CN101849988A - 一种鸡血藤提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鸡血藤提取物及其制备方法和应用。鸡血藤药材中加入45-55％的乙醇进行提取后上大孔吸附树脂柱，然后依次用水、10-30％的乙醇和65-75％的乙醇进行洗脱。取65-75％乙醇洗脱部分，回收乙醇，蒸干，得到鸡血藤提取物。本发明鸡血藤提取物的制备方法在现有制备方法的基础上进行了合理化设计，得到了优化的生产工艺组合，采用该制备方法制备得到的鸡血藤提取物得率较高；本鸡血藤提取物相较于现有制备方法得到的鸡血藤提取物具有更显著地升高白细胞的作用。

Description

一种鸡血藤提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种鸡血藤提取物及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤通常合并不同程度贫血，而目前对恶性肿瘤的治疗主要还是以手术摘除、放疗、化疗为主，而几乎所有抗癌药物在作用于癌细胞的同时，也累及正常细胞，因此肿瘤患者放疗后常常引起骨髓抑制，表现为白细胞、红细胞及血小板不同程度下降，其中下降最为明显的是白细胞，这是目前制约肿瘤治疗效果及愈后康复的一大难题。目前临床使用的升白药有强力升白片、瑞白等，但因毒副反应大、价格昂贵等因素，其应用范围受到限制，未能真正满足临床需要。寻找治疗效果好、毒副反应低、价格相对便宜的新的骨髓抑制治疗药物，已成为目前肿瘤医生关注的焦点问题。

鸡血藤为豆科植物密花豆Spatholob suberectus Durra的干燥藤茎(《中华人民共和国药典》2005版)，主要分布在广西、广东，其性温，味苦、甘，归肝、肾经，具有补血、活血通络的作用，是一种较常用的活血化瘀中药，用于治疗血虚萎黄、麻木瘫痪、风湿痹痛等历史悠久：《本草纲目拾遗》记载鸡血藤“活血”，《饮片新参》记载“鸡血藤去瘀血，生新血，流利经脉”。

目前，开发我国传统中药的药理作用越来越受到医学界的重视，从许多天然药物中发现了具有治疗价值的新药。研究发现，鸡血藤不但可以降低因受到辐照而产生骨髓功能性抑制所造成的造血干、祖细胞数量下降的速度，甚至可阻止这种抑制作用，从而弥补造血干、祖细胞因辐照而导致的在量和质上的缺陷，以期达到使三系血细胞(白细胞、红细胞、血小板)水平恢复的最终目的，其中提升白细胞的作用最为明显。近年来临床上常用鸡血藤治疗各种原因引起的白细胞、血小板、红细胞等全血性减少和再生障碍性贫血等疾病，具有较好的疗效，尤其是在提升白细胞方面，效果显著。

鸡血藤的主要成分为黄酮类、酚类、三萜类及甾体类化合物，有关其活性部位的提取精制及活性已有部分报道：专利CN101347496A采用的是乙酸乙酯和乙醇的混合溶剂提取，提取物过正相硅胶柱，用石油醚、乙酸乙酯、氯仿等进行洗脱，最后用制备液相色谱，乙腈-水洗脱，所得组分用于恶性肿瘤，该方法使用了氯仿、乙腈等有毒溶剂，并且应用了制备液相等精密仪器，不适合工业化大生产；专利CN1939396A则将鸡血藤药材闷润后，用水或80％乙醇回流提取，提取物用聚酰胺层析柱吸附后，不同浓度乙醇洗脱，所得组分用于恶性肿瘤，该方法的缺点是提取时间过长、步骤繁琐；也有文献报道采用水和/或乙醇回流提取鸡血藤，提取液用大孔树脂吸附后，用水和/或乙醇进行洗脱，得到鸡血藤提取物，再使用大孔树脂进行精制，其工艺过程中，提取溶剂为通用试剂水或高浓度乙醇，提取目标物质太过广泛，为后续精制造成不便，提取液经大孔树脂吸附后，又采用了全梯度水-乙醇洗脱，工艺较为复杂，且得到的鸡血藤提取物对升高白细胞的作用不明显。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种鸡血藤提取物的制备方法。

