CN101765662A - Epa浓缩油和dha浓缩油的制造方法 - Google Patents

Epa浓缩油和dha浓缩油的制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种方法，在氧化镁等反应添加物的存在下，通过对碳原子数为18以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶，使得含有EPA和DHA的油脂发生醇解反应之后，分离甘油酯组分，进一步地，在氧化镁等反应添加物的存在下，通过对碳原子数为20以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶，使得该甘油酯组分发生醇解反应，同时得到EPA浓缩油和DHA浓缩油。

Description

EPA浓缩油和DHA浓缩油的制造方法
技术领域
本发明涉及一种利用脂肪酶催化反应、制造分别含有高浓度的二十碳五烯酸(以下记作EPA)和二十二碳六烯酸(以下记作DHA)浓缩油的方法。
背景技术
作为n-3系多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid，以下记作PUFA)的二十碳五烯酸(以下称为EPA)和二十二碳六烯酸(以下称为DHA)，具有多种生理作用，作为医药品、健康食品、食品材料等而被利用。EPA乙酯能够用于作为动脉硬化和高脂血症的治疗药物，另外，添加有包含EPA、DHA的鱼油的饮料也被认可作为特定保健用食品。另外，在日本国内外作为补品的需要也非常高。
PUFA由于双键的数目多，所以对于氧化非常不稳定。因此，在含有PUFA的油的制造工序中，十分期望在常温常压等温和的条件下利用酶催化反应进行反应。
主要从微生物得到的产业用的脂肪酶制品中，具有与上述的PUFA较难发生作用的性质的脂肪酶制品是已知的。使用具有这种性质的脂肪酶，优先使得碳原子数少的脂肪酸游离，除去它，从而能够制造浓缩有PUFA的油脂。例如，公开了下面的制造方法：使用柱状假丝酵母(Candida cylindoracea)的脂肪酶水解金枪鱼油之后，除去游离脂肪酸，从而得到浓缩有DHA的油脂(专利文献1)。
众所周知，以前，在有机溶剂中的酶催化反应中，水对于酶活性表现具有重要的推动作用(非专利文献1)。据报道，当使用醇解反应从鳕鱼肝油中浓缩PUFA时，水的添加促进了脂肪酶催化反应，所述醇解反应是指在醇的作用下从甘油酯切断出脂肪酸的反应(非专利文献2)。另一方面，公开了在几乎无水的条件下，特定的脂肪酶进行油脂的醇解。但是，脂肪酶的使用量相当于油的10％，是非常多的，为了提高生产性，有必要固定化脂肪酶(专利文献2)。
专利文献3中记载了：在利用具有1，3位置特异性的脂肪酶，对于含有作为构成脂肪酸的长链多不饱和脂肪酸的油脂，进行水解的情况下，使用碱金属盐的方法。
专利文献1：日本特开昭58-165796号
专利文献2：日本特表平9-510091号
专利文献3：日本特开平3-108489号
非专利文献1：J.S.Dordick，，“单相有机溶剂中的酶催化反应(Enzymaticcatalysis in monophasic organic solvents)”，Enzyme Microb.Technol.，1989，11，April，194-211
非专利文献2：L.Zui and O.P.Ward，，“脂肪酶催化醇解浓缩鳕鱼肝油的n-3系多不饱和脂肪酸(Lipase-catalyzed alcoholysis to concentrate the n-3polyunsaturated fatty acid of cod liver oil)”，Enzyme Microb.Technol.，1993，15，July，601-606
发明内容
发明所要解决的问题
虽然市场上已经出现了应用上述脂肪酶的性质而浓缩了鱼油等的PUFA的浓缩油，但是浓缩度有限制，高浓度的制品较难得到或者需要大量的酶。本发明的课题是，提供一种分别高效地浓缩原料油中所含的PUFA之中的EPA和DHA的方法。
解决问题的手段
本发明人等对于使用产业用的脂肪酶的反应从各个角度进行了研究，结果发现，通过少量添加氧化镁(以下也记作MgO)、氢氧化镁、氧化钙、氢氧化钙等，即使脂肪酶的使用量很少，脂肪酶催化反应的效率也得到了飞跃性的提高。另外还发现，该反应是非常底物特异的，能够适用于分别高度浓缩EPA和DHA。
本发明的要旨是，提供一种制造方法，其特征在于，在作为反应添加物的选自氧化镁、氢氧化镁、氧化钙、氢氧化钙中至少一种的化合物的存在下，使得对碳原子数为18以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶与含有作为构成脂肪酸的EPA和DHA的油脂发生反应，将碳原子数为18以下的脂肪酸从甘油酯中切离之后，分离甘油酯级分，进一步地，在选自氧化镁、氢氧化镁、氧化钙、氢氧化钙中至少一种的化合物的存在下，使得对碳原子数为20以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶与该甘油酯级分发生反应，同时得到EPA浓缩油(作为低级醇酯)和DHA浓缩油(作为甘油酯级分)。
即，本发明为一种方法，是从含有作为构成脂肪酸的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的油脂中制造二十碳五烯酸浓缩油和二十二碳六烯酸浓缩油的方法，包括：
