 도시된 바와 같이, 화합물 B 또는 화합물 C로 HUVEC의 전처리는 염증성 사이토킨 TNF-α 또는 IL-1β에 의해 유도된 세포 표면 E-셀렉틴 발현을 감소시켰다. 이에 더하여, 둘중 한 화합물로 전처리는 E-셀렉틴 발현을 증가시키는 것 으로 알려진 3가지 염증성 사이토킨(TNF-α, IL-1β, IFN-γ)의 존재하에 E-셀렉틴 발현을 감소시켰다. 이들 결과는 활성화된 내피세포에서 백혈구의 롤링(rolling)을 매개하는 세포 표면 부착 분자의 발현의 저해에 의해 예시되는 바와 같이, 본 발명 화합물이 내피 세포에서 TNF-α, IL-1β, IFN-γ의 염증 기능을 차단하다는 것을 암시한다. E-셀렉틴을 통한 활성화된 내피에서 백혈구 부착이 염증 캐스케이드를 영속화시키는 초기 단계이기 때문에, E-셀렉틴 발현의 저해를 통한 백혈구 롤링의 저해는 EPO 생산을 더욱 한정하고 조혈을 억제하는 염증성 캐스케이드를 감소시키는 수단을 제공한다.

실시예 9: EPO 생산에서 상승적 증가

Hep3B 세포는 다양한 농도(3 μM, 10 μM, 30 μM)의 화합물 A 또는 화합물 B의 존부하에 다양한 농도(0, 0.1, 1, 10 ng/㎖)의 IL-6으로 3일동안 처리하였다. 분비된 EPO 수준은 상업적으로 입수가능한 ELISA 키트(R&D Systems, catalog no. DEP00)를 이용하여 결정하였다. 화합물의 부재하에 IL-6으로 Hep3B 세포의 처리는 EPO 생산에 최소의 효과를 보였다.

도 27A와 27B에 도시된 바와 같이, IL-6으로 처리된 Hep3B 세포는 처리되지 않은 세포에 비하여 약간 높게 EPO 발현을 증가시켰다. 구체적으로, 대조 세포에서 EPO 수준은 대략 20 mIU/㎖인 반면, 10 ng/㎖ IL-6으로 처리된 세포에서 EPO 수준은 대략 50 mIU/㎖이었다.

IL-6 없이 화합물 A 또는 화합물 B로 처리된 Hep3B 세포는 용량-의존 방식으로 EPO 수준을 증가시켰다. 하지만, IL-6의 존재하에 화합물 A 또는 화합물 B로 처 리된 Hep3B 세포는 EPO 수준에서 현저한 증가를 보였다(참조:도 27A와 27B). IL-6의 존재하에 EPO 생산에 대한 화합물 처리의 효과는 상승적이었다. 가령, 10 ng/㎖ IL-6으로 처리된 Hep3B 세포는 대략 50 mIU/㎖ EPO 수준을 보였다. IL-6의 부재하에 10 mM 화합물 A 또는 화합물 B로 Hep3B 세포의 처리는 각각 대략 60 mIU/㎖ EPO 및 220 mIU/㎖를 보였다. 10 ng/㎖ IL-6의 존재하에, 화합물 A와 화합물 B 첨가는 EPO 수준을 각각 대략 270 mIU/㎖ 및 400 mIU/㎖ 이상으로 증가시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 화합물과 방법은 간세포에서 EPO 발현을 유도하는데 있어 IL-6과 상승적으로 작용한다.

실시예 10: EPO 수용체 신호전달의 사이토킨-유도된 억제 극복

세포주 TF-1(인간 적백혈병(erythroleukemia); ATCC cat CRL-2003)은 EPO 첨가에 반응하여 증식하도록 자극한다. 다양한 친-염증성 사이토킨의 존재하에, TF-1 세포 증식에서 EPO-매개된 증가는 약화된다. TF-1 세포 증식에 대한 프롤릴 하이드록실라아제 저해의 효과를 결정하기 위하여, TF-1 세포는 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질의 존부하에 다양한 농도의 친-염증성 사이토킨 IL-1β, TNF-α 또는 IFN-γ으로 처리하고, EPO-매개된 세포 증식을 아래와 같이 측정한다. 96-웰 마이크로역가 평판에서 배양된 세포의 삼중 웰은 EPO의 존부하에 혈청-없는 배지와 함께 24시간동안 배양한다. 최종 4시간 배양동안, 1 μCi의 적정된 티미딘(³H-TdR; Amersham)을 각 웰에 첨가한다. EPO 수용체 신호전달에 대한 세포 반응성은 세포 증식을 정량하여 측정한다. 세포 증식은 먼저 세포를 물로 용해시키고, 이후 세포 포집기에서 나일론 필터에 DNA를 포집함으로써 세포에 통합된 ³H-TdR의 양을 정량하여 측정한다.

대안으로, 비장에서 EPO 반응성 선조세포의 우세를 유도하는 페닐하이드라진-처리된 동물로부터 획득된 비장 세포의 단일 세포 현탁액을 EPO 반응성 세포의 공급원으로 이용한다. 이후, EPO-매개된 증식을 상기한 바와 같이 탈체에서 사정한다.

EPO로 처리된 TF-1 세포는 적정된 티미딘 통합에서 증가로서 확인되는 세포 증식에서 증가를 결과한다. EPO-처리된 TF-1 세포에 친-염증성 사이토킨 IL-1β, TNF-α 또는 IFN-γ의 첨가는 EPO에 대한 감소된 반응성 및 결과적으로 감소된 세포 증식을 유발한다. TF-1 세포에서 EPO-매개된 세포 증식에 대한 친-염증성 사이토킨의 저해 효과에 대한 본 발명 화합물의 첨가 효과를 측정한다. EPO와 친-염증성 사이토킨으로 처리된 TF-1 세포에서 증가된 적정 티미딘 통합으로 측정되는 증가된 세포 증식은 본 발명의 화합물과 방법아 세포 증식에서 EPO-매개된 증가에 대한 친-염증성 사이토킨의 억제 효과를 극복한다는 것을 암시한다.

실시예 11: 트랜스페린 수용체 발현 증가

트랜스페린 수용체 발현에 대한 본 발명 화합물의 효과는 아래와 같이 조사하였다. 다양한 세포(Hep3B, HepG2, HK-2)는 화합물 A 또는 화합물과 함께 하루동안 배양하였다. 이후, 이들 세포는 CD7-1-PE 항체(Ancell, catalog no. 223-050)를 이용한 FACS 분석으로 트랜스페린 수용체 발현을 분석하였다. 결과는 아래 표 1에 도시한다.

세포형	처리	평균 FL
Hep3B	DMSO	40.21
	화합물 A	40.89
	화합물 B	42.43
HepG2	DMSO	49.59
	화합물 A	56.52
	화합물 B	53.53
HK-2	DMSO	10.80
	화합물 A	12.20
	화합물 B	18.92

상기 표 1에 도시된 바와 같이, 세포에 대한 다양한 본 발명 화합물의 첨가는 트랜스페린 수용체의 발현을 증가시켰다. 본 발명의 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질을 이용한 HIF 프롤릴 수산화의 저해는 세포에서 트랜스페린 수용체 발현을 증가시켰다. 본 발명의 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질을 이용한 증가된 트랜스페린 수용체 발현은 간 세포(가령, Hep3B, HepG2), 신장 세포(가령, HK-2), 림프구(가령, THP-1)에서 관찰되었다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 다양한 세포형에서 트랜스페린 수용체 발현을 증가시키는데 유효하다. 이에 더하여, 증가된 트랜스페린 수용체 발현은 제2철 트랜스페린의 증가된 트랜스페린 수용체-매개된 세포내이입(endocytosis)을 유도하고, 따라서 철 운반, 이용, 저장, 대사를 증가시킨다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 철 운반, 이용, 저장, 대사를 증가시킴으로써 조혈을 강화시키는데 유효하다.

실시예 12: 트랜스페린 수용체 발현과 시험관내 철 흡입 증가

세포에서 철 흡입에 대한 화합물의 효과는 아래와 같이 측정된다. 일차 단핵구와 대식세포 및 단핵구와 대식세포 세포주(가령, THP-1)는 다양한 농도의 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질로 1일, 2일 또는 3일동안 처리한다. 이후, 세포는 형광 면역염색과 유세포분석법을 이용하여 세포 표면 트랜스페린 수용체의 존재를 검사한다. 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질의 첨가가 세포 표면 트랜스페린 수용체 발현을 증가시킨다는 결과는 세포에 대한 트랜스페린 결합 및 이에 따른 철 결합을 증가시키는데 있어 프롤릴 하이드록실라아제 저해의 효능을 암시한다. 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질로 처리된 세포에 의한 철 흡수에서 변화는 아래와 같이 측정된다. 세포는 ⁵⁹Fe의 존재하에 화합물로 처리한다. 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질로 처리된 세포에 의한 증가된 철 흡입은 세포-결합된 ⁵⁹Fe를 측정함으로써 결정한다. 세포-결합된 ⁵⁹Fe에서 증가는 세포에서 증가된 철 흡입을 암시한다.

