KR20100057015A

KR20100057015A - Ｅｐａ 농축유 및 ｄｈａ 농축유의 제조 방법

Info

Publication number: KR20100057015A
Application number: KR1020107004008A
Authority: KR
Inventors: 기요미 후리하타; 히로유키 가와하라; 히데아키 야마구치; 히데오 이케모토; 노부시게 도이사키
Original assignee: 닛폰 스이산 가부시키가이샤
Priority date: 2007-07-30
Filing date: 2008-07-29
Publication date: 2010-05-28
Also published as: CN101765662A; WO2009017102A1; DK2172558T3; EP2172558B1; EP2172558A4; EP2172558A1; US9556401B2; KR101502191B1; CA2693070A1; US20100190220A1; CN101765662B; JPWO2009017102A1; JP5204776B2

Abstract

본 발명에 의해, 산화 마그네슘 등의 반응 첨가제의 존재하에서 EPA 및 DHA 를 함유하는 유지를 탄소수 18 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 리파아제에 의해 알코올리시스 반응시킨 후 글리세리드 획분을 분리하고, 추가로 그 글리세리드 획분을 산화 마그네슘 등의 반응 첨가제의 존재하에서, 탄소수 20 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 리파아제에 의해 알코올리시스 반응시켜, EPA 농축유 및 DHA 농축유를 동시에 얻는 방법이 제공된다.

Description

ＥＰＡ 농축유 및 ＤＨＡ 농축유의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCTION OF EPA-ENRICHED OIL AND DHA-ENRICHED OIL}

본 발명은 리파아제 반응을 사용한, 에이코사펜타엔산 (이하, EPA 라고도 한다) 및 도코사헥사엔산 (이하, DHA 라고도 한다) 의 각각을 고농도로 함유하는 농축유의 제조법에 관한 것이다.

n-3 계 고도 불포화 지방산 (Polyunsaturated Fatty Acid, 이하, PUFA 라고도 한다) 인 에이코사펜타엔산 (이하, EPA 라고도 칭한다) 이나 도코사헥사엔산 (이하, DHA 라고도 칭한다) 은 여러 생리 작용을 가지며, 의약품, 건강 식품, 식품 소재 등으로서 이용되고 있다. EPA 에틸에스테르는 동맥 경화나 고지혈증의 치료약으로서 사용되고, 또 EPA, DHA 를 함유하는 어유 (魚油) 를 첨가한 음료는 특정 보건용 식품으로도 인가되어 있다. 또한, 국내외에서 서플리먼트로서의 수요도 매우 높다.

PUFA 는 이중 결합수가 많기 때문에, 산화에 대하여 매우 불안정하다. 따라서, PUFA 함유유의 제조 공정에 있어서, 상온 상압이라는 온화한 조건에서 반응이 진행되는 효소 반응을 이용하는 것은 매우 바람직하다.

주로 미생물에서 얻어지는 산업용 리파아제 제품 중에는 이러한 PUFA 에 잘 작용하지 않는 성질이 있는 것이 알려져 있다. 이러한 성질을 갖는 리파아제를 사용하여 탄소수가 적은 지방산을 우선적으로 유리시키고, 이것을 제거함으로써 PUFA 를 농축시킨 유지를 제조할 수 있다. 예를 들어 칸디다 실린도라세아 (Candida cylindoracea) 의 리파아제를 사용하여 다랑어유를 가수 분해한 후, 유리 지방산을 제거함으로써 DHA 를 농축시킨 유지의 제조 방법이 개시되어 있다 (특허 문헌 1).

종래, 유기 용매 중의 효소 반응에 있어서는 물이 효소 활성 발현에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다 (비특허 문헌 1). 알코올을 작용시켜 지방산을 글리세리드로부터 절단하는 반응인 알코올리시스 반응을 사용하여, 대구 간유로부터 PUFA 를 농축시킬 때에, 물의 첨가가 리파아제 반응을 촉진시키는 것으로 보고되어 있다 (비특허 문헌 2). 한편, 특정한 리파아제에서는 거의 무수 (無水) 인 조건에서 유지의 알코올리시스가 진행되는 것으로 개시되어 있다. 그러나 리파아제의 사용량이 기름에 대하여 10 ％ 로 매우 많아, 생산성 향상을 위해서는 리파아제를 고정화할 필요가 있다 (특허 문헌 2).