a)在作为反应添加物的选自氧化镁、氢氧化镁、氧化钙、氢氧化钙中的至少一种化合物、以及醇或者含水醇的存在下，利用对碳原子数为18以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶，使得该油脂进行醇解反应或者进行伴随有水解反应的醇解反应，从得到的反应混合物中，得到浓缩有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的甘油酯级分的工序；
b)在作为反应添加物的选自氧化镁、氢氧化镁、氧化钙、氢氧化钙中的至少一种化合物、以及醇或者含水醇的存在下，利用对碳原子数为20以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶，使得前述甘油酯进行醇解反应或者进行伴随有水解反应的醇解反应，从得到的反应混合物中，分离浓缩有二十碳五烯酸的酯的组分和浓缩有二十二碳六烯酸的甘油酯级分的工序。
发明的效果
本发明通过少量添加氧化镁等廉价的反应添加物，提高了酶的反应性，而且在各阶段中实现了高度底物特异性的反应。作为其结果，能够高收率并且廉价地同时制造EPA浓缩油和DHA浓缩油。
具体实施方式
在本发明中作为原料使用的油脂，只要是含有作为构成该油脂中所含的甘油酯的脂肪酸的EPA和DHA的油即没有特别的限制，例如以鱼油为代表的水产物油、微生物油、藻类油、植物油等。作为本发明的原料使用的场合，可以使用这些的原油(其榨出油)，也可以使用经过任意的精制工序而得到的油。作为本发明中使用的原料，EPA和DHA的含有量越高越好，作为优选的脂质，可以举出沙丁鱼油(例：EPA 17％、DHA 12％)、鳕鱼油(例：EPA 7％、DHA25％)、鲣鱼油(例：EPA 5％、DHA 24％)，鲑鱼油(例：EPA 9％、DHA 14％)等。
油脂通常的意思是脂肪酸的三甘油酯，然而在本发明中还包括二甘油酯、单甘油酯等与脂肪酶作用的其他的甘油酯。在本发明中，所谓的甘油酯是脂肪酸的三甘油酯、二甘油酯和单甘油酯的总称。
本发明中所谓的EPA或者DHA的浓缩，意思是与原料油脂的“EPA或者DHA的量/脂肪酸全量”相比，使得反应后的“EPA或者DHA的量/脂肪酸全量”变大；与原料油脂相比“EPA或者DHA的量/脂肪酸全量”变大的油为EPA浓缩油或者DHA浓缩油。
本发明中，所谓的“醇”可以含有单一的或者多个种类的醇。
利用本发明的方法进行的脂肪酶催化反应为从甘油酯生成脂肪酸酯的醇解反应。该脂肪酶催化反应，也可以是在醇和水的混合溶剂中进行，生成游离脂肪酸和脂肪酸酯的反应。作为本发明中使用的溶剂低级醇，可以列举出例如乙醇、甲醇、2-丙醇、丁醇等。特别优选为乙醇。
本发明的工序a)中使用的脂肪酶，只要是对碳原子数为18以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶，就没有特别的限制。作为优选的脂肪酶，例如从属于产碱菌(Alcaligenes sp.)的微生物中得到的脂肪酶(理帕兹(Lipase)QLM、理帕兹QLC、理帕兹QLG、理帕兹PL(均是名糖产业(株)制)等)。特别优选为理帕兹QLM。从名糖产业(株)能够得到的理帕兹QLC具有以下的特征·性质。性状：米黄色粉末，活性：约60,000U/g，分子量：31kDa，等电点：4.9，最适pH：7～9，最适温度：65～70℃。另外，理帕兹QLC为把理帕兹QLM固定在硅藻土的产物，理帕兹QLG为把理帕兹QLM固定在造粒后的硅藻土上的产物。
关于脂肪酶的使用量，并没有特别的限制，但是，对于粉末的脂肪酶，相对于油脂为10unit/g以上，如果考虑到反应速度的实用性，优选使用30unit/g以上，对于固定化的脂肪酶，相对于油脂，优选为0.01％(w/w)以上。
本发明的工序b)中使用的脂肪酶，只要是对碳原子数为20以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶，就没有特别的限制。作为优选的脂肪酶，例如从属于疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的微生物中得到的脂肪酶(立普塞姆TLIM，诺维信社制)。从诺维信社能够得到的立普塞姆TLIM具有以下的特征·性质。分子量：30kDa，等电点：4.8，最适pH：6～11，最适温度：60～70℃，固定化载体：硅胶，粒度：300～1000μm(主要为500～900μm)，比重：0.54g/ml。关于脂肪酶的使用量，并没有特别的限制，但是，对于粉末的脂肪酶，相对于甘油酯级分，为10unit/g以上，如果考虑到反应速度的实用性，优选使用30unit/g以上，对于固定化的脂肪酶，相对于油脂，优选为0.01％(w/w)以上。
作为反应添加物，可以利用氧化镁、氢氧化镁、氧化钙、氢氧化钙，由于氧化镁的效果好、还能够用于食品用途，所以是特别优选的。粉末、细粒状、颗粒状等的添加物操作容易、能够使用产业用市售的添加物。反应添加物的添加量没有特别的限制，优选在相对于工序a)中的原料油脂为0.01％(w/w)～30％(w/w)，更优选0.05％(w/w)～5％(w/w)的范围内使用。另外，优选在相对于工序b)中的原料甘油酯级分为0.01％(w/w)～30％(w/w)，更优选0.05％(w/w)～5％(w/w)的范围内使用。
