CN101892183B - 一种适用于大豆发酵的菌株,包含该菌株的发酵剂及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于农业微生物和食品加工技术领域，具体涉及一种作为微生物发酵剂的菌株，包含该菌株和米曲霉的复合发酵剂及其应用。本发明的特征在于分离、筛选得到一株保藏号为CCTCC NO：M201028的适合豆豉发酵用的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YDC-001，利用该芽孢杆菌与米曲霉(Aspergillus oryzae)A3042制成微生物复合发酵剂。该复合发酵剂可应用于大豆发酵制品生产。该微生物复合发酵剂具有良好的发酵性能，发酵后的产品具有典型的豉香味和鲜味。本发明的复合发酵剂易于工业化生产。

Description

一种适用于大豆发酵的菌株,包含该菌株的发酵剂及应用

技术领域

本发明属于食品发酵和食品加工技术领域，具体涉及一种作为微生物发酵剂的菌株筛选，包含该菌株的复合发酵剂(菌剂)及其在大豆制品特别是豆豉制品中的应用。 

背景技术

大豆发酵食品是我国的传统食品，但目前大多采用自然发酵和和纯种发酵方法生产。前者制成的豆豉，风味独特，但加工时间长，过程中容易引起杂菌污染；后者缩短了发酵时间，但豆豉的风味单一，没有自然发酵好。所以，研究大豆发酵食品的发酵剂对于传统发酵食品的工业化生产具有重要意义。 

曲霉豆豉的生产中起主要作用的微生物是米曲霉，特别是在制曲阶段是米曲霉起作用，而在自然发酵豆豉中也有细菌参与制曲的发酵过程。传统的生产均为自然发酵或接入纯种米曲霉进行人工发酵，由于发酵的过程微生物菌系复杂，且在发酵的过程中微生物的活性和比例容易发生变化，容易受杂菌污染，导致豆豉生产的周期拉长，而且产品的质量也不稳定。但曲霉豆豉的发酵过程，实质是由不同的菌系共同作用，产生的风味物质的过程，虽然曲霉在其中起到主导作用，但其他菌系的作用也不能忽视。所以，从豆豉中分离关键发酵菌，与米曲霉制成混合发酵剂，既可以缩短发酵时间又可以改善单菌种发酵豆豉风味。 

微生物发酵剂是用于生产发酵制品的特定微生物培养物，微生物发酵剂在发酵制品生产中的应用，改变了传统的发酵制品生产的模式，开发发酵制品的专用微生物发酵剂是解决传统发酵食品的工业化生产的重要方法。直接使用微生物发酵剂具有如下优点：发酵活力强，发酵时间短；可以保持微生物菌种的活性、比例；可有效地防止杂菌的污染(李元莉等，功能性乳酸菌在食品发酵工业中的应用，中国乳品工业，2006，1：35-37)；可以节省原材料，降低成本，避免发酵失败；还可以保证发酵产品质量的稳定(贺稚非等，泡菜活性直投式乳酸菌发酵剂的研究，食品科学，2006，8：191-197)；微生物发酵剂接种量小，可以精确控制发酵工程(杜磊等，乳酸菌浓缩发酵剂的研究意义，河南畜牧兽医，2007，2：13)等等。 

多菌种发酵是微生物发酵领域中通用技术问题。在大豆发酵制品中，多菌种制曲或发酵是最常用的手段，特别是在提高酱油风味的应用中(李琴等，双菌种制曲在酱油生产中的应用，中国调味品，2003(12)：36-38；邹镜铭，多菌种混合制曲提高酱油质量，中国调味品，2005(4)：33-34)。在其他的大豆发酵制品中混合多菌种发酵也得到广泛研究(刘福林等，多菌种发酵蚕豆酱的研制，中国酿造，1999(1)：11-14；王瑞芝，多菌种酿制乳腐，中国调味品，1998(9)：6-10)多菌种混合发酵可以弥补单菌种发酵的单调性，不仅使产品风味物质更加丰富，而且提高产品质量，还可增加产品的多样性，扩大市场消费(贾原媛等，多菌种混合发酵生产细菌纤维素和饮料，2008(7)：118-121；吴茂玉等，共固定化多菌种混合发酵生产苹果醋的研究，2001(8)：15-19)。根据产品的需要，微生物发酵在食品工业中的应用越来越广泛，特别是在调味品中的应用，其中多菌种混合发酵已成为调味品生产的主要研究方向。 