특허 문헌 3 에는, 장사슬 고도 불포화 지방산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지를 1, 3 위치 특이성이 있는 리파아제에 의해 가수 분해하는 경우에 알칼리염을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

일본 공개특허공보 소58-165796호 일본 공표특허공보 평9-510091호 일본 공개특허공보 평3-108489호

J.S.Dordick,, "Enzymatic catalysis in monophasic organic solvents", Enzyme Microb. Technol., 1989, 11, April, 194-211 L.Zui and O.P.Ward,, "Lipase-catalyzed alcoholysis to concentrate the n-3 polyunsaturated fatty acid of cod liver oil", Enzyme Microb. Technol., 1993, 15, July, 601-606

상기 서술한 바와 같은 리파아제의 성질을 응용하여 어유 등의 PUFA 를 농축시킨 농축유는 이미 시장에 나와 있는데, 농축도에는 한계가 있어, 고농도의 제품은 얻기 어렵거나 또는 대량의 효소를 필요로 한다. 본 발명은 원료유 중에 함유되는 PUFA 중 EPA 및 DHA 를 각각 효율적으로 농축시키는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

발명자들은 산업용 리파아제를 사용한 반응을 여러 각도에서 연구한 결과, 산화 마그네슘 (이하, MgO 라고도 한다), 수산화 마그네슘, 산화 칼슘, 수산화 칼슘 등을 소량 첨가함으로써, 리파아제의 사용량이 적어도 리파아제 반응의 효율을 비약적으로 향상시키는 것을 알아내었다. 나아가, 당해 반응은 충분히 기질 특이적이며, EPA 및 DHA 의 각각을 고도로 농축시키는 방법에 적용 가능한 것을 알아내었다.

본 발명은 반응 첨가제로서의 산화 마그네슘, 수산화 마그네슘, 산화 칼슘, 수산화 칼슘 중에서 선택된 적어도 1 종의 화합물의 존재하에서, EPA 및 DHA 를 구성 지방산으로서 함유하는 유지에 탄소수 18 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 리파아제를 반응시켜, 탄소수 18 이하의 지방산을 글리세리드로부터 떼어낸 후, 글리세리드 획분을 분리하고, 추가로 그 글리세리드 획분을 산화 마그네슘, 수산화 마그네슘, 산화 칼슘, 수산화 칼슘 중에서 선택된 적어도 1 종의 화합물의 존재하에서 탄소수 20 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 리파아제를 반응시켜, EPA 농축유 (저급 알코올 에스테르로서) 및 DHA 농축유 (글리세리드 획분으로서) 를 동시에 얻는 것을 특징으로 하는 제조 방법을 요지로 한다.

즉, 본 발명은 EPA 및 DHA 를 구성 지방산으로서 함유하는 유지로부터 EPA 농축유 및 DHA 농축유를 제조하는 방법으로서,

a) 반응 첨가물로서 산화 마그네슘, 수산화 마그네슘, 산화 칼슘, 수산화 칼슘 중에서 선택된 적어도 1 종의 화합물, 및 알코올 또는 함수 알코올의 존재하에서, 그 유지를 탄소수 18 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 리파아제에 의한 알코올리시스 반응 또는 가수 분해 반응을 수반하는 알코올리시스 반응에 제공하고, 얻어진 반응 혼합물로부터, 에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산이 농축된 글리세리드 획분을 얻는 공정 ;

b) 반응 첨가물로서 산화 마그네슘, 수산화 마그네슘, 산화 칼슘, 수산화 칼슘 중에서 선택된 적어도 1 종의 화합물, 및 알코올 또는 함수 알코올의 존재하에서, 상기 글리세리드 획분을 탄소수 20 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 리파아제에 의한 알코올리시스 반응 또는 가수 분해 반응을 수반하는 알코올리시스 반응에 제공하고, 얻어진 반응 혼합물로부터, EPA 가 농축된 에스테르의 획분, 및 DHA 가 농축된 글리세리드 획분을 분리하는 공정 ; 을 포함하는 상기 방법이다.

본 발명은 산화 마그네슘 등의 저가의 반응 첨가제를 소량 첨가함으로써 효소의 반응성을 높이고, 또한 각 단계에 있어서 고도로 기질 특이적인 반응을 실현한다. 그 결과로서, EPA 농축유 및 DHA 농축유를 동시에 고수율 또한 저가로 제조할 수 있다.

본 발명에서 원료로서 사용되는 유지는, 당해 유지에 함유되는 글리세리드를 구성하는 지방산으로서 EPA 및 DHA 를 함유하는 기름이면 특별히 한정되지 않고, 어유를 비롯한 수산물유, 미생물유, 조류유 (藻類油), 식물유 등이 예시된다. 본 발명의 원료로서 사용하는 경우, 그들의 원유 (착유된 것 자체) 여도 되고, 어떠한 정제 공정을 거친 것이어도 된다. 본 발명에 사용하는 원료로는 EPA 및 DHA 의 함유량이 많을수록 좋고, 바람직한 지질로서 정어리유 (예 : EPA 17 ％, DHA 12 ％), 다랑어유 (예 : EPA 7 ％, DHA 25 ％), 가다랭이유 (예 : EPA 5 ％, DHA 24 ％), 연어유 (예 : EPA 9 ％, DHA 14 ％) 등을 들 수 있다.