关于反应方法，只要是能够混合规定量的原料油脂、反应添加物、醇等，就没有特别的限制，可以按照通常的使用脂肪酶的反应的技术常识来进行。通常，在酶表现高活性的反应温度(例如，20℃～60℃)，采用1小时到24小时左右的反应时间，搅拌以使得充分混合。也可以在反应中使用填充在柱等中的固定化酶。
脂肪酶催化反应为醇解反应的场合，反应后，可以通过过滤和用水溶液洗净等来除去反应添加物和酶等。
工序a)和工序b)中甘油酯级分的分离方法，没有特别的限制，例如，可以利用分子蒸馏、短程蒸馏等蒸馏法、使用各种色谱法的分离方法。精制方法也是使用通常用于精制油脂的方法即可，例如各种色谱法、水蒸汽蒸馏等。
本发明的一个实施方式中，在工序a)或者工序b)的任一工序中，或者在工序a)和工序b)两者中，可以在反应体系中添加少量的水来进行脂肪酶催化反应。添加水的场合，添加水的量相对于使用的低级醇为1％(v/v)～30％(v/v)，更优选为5％(v/v)～20％(v/v)。最好将包含在油脂中的水分量也考虑在内。
低级醇的量，例如，相对于反应体系中的油脂或者甘油酯级分中所含的脂肪酸，优选使用0.2～5当量，更优选为0.2～1.5当量。
至于在含水低级醇存在下进行工序a)的情况下生成的脂肪酸低级醇酯和游离脂肪酸，可以通过蒸馏(例如薄膜蒸馏、分子蒸馏和短程蒸馏)、使用碱的脱酸工序等来除去。
下面给出实施例，具体地说明本发明，但是本发明不受这些实施例的任何限制。这里，原料油和甘油酯级分的EPA或者DHA的含有量，是通过甲酯化之后气相色谱分析的面积比确定的。另外，气相色谱测定前进行的甲酯化，是按照日本油化学会规定的基准油脂试验法进行的(日本油化学会制定基准油脂分析试验法(I)1996年版，2.4.1脂肪酸衍生物化法，2.4.1.2-1996甲酯化法(三氟化硼-甲醇法))。
实施例1
(1)工序a)的脂肪酶催化反应
在精制沙丁鱼油(EPA 17.4％，DHA 11.9％、日本水产(株)制)1.20Kg中，加入理帕兹QLM 1.49g(100unit/g)、水20.7g、氧化镁(纯正化学(株)特级试剂99％以上、粉末)30g(相当于油的2.5％)、乙醇207ml，在40℃搅拌16小时。反应后，过滤分离固体成分，分别用20％的硫酸560ml和食盐水200ml洗净，然后，蒸馏除去油层中残存的水分和乙醇，得到1.21Kg的油。从得到的油中取少量，用制备TLC分离甘油酯级分，甲酯化之后，用气相色谱进行脂肪酸组分的分析。分析条件如下所示(如果没有特别的说明，以后的利用制备TLC和气相色谱的分析也通过同样的方法进行)。
TLC的分离制备条件、甲酯化条件；
在反应液50μL中加入己烷1ml、饱和食盐水10ml，进行己烷萃取。把得到的己烷层150μl涂布在制备用TLC上，用己烷∶二乙醚∶乙酸(70∶30∶1，体积比)展开。展开后，刮取乙酯以外的甘油酯级分，直接通过甲基化法进行甲酯化。即，加入1N的甲醇钠/甲醇溶液2ml，在80℃加热1分钟的时间。之后，为了使得反应停止，加入1N盐酸2ml，在80℃加热1分钟的时间。然后加入己烷0.5ml、饱和食盐水6ml，振荡之后，静置，用气相色谱分析己烷层。
气相色谱条件：
毛细管柱：DB-WAX(J&M Scientific制造)、Fused Silica Capillary Column(石英毛细管柱)、0.25mml.D.×30m，0.25μm薄膜厚度(film thickness)
载气：氦气
检测器：250℃，FID
注入口：250℃，分流比＝100∶1
柱温：180℃→3℃/min→230℃/(15min)
装置：Hewlett Packard 6890
另外，把5重量％的己烷溶液(1μl)在硅胶条上点样后，用己烷∶二乙醚∶乙酸(90∶10∶1)进行展开，用TLC/FID进行脂质组成的分析。原料沙丁鱼油的脂质组成和脂肪酸组成、得到的油的脂质组成(面积％)和甘油酯级分的脂肪酸组成(面积％)如表1和表2所示。EPA和DHA通过该反应被浓缩在甘油酯级分中，分别为46.7％、20.6％。另外，EPA、DHA的回收率分别为106.6％、68.7％的高回收率。EPA、DHA的回收率(％)，通过下面的方式算出：(反应后的甘油酯级分的EPA(或者DHA)的比例(％)×甘油酯的含量(％))/(反应前的油脂的EPA(或者DHA)的比例(％))。
[表1]
表1脂肪酸组成(面积％)
精制沙丁鱼油   工序a)反应后甘油酯级分
  C14:0   6.3   2.3
  C15:0   0.5   0.0
  C16:0   14.9   2.8
  C16:1   8.1   2.4
  C16:2   1.6   1.7
  C16:3   1.3   0.4
  C16:4   1.8   0.4
  C18:0   3.5   0.7
  C18:1   13.4   4.5
  C18:2n-6   1.2   0.3
  C18:3n-3   0.7   0.0
  C18:4n-3   2.5   0.5
  C20:1   3.1   2.3
精制沙丁鱼油   工序a)反应后甘油酯级分
  C20:4n-6   1.6   3.6
  C20:4n-3   0.9   0.3
  C20:5(EPA)   17.4   46.7
  C22:1   1.9   1.5
  C22:4   0.7   0.9