在工业生产上，微生物发酵剂的应用已逐渐成为热门，对各种发酵剂的研究也相继增多。但还是主要集中在酸奶，肉类和发酵香肠的研究领域，对于在大豆类发酵食品中的应用主要集中在酱油和豆酱上，目前还没有米曲霉与细菌混合发酵大豆制曲的相关报道。 

发明内容

本发明的第一个目的是从曲霉豆豉的中分离出发酵性能良好的纯种菌株作为微生物发酵剂应用的菌株；本发明的第二个目的是制备作为大豆发酵制品特别是豆豉发酵用的包含本发明筛选的细菌(枯草芽孢杆菌)和米曲霉的复合发酵剂(菌剂)；本发明的第三个目的是含有本发明制备的微生物菌株的复合发酵剂(菌剂)在豆豉生产中的应用，以达到改善大豆发酵制品(豆鼓)口味及增香的目的。 

本发明通过下列技术方案实现： 

申请人通过分离筛选得到一株适用于豆制品(特别是豆鼓)酿造的菌株，该菌株为一种细菌，即，一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YDC-001，该菌株于2010年6月1日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M201028。 

申请人将分离获得的保藏号为CCTCC NO：M201028的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YDC-001和米曲霉(Aspergillus oryzae)A3042(该米曲霉A3042菌株购自中国，北京市，海淀区，中关村，中国科学院微生物研究所)混合制备成一种适用于大豆制品特别是豆豉发酵的微生物复合发酵剂。 

申请人利用上述菌株可以制备成单菌发酵剂(例如枯草芽孢杆菌YDC-001菌剂，或称菌剂)和复合发酵剂(例如枯草芽孢杆菌YDC-001与米曲霉A3042的混合制曲的菌剂，或称复合菌剂)，经过生物学验证表明本发明的的菌株或菌剂(发酵剂)具有下列特征； 

1)单菌剂枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YDC-001的发酵剂的活菌数实测达到1.5×10¹⁰cfu/g，米曲霉(Aspergillus oryzae)A3042的活菌数均达到3.5×10¹¹cfu/g以上。 

2)由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YDC-001与米曲霉(Aspergillus oryzae)A3042混合制备的复合发酵菌剂(固态发酵剂，含水量为20％以下)的活菌数实测达到10¹⁰cfu/g以上。 

1、枯草芽孢杆菌YDC-001菌株的分离、筛选和鉴定： 

如附图1所示，本发明的芽孢杆菌的分离和鉴定方法如无特别说明均参照周德庆主编，《微生物学实验手册》，上海科学技术出版社，1986年。东秀珠等，《常见细菌系统鉴定手册》，北京，科学出版社，1999年。布坎南和吉本斯，《伯杰细菌鉴定手册》(第8版)，北京，科学出版社，1984年。本发明的菌株枯草芽孢杆菌YDC-001是本申请人从中国不同豆豉产品中分离得到17个候选菌株，经耐盐实验、蛋白酶活力测定等筛选得到的1株细菌，并通过参照伯杰氏细菌鉴定手册进行生理生化鉴定试验，包括革兰氏染色、运动性、过氧化氢酶试验、乙酰甲基醇试验(V-P)、NaCl浓度试验、淀粉水解试验、糖分解代谢形式试验、柠檬酸盐利用试验和硝酸盐还原试验。经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 

2、枯草芽孢杆菌YDC-001菌株的保藏： 

该枯草芽孢杆菌YDC-001菌株保藏参照上述《微生物学实验手册》操作，按常规保藏方法保藏。 

3、本发明的枯草芽孢杆菌YDC-001菌株的菌学特征： 

本发明的枯草芽孢杆菌YDC-001菌株革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，染色后显微镜下清楚观察到芽孢。在牛肉膏蛋白胨固体培养基上形成的菌落乳白色、边缘不规则、表面皱褶、不透明。发酵葡萄糖、木糖、甘露醇、L-阿拉伯糖；过氧化氢酶实验阳性；V-P测试阳性；淀粉水解呈阳性；柠檬酸盐试验阳性，硝酸盐还原试验阳性。 

