CN101864002A - 一种肝素钠的提取方法 - Google Patents

Abstract

一种肝素钠的提取方法，包括如下步骤：(1)常规法肠粘膜物的酶水解，水解采用的酶制剂是：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料；(2)常规法树脂吸附；(3)常规法树脂洗脱；(4)常规法肝素钠沉析；(5)常规法肝素钠纯化；(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。一种改进方案是前述方案步骤1中在过滤水解混合物之前添加沉淀剂。本发明工艺简单，生产周期短，操作简便，投资少，适合规模工业生产，肝素纯度可达100-120IU/mg，提取效率可达1亿IU/1700-1800根猪小肠，提高20-30％，节省用盐30-50％，节省用水50-70％，节能30-40％，粗蛋白回收率可达60％。

Description

一种肝素钠的提取方法

技术领域

本发明涉及肝素钠的提取方法，尤其是一种对酶盐结合法的改进方法。

背景技术

肝素钠是一种由动物结缔组织的肥大细胞产生的酸性粘多糖的硫酸酯类物质，因其具有强抗凝作用，是防治深层静脉血栓形成等血栓栓塞性疾病的首选药物，随着研究的深入，人们发现肝素钠不仅有抗凝、抗血栓形成和调整血脂的作用，还有抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌等多种生物学功能。虽肝素钠用于临床已有60余年的历史，但迄今还没有一种能够完全代替它的产品，所以它仍然是最重要的抗凝血和抗血栓的生化药物，且目前只能从动物的部分组织中提取，不能人工合成。我国是生猪养殖、屠宰和消费大国，更是肠衣加工大国。肠粘膜是提取肝素钠的最佳原料，国内有大量致力于从肠粘膜中提取肝素钠的厂家，大部分企业用盐析法或酶盐结合法提取肝素钠。酶盐结合法的主要程序是：先对肠粘膜物进行酶解、过滤，然后用树脂吸附、洗脱，再用酒精沉淀，纯化后烘干即成。肝素钠提取率多在一亿IU/2300-2500根小肠之间(最好水平在一亿IU/2000根小肠，仅个别企业可达到此水平)，所提肝素钠的纯度较低，常在70-90IU/mg，其中含有大量的蛋白质，色泽黑褐，给临床用药的制备增加难度。

有报道用超声波法辅助盐析法或酶法提取肝素钠，如宋大巍“肝素钠的高效提取和分离纯化技术研究，胰蛋白酶水解法提取肝素工艺参数的优化研究，黑龙江八一农垦大学学报，2008.3”，但其工艺繁琐，投入高、能耗大，未见工业应用报道。

采用酸碱法、化学氧化法或酸法-氧化法结合可将粗肝素钠纯化，但肝素钠在温热的稀酸中会失活，温度越高，pH值越低，失活越快。在碱性条件下，N-硫酸基相当稳定，但艾杜糖醛酸上的硫酸基可被水解，从而使其失去活性；肝素钠与氧化剂作用可被降解成酸性产物，故用氧化剂进行纯化时，会降低肝素钠的收率。

发明内容

本发明的目的是提供一种肝素钠的提取方法，其产率高、效价高、能耗低、成本低。

本发明采用如下技术方案，其特征在于包括以下步骤：

(1)常规法肠粘膜物的酶水解，水解采用的酶制剂是：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料；(2)常规法树脂吸附；(3)常规法树脂洗脱；(4)常规法肝素钠沉析；(5)常规法肝素钠纯化；(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。这种技术方案改进了传统酶解工艺，在酶解前先将底物加热，再采用新的配方酶制剂，利用多种酶的协同作用使肝素钠与蛋白复合物解离，解离效果好，在较缓和的条件下使细胞壁变性完成酶水解过程，更加有利于蛋白酶发挥作用。

一种进一步改进的技术方案是，改进前述方案的步骤1，即：在步骤1过滤水解混合物之前添加沉淀剂，所述沉淀剂是选至聚合氯化铝、碱式氯化铝、硫酸铝中的至少一种材料。加入沉淀剂可将水解液中的蛋白质、肠渣等有效分离、回收，可减少树脂吸附工序树脂对它们的吸附，提高树脂吸附的有效性，提高肝素钠产物的纯度。

本发明具有以下优点：

1.工艺简单，生产周期短，操作简便，投资少，适合规模工业生产。

2.肝素钠纯度高，产率高，质量稳定。生产的肝素钠纯度可达100-120IU/mg，提取肝素钠的效率可达1亿IU/1700-1800根猪小肠，较现有技术提高20-30％。

3.水耗、能耗低，生产成本低。本发明方法比常规酶解工艺节省用盐量约30-50％，耗水量和废水排放量较常规减少50-70％，酶解结束后无需再次升温至80-90℃后又降温，可降低能耗30-40％。

4.原料综合利用率高，废水污染负荷低、易处理。粗蛋白回收率达60％，废液C0D减少75-85％，污染负荷显著降低。

具体实施方式

实施例1

一种肝素钠的提取方法，包括以下步骤：

(1)肠粘膜物的酶水解：在带有搅拌装置、加料装置、温度显示和观察孔的反应釜中加入100份肠粘膜物，升温至70℃，保温15min，加水180份，加NaCl 7份，控制温度45℃，用碱液调pH为7.5，加酶制剂(酶制剂配方为：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1∶1∶0.2的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是2709酶)0.04份，搅拌1.5h，加沉淀剂聚合氯化铝0.27份，搅拌10min，静置4h，将上层清液用120目滤布过滤，收集滤液；