  C22:5n-3   2.4   5.8
  C22:6(DHA)   11.9   20.6
  其他   4.6   2.2
表2脂质组成(面积％)
Figure GPA00001013770200081
(2)甘油酯级分的分离
从实施例1得到的油中，用薄膜蒸馏装置蒸馏除去乙酯和脂肪酸。薄膜蒸馏装置，使用UIC GmbH社制短程蒸馏装置KDL-5(蒸发面积0.048m2)，在130℃、1×10-3mbar、0.60L/h的条件下，进行2次通过处理。蒸馏除去后的残留油的脂肪酸组成(面积％)和脂质组成(面积％)如表3和表4所示。从脂质组成中蒸馏除去乙酯和游离脂肪酸，确认得到浓缩有EPA、DHA的甘油酯级分。
表3脂肪酸组成(面积％)
  薄膜蒸馏处理后2次通过后
  C14:0   1.9
  薄膜蒸馏处理后2次通过后
  C15:0   0.0
  C16:0   2.8
  C16:1   2.9
  C16:2   1.5
  C16:3   0.5
  C16:4   0.4
  C18:0   0.9
  C18:1   4.8
  C18:2n-6   0.3
  C18:3n-3   0.0
  C18:4n-3   0.6
  C20:1   2.4
  C20:4n-6   3.9
  C20:4n-3   0.4
  C20:5(EPA)   45.1
C22:1 1.7
  C22:4   0.7
  C22:5n-3   5.8
  C22:6(DHA)   20.5
  其他   2.7
表4脂质组成(面积％)
Figure GPA00001013770200101
(3)工序b)的脂肪酶反应和生成物的分离
在利用上述工序(2)得到的油(甘油酯级分)1g中，加入水10μL、立普塞姆TLIM 20mg(相当于油的2％)、氧化镁25mg(相当于油的2.5％)、乙醇173μL，在40℃搅拌16小时。之后，过滤分离固体成分，用食盐水洗净后，对得到的油的脂质组成进行分析。通过制备TLC分别分离制备得到乙酯和甘油酯级分，进行脂肪酸组成的分析。制备TLC的条件在与实施例1、(1)工序a)相同的条件下进行，在本次的情况下，分别刮取乙酯、甘油酯级分来进行分析。反应后的脂肪酸组成(面积％)、脂质组成如表5和表6所示。经过浓缩，DHA在甘油酯级分中被浓缩为76.4％，EPA在乙酯级分中被浓缩为52.1％，能够同时得到DHA浓缩油和EPA浓缩油。该反应中的甘油酯级分的DHA回收率为71.6％，乙酯级分的EPA回收率为74.9％。DHA的回收率(％)通过下面的方式算出：(反应后的甘油酯级分的DHA的比例(％)×反应后的甘油酯的含量(％))/(反应前的甘油酯级分的DHA的比例(％))，EPA的回收率通过下面的方式算出：(反应后的乙酯的EPA的比例(％)×反应后的乙酯的含量(％)/(反应前的EPA的比例(％))。
[表5]
表5脂肪酸组成(面积％)
Figure GPA00001013770200111
表6脂质组成(面积％)
  工序b)反应后
  乙酯   64.8
  三甘油酯   0.0
  二甘油酯   1.8
  单甘油酯   17.4
  游离脂肪酸   15.2
实施例2
实施例1的工序3)的立普塞姆TLIM(Lipozyme TLIM)的使用量改为5mg(相当于油的0.5％)，在和实施例1的工序(3)相同的条件下进行反应。结果如表7和表8所示。即使在脂肪酶的使用量减少的情况下，也能够同时得到DHA浓缩油和EPA浓缩油。该反应中的甘油酯级分的DHA回收率为114.7％，乙酯级分的EPA回收率为58.9％。(回收率中超过100％的数值，是由于本次回收率计算方法为简易计算法。即，用于计算回收率的FID的测定值，由于分子量越大相对的灵敏度就越大，所以对于DHA那样的分子量高的脂肪酸，就得到较高的值。以后的实施例中也一样。)
表7脂肪酸组成(面积％)
表8脂质组成(面积％)
  工序b)反应后
  乙酯   48.5
  工序b)反应后
  三甘油酯   0.0
  二甘油酯   6.5
  单甘油酯   33.5
  游离脂肪酸   10.2
实施例3
使用EPA浓度高的低温分离精制沙丁鱼油(EPA 29.0％、DHA 12.5％、日本水产(株)制)作为原料的脂质，进行DHA浓缩油和EPA浓缩油的制备。工序a)的反应为，使用精制沙丁鱼油1.2Kg、理帕兹QLM 1.49g、水20.7ml、氧化镁60g、乙醇207ml，在40℃反应16小时，处理操作与实施例1相同地进行。然后，在与实施例1同样的条件下，进行2次通过薄膜蒸馏处理，得到甘油酯级分。使用工序a)得到的油1g、水10μL、立普塞姆TLIM 20mg、氧化镁25mg、乙醇173μL，进行工序b)的反应，在40℃反应16小时。用制备TLC分别分离制备乙酯和甘油酯级分(条件和实施例1相同)。原料精制沙丁鱼油和工序a)的薄膜蒸馏处理2次通过之后的残留油、以及工序b)反应后的脂肪酸的组成如表9所示；工序a)和工序b)反应后的脂质组成如表10所示。通过2阶段的反应，能够同时使得EPA浓度和DHA浓度高浓度化，EPA浓度高浓度化为73.9％，DHA浓度高浓度化为50.8％。工序a)反应中的EPA回收率为95.8％，DHA回收率为53.7％；工序b)中的乙酯级分的EPA回收率为62.6％，甘油酯级分的DHA回收率为114.6％。
[表9]
表9脂肪酸组成(面积％)