本发明的枯草芽孢杆菌YDC-001菌株在分类学上属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 

与传统豆豉生产所用的天然发酵微生物相比，本发明具有以下突出优点： 

1、本发明的枯草芽孢杆菌YDC-001菌株可以作为优质豆豉专用发酵剂：本发明作为高活菌数的菌种培养物接入到大豆发酵制品(例如豆豉)中，在豆豉发酵过程中，能够实现强化发酵，缩短发酵时间，发酵特性好，产品质量稳定。 

2、本发明的枯草芽孢杆菌YDC-001发酵剂(单菌的菌剂)使用方便：本发明的发酵剂可直接添加到豆豉的发酵过程中，不需添加其他添加剂，使用方便。 

3、本发明的复合发酵菌剂混合了枯草芽孢杆菌和米曲霉两种菌种，其中枯草芽孢杆菌发酵豆豉产生特有的细菌型豆豉的豉香，与米曲霉共同使用则可以缩短制曲时间，赋予曲霉豆豉特别的风味。 

附图说明

图1：是本发明的菌种分离、筛选以及鉴定的技术流程。 

图2：是本发明的固态复合发酵剂(菌剂)的构建流程。 

图3：是利用本发明发酵剂(菌剂)生产曲霉豆豉工艺路线。 

图4：三种豆豉的主要挥发性成分及其相对含量分析。 

具体实施方式

实施例1：菌株的分离、筛选与鉴定 

1、分离培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制备 

分离培养基成分：按g/L计，蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂15-17g，补充蒸馏水至1000mL，调培养基的pH至7.4。将培养基分装到三角瓶中，于0.1Mpa的高压蒸汽下灭菌20min后备用。 

2、分离方法(稀释平板法) 

2.1样品稀释液的制备： 

用1ml无菌吸管吸取富集培养液(即上述分离培养基)1ml，放入装有9ml无菌水的试管中，振荡混匀即成10^-1稀释液；再用1ml无菌吸管吸取10^-1稀释液1ml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10^-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10^-2稀释液1ml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10^-3稀释液；以次类推，每次更换吸管，连续稀释至10^-5、10^-6、10^-7稀释度。 

2.2平板接种培养： 

采用混平板法：用无菌吸管吸取1ml菌液加入灭菌的培养皿中，倒入冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，混合均匀，凝固后将平板倒置37℃保温培养1-2天。 

2.3、挑菌纯化： 

从培养过的平板中选取分离较好的细菌单菌落转接斜面。不同的菌株的菌落形态各异，据此可在一定程度上鉴别微生物。 

2.4、菌株筛选： 

1)菌株的耐盐试验 

10％NaCl液体培养基成分：按g/L计，牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 100g，补充蒸馏水至1000mL，调培养基的pH至7.4。将该培养基分装至试管(培养基装试管高度1/4左右为宜)，在0.1Mpa的高压蒸汽下灭菌20min后备用。 

将2.3步骤制备的菌种接入浓度为10％NaCl液体培养基的试管中，于37℃培养箱中培养2天，采用比色法比较各菌株的生长情况，筛选出在高盐状态下仍正常生长繁殖的菌株9株。 

2)蛋白酶分解菌筛选 

脱脂牛乳琼脂培养基：pH为7.4的琼脂1000mL，脱脂牛乳100mL。熔化琼脂，冷却50℃左右，加入灭菌的脱脂牛乳，混合均匀后倾注平板。 

生长曲线法：将2.4.1步骤筛选出的菌种接入脱脂牛乳琼脂培养基，20℃培养3天，用浓度为1％的盐酸或浓度为10％的醋酸溶液淹没平板1min，倾去多余的酸溶液。测定水解圈与菌落圈直径比值，筛选出蛋白酶产量较高的菌株5株。 

3)发酵大豆试验 

将2.4.2步骤中得到的菌株，接种到蒸熟的大豆中制曲发酵36h，然后按照曲霉豆豉的制作工艺(李里特，《大豆加工与利用》，化学工业出版社，2004年版)，将大豆用浓度为16％的食盐酿造，在35℃后熟5天，比较其风味。最后筛选出三株菌株(编号分别为YDC-001，YDC-2和YDC-3)发酵的大豆具有细菌豆豉独有的风味。其中：YDC-001菌株发酵大豆有豆豉的酸味和轻微酱香；YDC-2菌株发酵大豆具有豆豉应有的弱酸味；YDC-3菌株发酵大豆有部分酱香和醋酸气味。 

