CN101849978A - 一种高效酶诱导提取老鹳草中多酚类活性成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及中草药老鹳草活性成分的提取技术，目的在于提供一种经济快速的高效酶诱导提取老鹳草中多酚类活性成分的方法。本发明采用匀浆破碎高效酶解技术结合负压空化辅助提取技术，获得富含三种多酚类活性成分的老鹳草提取物，结果表明：提取物中总多酚类活性成分的含量最高可达156.14mgGAE/g，没食子酸、柯里拉京、老鹳草素三种主要多酚类活性成分的含量最高分别可达9.58、6.87、19.82mg/g，比传统热回流方法提高了30～67％。该方法无需高温加热，无需有机溶剂，提取率高，绿色环保，操作安全，适于产业化生产，为中药提取现代化提供了一种新的方法和手段。

Description

一种高效酶诱导提取老鹳草中多酚类活性成分的方法

技术领域

本发明涉及一种酶诱导提高中草药中有效成分的含量、并对其进行负压空化辅助提取的方法，即获得富含没食子酸、柯里拉京、老鹳草素三种多酚类活性成分的老鹳草提取物的高效酶诱导辅助提取方法。

背景技术

老鹳草[Geranium]，为牻牛儿苗科老鹳草属多年生草本植物。又名老观草、鸭脚草等，是一种民间用药。老鹳草具有抗菌、抗病毒、抗氧化的功效，可用于治疗风湿痹痛、麻木拘挛、筋骨酸痛、泄泻痢疾(周海燕，1996；雷志勇等，2002)。根据国外相关报道，老鹳草提取物制剂还具有治疗肠炎，保护肝脏和抑制高血压的作用(Kinoshita et al，2007；Jae & Kye，2008)。

在老鹳草中，多酚类化合物是含量最高的组分，其中没食子酸、柯里拉京、老鹳草素有较好的药理作用，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血压、保肝等作用，对预防血栓也有一定功效(王晓丽等，2008；Shyr-Yi Lin et al，2008；K.Nagendra Prasad et al，2009；)。

传统的提取方法如煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取及索式提取过程都是在完整植物细胞的情况下，通过浸润与渗透、使溶剂进入组织细胞、溶解细胞内物质并使其扩散至溶剂主体，这使溶剂提取细胞内生物活性成分成为可能。但由于细胞壁的屏障作用，决定了中药材有效成分的提取效率有一定限度(刘增琪等，2003；冯青然等，2003；贾立革等，2004)。所以传统提取方法存在提取温度过高，提取率低，有机溶剂污染环境等问题。

酶诱导是在提取的基础上，一方面利用酶(如半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶等)将细胞壁的成分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分游离出来，溶解、混悬或胶溶于提取溶剂中，加速有效成分的释放，从而提高提取效率；另一方面利用酶(如β-葡萄糖苷酶等)将细胞内的苷类化合物水解成相应的苷元，从而提高细胞内目标物的含量。

所谓空化，一般是指液体内部局部压力降低时，液体内部或液固交界面上蒸汽或气体的空穴(空泡)的形成、发展和溃灭的过程。当溃灭发生在固体表面附近时，由于空泡瞬间(微秒级)溃灭产生极高的瞬时压强，极高压强的反复作用，从而破坏固体表面。因此，负压空化辅助提取技术是利用负压空化气泡产生强烈的空化效应和机械振动(李根生等，1997；高秋生，1999)，造成样品颗粒细胞壁快速破裂，加速了胞内物质向介质释放、扩散和溶解，从而促进提取。

现在有一些关于通过酶预处理来提取油类作物中油和蛋白质以及利用负压空化辅助提取技术提取植物材料中活性成分的报道，但将酶诱导技术和负压空化提取技术相结合提取老鹳草中的活性成分还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以老鹳草为原料，高效地获得富含三种多酚类活性成分提取物的酶诱导辅助提取方法。在确定提取技术路线的基础上，对工艺进行优化，获得富含没食子酸、柯里拉京、老鹳草素三种多酚类活性成分的老鹳草提取物，从而提高老鹳草的资源利用度。