실시예 13: 철-조절 단백질-2 수준과 활성 증가

철 흡입, 저장, 이용의 조절은 철-조절 단백질(IRP)로 알려져 있는 트랜스-작용 단백질을 비롯하여 철 대사에 관여하는 핵심 단백질의 발현과 활성을 통하여 부분적으로 진행된다. IRP-1과 IRP-2는 철 대사에 관여하는 단백질의 다양한 mRNA에서 특정 철-반응성 요소에 결합함으로써 mRNA 안정성과 번역을 조절하고, 따라서 철 대사의 사실상 모든 측면에 영향을 준다. 철 결핍은 IRP 활성을 증가시켜 증가된 트랜스페린 수용체 발현과 감소된 훼리틴 발현을 유발한다. 유사하게, 철의 존재하에 IRP 활성은 감소하고 감소된 트랜스페린 수용체 발현과 증가된 훼리틴 발현을 유도한다.

철 대사의 다양한 측면에 대한 본 발명 화합물의 효과를 검사하기 위하여, 아래의 실험을 수행한다. 생쥐 Hepa-1 세포는 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질로 최대 48시간동안 처리한다. 이후, 이들 세포는 수집하고, 세포 용해질은 IRP-2에 특이적인 항체(Alpha Diagnostic International, Inc., San Antonio TX)를 이용한 면역블랏팅으로 IRP-2 발현을 분석한다. 화합물의 첨가이후 상승된 수준의 세포질 IRP-2를 보이는 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 IRP 수준 및 철 대사를 증가시키는데 유효하다는 것을 입증한다.

훼리틴과 트랜스페린 발현에서 변화로 측정된 IRP-2 활성에 대한 본 발명 화합물의 효과는 아래와 같이 측정된다. 생쥐 RAW 264.1 대식세포 세포주는 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질로 최대 48시간동안 처리한다. 이후, 세포는 수집하고 면역블랏팅(ADI, catalogue # IRP21-S)으로 훼리틴과 트랜스페린 단백질 발현을 분석한다. 프롤릴 하이드록실라아제 저해이후 감소된 수준의 훼리틴 발현과 증가된 수준의 트랜스페린 발현은 본 발명의 방법과 화합물이 IRP-2의 활성을 안정시키고 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다. IRP-2의 증가된 발현은 훼리틴의 발현을 감소시키는데, 이는 철의 장기적인 저장을 주도하고 트랜스페린과 트랜스페린 수용체의 발현을 증가시키며 철 흡입, 운반, 이용을 조장하고, 따라서 조혈을 강화시킨다. IRP-2의 발현과 활성을 증가시킴으로써, 본 발명의 방법과 화합물은 훼리틴의 발현과 철의 장기적인 저장을 감소시키고 트랜스페린과 트랜스페린 수용체의 발현을 증가시키는데 유효하다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 철 흡입, 운반, 이용을 증가시키는데 유효하고, 따라서 조혈을 강화시키는데 유효하다.

실시예 14: 철 이용 강화

쥐는 ⁵⁹Fe-방사성표지된 구연산 제일철(ferrous citrate)(Amersham)로 정맥내 주사에 앞서, 운반제 대조 또는 HIF 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질을 투여한다. 여러 혈액 샘플을 꼬리 정맥으로부터 채취하고, 전체 유리 혈장과 적혈구-결합된 방사능을 신틸레이션 계수기에서 측정하여 철 운반과 적혈구 헴으로의 통합 및 헤모글로빈 합성을 검출한다. 적혈구-결합된 ⁵⁹Fe의 증가는 본 발명 화합물이 헴 합성, 헤모글로빈 생산, 조혈에 필요한 철 이용을 강화시키는데 유효하다는 것을 암시한다.

실시예 15: 시험관내에서 조혈 유전자의 강화된 발현

Hep3B 세포(ATCC No. HB-8064)는 8% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 성장시켰다. Hep3B 세포는 6-웰 배양 접시에서 웰당 ~500,000 세포로 접종하였다. 8시간후, 배지는 0.5% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM으로 교체하고, 세포는 추가로 16시간동안 배양하였다. 화합물 B 또는 화합물 D를 세포에 첨가하고(25 μM 최종 농도), 이들 세포는 다양한 시간동안 배양하였다. 대조 세포(화합물 처리없음, DMSO 단독의 첨가)는 0, 6, 48 시간 시점에 수집하였다. 수집된 세포는 세포 생존(GUAVA)을 사정하거나, 또는 후속 RNA 정제를 위하여 RNA 추출 완충액(RNeasy, Qiagen)에 첨가하고 -20℃에서 보관하였다. 서로 다른 일자에 수행된 반복 실험으로부터 분리된 RNA를 이용하여 반복 마이크로어레이를 만들었다. 전체 RNA는 RNeasy 키트(Qiagen)를 이용하여 세포로부터 분리하였다.

RNA는 0.3 M 나트륨 아세테이트(pH 5.2), 50 ng/㎖ 글리코겐, 2.5 볼륨의 에탄올에서 -20℃에서 1시간동안 침전시켰다. 샘플은 원심분리하고, 펠렛은 차가운 80% 에탄올로 세척하고 건조시키고 물에서 재부유시켰다. 제조업자의 지시에 따라 T7-(dT)24 일차 가닥 프라이머(Affymetrix, Inc., Santa Clara CA)와 SUPERSCRIPT CHOICE 시스템(Invitrogen)을 이용하여 이중 가닥 cDNA를 합성하였다. 최종 cDNA는 PHASE LOCK GEL 삽입체(Brinkman, Inc., Westbury NY)를 이용하여 동등 볼륨의 25:24:1 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올로 추출하였다. 수상은 수집하고, cDNA는 0.5 볼륨의 7.5 M 암모늄 아세테이트와 2.5 볼륨의 에탄올을 이용하여 침전시켰다. 대안으로, cDNA는 제조업자의 지시에 따라 GENECHIP 샘플 정화 모듈(Affymetrix)을 이용하여 정제하였다.

비오틴-표지된 cRNA는 제조업자의 지시에 따라 BIOARRAY HighYield RNA 전사체 표지 키트(Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY)를 이용하여 시험관내 번역(IVT) 반응에서 상기 cDNA로부터 합성하였다. 최종 표지된 산물은 제조업자의 지시에 따라 GENECHIP 샘플 정화 모듈(Affymetrix)을 이용하여 정제하고 단편화시켰다.

혼성화 칵테일은 5 ㎍ 프로브를 100 ㎕의 1x 혼성화 완충액(100 mM MES, 1 M [Na⁺], 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20), 100 ㎍/㎖ 청어 정자 DNA, 500 ㎍/㎖ 아세틸화된 BSA, 0.03 nM 대조 올리고 B2(Affymetrix), 1x GENECHIP 진핵 혼성화 대조(Affymetrix)에 집어넣어 제조하였다. 칵테일은 99℃에서 5분, 45℃에서 5분간 순차적으로 배양하고, 이후 5분동안 원심분리하였다. 인간 게놈 U133A 어레이(Affymetrix)는 실온이 되게 하고, 이후 회전하면서 45℃에서 10분동안 1x 혼성화 완충액으로 미리 혼성화시켰다. 그 다음, 완충액은 80 ㎕ 혼성화 칵테일로 교체하고, 어레이는 카운터 밸런스에서 60 rpm으로 45℃에서 16시간동안 혼성화시켰다. 혼성화이후, 어레이는 6x SSPE, 0.1% Tween 20으로 1회 세척하고, 이후 제조업자의 1v1 프로토콜(Affymetrix)에 따라 R-피코에리트린-공액된 스트렙타비딘(Molecular Probes, Eugene OR), 염소 항-스트렙타비딘 항체(Vector Laboratories, Burlingame CA), GENECHIP Fluidics Station 400 장치(Affymetrix)를 이용하여 세척하고 염색하였다. 어레이는 GENEARRAY 스캐너(Affymetrix)와 Microarray Suite 소프트웨어(Affymetrix)를 이용하여 분석하였다.

인간 게놈 U133A 어레이(Affymetrix)는 대략 14,500개의 충분히 특성화된 인간 유전자를 포함하는 Human Unigene 데이터베이스 빌드 133(National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD)에서 모든 서열을 대표한다.