综合以上试验，申请人最终选定编号分别为YDC-001菌株作为本单菌种发酵剂的菌株。 

2.5、细菌(YDC-001菌株)的鉴定： 

细菌细胞形态观察、革兰氏染色、过氧化氢酶、糖类发酵试验、柠檬酸盐、V-P试验、硝酸盐还原试验和淀粉水解，参考周德庆主编，《微生物学实验手册》，上海科学技术出版社，1986年版，《常见细菌系统鉴定手册》，北京科学出版社，1999年版；《伯杰细菌鉴定手册》，第8版，北京科学出版社，1984年。将细菌鉴定到种。确定本发明筛选的菌株YDC-001为一株枯草芽孢杆菌。 

本发明的枯草芽孢杆菌的保藏培养基为牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，配方如下：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂15-17g，补充蒸馏水至1000mL，灭菌前调培养基的pH至7.4。在0.1Mpa的高压蒸汽下灭菌20min。 

实施例2单菌种发酵剂(或称菌剂)的制备 

1、试验材料：枯草芽孢杆菌YDC-001为本发明分离筛选得到一株新菌株，米曲霉A3042购自中国科学院微生物研究所；甘油；脱脂乳为商品。 

2、枯草芽孢杆菌发酵剂的制作 

1)斜面试管菌种的培养：将枯草芽孢杆菌YDC-001接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(配方同实施例1的分离培养基)该培养基在灭菌前调pH至6.0左右)斜面固体上，在37℃条件下培养1-2d，使其活化即成为斜面菌种。 

2)三角瓶扩大培养 

增菌液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，补充蒸馏水至1000mL，灭菌前调培养基的pH至7.4，在0.1Mpa的高压蒸汽下灭菌20min后备用。 

将上述步骤1)的试管菌种接种三角瓶增菌液体培养基上，于37℃条件下培养1-2d，检测该菌体活菌数达到10⁷cfu/mL以上，备用。 

3)离心条件选择 

申请人通过离心方法，收集达到对数生长期的菌体，离心后上清液中活菌数的残留为评价标准，分别确定离心转数4000rpm和5000rpm时的离心时间。 

表1不同离心条件对枯草芽孢杆菌活菌数的影响(cfu/mL) 

选择4000rpm离心时不能充分将菌体富集，而5000rpm下离心20min和30min均能使收集效果达到最好，且两者差异不大。因此，考虑成本节约，选定最佳离心转数为5000rpm，离心时间20min。 

4)冷冻干燥 

取离心后的菌体，以10％的脱脂乳和5％甘油作为保护剂，制备成悬浮液后置-18℃预冷12h，放入冷冻干燥机(德国christ冷冻干燥机，型号BETR 2-8LD plus，按照产品说明书操作)中，干燥28-32h。 

5)干燥后活菌数计数 

在超净工作台中，取冷冻干燥样1g放入装有9ml无菌水的试管中，振荡混匀即成10^-1稀释液；再用1ml无菌吸管吸取10^-1稀释液1ml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10^-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10^-2稀释液1ml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10^-3稀释液；以次类推，每次更换吸管，连续稀释至10^-9、10^-10、10^-11稀释度。 

采用混平板法；用无菌吸管吸取1ml菌液加入灭菌的培养皿中，倒入冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(配方同本实施例步骤2)，混合均匀，凝固后将平板倒置37℃保温培养1-2天。计算菌落数。经过以上工艺得到的枯草芽孢杆菌冻干粉中的活菌数达到1.5×10¹⁰cfu/g，达到国内冻干菌粉的同等水平。说明本工艺适合于枯草芽孢杆菌YDC-001冻干菌粉制备。 

3、米曲霉A3042发酵剂(或称菌剂)制备 

1)斜面试管菌种的培养 

斜面培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，补充蒸馏水至1000mL，pH自然(原始pH，不作调整)。将马铃薯去皮切块，称取200g加入培养基总体积为1000mL蒸馏水的部分蒸馏水，煮沸10-20min，用双层纱布过滤，再向滤汁中加入葡萄糖和琼脂，补充蒸馏水至1000mL。加热溶化后分装，在0.10MPa的高压蒸汽下灭菌15-20min。 

将米曲霉A3042接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上斜面固体上，在28℃条件下培养1-2d，使其活化即成为斜面菌种。 