为实现上述目的，本发明采取了以下技术方案：

(1)提取

将鸡血藤药材粉碎，加入45-55％的乙醇，回流提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，将提取液浓缩至无醇味；

(2)上柱

将步骤(1)得到的提取液用大孔吸附树脂柱进行吸附；

(3)洗脱

第一次用水洗脱至无糖反应；第二次用20-30％乙醇洗脱至颜色明显变浅；第三次用65-75％的乙醇洗脱至颜色明显变浅；收集65-75％的乙醇洗脱液，回收乙醇，蒸干，得到鸡血藤提取物。

优选地，所述步骤(1)中加入50％的乙醇提取；所述步骤(3)为第一次用水洗脱至无糖反应；第二次用20-30％乙醇洗脱至颜色明显变浅；第三次采用70％的乙醇进行洗脱。

本发明还提供了一种鸡血藤提取物，其是采用上述制备方法制备而得。

本发明还提供了上述方法制备而得的鸡血藤提取物在制备升高白细胞的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.本发明鸡血藤提取物的制备方法是在现有方法的基础上，通过长期研究和系列实验筛选，筛选得到的最合理的生产工艺组合，即：45-55％的乙醇为提取溶剂、HPD400大孔吸附树脂吸附、65-75％的乙醇洗脱。采用该制备方法最大限度的提取了有效成分，鸡血藤提取物总黄酮的得率较高，同时减少了杂质溶出；且所得到的鸡血藤提取物比已有相关文献报道的方法制备得到的鸡血藤提取物具有更显著地升高白细胞的作用。

2.本发明鸡血藤提取物的制备方法操作简便，溶剂使用少，在可操作性和成本上非常符合工业化大生产的需要。

附图说明

图1为不同制备工艺得到的鸡血藤提取物对CTX致SD大鼠白细胞低下模型的影响，其中#表示与模型组相比，p＜0.05。

具体实施方式

实施例1

一种鸡血藤提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取

将鸡血藤药材1公斤粉碎，加入45％的乙醇6升回流提取3次，每次2小时，合并提取液，将提取液浓缩至约为药材的1/4重量；

(2)上柱

将步骤(1)得到的提取液用大孔吸附树脂柱进行吸附；

(3)洗脱

第一次用水洗脱至无糖反应；第二次用20％乙醇洗脱至颜色明显变浅；第三次用65％乙醇洗脱至颜色明显变浅。收集65％乙醇洗脱液，回收乙醇，蒸干，得到鸡血藤提取物65克，用比色法测得其中总黄酮的总苷含量为55％。

实施例2

一种鸡血藤提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取

将鸡血藤药材2公斤粉碎，加入50％乙醇12升回流提取3次，每次2小时，合并提取液，将提取液浓缩至约为药材的1/4重量；

(2)上柱

将步骤(1)得到的提取液用大孔吸附树脂柱进行吸附；

(3)洗脱

第一次用水洗脱至无糖反应；第二次用25％乙醇洗脱至颜色明显变浅；第三次用70％乙醇洗脱至颜色明显变浅。收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，蒸干，得到鸡血藤提取物141克，用比色法测得其中总黄酮的总苷含量为62％。

实施例3

一种鸡血藤提取物的制备方法，包括以下步骤：

(1)提取

将鸡血藤药材1公斤粉碎，加入55％乙醇6升回流提取2次，每次1.5小时，合并提取液，将提取液浓缩至无醇味(约为药材的1/4重量)；

(2)上柱

将步骤(1)得到的提取液用大孔吸附树脂柱进行吸附；

(3)洗脱

第一次用水洗脱至无糖反应；第二次用20％乙醇洗脱至颜色明显变浅；第三次用75％乙醇洗脱至颜色明显变浅。收集75％乙醇洗脱液，回收乙醇，蒸干，得到鸡血藤提取物73克，用比色法测得其中总黄酮的总苷含量为53％。