本发明的技术方案：将干燥的老鹳草与配制好的酶溶液混合，匀浆，将匀浆液转移入容器置于恒温摇床中进行振荡酶解，酶解过程之后将酶解液转移入提取容器中，进行负压空化辅助提取，将提取液进行减压抽滤后浓缩至干，即得到富含没食子酸、柯里拉京、老鹳草素三种活性成分的老鹳草提取物。具体方案如下：

(1)匀浆破碎酶解：以水为溶剂配制浓度为50～100U/mL的酶溶液，将酶溶液和干燥的老鹳草以溶液体积与原料质量比20～30mL/g混合，调节pH值至4.0～6.0，利用匀浆机匀浆1～2min。

(2)恒温酶解：将匀浆液转移入容器并置于恒温摇床中，在30～50℃下，酶解3～6h，转速100～120rpm。

(3)负压空化辅助提取：将酶解液转移入负压空化提取器中，提取1～3次，每次10～30min，将提取液减压抽滤后浓缩至干，即得到富含多酚类活性成分的老鹳草提取物。

本发明步骤(1)采用的匀浆粉碎技术与普通干燥粉碎技术相比，可将老鹳草在酶溶液中粉碎成细胞组织，并具有破坏细胞壁、使植物组织细胞与酶充分接触以及瞬时刺激诱发内源性酶活性的作用，从而提高目标成分的游离，增加目标成分的含量；而且匀浆粉碎时不产生粉尘，不污染环境。

由于植物细胞壁是以纤维素为骨架，并与半纤维素、果胶及蛋白质等大分子结合，单一的酶无法使细胞壁彻底崩溃、对提高有效成分的提取率作用有限，因此，本发明使用的酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶，其中的一种或两种以上的组合。根据所加酶组成与比例，调节pH值为4.0～6.0，使酶的活性保持最佳。酶溶液体积与原料质量比为20～30mL/g。

本发明所述步骤(2)恒温酶解过程，酶溶液的浓度为50～100U/mL，酶解温度30～50℃，酶解时间为3～6h。

本发明所述步骤(3)负压空化辅助提取过程，将酶解液进行负压空化辅助提取，在室温下提取1～3次，每次10～30min，通过空化效应使细胞壁进一步破碎，加速目标成分的游离，增加目标成分的含量；而且提取过程无需高温加热，无需有机溶剂，绿色环保。

按照本发明所述优选的高效酶诱导负压空化辅助提取条件对老鹳草中主要含有没食子酸、柯里拉京、老鹳草素的多酚类活性成分进行提取，所得提取物中总多酚类活性成分的含量最高可达156.14mgGAE/g，没食子酸、柯里拉京、老鹳草素三种主要多酚类活性成分的含量最高分别可达9.58、6.87、19.82mg/g，比传统热回流方法提高了30～67％。

本发明的优点：

(1)该方法具有经济、快速、高效、设备简单、操作安全的特点，可实现大规模的产业化生产。

(2)与传统提取方法相比，无需高温加热、无需有机溶剂、绿色环保、提取率高、降低了生产成本。

附图说明

图1为没食子酸的结构

图2为柯里拉京的结构

图3为老鹳草素的结构

具体实施方式

实施例1

配制纤维素酶浓度为100U/mL、半纤维素酶浓度为50U/mL的酶溶液，调节pH至5.3。称取干燥的老鹳草10g，以酶溶液体积与原料质量30mL/g的比例加入酶溶液，匀浆2min，将匀浆液转移入容器置于40℃的恒温摇床中振荡酶解5h，酶解过程之后将酶解液转移入提取容器，负压空化辅助提取2次，时间为15min，提取液减压抽滤后将滤液浓缩至干，得到固形物2.41g，甲醇定容，利用Folin-Phenol试剂法测定总多酚含量，HPLC检测，所得固形物中总多酚类活性成分的含量为156.14mgGAE/g，比传统的热回流方法提高了50.9％，没食子酸、柯里拉京、老鹳草素的含量分别为7.46、6.31、19.82mg/g，分别比传统的热回流方法提高了30.6％、44.1％和67.3％。