2)三角瓶扩大培养 

增菌液体培养基：麸皮80g，面粉20g，水80-85mL，用250mL三角瓶装湿料20g，在0.1Mpa的高压蒸汽下灭菌30min。 

将上述步骤1)的试管菌种米曲霉A3042接种三角瓶增菌培养基上，于28-30℃培养72h，其中摇瓶2次，扣瓶1次，得到米曲霉A3042固态种曲，检测该菌体的活菌数达到10⁷cfu/mL以上，备用。 

3)冷冻干燥 

取制的种曲，加入种曲质量10％的脱脂乳作为保护剂，混合均匀，在-18℃预冷12h，放入冷冻干燥机(型号同前，按照使用说明书操作)中，干燥28-32h。 

4)干燥后活菌数计数 

在超净工作台的无菌环境中，取冷冻干燥的米曲霉A3042样品1g放入装有9ml无菌水的试管中，振荡混匀即成10^-1稀释液；再用1ml无菌吸管吸取10^-1稀释液1ml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10^-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10^-2稀释液1ml放入装有9ml无菌水的试管中，吹吸三次，让菌液混匀，即成10^-3稀释液；以次类推，每次更换吸管，连续稀释至10^-10、10^-11、10^-12稀释度。 

采用混平板法；用无菌吸管吸取1ml菌液(米曲霉A3042)加入灭菌的培养皿中，倒入冷却至50℃左右的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，混合均匀，凝固后将平板倒置28℃保温培养1-2天。计算菌落数。得到活菌数达到3.5×10¹¹cfu/g，米曲霉A3042冻干剂存活率相对较高。因此，说明该工艺适合米曲霉A3040菌剂的制备。 

实施例3枯草芽孢杆菌YDC-001和米曲霉A3042发酵剂混合比例的确定 

1、试验材料 

试验菌株为本发明的枯草芽孢杆菌YDC-001和商购菌株米曲霉A3042，大豆为市售产品。 

2、混合发酵剂菌种比例的确定 

将上述制成的枯草芽孢杆菌YDC-001发酵剂与米曲霉A3042发酵剂分别按照质量比1∶1或1∶2或1∶3的比例混合，制成复合发酵剂(或称复合发酵菌剂)。按照曲霉豆豉的生产工艺(文献同前)，分别添加0.4％质量的不同比例混合发酵剂，制曲后，测定豆曲的蛋白酶活力，与纯种米曲霉制曲的豆曲的蛋白酶活进行比较，选择合适的混合比例。具体操作如下： 

豆豉制曲工艺： 

将500g大豆洗净，放入30℃的温水中浸泡3小时左右(使其重量增加至原重量的2～2.5倍，即，豆粒胀起无皱纹)，放掉浸泡水，晾干备用。 

把浸泡后控干水分的大豆放至锅中，盖好锅盖，蒸至大豆熟透而不烂，用手捻时豆皮脱落，豆瓣分开，手捻豆子稍有硬心为宜。 

将蒸熟的大豆出锅，冷却，按原料质量的0.4％加入复合发酵剂，拌匀，放于30℃培养箱中培养36-40h，每7～8个小时翻曲一次。 

蛋白酶活力测定： 

蛋白酶活力的测定采用福林-酚试剂法。具体操作步骤参见：吴国峰等主编，《工业发酵分析》，化学工业出版社，2006年版介绍的方法。 

表2不同发酵剂(菌剂)的配合比例对豆鼓发酵中的蛋白酶活力的影响 

豆豉制曲的主要作用是微生物产生各种酶系，代谢分解大豆中的主要大分子成分。其中蛋白酶是豆豉曲中最主要的酶系，它使蛋白质降解为分子量较小的肽或氨基酸，这些都是豆豉风味形成的基物。因此，蛋白酶活力的高低，可以作为判断豆豉曲好坏的标准。由表2可知，当枯草芽孢杆菌YDC-001菌剂与米曲霉A3040菌剂按质量比为1∶3的比例混合后投放入大豆中，制得的豆豉曲蛋白酶活力最高，且与米曲霉A3040纯菌剂发酵豆曲的酶活力较接近。但如果酶活力过高则发酵过程中蛋白质水解过度，易使豆豉产生苦味。所以，综合以上考虑，枯草芽孢杆菌YDC-001菌剂按质量比1∶3与米曲霉A3040菌剂混合后发酵豆豉，可以有效提高豆曲蛋白酶的活力，同时也可以缩短制曲的时间。 