试验例1 鸡血藤提取物的制备工艺研究

1)药材来源

采购于广州清平药材市场

2)提取溶剂对鸡血藤提取物制备方法的影响

分别用水、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇对鸡血藤药材进行提取，得到浸膏，结果如表1。

表1 不同溶剂对鸡血藤浸膏得率的影响

提取溶剂	药材重量(g)	浸膏重量(g)	浸膏得率
				水	100	15.60	15.60％
50％乙醇	100	15.52	15.52％
				75％乙醇	100	15.50	15.50％

提取溶剂	药材重量(g)	浸膏重量(g)	浸膏得率
				95％乙醇	100	6.74	6.74％

表1结果表明：除95％乙醇外，水、50％乙醇、75％乙醇提取的浸膏得率都相当，采用50％乙醇提取得到的提取物总黄酮含量较高，因此对其进行大孔吸附树脂分离。

3)不同提取方法结合洗脱方法对鸡血藤提取物得率的影响

采用弱极性的HPD400大孔吸附树脂分离经过2)处理后的鸡血藤提取物，第三次分别采用水、25％乙醇、70％乙醇、90％乙醇进行洗脱(洗脱的第一次和第二次均相同)，结果见表2。

表2 不同洗脱方法对鸡血藤提取物得率的影响

从表2可以看出，50％乙醇提取-水洗脱和50％乙醇提取-70％乙醇洗脱，浸膏得率最高，由于黄酮的水溶性相对较差，而大部分黄酮在稀醇中溶解度较大，因此，选用50％乙提取-70％乙醇洗脱得到的鸡血藤提取物得率最高。