Figure GPA00001013770200141
表10脂质组成(面积％)
  工序a)反应后   工序b)反应后
  乙酯   36.2   55.5
  三甘油酯   0.0   0.0
  二甘油酯   6.8   3.0
  单甘油酯   35.7   30.4
  游离脂肪酸   22.3   14.1
下面，研究用于实施本发明的条件，并作为参考例1～13来表示。
参考例1
在1g精制沙丁鱼油(EPA 28.2％、DHA 12.5％、日本水产(株)制)中，加入理帕兹QLM(产碱菌、名糖产业(株)制)1.65mg(100unit/g)、水17μl、MgO(纯正化学(株)特级试剂99％以上)(相当于油的0.25％(w/w)或者2.5％(w/w))、乙醇170μl(对于脂肪酸为0.75当量)，在40℃搅拌16小时。反应后，过滤分离固体成分，用己烷萃取滤液。通过以下所示的方法用制备TLC分离制备甘油酯级分。
把得到的甘油酯级分甲酯化，用气相色谱进行脂肪酸组成的分析。制备TLC、甲酯化和气相色谱分析的条件和实施例1相同。
对理帕兹(Lipase)PS(Burkholderias cepacia，天野酶(株)制)3.3mg(100unit/g)，也在同样的条件下反应。
另外，作为比较例，对于各个脂肪酶，除了不添加水和MgO、仅添加水、仅添加MgO 0.25％(w/w)以外，在上述的条件下进行醇解反应。
把5重量％的己烷溶液(1μl)点样在硅胶条上之后，用己烷∶二乙酯∶乙酸(90∶10∶1、体积比)展开，使用TLC/FID(Iatroscan TH-10，三菱化学亚特龙(Yatron)社制)，对甘油酯级分的脂质组成进行分析。结果，通过得到的图，得到甘油酯、酯的峰面积比，基于此，算出甘油酯回收率。EPA和DHA的回收率，通过下面的方式算出：(反应后的甘油酯的PUFA的比例(％)×甘油酯的含量(％))/(反应前的PUFA的比例(％))。EPA和DHA的面积％，EPA和DHA的脂肪酸回收率和甘油酯回收率的结果如表11所示，比较例的结果如表12所示。
比较表11的结果和表12的比较例的结果，可以看出这样的效果：脂肪酶量即使相同，通过添加水、MgO，也可以影响到EPA和DHA的浓缩。另外，还可以看出，随着MgO添加量的增加，EPA和DHA被浓缩。而且，EPA和DHA的回收率非常高，保持着该反应的脂肪酸选择性。
[表11]
表11
  原料精制沙丁鱼油   理帕兹QLMMgO0.25％+水   理帕兹QLMMgO2.5％+水   理帕兹PSMgO0.25％+水   理帕兹PSMgO2.5％+水
  EPA面积％DHA面积％   28.812.5   50.616.3   61.516.2   52.215.6   59.717.9
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)甘油酯回收率(％)   98.590.467.8   97.591.750.6   93.283.660.5   91.770.249.1
表12
  理帕兹QLM   理帕兹QLM+水   理帕兹QLM+MgO   理帕兹PS   理帕兹PS+水   理帕兹PS+MgO
  EPA面积％DHA面积％   36.115.2   43.017.5   41.716.4   30.712.9   45.017.1   30.112.3
  理帕兹QLM   理帕兹QLM+水   理帕兹QLM+MgO   理帕兹PS   理帕兹PS+水   理帕兹PS+MgO
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)甘油酯回收率(％)   99.599.283.4   94.889.074.6   98.590.069.8   99.698.696.2   85.976.255.0   99.697.598.0
参考例2
使用与参考例1中所用的沙丁鱼油相比EPA和DHA的含有量较少的沙丁鱼油(EPA 15.7％、DHA 8.99％、日本水产(株)制)作为原料，在和参考例相同的条件下，在油脂1g中加入理帕兹QLM 1.65mg(100unit/g)、水17μl、MgO 2.5％(w/w)、乙醇170μl，在40℃进行醇解反应16小时。EPA和DHA面积％、回收率、甘油酯回收率的结果如表13所示。
表13
  理帕兹QLMMgO 2.5％+水
  EPA面积％DHA面积％   43.517.3
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)甘油酯回收率(％)   95.580.541.9
参考例3
在精制鳕鱼油(EPA 6.75％、DHA 24.3％、日本水产(株)制)2g中，加入立普塞姆TLIM(疏绵状嗜热丝孢菌、诺维信社制)2mg(相当于油的0.1％(w/w))、水34μl、MgO(0.25％(w/w)或者2.5％(w/w))、乙醇340μl，在40℃搅拌16小时。另外，作为比较例，除了不添加水和MgO、仅添加水、仅添加MgO 0.25％(w/w)以外，在上述的条件下进行醇解反应。反应后，过滤分离固体成分，用制备TLC分离甘油酯级分，甲酯化之后，进行脂肪酸组成的分析。EPA和DHA的脂肪酸回收率、甘油酯回收率如表14所示；比较例的EPA和DHA的面积％和脂肪酸回收率、甘油酯回收率如表15所示。