RNA 양은 모세관 전기영동(Agilent Bioanalyzer)으로 모니터하였다. 혼성화 칵테일은 상기한 바와 같이 제조하고(Affymetrix), 22,283개의 프로브 세트를 보유하는 Affymetrix 인간 U133A 어레이에 혼성화시켰다. 어레이 성능은 Affymetrix MicroArray Suite(WAS) 소프트웨어로 분석하고, 개별 프로브 세트는 소프트웨어 디폴트에 따라 “존재”, “한계”, “부재” 콜(call)로 지정하였다. 통계학적 분석 및 걸러진 프로브 세트 목록은 GeneSpring 소프트웨어(Silicon Genetics)를 이용하여 준비하였다. “발현된” 프로브 세트에 대한 컷오프(Cutoff)는 Affymetrix “P”콜(call) 및 Genespring의 내재 데이터 오류 모델(intrinsic data error model)로부터 유래된 절대 발현 수치의 조합을 이용하였다. 데이터는 평균화된 대조 샘플로 표준화시켰다.

아래의 표 2에 도시된 바와 같이, 조혈 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현(mRNA 수준에서 대조 이상으로 배수적 증가)은 본 발명의 화합물로 처리된 Hep3B 세포에서 증가하였다(각 조건에 대한 2가지 셀룰로플라스민 데이터 지점은 아래의 표 2에 제시한다). 구체적으로, 셀룰로플라스민과 트랜스페린 수용체 2 유전자 발현은 다양한 본 발명의 화합물로 처리된 Hep3B 세포에서 Hep3B 세포에서 증가하였다.

화합물	시간	셀룰로플라스민(CP)	트랜스페린 수용체(TFR2)
D	6 hr	2.06/2.387	측정되지 않음
B	1 hr	1.142/0.946	0.575
B	3 hr	1.123/0.955	0.558
B	6 hr	1.555/1.103	0.822
B	12 hr	2.366/2.507	1.253
B	24 hr	5.136/4.909	2.522
B	48 hr	5.82/4.678	4.169

실시예 16: 동물 투약

아래의 실시예에 이용된 동물은 Swiss Webster 수컷 생쥐(30-32 g), Sprague Dawley 수컷 쥐(200-350 g), Lewis 암컷 쥐(Simonsen, Inc., Gilroy CA), Charles River(Hollister, CA), 또는 Harlan이다. 동물은 표준 절차를 이용하여 유지시키고, 사료와 물은 동물이 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 처리동안, 동물은 체중 변화 및 과다 독성과 치사 징후를 모니터하였다.

화합물은 일반적으로, 위관 영양 또는 IV 투여로 투여하였다. 경구 위관 영양으로 처리된 동물은 다양한 투약 섭생(dosing regimen)을 이용하여 0.1% 폴리솔베이트 80(0 ㎎g/kg/day)을 함유하거나 함유하지 않는 4-10 ㎖/kg 용적의 0.5% 카르복시메틸 셀룰로오스(CMC; Sigma-Aldrich, St. Louis MO), 또는 0.1% 폴리솔베이트 80을 함유하거나 함유하지 않고 0.5% CMC에 담긴 가변 용량의 본 발명 화합물(가령, HIF 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질)을 섭취하였다. 혈액 샘플은 처리동안 예로써 꼬리 정맥(쥐), 또는 복부 정맥이나 심장 천자(cardiocentesis)(생쥐 또는 쥐)로부터 적절한 간격으로 수집하였다. 일반적으로, 동물은 이소플루란으로 마취시키고, 혈액 샘플을 MICROTA1NER 혈청 분리 튜브(Becton-Dickinson, Franklin Lakes NJ)에 집합시켰다. 혈청 성분의 측정을 위하여, 튜브는 실온에서 30분동안 배양하고, 이후 4℃에서 10분동안 8,000 rpm으로 원심분리하였다. 이후, 혈청 분획을 가공하고 특정 성분, 예를 들면, 혈청 철의 존재를 분석하였다(Quality Clinical Labs(Mountain View, CA)에서 검사 수행). 헤마토크리트의 측정을 위하여, 혈액 샘플은 MICROTAINER EDTA-2K 튜브(Becton-Dickinson)에 집합시켰다; 그 다음, EDTA-혈액을 75 ㎜ x 1.1-1.2 ㎜ I.D. 모세관 튜브(Chase Scientific Glass, Inc., Rockwood TN)에 대략 3/4 길이로 채취하는데, 튜브의 한쪽 단부는 CRITOSEAL 밀폐제(Sherwood Medical Company)로 밀봉하고, 튜브는 J-503M MICROHEMATOCRIT 원심분리기(Jorgensen Laboratories, Inc., Loveland CO)에서 5분동안 12,000 rpm으로 원심분리하였다. 헤마토크리트는 판독기 카드에서 판독하였다. 지정되면, 혈중 헤모글로빈 수준, 망상적혈구 숫자, 헤마토크리트를 비롯한 전혈수치(CBC) 분석을 Quality Clinical Labs(Mountain View, CA)에서 수행하였다.

각 연구의 종결 시점에서, 동물은 전신 마취하에 방혈(exsanguination) 또는 CO₂ 질식으로 안락사시키고, 장기와 조직 샘플을 수집하였다. 조직은 중성 완충 포르말린에 고정시키거나 -70℃에서 동결 보관하였다. 게놈 분석을 위한 조직은 RNAlater에 위치시켰다.

실시예 17: 생체내에서 철-가공 단백질을 인코딩하는 유전자의 증가된 발현

Swiss Webster 수컷 생쥐는 단일 용량의 0.5% CMC(Sigma-Aldrich)(0 ㎎/㎏) 또는 100 ㎎/㎏ 화합물 A로 상기한 바와 같이 처리하였다. 투여이후 4, 8, 16, 24, 48 또는 72시간 시점에, 동물은 마취시키고 희생시키며 신장, 간, 뇌, 폐, 심장의 조직 샘플을 분리하고 RNALATER 용액(Ambion)에 -80℃에서 보관하였다. 대안으로, 동물은 4일 연속 용량의 0.5% CMC(0 ㎎/㎏/day), 0.5% CMC(30 ㎎/㎏/day)에 담긴 7.5 ㎎/㎖ 화합물 A, 또는 0.5% CMC(100 ㎎/㎏/day)에 담긴 25 ㎎/㎖ 화합물 A로 처리하였다. 최종 투여이후 4시간 시점에, 동물은 마취시키고 희생시키며 대략 150 ㎎의 간과 각 신장을 분리하고 RNALATER 용액(Ambion)에 -20℃에서 보관하였다.

RNA 분리는 아래의 프로토콜을 이용하여 수행하였다. 각 장기의 절편은 자르고 875 ㎕의 RLT 완충액(RNEASY 키트; Qiagen Inc., Valencia CA)을 첨가하며, 이들 조각은 로터-스테이터 POLYTRON 균질화기(Kinematica, Tnc., Cincinnati OH)를 이용하여 균질화시켰다. 균질액은 3분동안 마이크로-원심분리하여 불용성 물질을 펠렛하고, 상층액은 새로운 튜브로 이전하고, RNA는 제조업자의 지시에 따라 RNEASY 키트(Qiagen)를 이용하여 분리하였다. RNA는 80 ㎕의 물에 용출하고 RIBOGREEN 시약(Molecular Probes, Eugene OR)으로 정량하였다. 260과 280 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 순도와 농도를 결정하였다.

대안으로, 조직 샘플은 절단하고 로터-스테이터 POLYTRON 균질화기(Kinematica)를 이용하여 TRIZOL 시약(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad CA)에서 균질화시켰다. 균질액은 실온이 되게 하고 0.2 볼륨 클로로포름을 첨가하며, 샘플은 활발하게 교반하였다. 혼합물은 수분동안 실온에서 배양하고, 이후 4℃에서 15분동안 12,000g로 원심분리하였다. 수상은 수집하고 0.5 볼륨의 이소프로판올을 첨가하였다. 샘플은 혼합하고 실온에서 10분동안 배양하며 4℃에서 10분동안 12,000g로 원심분리하였다. 상층액은 제거하고, 펠렛은 75% EtOH로 세척하고 4℃에서 5분동안 7,500g로 원심분리하였다. 260과 280 nm에서 흡광도를 측정하여 RNA 순도와 농도를 결정하였다.

RNA는 0.3 M 나트륨 아세테이트(pH 5.2), 50 ng/㎖ 글리코겐, 2.5 볼륨의 에탄올에서 -20℃에서 1시간동안 침전시켰다. 샘플은 원심분리하고, 펠렛은 차가운 80% 에탄올로 세척하고 건조시키고 물에서 재부유시켰다. 제조업자의 지시에 따라 T7-(dT)24 일차 가닥 프라이머(Affymetrix, Inc., Santa Clara CA)와 SUPERSCRIPT CHOICE 시스템(Invitrogen)을 이용하여 이중 가닥 cDNA를 합성하였다. 최종 cDNA는 PHASE LOCK GEL 삽입체(Brinkman, Inc., Westbury NY)를 이용하여 동등 볼륨의 25:24:1 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올로 추출하였다. 수상은 수집하고, cDNA는 0.5 볼륨의 7.5 M 암모늄 아세테이트와 2.5 볼륨의 에탄올을 이용하여 침전시켰다. 대안으로, cDNA는 제조업자의 지시에 따라 GENECHIP 샘플 정화 모듈(Affymetrix)을 이용하여 정제하였다.