实施例4混合发酵剂发酵豆豉的应用 

1、试验材料 

复合发酵剂按实施例3的方法制作(枯草芽孢杆菌YDC-001和米曲霉A3040复合发酵剂，菌种的质量比为1∶3)，大豆为市售产品(同实施例3)，“一品香豆豉”为湖南浏阳生产，散装豆豉为市售产品。 

2豆豉制作工艺 

浸豆：将大豆洗净，放入30℃的温水中浸泡4小时左右(使其重量增至原重量的2.1～2.5倍，即，豆粒胀起无皱纹)，放掉浸泡水，晾干备用。 

蒸豆：把浸泡后控干水分的大豆放至压力锅中，盖好锅盖，121℃蒸20min，大豆熟烂。 

制曲：将蒸熟的大豆出锅，冷却，以原料质量的0.3-0.4％加入混合发酵剂(按实施例2、3的方法制作，混合比例1∶3)，拌匀，放于30℃培养箱中培养36-40h，每7～8个小时翻一次曲。 

洗曲：用清水把豆豉的成品曲表面的霉菌以及污物清洗干净，大水冲洗10min，注意不要破皮。后发酵：将大豆沥干，加入15-16％食盐，拌匀，压实装罐密封，在35℃培养箱中培养15d。 

干豆豉：豆豉发酵好后，放在阴凉处风干，即成豆豉成品。 

3、豆豉理化指标测定 

以上述混合发酵剂发酵豆豉，分别测定豆豉的水分、蛋白质、氨基酸、总酸、还原糖含量，具体测定步骤参见：吴国峰等主编，《工业发酵分析》，化学工业出版社，2006年版。结果与米曲霉豆豉标准进行比较(李里特主编，《大豆加工与利用》，化学工业出版社，2004版)，结果如表3所示。 

表3本发明生产的豆豉理化指标比较 

由表3可以看出，采用混合发酵的豆豉蛋白质和氨基酸的含量都比较高，其中氨基酸含量是标准的1.5倍。豆豉的鲜味主要就是由氨基酸产生的，因此，采用混有枯草芽孢杆菌YDC-001菌剂的混合发酵剂发酵豆豉，豆豉的鲜味更突出。此外，本豆豉的还原糖和总酸的含量也较高，使得豆豉的口感除了咸鲜外，更加柔和，丰富了豆豉的口味。 

4、豆豉香气成分比较 

采用固相微萃取和GC-MS联用技术比较三种豆豉的主要香气成分。样品来源如表4所示。 

表4试验用豆豉样品来源 

具体方法如下： 

固相微萃取(SPME)法：取3g粉碎样品置于20mL钳口瓶中，加入6mL蒸馏水，用聚四氟乙烯隔垫密封，于磁力搅拌器上在60℃加热平衡15min后，通过隔垫插入已活化好的SPME萃取头(270℃活化30min)，推出纤维头，顶空吸附40min后，插入GC进样口解析5min。 

色谱条件：色谱柱为DB-5MS，30m×0.25mm ID×0.25μm；载气：氦气；柱流量：1mL/min；进样口温度：250℃，不分流进样；起始温度40℃保持3min，以5℃/min升至150℃，再以10℃/min升至250℃，保持10min。 

质谱条件：接口温度280℃，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，离子化方式：EI，电子能量70eV，质量范围35～350AMU/s。 

三种豆豉香气成分比较结果如图4所示。 

虽然豆豉样S2和S3的某些香气成分的含量比较高，但它们所测的挥发性成分种类比较单一。采用本发明的枯草芽孢杆菌YDC-001和米曲霉A3040混合制曲生产的豆豉挥发性成分含量虽然不算太高，但所测得的香气物质总类丰富，这些富有香气的物质协同作用，赋予发酵生产的豆豉特有的风味。这说明，该复合发酵剂可使大豆发酵产生更丰富的香味，起到良好的增香作用。 

Claims (5)

1.一株分离的适用于豆制品酿造的菌株，该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YDC-001，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2010128。

2.一种由保藏号为CCTCC NO：M2010128的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YDC-001和米曲霉(Aspergillus oryzae)A3042制备的微生物复合发酵剂。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株YDC-001在制备微生物发酵剂中的应用。

4.权利要求2所述的微生物复合发酵剂在大豆发酵制品中的应用。

5.权利要求4的应用，其中包括豆豉制品中的应用。

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