CN101875648A - 一种从药用植物中提取纯化球松素的方法及其药物制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种称为球松素的天然生物活性物质的提取纯化方法及其药物制剂与应用。具体地说，本发明公开了一种从药用植物中提取和纯化球松素的方法及其药物制剂和在制备治疗胃肠病药物中的应用，属于生命科学领域。该方法将药用植物用浓度为70-95%的乙醇匀浆提取，提取液浓缩至一定体积后，静止沉淀，去除上清液，得到的沉淀物用有机溶剂溶解，采用凝胶树脂柱层析分离，再经过结晶和重结晶得到纯度大于90%的球松素单体。本发明制备的球松素单体加入不同的赋形剂后可以制备成任何一种常用的药剂学剂型，对幽门螺旋杆菌感染引起的消化性溃疡、胃炎、胃疼、胃排空(即胃胀)和消化道肿瘤等方面具有明显的生理活性，并且具有无毒副作用的特点。

Description

一种从药用植物中提取纯化球松素的方法及其药物制剂与应用

技术领域

本发明涉及生命科学领域，具体涉及一种从药用植物中提取纯化球松素的方法及其药物制剂与其在制备治疗胃肠病药物中的应用。

背景技术

胃肠病是当今世界的常见、多发疾病，严重危害人类的身体健康。近年来，随着人类生活水平的不断提高，饮食不规律、免疫功能紊乱、幽门螺旋杆菌感染以及有害物质的摄入等导致胃胀、胃酸、急慢性胃炎、消化道溃疡甚至胃癌等多种胃肠病，严重影响人类的健康生活。目前，临床治疗胃肠病主要采用中药制剂和化学合成药物，这两类药物，前者用药量大，临床作用缓慢，后者毒副作用较大，因此，低毒、高效的天然药物开发具有广阔的市场前景。

胡桃科植物山核桃(Caryaacthayensis)，在我国主要分布在浙江、安徽交界的天目山区，产量大。山核桃的肉质果皮是我国传统中药，称作青龙衣，具有治疗胃痛、胃溃疡、皮肤病、子宫脱落等作用（杜旭等，1996）；山橿(LindarereflexaHemsl.)为樟科山胡椒属植物的地下根，在我国长江以南广泛分布，主治胃脘胀痛、胃寒疼痛、嗳气吞酸及消化性溃疡等症（张君增等，1994）；镰形棘豆(Oxytropisfalcatabunge)为豆科棘豆属植物，在藏药中被称作草药之王，我国东北、西北及西南地区广泛分布。镰形棘豆全草入药，可治疗急性、慢性炎症、高热、溃疡（姚淑英等，2008；王栋等，2008）等；木豆叶来源于豆科木豆属植物木豆[Cajan??scajan(L.)Millsp.]，在我国长江以南的广大地区均有种植，资源丰富。木豆叶可用于治疗烧伤、感染、溃疡、褥疮、感冒、痢疾、皮肤病、肝炎、和抗菌消炎等（刘中秋等，1998；MillikenW.，1997；孙绍美等，1995）。

近年来研究发现，上述几种药用植物中共有的主要化学成分之一——球松素，属于黄酮类化合物，具有抗幽门螺旋杆菌、抗病毒、止痛、抗肿瘤等多方面的显著生理活性（潘永峰等,2005；Bhamarapravatietal，2006；闫海燕，2008）。虽然已有专利（CN1666745A）和（申请号：2007101445360）报道了球松素提取纯化方法，但存在操作繁琐、毒性溶剂使用多等特点，并且未见用球松素制剂治疗胃肠病方面的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种从药用植物中提取纯化球松素的方法。

本发明的另一个目的是提供球松素用于制备治疗胃肠病药物的新应用，具体是治疗幽门螺旋杆菌感染、消化性溃疡、胃炎、胃疼、胃排空（即胃胀）和消化道肿瘤等胃肠病。

本发明的药用植物包括新鲜或干燥的山核桃肉质果皮、山橿根、镰形棘豆全草和木豆叶，本发明的目的通过以下步骤实现：

（1）取干燥药用植物材料，切碎，加入4-6倍量蒸馏水，浸泡4-24小时，或者取新鲜的药用植物材料，切段；

（2）上述材料加入10-20倍量浓度为70-95%的乙醇，匀浆提取1-10分钟，过滤，滤渣重复提取1-3次，合并提取液，浓缩至相对密度1.10-1.25，静止沉淀，去除上清液，得到沉淀物；