비오틴-표지된 cRNA는 제조업자의 지시에 따라 BIOARRAY HighYield RNA 전사체 표지 키트(Enzo Diagnostics, Inc., Farmingdale NY)를 이용하여 시험관내 번역(IVT) 반응에서 상기 cDNA로부터 합성하였다. 최종 표지된 산물은 제조업자의 지시에 따라 GENECHIP 샘플 정화 모듈(Affymetrix)을 이용하여 정제하고 단편화시켰다.

혼성화 칵테일은 5 ㎍ 프로브를 100 ㎕의 1x 혼성화 완충액(100 mM MES, 1 M [Na⁺], 20 mM EDTA, 0.01% Tween 20), 100 ㎍/㎖ 청어 정자 DNA, 500 ㎍/㎖ 아세틸화된 BSA, 0.03 nM 대조 올리고 B2(Affymetrix), 1x GENECHIP 진핵 혼성화 대조(Affymetrix)에 집어넣어 제조하였다. 칵테일은 99℃에서 5분, 45℃에서 5분간 순차적으로 배양하고, 이후 5분동안 원심분리하였다. 뮤린 게놈 MOE430Aplus2 어레이(Affymetrix)는 실온이 되게 하고, 이후 회전하면서 45℃에서 10분동안 1x 혼성화 완충액으로 미리 혼성화시켰다. 그 다음, 완충액은 80 ㎕ 혼성화 칵테일로 교체하고, 어레이는 카운터 밸런스에서 60 rpm으로 45℃에서 16시간동안 혼성화시켰다. 혼성화이후, 어레이는 6x SSPE, 0.1% Tween 20으로 1회 세척하고, 이후 제조업자의 EukGE-WS2v4 프로토콜(Affymetrix)에 따라 R-피코에리트린-공액된 스트렙타비딘(Molecular Probes, Eugene OR), 염소 항-스트렙타비딘 항체(Vector Laboratories, Burlingame CA), GENECHIP Fluidics Station 400 장치(Affymetrix)를 이용하여 세척하고 염색하였다. 어레이는 GENEARRAY 스캐너(Affymetrix)와 Microarray Suite 소프트웨어(Affymetrix)를 이용하여 분석하였다.

뮤린 게놈 MOE430Aplus2 어레이(Affymetrix)는 대략 14,500개의 충분히 특성화된 생쥐 유전자를 포함하는 Murine Unigene 데이터베이스 빌드 107(National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD)에서 모든 서열을 대표한다.

아래의 표 3에서는 화합물 A의 투여이후 생쥐 신장에서 셀룰로플라스민 mRNA 발현을 보여준다. 데이터는 처리되지 않은 대조 동물에서 관찰되는 수치의 평균 수치로 표준화시켰다.

조건	셀룰로플라스민 (상대적인 mRNA 수준)
처리되지 않음	0.81
CMC 대조	1.26
화합물 A-4 시간	1.16
화합물 A-8 시간	1.39
화합물 A-16 시간	1.22
화합물 A-24 시간	2.45
화합물 A-48 시간	1.44
화합물 A-72 시간	2.10

상기 표 3에 도시된 데이터는 본 발명의 방법과 화합물이 셀룰로플라스민 유전자 발현을 증가시키는데 유효하다는 것을 입증한다. 페록시다아제-1로도 알려져 있는 셀룰로플라스민은 저장 위치(가령, 훼리틴)로부터 방출된 환원 철을 산화 형태로 전환시킨다. 산화 철은 혈장 운반 단백질, 트랜스페린에 결합할 수 있다. 셀룰로플라스민 결핍은 간과 다른 조직에서 철의 축적과 연관된다. 여러 증거에서, 셀룰로플라스민은 간으로부터 철의 유출을 촉진하고 철-결핍 세포로 철의 유입을 촉진하는 것으로 인정되고 있다(참조: Tran et al.(2002) J Nun 132:351-356).

아래의 표 4에서는 화합물 A의 투여이후 생쥐 간에서 헵시딘 mRNA 발현을 보여준다. 데이터는 처리되지 않은 대조 동물에서 관찰되는 수치의 평균 수치로 표준화시켰다.

조건	시간	헵시딘 (상대적인 mRNA 수준)
대조	-	1.0
I-복수 고용량	-	0.275
II-복수 고용량	-	0.703
II-복수 저용량	-	0.129
III	4 시간	0.672
III	8 시간	0.305
III	16 시간	0.119

상기 표 4에 도시된 바와 같이, 화합물 A의 투여는 생쥐 간에서 헵시딘 mRNA의 감소된 발현을 결과하였다. 감소된 헵시딘 발현은 망상내피 세포로부터 증가된 철 방출과 증가된 장내 철 흡수와 연관된다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 헵시딘 발현을 감소시키고 장내 철 흡수를 증가시키는데 유효하다.

도 6A에서는 신장에서 트랜스페린 수용체의 상대적인 발현 수준(회색 막대) 및 장 십이지장 철 운반체 NRAMP2(자연-저항성-연관된 대식세포 단백질 2)(S1c11a2(용질 담체 계통 11, 양성자-결합된 이가 금속 이온 운반체, 구성원 2), 다른 명칭으로 DCT1(이가 양이온 운반체 1), DMT1(이가 금속 운반체 1))(검은색 막대)의 상대적인 발현 수준을 도시한다.

다른 실험에서, mRNA는 60 ㎎/㎏ 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C를 생쥐에 IV 투여하고 4시간 이후에 수집된 소장으로부터 분리하였다. 프로브는 5마리 처리군으로부터 각 2마리 동물로부터 준비하고 Affymetrix 생쥐 MO17430Aplus2 마이크로어레이(어레이당 1마리 동물)에 혼성화시켰다. 처리된 동물 vs. 처리되지 않은 동물로부터 획득된 데이터의 통계학적 비교를 수행하였다. 도 6B에서는 화합물 A, 화합물 B, 화합물 C로 처리된 동물의 소장에서 NRAMP2 mRNA의 상대적인 발현 수준을 도시한다. 발현 수준은 처리되지 않은 대조 동물에 비하여 각 발현된 유전자에 대한 배수-유도(fold-induction)로 표시한다. 이들 실험으로부터 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 장에서 NRAMP2의 발현을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 더 나아가, 이들 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 철 흡수를 증가시키는데 유효하고, 따라서 헴 합성, 헤모글로빈 합성, 적혈구 생산, 조혈을 위한 철 이용가능성을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다.

도 6C에서는 운반제 대조에 비하여 처리된 동물에서 5-아미노레불리네이트 합성효소(ALAS-2) 발현의 배수-유도를 도시한다. 상기 데이터는 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질로 정상 동물의 처리가 장으로부터 철 흡수 및 트랜스페린 수용체를 통한 말초에서 철 운반에 관여하는 유전자를 비롯한 철 대사에 관여하는 유전자의 증가된 발현을 결과한다는 것을 입증한다. 이들 유전자의 발현은 투약이후 16시간 시점에 기준(대조) 수준으로 환원되었다. 상기 데이터는 또한, 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질 처리이후 지정된 조직에서 헴 합성 경로에서 일차 효소이며 헴 합성을 위한 속도-제한 효소인 ALAS-2의 조정 발현을 입증한다. 종합하면, 이들 결과는 본 발명의 화합물이 철 흡수, 철 운반, 헴 합성을 비롯한 조혈을 촉진하는데 관여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현에서 증가를 조정한다는 것을 암시한다.

대안으로, 유세포분석법을 이용하여 이중 면역염색된 말초혈 단핵 세포에서 대식세포 세포 표면 마커 CD11c와 트랜스페린 수용체 수준을 측정한다. 활성은 증가된 대식세포 트랜스페린 수용체 발현을 검출함으로써 화합물 처리에 대하여 확인한다. 또한, 혈장은 수집하고 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트(참조: KomaBiotech, Korea)를 이용하여 트랜스페린 수준을 검사할 수 있다.

실시예 18: 강화된 생체내 조혈

조혈에 대한 본 발명 화합물의 투여 효과는 아래와 같이 측정한다. 정상 생쥐는 빈혈을 유발하고, TNF-α에 응하는 EPO 생산과 신호전달의 부재로 조혈을 저해하는 것으로 알려진 섭생인 TNF-α의 만성 투여로 빈혈 상태로 유지시킨다. 1- 내지 4-주 기간동안 빈혈을 유도한 이후, 동물은 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질을 투여한다. 조직은 BFU-E와 CFU-E 생산을 검사하고, 혈액 샘플은 조성을 분석한다. 골수, 비장, 말초에서 BFU-E와 CFU-E의 개체수 증가 및/또는 PHI로 처리된 동물에서 증가된 혈청 헤모글로빈, 망상적혈구, 헤마토크리트를 보여주는 결과는 효능을 입증한다.