可以看出，使用立普塞姆TLIM的场合，一方面DHA浓度的浓缩度升高，另一方面EPA的醇解也在进行。随着MgO的添加量的增加，DHA浓度的浓缩度升高。在比较例中，虽然使用同样的酶量，但是DHA几乎没有被浓缩。
表14
  精制鳕鱼油   立普塞姆TLIMMgO 0.25％+水   立普塞姆TLIMMgO 2.5％+水
  EPA面积％DHA面积％   6.824.3   9.448.2   8.468.7
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)甘油酯回收率(％)   69.699.150.0   37.083.529.6
表15
  立普塞姆TLIM   立普塞姆TLIM+水   立普塞姆TLIM+MgO
  EPA面积％DHA面积％   7.226.2   7.226.5   7.125.5
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)甘油酯回收率(％)   99.299.697.2   99.099.893.5   99.599.598.0
参考例4
为了研究MgO以外的反应添加物的效果，在与实施例1同样的条件下，添加9种相当于原料油的1％(w/w)的反应添加物。即，在精制沙丁鱼油(EPA28.2％，DHA 12.5％、日本水产(株)制)1g中，加入理帕兹QLM(产碱菌、名糖产业(株)制)1.65mg(100unit/g)、水17μl、如表16所示的9种相当于油的1％(w/w)的反应添加物、乙醇170μl(相当于脂肪酸的0.75当量)，在40℃搅拌16小时。反应后，过滤分离固体成分，用制备TLC分离甘油酯级分，甲酯化之后，测定脂肪酸组成。甘油酯级分的EPA面积％如表16所示。可以看出，除了MgO之外，氢氧化镁、氧化钙和氢氧化钙产生EPA浓缩效果。
[表16]
表16
  EPA面积％  制造商   等级   纯度min％
  氧化镁   56.3  纯正化学(株)   特级   99
  氢氧化镁   54.5  和光纯药工业(株)   1级   97
  碳酸镁(碱性)   44.7  日本Nacali Tesque(株)   特级 MgCO360-55％MgO40-45％
  EPA面积％  制造商   等级   纯度min％
  氯化镁   30.7  和光纯药工业(株)   特级   98
  氧化钙   46.9  和光纯药工业(株)   特级   99.9
  氢氧化钙   46.6  日本Nacali Tesque(株)   特级   95
  氯化钙   29.6  日本Nacali Tesque(株)   特级   98.5
  硝酸钙   30.1  日本Nacali Tesque(株)   特级   99.5
  碳酸钠   29.9  和光纯药工业(株)   特级   99.5
  碳酸氢钾   36.2  日本Nacali Tesque(株)   特级   99.7
参考例5
利用理帕兹QLM进行的EPA浓缩油脂的制造
在精制沙丁鱼油(EPA 28.2％，DHA 12.5％、日本水产(株)制)1kg中，加入理帕兹QLM(产碱菌、名糖产业(株)制)0.83g、水17g、MgO 2.5g、乙醇173ml，在40℃搅拌16小时。离心分离后、除去固体成分，蒸馏除去乙醇、得到1.06kg。用稀硫酸洗净后，热水洗净，利用薄膜蒸馏装置，蒸馏除去酯、脂肪酸，得到作为甘油酯级分的EPA浓缩油583g。测定脂肪酸组成的结果是EPA 48.3％、DHA 17.3％。
参考例6
利用立普塞姆TLIM的DHA浓缩油脂的制造
在精制鳕鱼油(EPA 6.75％、DHA 24.3％)1kg中，加入立普塞姆TLIM(疏绵状嗜热丝孢菌、诺维信社制)1g、水17g、MgO 5g、乙醇173ml，在40℃搅拌16小时。过滤固体成分后，蒸馏除去乙醇、得到1.07kg。用磷酸洗净后，热水洗净，利用分子蒸馏装置，蒸馏除去酯、脂肪酸，得到作为甘油酯级分的DHA浓缩油416g。测定脂肪酸组成的结果是EPA 9.4％、DHA 52.8％。
参考例7
MgO的添加量的研究
在与参考例1相同的条件下，即，在精制沙丁鱼油(EPA 28.2％、DHA12.5％、日本水产(株)制)1g中，加入理帕兹QLM 1.65mg(100unit/g)、水17μl、MgO(相当于油的0～10％(w/w))、乙醇170μl(相当于脂肪酸的0.75当量)，在40℃搅拌16小时，进行醇解。
结果如表17所示。MgO的添加量越多，越能促进反应、浓缩EPA。
表17
  MgO添加量   EPA面积％   DHA面积％
  00.05％0.1％0.25％1％2.5％5％10％   43.646.747.250.656.361.566.867.6   17.116.116.216.317.016.215.115.4
参考例8
乙醇量的研究
在下述条件下进行醇解反应：在精制沙丁鱼油(EPA 28.2％、DHA 12.5％、日本水产(株)制)1g中，加入理帕兹QLM 0.83mg(50unit/g)、水17μl、MgO(相当于油的0.25％(w/w))、相对于脂肪酸的0.5～1.5当量的乙醇，在40℃搅拌16小时。
结果如表18所示。可以看出，乙醇的使用量优选为相对于脂肪酸量的0.5～1.5当量。
表18