（3）上述沉淀物用极性溶剂溶解后，以相应极性溶剂为流动相经过1-4次凝胶树脂柱层析分离，再经过结晶和重结晶得到纯度大于90%球松素单体；

（4）将上述球松素单体加入相应的赋形剂，制备成任何一种药剂学能够接受的口服剂型。

本发明步骤（2）所述的球松素提取方法为匀浆提取，所用溶剂为浓度为70-95%的乙醇，提取时间为1-10分钟。

本发明步骤（3）所述的凝胶树脂包括聚苯乙烯型或甲基丙烯酸酯型MCI-GELCHP系列凝胶树脂或者HW-40、HW-50和HW-55型凝胶树脂，其用量为沉淀物质量的10-40倍；所述的用于溶解沉淀物的极性溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮和乙腈中的任意一种或者几种以任意比例混合。

本发明步骤（4）所述的赋形剂为药剂学的一种或数种赋形剂的组合，所述口服剂型为胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、片剂。

本发明通过体外抗幽门螺旋杆菌试验，观察该药物对幽门螺旋杆菌的杀菌效果。研究结果证明：球松素能够在较低浓度下直接杀死幽门螺旋杆菌，对幽门螺旋杆菌感染及其引起的胃炎、消化道溃疡具有显著的治疗作用。主要药效学研究结果表明，球松素具有预防和治疗幽门螺旋杆菌感染引起的胃肠病的新应用，对人胃癌细胞具有较强的抑制作用，可用于制备抗幽门螺旋杆菌感染、治疗消化性溃疡、胃炎、胃疼、胃排空(即胃胀)和消化道肿瘤等胃肠病的药物。

本发明的优点：

1.   本发明以新鲜或者干燥药用植物为原料，资源利用高效、合理；提取和纯化操作简单、易于大规模生产；

2.   本发明中的球松素单体为具有较强生物活性的天然黄酮类 ，具有安全低毒、能够克服原发耐药性、不易产生继发耐药性的优点。

附图说明

图1药用植物中球松素的结构式

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步说明本发明，需要指出的是，本发明的实施例是用于说明本发明，但并不限制本发明。依据本发明的实质对本发明进行的简单改进均属于本发明要求保护的范围。

实施例1.山核桃肉质果皮中球松素提取物的制备

取新鲜山核桃肉质果皮，置于匀浆提取器中，加入10倍量的浓度为90%的乙醇，高速匀浆2次，每次1min，提取液过滤，合并过滤液，减压浓缩回收乙醇（60℃，0.09Mpa）至提取液相对密度1.12，静止放置20min，除去上清液，得到沉淀物为球松素的提取物。

实施例2.山橿根中球松素提取物的制备

取干燥山橿根，去杂，切片，加入5倍量水浸泡24小时，然后将其置于组织匀浆提取器中，加入15倍量的浓度为90%的乙醇，高速匀浆3次，每次5min，提取液过滤，合并过滤液，减压浓缩回收乙醇（60℃，0.09Mpa）至提取液相对密度1.15，静止放置20min，除去上清液，得到沉淀物为球松素的提取物。

实施例3.镰形棘豆全草中球松素提取物的制备

取新鲜镰形棘豆全草，去杂，切段，置于组织匀浆提取器中，加入12倍量的浓度为80%的乙醇，高速匀浆2次，每次2min，提取液过滤，合并过滤液，减压浓缩回收乙醇（60℃，0.09Mpa）至提取液相对密度1.10，静止放置20min，除去上清液，得到沉淀物为球松素的提取物。