(2)树脂吸附：在带有搅拌装置的容器内加入100份由步骤(1)获得的滤液，加入ZGA 398树脂3份，搅拌4h，将树脂滤出，再加ZGA 398树脂3份，搅拌5h，将树脂滤出，将滤出的树脂合并用水清洗1-2次；

(3)树脂洗脱：将步骤(2)回收的树脂加入质量为0.9倍树脂质量的3-4mol/L NaCl溶液中，搅拌2.5h，过滤、收集洗脱液；再添加质量为0.8倍树脂质量的2.5-3mol/LNaCl溶液，搅拌3h，过滤，收集洗脱液；然后用与树脂质量相等质量的2.5-3mol/L NaCl溶液搅拌洗涤一次，收集洗液，用于下批树脂的洗脱；

(4)肝素钠的沉析：将步骤(3)中第1次和第2次的洗脱液合并，加入浓度为85-95％乙醇搅拌，使洗脱液乙醇浓度达到45-50度，静置6h，将沉析肝素钠的上清液回收，收集肝素钠沉淀；

(5)肝素钠的纯化：将步骤(4)回收的肝素钠沉淀用1％NaCl溶液溶解，过滤或离心分离除去不溶物，加入浓度为85-95％乙醇搅拌，使肝素钠溶液乙醇浓度达到45-50度，静置7h，过滤、收集肝素钠沉淀，用浓度为85-95％乙醇洗涤肝素钠沉淀1-2次，过滤，收集肝素钠沉淀；

(6)干燥：将肝素钠沉淀在低温下风干至基本全干，或在真空条件下干燥，得纯品肝素钠。

实施例2

本实施例的步骤同实施例1，只是酶制剂配方与沉淀剂有变化，酶制剂配方比例改为：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以4∶3∶0.3的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是AS1.398酶与胰酶按1∶1质量比的混合物；沉淀剂改为碱式氯化铝。

实施例3

本实施例的步骤同实施例1，只是酶制剂与沉淀剂的配方有变化，酶制剂配方改为：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以2∶2∶0.2的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是胰酶；沉淀剂改为硫酸铝。

实施例4

本实施例的步骤同实施例1，只是酶制剂与沉淀剂的配方有变化，酶制剂配方改为：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1∶1∶0.1的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是AS1.398酶；沉淀剂改为碱式氯化铝与硫酸铝按2∶1质量比的混合物。

本发明可用其它不违背本发明精神或主要特征的具体形式来概述，在不脱离本发明上述主题范围的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种变更和替换，均落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种肝素钠的提取方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)常规法肠粘膜物的酶水解，水解采用的酶制剂是：蛋白酶∶木瓜酶∶脂肪酶以1-4∶1-3∶0.1-0.3的质量份比例混合而成的混合物，其中蛋白酶是选至2709酶、AS1.398酶、胰酶中的至少一种材料；(2)常规法树脂吸附；(3)常规法树脂洗脱；(4)常规法肝素钠沉析；(5)常规法肝素钠纯化；(6)常规法干燥即得纯品肝素钠。

2.根据权利要求1所述的一种肝素钠的提取方法，其特征在于：所述步骤1中在过滤水解混合物之前添加沉淀剂，所述沉淀剂是选至聚合氯化铝、碱式氯化铝、硫酸铝中的至少一种材料。

3.根据权利要求2所述的一种肝素钠的提取方法，其特征在于包括如下步骤：各步骤所用材料除特别说明外，均按质量份计：

(1)肠粘膜物的酶水解：在带有搅拌装置、加料装置、温度显示和观察孔的反应釜中加入100份肠粘膜物，升温至60-75℃，保温10-30min，加水100-200份，加NaCl6-8份，控制温度40-55℃，用碱液调pH为7.0-9.0，加酶制剂0.02-0.05份，搅拌1.5-2.5h，加沉淀剂0.2-0.3份，搅拌10-15min，静置3-5h，将上层清液用100-150目滤布过滤，收集滤液；

(2)树脂吸附：在带有搅拌装置的容器内加入100份由步骤(1)获得的滤液，加入ZGA 398树脂3-5份，搅拌3-6h，将树脂滤出，再加ZGA 398树脂1-4份，搅拌3-7h，将树脂滤出，将滤出的树脂合并用水清洗1-2次；

(3)树脂洗脱：将步骤(2)回收的树脂加入质量为0.8-1.2倍树脂质量的3-4mol/LNaCl溶液中，搅拌2-3h，过滤、收集洗脱液；再添加质量为0.7-0.9倍树脂质量的2.5-3mo1/L NaCl溶液，搅拌2-3h，过滤，收集洗脱液；然后用与树脂质量相等质量的2.5-3mol/L NaCl溶液搅拌洗涤一次，收集洗液，用于下批树脂的洗脱；

(4)肝素钠的沉析：将步骤(3)中第1次和第2次的洗脱液合并，加入浓度为85-95％乙醇搅拌，使洗脱液乙醇浓度达到45-50度，静置6-8h，将沉析肝素钠的上清液回收，收集肝素钠沉淀；

(5)肝素钠的纯化：将步骤(4)回收的肝素钠沉淀用1％NaCl溶液溶解，过滤或离心分离除去不溶物，加入浓度为85-95％乙醇搅拌，使肝素钠溶液乙醇浓度达到45-50度，静置5-7h，过滤、收集肝素钠沉淀，用浓度为85-95％乙醇洗涤肝素钠沉淀1-2次，过滤，收集肝素钠沉淀；

(6)干燥：将肝素钠沉淀在低温下风干至基本全干，或在真空条件下干燥，得纯品肝素钠。