다른 실험 동물 모델이 조혈에 대한 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질의 투여 효과를 검사하는데 유용하다. 상기 모델에서, 외래유전자도입 생쥐는 TNF-α를 구성적으로 과다발현하는 결과로써 만성 질환 빈혈증이 발생한다. 이들 생쥐에서 빈혈증의 발병이후, 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질은 다양한 기간동안 다양한 투약 전략을 이용하여 투여한다. 이후, 조직과 혈액 샘플을 수집하고 분석한다. 상기한 바와 같이,

골수, 비장, 말초에서 BFU-E와 CFU-E의 개체수 증가 및/또는 증가된 혈청 헤모글로빈, 망상적혈구, 헤마토크리트를 보여주는 결과는 외래유전자도입 동물에서 TNF-α 과다생산과 연관된 빈혈증이 본 발명의 방법과 화합물을 이용한 프롤릴 하이드록실라아제 저해물질의 투여에 의해 치료될 수 있음을 분명하게 입증한다.

실시예 19: 혈청 철 수준 증가

수컷과 암컷 쥐는 다양한 농도(0, 20, 60 또는 150 ㎎/㎏)의 화합물 A로 93일동안 주 2회(월요일과 목요일) 처리하였다. 전체 혈청 철 수준을 측정하였다.

용량	혈청 철(㎍/㎗) 수컷 쥐(평균+/-SD)	혈청 철(㎍/㎗) 암컷 쥐(평균+/-SD)
O ㎎/㎏	158 +/-37	342 +/-91
20 ㎎/㎏	198 +/-64	505 +/-41*
60 ㎎/㎏	357 +/-111*	445 +/-46*
150 ㎎/㎏	307 +/-142*	399 +/-117

표 5에 도시된 바와 같이, 화합물 A의 투여는 수컷과 암컷 쥐 모두에서 혈청 철 수준을 증가시켰다(표 5에 제시된 데이터는 혈청 철 수준 +/- 표준 편차로 표시된). *는 처리되지 않은 동물로부터 혈청 철 수준에서 유의한 차이를 지시한다. 이들 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 혈청 철 수준을 증가시키는데 유효하고, 따라서 철 결핍증과 연관된 질환을 치료하는데 유효하다는 것을 암시한다.

실시예 20: 만성 질환 빈혈증/손상된 조혈/손상된 철 대사의 동물 모델에서 효능

만성 질환 빈혈증(ACD)은 관절염, 신생물 질환, 만성 염증과 연관된 다른 질환을 비롯한 다양한 염증성 상태와 연관된다. ACD의 쥐 모델을 이용하여 만성 질환과 연관된 빈혈증 치료에 대한 본 발명의 방법과 화합물을 이용한 HIF 안정화의 효과를 검사하였다. 상기 동물 모델에서, ACD는 쥐에서 펩티도글리칸-폴리사카라이드 중합체로 유도한다(참조: Sartor et al.(1989) Infection and Immunity 57: 1177-1185). 상기 모델에서, 동물은 초기 단계에 심각한 급성 빈혈증이 발생하고, 이후 후기 단계에 중증도로 심각한 만성 소적혈구성 빈혈증이 나타난다.

ACD의 동물 모델 - 실험 시리즈 1:

대략 160 g의 암컷 Lewis 쥐는 PG-PS 10S(Lee laboratories, 15 ㎍/gm 체중, 복강내)로 공격하였다. PG-PS 10S는 스트렙토코커스 피오진(Streptococcus pyogene), Group A, D58 균주의 세포벽으로부터 분리된 정제된 펩티도글리칸-폴리사카라이드 중합체를 보유한다. 관절염과 빈혈증은 35일동안 발생시켰다. 35일 시점에, CBC와 망상적혈구 계산(Quality Clinical Labs에서 수행)을 위하여 전신 마취(이소플루란)하에 꼬리 정맥으로부터 혈액 샘플(대략 400 ㎕)을 채취하였다. 45% 이상의 회전 헤마토크리트 수준을 보이는 동물은 비-빈혈 상태로 간주하고 연구로부터 배제하였다.

PG-PS 주입이후 35일 시점에, 빈혈성 동물은 운반제 단독을 섭취하거나 화합물 A(60 ㎎/㎏, PO)로 2주간 매주 2일 연속으로 처리하였다. 자동화된 전혈구 수치(CBC)는 35일, 39일, 42일, 49일에 측정하였다; 혈청 철 수준은 49일에 측정하였다.

망상적혈구 수치

도 7에 도시된 바와 같이, 빈혈성 동물에 화합물 A의 투여는 39일(즉, 화합물 투약의 개시이후 5일 시점)에 망상적혈구 수치를 증가시켰다. 망상적혈구 수준은 대조(비-빈혈성) 동물과 빈혈성(PG-PS 처리된) 동물에서 적혈구의 각각 대략 2%와 4%이었다. 하지만, 처리된 동물에서 망상적혈구 수준은 적혈구 수치의 대략 10%이었다. 화합물 A 처리는 빈혈성 동물에서 망상적혈구 수치를 증가시켰다. 이런 이유로, 화합물 A는 ACD의 쥐 동물 모델에서 조혈을 자극하였다.

헤마토크리트

헤마토크리트 수준은 화합물 A로 처리된 빈혈성 동물에서 상승하였다. 빈혈성(PG-PS 처리된) 동물에서 헤마토크리트 수준(Quality Clinical Labs에서 Baker 9000으로 측정됨)은 비-빈혈성 대조 동물에서 41%에 비하여 35% 미만이었다(참조: 도 8). 빈혈성 동물에 화합물 A의 투여는 화합물 처리의 개시이후 5일 시점에 헤마토크리트 수준을 대략 37%로 증가시켰다. 화합물 A의 2차 투약이후, 헤마토크리트 수준은 비-빈혈성 대조 동물에서 관찰되는 헤마토크리트 수준에 필적하는 대략 40%로 상승하였다. 화합물 A는 ACD의 쥐 모델을 이용한 빈혈성 동물에서 헤마토크리트를 증가시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 헤마토크리트를 증가시키고 만성 질환 빈혈증을 치료하는데 유효하다.

헤모글로빈

화합물 A 투여는 빈혈성 동물에서 헤모글로빈 수준 역시 증가시켰다. 도 9에 도시된 바와 같이, 35일 시점에 비-빈혈성 대조 동물은 대략 15 gm/㎗의 헤모글로빈 수준을 보인 반면, PG-PS 처리된 동물(즉, 빈혈성 동물)에서 헤모글로빈 수준은 대략 13 gm/㎗이었다. 도 9에 도시된 바와 같이, 화합물 A는 화합물 투여의 개시이후 5일(39일) 시점에 빈혈성 동물에서 헤모글로빈 수준을 증가시켰다. 헤모글로빈 수준은 49일에도 상승된 상태로 유지되고 비-빈혈성 대조 동물에 필적하는 수준에 도달하였는데, 이는 본 발명 화합물이 빈혈성 동물에서 정상적인 헤모글로빈 수준을 회복시킨다는 것을 암시한다. 이들 결과는 화합물 A가 ACD의 쥐 모델을 이용한 빈혈성 동물에서 헤모글로빈을 증가시킨다는 것을 입증한다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 헤모글로빈을 증가시키고 만성 질환 빈혈증을 치료하는데 유효하다.

적혈구 수치

화합물 A 투여는 빈혈성 동물에서 적혈구 수치를 증가시켰다. 도 10에 도시된 바와 같이, 적혈구 수치는 화합물 투여의 개시이후 5일(즉, 도 10에서 39일) 시점에 처리되지 않은 빈혈성 동물에 비하여 화합물 A로 처리된 빈혈성 동물에서 증가하였다. 화합물 A는 ACD의 쥐 모델을 이용한 빈혈성 동물에서 적혈구 수치를 증가시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 적혈구 수치를 증가시키고 만성 질환 빈혈증을 치료하는데 유효하다.

평균 혈구 용적

빈혈성 동물은 비-빈혈성 대조 동물에 비하여 감소된 평균 혈구 용적을 보였다(참조: 도 11). 화합물 A로 처리된 빈혈성 동물은 처리되지 않은 빈혈성 동물에 비하여 처리이후 5일(도 11에서 39일)이후 증가된 평균 혈구 용적을 보였다. 처리된 동물에서 평균 혈구 용적은 전체 실험 기간동안 처리되지 않은 빈혈성 동물에 비하여 상승된 상태로 유지되었다. 이들 결과는 화합물 A가 소적혈구증(즉, microcythemia, 다양한 형태의 빈혈증과 연관된 비정상적으로 작은 적혈구인 소적혈구의 다수 존재)을 개선(즉, 감소)시킨다는 것을 입증한다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 만성 질환 빈혈증에서 소적혈구증을 개선/감소시킨다.