实施例4.木豆叶中球松素提取物的制备

取新鲜木豆叶，去杂，置于组织匀浆提取器中，加入15倍量的浓度为80%的乙醇，高速匀浆2次，每次1min，提取液过滤，合并过滤液，减压浓缩回收乙醇（60℃，0.09Mpa）至提取液相对密度1.10，静止放置20min，除去上清液，得到沉淀物为球松素的提取物。

实施例5.山橿根提取物中球松素的纯化

   将40克山橿根提取物用120mL无水乙醇溶解，过滤，滤液经过装有600gHW-40凝胶树脂、径高比为1:35的凝胶树脂柱，以无水乙醇为流动相，对样品分离，经过10个柱体积后，得到4个柱体积的富含球松素的流份，静止析晶得到纯度92%的球松素56.8mg。

实施例6.山核桃肉质果皮中球松素的纯化

   将25克山核桃肉质果皮提取物用50mL无水乙醇溶解，过滤，滤液经过装有300gMCIGel凝胶树脂、径高比为1:22的MCIGELCHP20型凝胶树脂柱，以无水乙醇为流动相，对样品分离得到富含球松素的流份，减压浓缩至干后，再次经过该MCIGELCHP20凝胶树脂柱，以甲醇为流动相，经过6个柱体积后，得到5个柱体积的富含球松素的流份，浓缩至1/5流份体积后，静止析晶得到纯度为95%的球松素18.4mg。

实施例7.镰形棘豆提取物中球松素的纯化

   将30克镰形棘豆提取物用100mL甲醇溶解，过滤，滤液经过装有300g凝胶树脂、径高比为1:22的MCIGELCHP20型凝胶树脂柱，以甲醇为流动相，对样品分离，经过7个柱体积后，得到3个柱体积的富含球松素的流份，减压浓缩至干后，用20mL丙酮溶解，再次经过MCIGELCHP20型凝胶树脂柱，以丙酮为流动相，经过5个柱体积后，得到含球松素较高的流份，体积为3个柱体积，浓缩至1/2体积后，静止析晶得到纯度为98%的球松素14.7mg。

实施例8.木豆叶提取物中球松素的纯化

   将15克木豆叶提取物用70mL丙酮溶解，过滤，滤液经过装有300gMCIGELCHP20型凝胶树脂、径高比为1:25的凝胶树脂柱，以丙酮为流动相，对样品分离，3个柱体积后得到2个柱体积的富含球松素的流份，减压浓缩至1/3流份体积后，静止析晶并重结晶得到纯度为96%球松素26.4mg。

实施例9.球松素的体外抗幽门螺旋杆菌分析

用微量肉汤百分比浓度稀释法测定球松素对幽门螺旋杆菌的最小杀菌浓度（MBC）。药品以5mg/mL的浓度作为原液，菌液初始密度约为10⁸CFU/mL，稀释后密度为10⁷CFU/mL。取无菌试管分别加入不同体积的肉汤培养液和5mg/mL的药品溶液，使总体积为1mL，每管中加入浓度为10⁷CFU/mL的菌液，在微需氧条件下，37℃培养48小时后，观察各个试管菌生长及液体混浊情况，然后从各个试管中取出液体50μL，接种于固体培养基上，37℃培养48小时后，以无菌落出现的最低浓度为最小杀菌浓度。试验结果表明本药物的最小杀菌浓度为0.5mg/mL。

实施例10.球松素对人胃癌细胞株的细胞毒性试验

用含10%小牛血清的RPMll640培养液对人胃癌细胞SGC-7901、于37℃、5%CO₂培养箱中贴壁培养至细胞生长80%融合时，0.25%胰蛋白酶消化传代。然后取对数生长期的SOC-7901细胞，制成细胞浓度为1×10⁵个/mL的单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔加细胞悬液100μL(相当于1×10⁴个)，以单纯的培养液为空白对照，继续于37℃、5%CO₂培养箱中贴壁培养24小时，分别加入球松素的最终浓度为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0mg/mL的培养液，以未加药的培养液为阴性对照，每组重复3次，分别培养24，48，72小时后，加入0.5%MTT20μL，继续培养4小时，吸除孔内液体，加二甲基亚矾200μL，震荡10分钟，用酶标仪在570nm波长处测定吸光度值，计算抑制率，如表1所示。结果表明球松素对人胃癌细胞具有很强的抑制作用，并且其作用效果随着用药量和时间的增加而增强，即球松素对人胃癌细胞的抑制作用呈现浓度依赖性和时间依赖性。