实施例2

配制半纤维素酶浓度为60U/mL、果胶酶浓度为80U/mL的酶溶液，调节pH至4.6。称取干燥老鹳草10g，以酶溶液体积与原料质量20mL/g的比例加入酶溶液，匀浆1min，将匀浆液转移入容器置于30℃的恒温摇床中振荡酶解5h，酶解过程之后将酶解液转移入提取容器，负压空化辅助提取1次，每次30min，提取液减压抽滤将后将滤液浓缩至干，得到固形物2.16g，甲醇定容，利用Folin-Phenol试剂法测定总多酚含量，HPLC检测，所得固形物中总多酚类活性成分的含量为134.28mgGAE/g，比传统的热回流方法提高了29.8％，没食子酸、柯里拉京、老鹳草素的含量分别为9.58、5.79、15.66mg/g，分别比传统的热回流方法提高了67.7％、32.2％、和31.9％。

实施例3

配制纤维素酶浓度为70U/mL、果胶酶浓度为100U/mL的酶溶液，调节pH至5.7。称取干燥老鹳草10g，以酶溶液体积与原料质量比25mL/g的比例加入酶溶液，匀浆2min，将匀浆液转移入容器置于50℃的恒温摇床中振荡酶解6h，酶解过程之后将酶解液转移入提取容器，负压空化辅助提取3次，每次20min，提取液减压抽滤将后将滤液浓缩至干，得到固形物2.25g，甲醇定容，利用Folin-Phenol试剂法测定总多酚含量，HPLC检测，所得固形物中总多酚类活性成分的含量为142.75mgGAE/g，比传统的热回流方法提高了38.1％，没食子酸、柯里拉京、老鹳草素的含量分别为8.82、6.87、16.04mg/g，分别比热回流方法提高了54.5％、56.8％、和35.1％。

对照组

称取干燥老鹳草10g，以溶液体积与原料质量25mL/g的比例加入蒸馏水，匀浆粉碎2min，70℃热回流提取5h，提取液减压抽滤将后将滤液浓缩至干，得到固形物1.73g，甲醇定容，利用Folin-Phenol试剂法测定总多酚含量，HPLC检测，所得固形物中总多酚类活性成分的含量为103.42mgGAE/g，没食子酸、柯里拉京、老鹳草素的含量分别为5.71、4.38、11.87mg/g。

本发明中，结果定量检测分析采用下表条件：

仪器	Agilent 1200高效液相色谱仪
		检测器	UV检测器
检测波长	220nm
		色谱柱	HIQ sil C18W column(150mm×4.6mm i.d.，5um)
柱温	30℃
		流动相	乙腈-水-乙酸(5∶94.95∶0.05，v/v/v)
洗脱时间	60min
		流速	1mL/min
进样体积	10μL

Claims (4)

1.一种高效酶诱导提取老鹳草中多酚类活性成分的方法，包括如下操作步骤：

(1)匀浆破碎酶解：以水为溶剂配制浓度为50～100U/mL的酶溶液，将酶溶液和干燥的老鹳草以溶液体积与原料质量比20～30mL/g混合，调节pH值至4.0～6.0，利用匀浆机匀浆1～2min；

(2)恒温酶解：将匀浆液转移入容器并置于恒温摇床中，在30～50℃下，酶解3～6h，转速100～120rpm；

(3)负压空化辅助提取：将酶解液转移入负压空化提取器中，提取1～3次，每次10～30min，将提取液减压抽滤后浓缩至干，即得到富含多酚类活性成分的老鹳草提取物。

2.按照权利要求1所述步骤(1)匀浆破碎酶解过程，其特征在于：使用的酶为纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶其中的一种或一种以上的组合，酶溶液的浓度为50～100U/mL，酶溶液体积与原料质量比为20～30mL/g。

3.按照权利要求1所述步骤(2)恒温酶解过程，其特征在于：酶解温度为30～50℃，酶解时间为3～6h，恒温摇床的转速为100～120rpm。

4.按照权利要求1所述步骤(3)负压空化辅助提取过程，其特征在于：负压空化提取技术是以负压为动力，利用气泡产生的空化效应、湍流效应的一种强化辅助提取工艺，提取次数为1～3次，所用压力为0.04～0.06MPa。

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