평균 혈구 헤모글로빈

빈혈성 동물은 또한, 감소된 평균 혈구 헤모글로빈 수준을 보였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 화합물 A로 빈혈성 동물의 처리는 처리되지 않은 빈혈성 동물에서 관찰되는 수준 이상으로 평균 혈구 헤모글로빈 수준을 증가시켰다. 이들 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 평균 혈구 헤모글로빈 수준을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다.

ACD의 동물 모델 - 실험 시리즈 2:

암컷 Lewis 쥐(대략 150-200 gm)는 PG-PS(복강내)를 주입하였다. 28일동안 관절염과 빈혈증을 발생시켰다. 동물은 경구 위관 영양으로, PG-PS 주입으로부터 28, 31, 35, 38, 42, 45, 49, 52, 56, 59, 63, 66, 70 일에 해당하는 6주간 주 2회(월요일과 목요일) 화합물 A를 투여하였다.

CBC 분석을 위하여 28, 42, 56, 70일에 꼬리 정맥을 통하여 전혈을 수집하였다. 이에 더하여, 철 결합 분석을 위하여 70일에 혈청을 수집하였다. CBC와 철 결합 분석은 Quality Clinical Labs(Mountain View, CA)에서 수행하였다.

헤마토크리트

헤마토크리트 수준은 PG-PS 공격이후 28일 시점에 동물에서 감소하였다. 도 13에서는 PG-PS가 주입된 동물에 빈혈이 발생하고 헤마토크리트가 공격되지 않은(비-빈혈성) 동물에 비하여 85% 수준이라는 것을 도시한다(도 13에서 0주는 본 실험 프로토콜에서 28일에 해당한다). 화합물 A(40 ㎎/㎏)로 처리된 공격되지 않은(비-빈혈성) 동물에서 헤마토크리트 수준은 시간이 흐름에 따라, 공격되지 않고 처리되지 않은 동물에 비하여 110% 이상으로 상승하였다. 도 13에 도시된 바와 같이, 빈혈성 동물에 화합물 A의 투여는 헤마토크리트 수준을 증가시켰다.

헤모글로빈

화합물 A 투여는 빈혈성 동물과 비-빈혈성 동물 모두에서 헤모글로빈 수준을 증가시켰다. 도 14에 도시된 바와 같이, 화합물 A(40 ㎎/㎏)로 처리된 비-빈혈성 동물에서 헤모글로빈 수준은 처리되지 않은 동물에 비하여 대략 110%로 상승하였다(도 14에서 0주는 본 실험 프로토콜에서 28일에 해당한다). 빈혈성 동물에서, 헤모글로빈 수준은 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏ 또는 40 ㎎/㎏ 화합물 A의 주 2회 투여이후에 상승하였다. 헤마토크리트 수준은 적어도 4주동안 지속적으로 상승하였다.

적혈구 수치

빈혈성 동물은 비-빈혈성 동물보다 낮은 적혈구 수치를 보였다. 구체적으로, PG-PS 주입이후 28일 시점에, 빈혈성 동물에서 적혈구 수치는 비-빈혈성 동물에서 관찰되는 수치의 90% 미만이었다. 도 15에 도시된 바와 같이, 적혈구 수치는 처리되지 않은 동물에 비하여 화합물 A로 처리된 빈혈성 동물에서 증가하였다(도 15에서 0주는 본 실험 프로토콜에서 28일에 해당한다). 증가된 적혈구 수치는 화합물의 투여이후 2주간 관찰되고, 6주 실험 기간동안 지속적으로 증가하였다.

평균 혈구 용적

빈혈성 동물은 비-빈혈성(공격되지 않은) 동물에 비하여 감소된 평균 혈구 용적을 보였다. 도 16에 도시된 바와 같이, PG-PS로 처리된 동물에서 평균 혈구 용적은 시간이 흐름에 따라 지속적으로 감소하였는데, 이는 만성 질환 빈혈증의 효과가 소적혈구성 빈혈증(줄어든 적혈구 개체수와 작아진 적혈구로 특성화됨) 및 이용 불가능한 철 저장에 기인한 헤모글로빈 생산의 불능을 유발한다는 것을 암시한다(도 16에서 0주는 본 실험 프로토콜에서 28일에 해당한다). 빈혈성 동물에 화합물 A의 투여는 평균 혈구 용적에서 감소를 완화시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 화합물과 방법을 이용한 프롤릴 하이드록실라아제의 저해는 만성 질환 빈혈증과 연관된 평균 혈구 용적의 감소 및 철 결핍과 연관된 빈혈증을 완화시키고 평균 혈구 용적을 회복시키며 평균 혈구 용적을 유지하는데 유효하였다. 상기 데이터는 본 발명의 방법과 화합물이 헤모글로빈 생산에 이용되는 저장으로부터 철 이용가능성을 증가시키는데 유효하다는 것을 더욱 뒷받침한다.

평균 혈구 헤모글로빈

빈혈성 동물은 대조 동물에 비하여 평균 혈구 헤모글로빈 수준이 감소하였는데, 이는 만성 질환 빈혈증이 헤모글로빈 생산에 영향을 준다는 것을 암시한다. 도 17에 도시된 바와 같이, 화합물 A가 투여된 빈혈성 동물은 시간이 흐름에 따라, 평균 혈구 헤모글로빈 수준에서 감소가 완화되었다(도 17에서 0주는 본 실험 프로토콜에서 28일에 해당한다).

철 상태 - 혈청 철과 트랜스페린 포화

만성 질환 빈혈증 환자는 임상적으로, 감소된 혈장 철 농도와 트랜스페린 포화로 특성화된다. 정상 동물과 빈혈성 동물에서 혈청 철과 트랜스페린 포화에 대한 본 발명 화합물의 효과를 측정하였다. 만성 질환 빈혈증의 동물 모델을 이용하여, 상기한 바와 같이 펩티도글리칸-폴리사카라이드 중합체를 IP 주사하여 쥐에서 빈혈증을 유도하였다. 28일동안 관절염과 빈혈증을 발생시켰다. 이후, 동물은 다양한 농도의 화합물 A로 6주간 주 2회 처리하였다. 혈청 철 수준과 트랜스페린 포화는 Quality Clinical Labs에서 측정하였다.

도 18A에 도시된 바와 같이, 빈혈성 동물(PG-PS)은 비-빈혈성 동물(sham)에 비하여 낮은 혈청 철 수준을 보였다. 화합물 A의 투여는 빈혈성(PG-PS) 동물과 비-빈혈성 대조(sham) 동물 모두에서 혈청 철 수준을 증가시켰다. 화합물 A로 처리된 동물은 처리되지 않은 비-빈혈성 동물과 처리되지 않은 빈혈성 동물에 비하여 트랜스페린 포화를 증가시켰다(참조: 도 18B). 이들 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 혈청 철 수준과 트랜스페린 포화 비율을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다.

철 흡수

빈혈성 동물(40 ㎎/㎏, 주 2회)에서 화합물 A의 투여이후 6주 시점에, 마이크로어레이 분석을 수행하여 장에서 철 운반과 흡수에 관여하는 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현을 검사하였다. 마이크로어레이 분석은 대략 4,699개의 충분히 특성화된 쥐 유전자 및 대략 10,467 EST 서열과 대략 700개의 비-EST 서열을 포함하는 Rat Unigene 데이터베이스 빌드 99(National Center for Biotechnology Information, Bethesda MD)에서 모든 서열을 대표하는 쥐 게놈 230A 어레이(Affymetrix)를 이용한 상기한 방법으로 수행하였다.

도 19에 도시된 바와 같이, 대조 동물에 화합물 A의 투여는 NRAMP2(열린 막대)와 피토 바이오 펩티드(닫힌 막대)에 대한 mRNA의 장내 발현을 증가시켰다. 처리되지 않은 빈혈성 동물(PG-PS)은 NRAMP2와 피토 바이오 펩티드 모두에 대한 mRNA 발현 수준을 감소시켰다. 이들 결과는 만성 질환 빈혈증이 철 흡수에 관여하는 단백질의 감소된 발현과 연관한다는 것을 암시한다. 하지만, 화합물 A로 처리된 빈혈성 동물은 장에서 NRAMP2와 피토 바이오 펩티드 모두의 증가된 발현을 보였다(도 19). 이들 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 철 운반과 흡수와 연관된 유전자의 발현을 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다. 이에 더하여, 이들 결과는 본 발명의 화합물과 방법이 건강한 개체 및 만성 질환 빈혈증 개체에서 철 흡수와 운반을 증가시킨다는 것을 암시한다.