表1球松素作用对人胃癌细胞SGC-7901的抑制率（%）

	24 h	48 h	72 h
				0.5 mg/mL	2.1	3.6	5.8
1.0 mg/mL	3.4	5.3	12.6
				2.0 mg/mL	18.7	21.3	34.6
4.0 mg/mL	39.2	57.9	69.2
				8.0 mg/mL	61.2	73.8	83.6
10.0 mg/mL	67.5	77.9	85.7

实施例11.球松素的急性毒性试验

雌雄各半小鼠30只，体重20-23g，随机分成2组，每组15只，设定药品组和水对照组，试验前对小鼠禁食不禁水12小时，按照最大体积0.04mL/g(320mg/kg)的最大灌胃量灌胃，每天一次，连续7天，监测小鼠体征与死亡状况。实验结果表明，7天后两组小鼠外观、饮食、活动均正常，无差异、无死亡发生。于末次给药12小时后，处死小鼠进行系统解剖，观察两组组小鼠主要脏器，包括脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、大肠、睾丸和卵巢等，结果表明其外形、重量正常，两组无明显差异，各器官组织切面未见异常，说明在最大给药量的条件下该药物安全无毒。

Claims (3)

1.一种从药用植物中提取纯化球松素的方法及其在制备治疗胃肠病的药物制剂与应用，其特征在于：它是以新鲜或干燥的药用植物为原料，通过以下步骤实现：

（1）取干燥药用植物材料，切碎，加入4-6倍量水浸泡4-24小时，或者取新鲜的药用植物材料，切段；

（2）上述材料加入10-20倍量浓度为70-95%的乙醇匀浆提取1-10分钟，过滤，滤渣重复匀浆提取1-3次，合并提取液，浓缩至相对密度1.10-1.25，静止沉淀，去除上清液，得到沉淀物；

（3）上述沉淀物样品用极性溶剂溶解后，以相应极性溶剂为流动相经过1-4次凝胶树脂柱层析分离，再经过结晶和重结晶得到高纯度球松素；

（4）将上述的球松素加入相应的赋形剂制备成任何一种药剂学能够接受的口服剂型。

2.如权利要求1所述的从药用植物中提取纯化球松素的方法及其药物制剂，其特征在于所用原料为新鲜或者干燥的药用植物材料，所述药用植物材料包括山核桃肉质果皮、山橿全株、镰形棘豆全草和木豆全株。

3.如权利要求1所述的从药用植物中提取纯化球松素的方法及其药物制剂，其特征在于步骤（2）所述的球松素提取方法为匀浆提取，所用溶剂为浓度为70-95%的乙醇，提取时间为1-10分钟。

4.如权利要求1所述的从药用植物中提取纯化球松素的方法及其药物制剂，其特征在于步骤（3）所述的凝胶树脂包括聚苯乙烯型或甲基丙烯酸酯型MCI-GELCHP系列凝胶树脂或者HW-40、HW-50和HW-55型凝胶树脂，其用量为沉淀物样品质量的10-40倍；所述的用于溶解和分离沉淀物样品的极性溶剂包括乙醇、甲醇、丙酮和乙腈中的任意一种或者几种以任意比例混合。

5.如权利要求1所述的从药用植物中提取纯化球松素的方法及其药物制剂，其特征在于步骤（4）所述的赋形剂为药剂学的一种或数种赋形剂的组合；所述口服剂型为胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、片剂。

6.如权利要求1或5所述的药物制剂在制备治疗抗幽门螺旋杆菌药物中的应用。

7.如权利要求1或5所述的药物制剂在制备治疗消化道溃疡药物中的应用。

8.如权利要求1或5所述的药物制剂在制备治疗急性、慢性胃炎药物中的应用。

9.如权利要求1或5所述的药物制剂在制备治疗消化道肿瘤药物中的应用。