试验例2 不同制备工艺制备的鸡血藤提取物对CTX致SD大鼠白细胞低下模型的影响

1.试验动物

选用检疫合格的SD大鼠98只，检疫观察结束后眼眶静脉丛采血测定血常规，然后根据白细胞总数将大鼠随机均衡分成12组。

2.试验分组及给药剂量

空白对照组(10只，灌胃给予与药物组等容积的0.5％CMC-Na)；

模型对照组(8只，灌胃给予与药物组等容积的0.5％CMC-Na)；

A组(8只，630mg/kg)：50％乙醇提取总浸膏；

B组(8只，220mg/kg)：50％乙醇提取-水洗脱浸膏；

C组(8只，64mg/kg)：50％乙醇提取-25％乙醇洗脱浸膏；

D高剂量组(8只，840mg/kg)：50％乙醇提取-70％乙醇洗脱浸膏；

D中剂量组(8只，280mg/kg)：50％乙醇提取-70％乙醇洗脱浸膏；

D低剂量组(8只，90mg/kg)：50％乙醇提取-70％乙醇洗脱浸膏；

E组(8只，6.2mg/kg)：50％乙醇提取-90％乙醇洗脱浸膏；

F组(8只，270mg/kg)：95％乙醇提取总浸膏

G组(8只，300mg/kg)文献报道方法(大孔吸附树脂分离纯化鸡血藤总黄酮的研究，时珍国医国药2008年第10期)提取的总黄酮浸膏；

阿胶(中药)组(8只，2.43g/kg)；

利可君(西药)组(8只，16.2mg/kg)；

以上分组中，A、F组为仅进行提取步骤(没有进行上柱和洗脱步骤)得到的总浸膏；B组为提取上柱后仅进行第一次洗脱得到的浸膏(仅用水洗脱，没有进行第二次和第三次洗脱)；C、D和E组是提取上柱后洗脱得到的浸膏，第三次洗脱分别采用25％的乙醇、70％的乙醇和90％的乙醇进行(第一次和第二次进行相同洗脱)；G组(8只，300mg/kg)为文献(大孔吸附树脂分离纯化鸡血藤总黄酮的研究，时珍国医国药2008年第10期)报道提取的总黄酮浸膏(提取方法为：取鸡血藤500g，2500ml 80％乙醇浸泡过夜，加热回流提取3次，2小时/次，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，加入5000ml蒸馏水，稀释至每毫升含生药0.1g的溶液，静至过夜，过滤，滤液用FL-2的大孔吸附树脂为纯化鸡血藤总黄酮的吸附剂，用70％乙醇洗脱剂洗脱，浓缩得鸡血藤总黄酮)。

3.给药方式

空白对照组皮下注射等容积的生理盐水；其余各组大鼠根据体重皮下注射大剂量(100mg/kg)环磷酰胺一次(day1)进行造模，造模后各组均根据设定剂量开始给药，每天一次，连续11天(day1～11)，空白对照组和模型对照组给予等容积的0.5％CMC-Na，实验过程中Day1、Day4、Day7、Day9称量大鼠体重并根据体重调整给药剂量。

4.观察指标

Day-1分组前，Day 4、Day 7、Day9、Day11给药后约2小时，检测血常规(采血约0.5ml/次)情况：重点统计分析白细胞总数WBC、中性粒细胞数NEUT、淋巴细胞数LYMpH、单核细胞数MONO、嗜酸性粒细胞数EO、嗜碱性粒细胞数BASO、NEUT％、LYMpH％、MONO％、EO％、BASO％、红细胞总数RBC、血红蛋白HGB等。

末次采血后动脉放血处死大鼠，取胸腺、脾脏称湿重计算脏器指数。

5.结果分析

本试验对采用本发明制备工艺所得的鸡血藤提取物(D高剂量组、D中剂量组和D低剂量组)与一系列采用现有制备工艺得到的鸡血藤提取物(A、B、C、E、F、G)及具有升白作用的中药阿胶和西药利可君进行了药效比较。试验结果如图1和表3所示。

图1和表3结果表明：鸡血藤提取物D组具有显著地促进白细胞低下模型大鼠白细胞恢复的作用，并有一定的量效关系；鸡血藤D高、中、低组升高白细胞的作用主要是通过促进中性粒细胞和淋巴细胞数的恢复实现的，对中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸、嗜碱性粒细胞数的比例未见明显影响。鸡血藤提取物D高剂量的升白效果最佳，与其他的现有制备工艺得到的鸡血藤提取物以及阿胶和利可君相比，升白效果显著；鸡血藤提取物A、B、C、E、F、G对白细胞低下模型大鼠未见明显影响，但提取物C具有一定的作用趋势；各组样品促进白细胞低下模型大鼠白细胞恢复作用的强弱顺序为：D高剂量组＞D中剂量组＞D低剂量组＞阿胶组＞利可君组＞C组≌A、B、E、F、G组。

以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。

Claims (5)

1.一种鸡血藤提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取

将鸡血藤药材粉碎，加入45-55％的乙醇，回流提取2-3次，每次1-2小时，合并提取液，将提取液浓缩至无醇味；

(2)上柱

将步骤(1)得到的提取液用大孔吸附树脂柱进行吸附；

(3)洗脱

第一次用水洗脱至无糖反应；第二次用10-30％的乙醇洗脱至颜色明显变浅；第三次用65-75％的乙醇洗脱至颜色明显变浅；收集65-75％的乙醇洗脱液，回收乙醇，蒸干，得到鸡血藤提取物。

2.根据权利要求1所述的鸡血藤提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入50％的乙醇提取。

3.根据权利要求1或2所述的鸡血藤提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中第三次采用70％的乙醇进行洗脱。

4.一种鸡血藤提取物，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的制备方法制备而得。

5.权利要求4所述的鸡血藤提取物在制备升高白细胞的药物中的应用。

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