실시예 21: 인간 개체에서 강화된 조혈

인간 개체에서 조혈에 대한 프롤릴 하이드록실라아제 저해의 효과는 아래와 같이 조사하였다. 20 ㎎/㎏ 경구 용량의 화합물 A는 건강한 인간 지원자에 4주간 주 2회 또는 3회 투여하였다. 화합물 투여이후 다양한 시점에서, EPO, 헤모글로빈, 헤마토크리트, 적혈구 수치, 가용성 트랜스페린 수용체, 혈청 훼리틴 수준의 분석을 위한 혈액을 채취하였다.

망상적혈구 수치

도 20에 도시된 바와 같이, 인간 개체에 화합물 A의 투여는 위약 대조의 수치 이상으로 망상적혈구 수치를 증가시켰다. 증가된 망상적혈구 수치는 주 2회 또는 3회 화합물이 투여된 개체에서 관찰되었다. 망상적혈구 수준은 처리되지 않은 개체에서 대략 1.4% 수준에 비하여 처리된 개체에서 적혈구의 대략 1.7% 이상으로 상승하였다. 화합물 A 투여는 인간 개체에서 망상적혈구 수치를 증가시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 방법과 화합물은 조혈을 강화시키고 망상적혈구 수준을 증가시키는데 유효하다.

헤마토크리트

헤마토크리트 수준은 화합물 A로 처리된 인간 개체에서 상승하였다. 3주간 주 2회 화합물 A가 투여된 인간 개체에서, 헤마토크리트 수준은 위약 대조 개체에서 대략 44%에 비하여 46% 이상이었다.

화합물 A는 인간 개체에서 헤마토크리트를 증가시켰다. 이런 이유로, 본 발명의 화합물과 방법은 조혈을 강화시키고 헤마토크리트를 증가시키는데 유효하다.

적혈구 수치

화합물 A 투여는 인간 개체에서 적혈구 수치를 증가시켰다. 도 21에 도시된 바와 같이, 적혈구 수치는 처리되지 않은 위약 대조 개체에 비하여, 20 ㎎/㎏ 화합물 A가 주 2회 또는 3회 투여된 인간 개체에서 증가하였다. 이들 데이터는 본 발명의 방법과 화합물이 조혈을 강화시키고 적혈구 수치를 증가시키는데 유효하다는 것을 암시한다.

철 상태 -가용성 트랜스페린 수용체와 혈청 훼리틴

앞서 보인 결과는 본 발명의 방법과 화합물이 인간 개체에서 망상적혈구 수치, 적혈구, 헤모글로빈, 헤마토크리트를 증가시키는데 유효하다는 것을 입증한다. 도 22에 도시된 바와 같이, 인간 개체에 화합물 A 투여는 처리되지 않은 대조 개체에서 관찰되는 수준 이상으로 가용성 트랜스페린 수용체 수준을 상승시켰다. 상승된 가용성 트랜스페린 수준은 주 2회 또는 3회 처리된 인간 개체에서 관찰되었다. 35%와 31%의 최대 반응은 각각 주 2회와 3회 처리된 환자에서 21일 시점에 관찰되었다. 위약 환자에서 sTfR의 평균 혈장 농도는 불변하였다. 이에 더하여, 혈청 훼리틴 수준이 화합물 A로 처리된 인간 개체에서 대략 46% 감소하였는데, 이는 이들 개체에서 증가된 철 이용을 암시한다(참조: 도 23).

종합하면, 이들 데이터는 본 발명의 화합물과 방법을 이용한 HIF 안정화가 철 저장의 증가된 동원; 철의 골수로의 증가된 운반; 헤모글로빈 합성, 조혈, 적혈구 생산을 위한 철의 증가된 이용을 결과한다는 것을 암시한다.

본원에 도시되고 기술된 것들을 비롯하여 본 발명의 다양한 개변은 상기한 명세서로부터 당업자에게 명백하다. 이런 개변은 첨부된 특허청구범위에 속한다.

본원에 언급된 모든 참고문헌은 순전히 참조로 한다.

Claims (90)

1. 하기와 같은 화학식 I을 가진 헤테로환형 카르보닐 글리신 화합물 또는 이의 생리학적으로 활성 염을 활성 성분으로 하는 개체에서 만성 질환 빈혈증 치료용 약학 조성물:

   화학식 I

   

   A는 (C₁-C₄)-알킬렌이며;

   B는 -CO₂H, 또는 CO₂-G 카르복시 라디칼이고, 여기서 G는 알코올 G-OH의 라디칼이고, (C₁-C₂₀)-알킬 라디칼 또는(C₇-C₁₆)-카르보사이클릭 아르알킬 라디칼에서 선택되며;

   X는 O이고;

   Q는 O이고,

   R⁴는 수소 또는 아릴 라디칼이고,

   Y는 N 또는 CR³이고;

   R¹, R²와 R³은 동일하거나 상이하고, 수소, 하이드록실, 할로겐, 시아노, (C₁-C₂₀)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₆)-아르알킬, (C₁-C₂₀)-알콕시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시, -O-[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g, 카바모일, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N-((C₁-C₁₈)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, 또는 (C₆-C₁₂)-아릴멀캅토이며,

   이때 아릴 라디칼은 할로겐, 시아노, (C₂-C₁₆)-알킬, (C₁-C₁₆)-알콕시, 카르바모일로부터 선텍된 1 내지 5개 치환체로 치환될 수 있으며; 또는

   R¹, R²와 R³은 이들을 보유하는 피리미딘 또는 피리다진과 결합하여 구조식 Ia, Ib, Ic 또는 Id로부터 선택된 임의로 치환된 헤테로환 고리를 형성하고;

   화학식 Ia

   

   화학식 Ib

   

   화학식 Ic

   

   화학식 Id

   

   V는 NR^k이고, R^k는 (C₁-C₆)-알킬 또는 아릴에서 선택되고; 아릴 라디칼은 앞서 정의된 바와 같은 1개 내지 5개의 치환기로 선택적으로 치환되고,

   각 경우에 독립적으로 R¹² 내지 R²⁷은 R¹, R², R³과 동일한 의미를 갖고;

   f는 1이고;

   g는 3이고;

   x는 0이다.
2. 청구항 1에 있어서, 새로운 적혈구 세포를 만드는데 이용가능한 철의 양을 증가시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 만성 질환 빈혈증은 류머티스 관절염, 류머티스 열, 염증성 장 질환, 전신성 루프스 홍반, 맥관염, 신생물 질환, 만성 감염, 또는 만성 염증에서 선택되는 만성 질환과 연관되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 개체는 염증성 사이토킨의 증가된 생산을 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
5. 청구항 4에 있어서, 염증성 사이토킨은 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-1β(IL-1β)와 인터페론-γ(IFN-γ)를 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
6. 하기와 같은 화학식 I을 가진 헤테로환형 카르보닐 글리신 화합물 또는 이의 생리학적으로 활성 염을 활성 성분으로 하는 개체에서 외부 투여된 에리트로포이에틴(EPO)을 이용한 치료에 저항하는 빈혈증 치료용 약학 조성물:

   화학식 I

   

   A는 (C₁-C₄)-알킬렌이며;

   B는 -CO₂H, 또는 CO₂-G 카르복시 라디칼이고, 여기서 G는 알코올 G-OH의 라디칼이고, (C₁-C₂₀)-알킬 라디칼 또는(C₇-C₁₆)-카르보사이클릭 아르알킬 라디칼에서 선택되며;

   X는 O이고;

   Q는 O이고,

   R⁴는 수소 또는 아릴 라디칼이고,

   Y는 N 또는 CR³이고;

   R¹, R²와 R³은 동일하거나 상이하고, 수소, 하이드록실, 할로겐, 시아노, (C₁-C₂₀)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₆)-아르알킬, (C₁-C₂₀)-알콕시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시, -O-[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g, 카바모일, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N-((C₁-C₁₈)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, 또는 (C₆-C₁₂)-아릴멀캅토이며,

   이때 아릴 라디칼은 할로겐, 시아노, (C₂-C₁₆)-알킬, (C₁-C₁₆)-알콕시, 카르바모일로부터 선텍된 1 내지 5개 치환체로 치환될 수 있으며; 또는

   R¹, R²와 R³은 이들을 보유하는 피리미딘 또는 피리다진과 결합하여 구조식 Ia, Ib, Ic 또는 Id로부터 선택된 임의로 치환된 헤테로환 고리를 형성하고;

   화학식 Ia

   

   화학식 Ib

   

   화학식 Ic

   

   화학식 Id

   