  乙醇(相对于脂肪酸量的当量)   0.5   0.67   0.75   1   1.5
  EPA面积％DHA面积％   43.116.7   46.3815.77   46.317.0   46.517.4   40.216.3
参考例9
脂肪酶使用量的研究
在下述条件下进行醇解反应：在精制沙丁鱼油(EPA 28.2％、DHA 12.5％、日本水产(株)制)1g中，加入理帕兹QLM 10～50unit/g、水17μl、MgO(相当于油的0.25～2.5％(w/w))、相当于脂肪酸的0.75当量的乙醇，在40℃搅拌16小时。
结果如表19所示。可以看出，脂肪酶的使用量优选为25unit/g以上。另外还确认了，即使是相同的脂肪酶量，通过增加MgO的量也能够提高反应性。
表19
  QLM(unit/g)   10   25   30   50   50
  MgO(％)EPA面积％DHA面积％   2.532.113.1   2.537.1715.4   148.217.2   0.2547.817.2   2.563.917.2
  QLM(unit/g)   10   25   30   50   50
  EPA回收率(％)   98.99   99.2   98.4   98.5   96.5
参考例10
反应时间的研究
在下述条件下进行醇解反应：在精制沙丁鱼油(EPA 28.2％、DHA 12.5％、日本水产(株)制)1g中，加入理帕兹QLM 1.65mg(100unit/g)、水17μl、MgO(相当于油的0.25％(w/w))、相当于脂肪酸的1当量的乙醇，在40℃搅拌0～24小时。
结果如表20所示。
表20
  反应时间   0   1   2   4   6   7   16   24
  EPA面积％DHA面积％   28.812.0   39.615.8   42.715.6   44.016.4   44.515.7   46.817.0   50.616.3   53.416.0
[比较例]
不使用MgO和水的场合的脂肪酶催化反应
在下述条件下进行醇解反应：在精制沙丁鱼油(EPA 28.2％、DHA 12.5％、日本水产(株)制)1g中，加入理帕兹QLM 100～1000unit/g、相当于脂肪酸的1当量的乙醇，在40℃搅拌16小时。
表21
  QLM(unit/g)   100   250   500   750   1000
  EPA面积％DHA面积％   36.115.2   41.436.1   45.916.2   46.717.92   46.317.97
  EPA回收率(％)   85.1   76.1   69.1   72.2   71.6
参考例11
向银鲑鱼(coho salmon)提取油的应用
在银鲑鱼提取油(EPA 9.8％、DHA 14.0％)1g中，加入立普塞姆TLIM(疏绵状嗜热丝孢菌、诺维信社制)2mg(0.2％)、水10μl、MgO(纯正化学(株)特级试剂99％以上)(相当于油的0.5％(w/w)或者2.5％(w/w))、乙醇170μl(相当于脂肪酸的0.75当量)，在40℃搅拌16小时。反应后，过滤分离固体成分，用制备TLC分离甘油酯级分，甲酯化之后，用气相色谱进行脂肪酸组成的分析。制备TLC、甲酯化、气相色谱分析的条件与实施例1相同。
另外，作为比较例，除了不添加水和MgO以外，在上述的条件性进行醇解反应。
甘油酯级分的EPA、DHA的面积％，EPA、DHA的脂肪酸回收率和甘油酯回收率的结果如表22所示；比较例的结果如表23所示。
表22
  原料银鲑鱼提取油   立普塞姆TLIM 0.2％MgO 0.5％+水   立普塞姆TLIM 0.2％MgO 2.5％+水
  EPA面积％DHA面积％EPA+DHA面积％   9.814.023.8   14.030.744.7   14.045.359.3
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)   69.6107.0   29.166.3
  甘油酯回收率(％)   48.8   20.5
表23
  立普塞姆TLIM 0.2％没有MgO没有水
  EPA面积％DHA面积％EPA+DHA面积％   10.3315.1525.48
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)   98.996.9
  甘油酯回收率(％)   95.28
参考例12
向绿鳕(Pollack)提取油的应用
用绿鳕提取油(EPA 12.3％、DHA 7.9％)作为原料，在1g的油脂中加入理帕兹QLM 1.65mg(100unit/g)、水17μl、MgO 2.5％(w/w)以及乙醇170μl，在40℃进行醇解反应16小时。另外，对于立普塞姆TLIM 5mg(0.5％)也同样地添加水、MgO，进行醇解反应。EPA、DHA面积％、回收率、甘油酯回收率的结果如表24所示。理帕兹QLM浓缩EPA，立普塞姆TLIM浓缩DHA。EPA和DHA的总和面积％都浓缩到了原料的两倍以上。
另外，作为比较例，除了不添加水和MgO以外，在上述的条件性进行醇解反应，结果如表25所示。
表24
  原料绿鳕提取油   理帕兹QLM 100u/gMgO 2.5％+水   立普塞姆TLIM 0.5％MgO 2.5％+水
  EPA面积％DHA面积％EPA+DHA面积％   12.37.920.2   30.912.943.8   14.038.349.4
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)   103.773.7   18.378.1
  甘油酯回收率(％)   45.1   16.2
表25
  理帕兹QLM 100u/g没有MgO没有水   立普塞姆TLIM 0.5％没有MgO没有水
  EPA面积％DHA面积％EPA+DHA面积％   15.89.925.7   18.616.034.5
  EPA回收率(％)DHA回收率(％)   101.097.8   64.364.1
  甘油酯回收率(％)   78.6   79.4
参考例13
太阳鱼肝油的应用
用太阳鱼肝油(花生油烯酸(AA)5.1％、EPA4.2％、二十二碳五烯酸(DPA)7.7％、DHA 10.5％)作为原料，在1g的油脂中加入理帕兹QLM 1.65mg(100unit/g)、水17μl、MgO 2.5％(w/w)、以及乙醇170μl，在40℃进行醇解反应16小时。另外，对于立普塞姆TLIM 5mg(0.5％)也同样地添加水、MgO，进行醇解反应。AA、EPA、DPA、DHA面积％、回收率、甘油酯回收率的结果如表26所示。理帕兹QLM浓缩AA、EPA、DPA和DHA，与此相对，立普塞姆TLIM仅浓缩DHA。
另外，作为比较例，除了不添加MgO和水以外，在上述的条件性进行醇解反应，结果如表27所示。
表26
原料太阳鱼肝油   理帕兹QLM100u/gMgO2.5％+水 立普塞姆TLIM0.5％MgO2.5％+水
  AA面积％EPA面积％DPA面积％DHA面积％   5.14.27.710.5   12.910.717.917.5   2.82.63.659.8
  AA+EPA+DPA+DHA面积％   27.6   59.0   68.8
  AA回收率(％)EPA回收率(％)DPA回收率(％)DHA回收率(％)   95.796.898.081.1   8.69.97.590.5
  甘油酯回收率(％)   44.8   15.9
表27
  理帕兹QLM100u/g   立普塞姆TLIM0.5％
  没有MgO没有水   没有MgO没有水
  AA面积％EPA面积％DPA面积％DHA面积％   6.55.310.413.5   5.64.58.712.8
  AA+EPA+DPA+DHA面积％   35.7   31.7
  AA回收率(％)EPA回收率(％)DPA回收率(％)DHA回收率(％)   98.599.1104.9100.1   90.389.293.1100.0
  甘油酯回收率(％)   67.9   82.3

Claims (10)

1.一种方法，是从含有作为构成脂肪酸的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的油脂中制造二十碳五烯酸浓缩油和二十二碳六烯酸浓缩油的方法，包括：
a)在作为反应添加物的选自氧化镁、氢氧化镁、氧化钙、氢氧化钙中的至少一种化合物、以及醇或者含水醇的存在下，利用对碳原子数为18以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶，使得该油脂进行醇解反应或者进行伴随有水解反应的醇解反应，从得到的反应混合物中，得到浓缩有二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸的甘油酯级分的工序；
b)在作为反应添加物的选自氧化镁、氢氧化镁、氧化钙、氢氧化钙中的至少一种化合物、以及醇或者含水醇的存在下，利用对碳原子数为20以下的脂肪酸具有底物特异性的脂肪酶，使得前述甘油酯进行醇解反应或者进行伴随有水解反应的醇解反应，从得到的反应混合物中，分离浓缩有二十碳五烯酸的酯的组分和浓缩有二十二碳六烯酸的甘油酯级分的工序。
2.根据权利要求1所记载的方法，其中，工序a)中使用的脂肪酶为从属于产碱菌(Alcaligenes sp.)的微生物中得到的脂肪酶。
3.根据权利要求1或2所记载的方法，其中，工序b)中使用的脂肪酶为从属于疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)的微生物中得到的脂肪酶。
4.根据权利要求1～3中任意一项所记载的方法，其中，工序a)中使用的脂肪酶为理帕兹QLM(Lipase QLM，商品名)。
5.根据权利要求1～4中任意一项所记载的方法，其中，工序b)中使用的脂肪酶为立普塞姆TLIM(Lipozyme TLIM，商品名)。
6.根据权利要求1～5中任意一项所记载的方法，其中，工序a)和/或工序b)的反应添加物为氧化镁。
7.根据权利要求1～6中任意一项所记载的方法，其中，工序a)和/或工序b)的反应添加物的添加量，相对于油脂，为0.01～30％(w/w)。
8.根据权利要求1～7中任意一项所记载的方法，其中，醇为低级醇。
9.根据权利要求1～8中任意一项所记载的方法，其中，含水醇类为包含1～30％(w/w)的水的醇。
10.根据权利要求1～9中任意一项所记载的方法，其中，工序a)中使用的油脂为鱼油。
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