   V는 NR^k이고, R^k는 (C₁-C₆)-알킬 또는 아릴에서 선택되고; 아릴 라디칼은 앞서 정의된 바와 같은 1개 내지 5개의 치환기로 선택적으로 치환되고,

   각 경우에 독립적으로 R¹² 내지 R²⁷은 R¹, R², R³과 동일한 의미를 갖고;

   f는 1이고;

   g는 3이고;

   x는 0이다.
7. 청구항 6에 있어서, 빈혈증은 만성 염증성 질환 또는 자가 면역 질환에 의해 유발되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
8. 청구항 7에 있어서, 질환은 만성 박테리아 심장내막염, 골수염, 류머티스 관절염, 류머티스 열, 크론병, 또는 궤양성 대장염에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
9. 청구항 6에 있어서, 골수의 EPO 반응성을 강화시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
10. 청구항 6에 있어서, EPO의 TNFα 또는 IL-1β 억제를 저해하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
11. 청구항 6에 있어서, EPO에 대한 조혈 선조세포의 반응성을 강화시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
12. 하기와 같은 화학식 I을 가진 헤테로환형 카르보닐 글리신 화합물 또는 이의 생리학적으로 활성 염을 활성 성분으로 하는 개체에서 소적혈구증(microcytosis) 또는 소적혈구성 빈혈증(microcytic anemia) 치료 또는 예방용 약학 조성물:

    화학식 I

    

    A는 (C₁-C₄)-알킬렌이며;

    B는 -CO₂H, 또는 CO₂-G 카르복시 라디칼이고, 여기서 G는 알코올 G-OH의 라디칼이고, (C₁-C₂₀)-알킬 라디칼 또는(C₇-C₁₆)-카르보사이클릭 아르알킬 라디칼에서 선택되며;

    X는 O이고;

    Q는 O이고,

    R⁴는 수소 또는 아릴 라디칼이고,

    Y는 N 또는 CR³이고;

    R¹, R²와 R³은 동일하거나 상이하고, 수소, 하이드록실, 할로겐, 시아노, (C₁-C₂₀)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₆)-아르알킬, (C₁-C₂₀)-알콕시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시, -O-[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g, 카바모일, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N-((C₁-C₁₈)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, 또는 (C₆-C₁₂)-아릴멀캅토이며,

    이때 아릴 라디칼은 할로겐, 시아노, (C₂-C₁₆)-알킬, (C₁-C₁₆)-알콕시, 카르바모일로부터 선텍된 1 내지 5개 치환체로 치환될 수 있으며; 또는

    R¹, R²와 R³은 이들을 보유하는 피리미딘 또는 피리다진과 결합하여 구조식 Ia, Ib, Ic 또는 Id로부터 선택된 임의로 치환된 헤테로환 고리를 형성하고;

    화학식 Ia

    

    화학식 Ib

    

    화학식 Ic

    

    화학식 Id

    

    V는 NR^k이고, R^k는 (C₁-C₆)-알킬 또는 아릴에서 선택되고; 아릴 라디칼은 앞서 정의된 바와 같은 1개 내지 5개의 치환기로 선택적으로 치환되고,

    각 경우에 독립적으로 R¹² 내지 R²⁷은 R¹, R², R³과 동일한 의미를 갖고;

    f는 1이고;

    g는 3이고;

    x는 0이다.
13. 제 12항에 있어서, 소적혈구증은 만성 질환, 만성 질환 빈혈증, 철 결핍증, 기능성 철 결핍증, 또는 철 결핍 빈혈증에서 선택되는 질환과 연관되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 질환은 만성 질환 빈혈증인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
15. 하기와 같은 화학식 I을 가진 헤테로환형 카르보닐 글리신 화합물 또는 이의 생리학적으로 활성 염을 활성 성분으로 하는 개체에서 철 결핍증 치료 또는 예방용 약학 조성물:

    화학식 I

    

    A는 (C₁-C₄)-알킬렌이며;

    B는 -CO₂H, 또는 CO₂-G 카르복시 라디칼이고, 여기서 G는 알코올 G-OH의 라디칼이고, (C₁-C₂₀)-알킬 라디칼 또는(C₇-C₁₆)-카르보사이클릭 아르알킬 라디칼에서 선택되며;

    X는 O이고;

    Q는 O이고,

    R⁴는 수소 또는 아릴 라디칼이고,

    Y는 N 또는 CR³이고;

    R¹, R²와 R³은 동일하거나 상이하고, 수소, 하이드록실, 할로겐, 시아노, (C₁-C₂₀)-알킬, (C₆-C₁₂)-아릴, (C₇-C₁₆)-아르알킬, (C₁-C₂₀)-알콕시, (C₆-C₁₂)-아릴옥시, (C₇-C₁₆)-아르알킬옥시, -O-[CH₂]_X-C_fH_(2f+1-g)-F_g, 카바모일, N-(C₁-C₁₂)-알킬카바모일, N-((C₁-C₁₈)-알콕시-(C₁-C₁₀)-알킬)-카바모일, 또는 (C₆-C₁₂)-아릴멀캅토이며,

    이때 아릴 라디칼은 할로겐, 시아노, (C₂-C₁₆)-알킬, (C₁-C₁₆)-알콕시, 카르바모일로부터 선텍된 1 내지 5개 치환체로 치환될 수 있으며; 또는

    R¹, R²와 R³은 이들을 보유하는 피리미딘 또는 피리다진과 결합하여 구조식 Ia, Ib, Ic 또는 Id로부터 선택된 임의로 치환된 헤테로환 고리를 형성하고;

    화학식 Ia

    

    화학식 Ib

    

    화학식 Ic

    

    화학식 Id

    

    V는 NR^k이고, R^k는 (C₁-C₆)-알킬 또는 아릴에서 선택되고; 아릴 라디칼은 앞서 정의된 바와 같은 1개 내지 5개의 치환기로 선택적으로 치환되고,

    각 경우에 독립적으로 R¹² 내지 R²⁷은 R¹, R², R³과 동일한 의미를 갖고;

    f는 1이고;

    g는 3이고;

    x는 0이다.
16. 청구항 15에 있어서, 철 결핍증은 기능성 철 결핍증이거나, 빈혈증과 연관되거나, 염증, 감염, 면역결핍 질환, 또는 신생물 질환에서 선택되는 질환과 연관되거나, 또는 만성 질환 빈혈증, 철 결핍 빈혈증(IDA), 또는 소적혈구성 빈혈증에서 선택되는 질환과 연관되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
17. 청구항 15에 있어서, 개체는 50 ng/㎖ 미만 또는 200 ng/㎖ 초과의 혈청 훼리틴 수준, 또는 개체가 성체인 경우에, 16% 미만의 트랜스페린 포화 %를 갖는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
18. 청구항 15에 있어서, 개체는 철 결핍증을 앓는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
19. 청구항 18에 있어서, 개체는 기능성 철 결핍증을 앓는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
20. 청구항 19에 있어서, 개체는 5% 초과의 저색소성 적혈구(hypochromic red cell)를 나타내는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
21. 청구항 18에 있어서, 활성 성분 화합물은 개체에서 망상적혈구를 증가시키거나, 헤마토크리트를 증가시키거나, 헤모글로빈을 증가시키거나, 적혈구 수치를 증가시키거나, 평균 혈구 용적을 증가시키거나, 평균 혈구 헤모글로빈을 증가시키거나, 혈청 철을 증가시키거나, 또는 트랜스페린 포화를 증가시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
22. 청구항 1, 6, 12 또는 15에 있어서, 활성 화합물은 개체에서 헵시딘(hepcidin) 발현을 감소시키는데 이용되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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27. 청구항 1 내지 21중 어느 한 항에 있어서, R¹과 R², 또는 R²와 R³은 그들을 보유하는 피리미딘 또는 피리다진과 결합하여 화학식 Ia, Ib, Ic를 충족하는 선택적으로 치환된 퀴놀린, 이소퀴놀린 또는 신놀린을 형성하는 것을 특징으로 약학 조성물:

    화학식 Ia

    

    화학식 Ib

    

    화학식 Ic

    

    화학식 Ia, Ib, Ic

    각 경우에 독립적으로 치환기 R¹² 내지 R²³은 R¹, R², R³과 동일한 의미를 갖는다.
28. 청구항 1 내지 21중 어느 한 항에 있어서, 헤테로환형 카르보닐 글리신은 [(1-클로로-4-하이드록시-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노]-아세트산인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
29. 청구항 1 내지 21중 어느 한 항에 있어서, 헤테로환형 카르보닐 글리신은 [(4-하이드록시-7-페녹시-이소퀴놀린-3 카르보닐)-아미노]-아세트산인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
30. 청구항 1 내지 21중 어느 한 항에 있어서, 헤테로환형 카르보닐 글리신은 [(4-하이드록시-7-페닐설파닐-이소퀴놀린-3-카르보닐)-아미노-아세트산인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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