유지는 통상, 지방산의 트리글리세리드를 의미하는데, 본 발명에서는 디글리세리드, 모노글리세리드 등 리파아제가 작용하는 그 밖의 글리세리드도 포함한다. 본 발명에 있어서, 글리세리드란 지방산의 트리글리세리드, 디글리세리드 및 모노글리세리드의 총칭이다.

본 발명에 있어서 EPA 또는 DHA 의 농축이란, 원료 유지의 「EPA 또는 DHA 의 양/지방산 전체량」보다, 반응 후의 「EPA 또는 DHA 의 양/지방산 전체량」을 많게 하는 것을 의미하며, 원료 유지에 비해 「EPA 또는 DHA 의 양/지방산 전체량」이 많아진 기름이 EPA 농축유 또는 DHA 농축유이다.

본 발명에 있어서, 「알코올」이란, 단일 또는 복수 종류의 알코올을 함유하고 있어도 된다.

본 발명 방법에서 이루어지는 리파아제 반응은, 글리세리드로부터 지방산 에스테르를 생성시키는 알코올리시스 반응이다. 당해 리파아제 반응은, 알코올과 물의 혼합 용매 중에서 실시하며, 유리 지방산 및 지방산 에스테르를 생성시키는 반응이어도 된다. 본 발명에서 사용되는 용매의 저급 알코올로는 에탄올, 메탄올, 2-프로판올, 부탄올 등이 예시된다. 에탄올이 특히 바람직하다.

본 발명의 공정 a) 에서 사용되는 리파아제는, 탄소수 18 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직한 리파아제로서, 알칼리게네스 에스피 (Alcaligenes sp.) 에 속하는 미생물에서 얻어지는 리파아제 (리파아제 QLM, 리파아제 QLC, 리파아제 QLG, 리파아제 PL, 모두 메이토 산업 (주) 제조 등) 가 예시된다. 특히, 리파아제 QLM 이 바람직하다. 메이토 산업 (주) 로부터 입수 가능한 리파아제 QLC 는 이하의 특징·성질을 갖는다. 성상 : 베이지 분말, 활성 : 약 60,000 U/g, 분자량 : 31 kDa, 등전점 : 4.9, 최적 pH : 7 ∼ 9, 최적 온도 : 65 ∼ 70 ℃. 또, 리파아제 QLC 는, 리파아제 QLM 을 규조토에 고정화한 것이고, 리파아제 QLG 는, 리파아제 QLM 을 조립 (造粒) 한 규조토에 고정화한 것이다.

리파아제의 사용량에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 분말의 리파아제에 대해서는 유지에 대하여 10 unit/g 이상, 반응 속도를 생각한 실용성을 고려하면 30 unit/g 이상 사용하는 것이 바람직하고, 고정화 리파아제에 대해서는 유지에 대하여 0.01 ％(w/w) 이상이 바람직하다.

본 발명의 공정 b) 에서 사용되는 리파아제는, 탄소수 20 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직한 리파아제로서, 서모마이세스 라누기노서스 (Thermomyces lanuginosus) 에 속하는 미생물에서 얻어지는 리파아제 (리포자임 TL IM, 노보자임사 제조) 가 예시된다. 노보자임사로부터 입수 가능한 리포자임 TL IM 은 이하의 특징·성질을 갖는다. 분자량 : 30 kDa, 등전점 : 4.8, pH : 6 ∼ 11, 최적 온도 : 60 ∼ 70 ℃, 고정화 담체 : 실리카겔, 입도 : 300 ∼ 1000 ㎛ (주로, 500 ∼ 900 ㎛), 비중 : 0.54 g/㎖. 리파아제의 사용량에 대해서는 특별히 한정되지 않지만, 분말의 리파아제에 대해서는 글리세리드 획분에 대하여 10 unit/g 이상, 반응 속도를 고려한 실용성을 생각하면 30 unit/g 이상 사용하는 것이 바람직하고, 고정화 리파아제에 대해서는 유지에 대하여 0.01 ％(w/w) 이상이 바람직하다.

반응 첨가제로는 산화 마그네슘, 수산화 마그네슘, 산화 칼슘, 수산화 칼슘을 이용할 수 있는데, 산화 마그네슘은 효과도 높고, 식품 용도에도 사용할 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 분말, 세립 형상, 과립 형상 등의 것이 취급하기 쉬우며, 산업용으로 시판되고 있는 것을 사용할 수 있다. 반응 첨가제의 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 공정 a) 에 있어서의 원료 유지에 대하여 0.01 ％(w/w) ∼ 30 ％(w/w), 보다 바람직하게는 0.05 ％(w/w) ∼ 5 ％(w/w) 의 범위에서 사용된다. 또, 바람직하게는 공정 b) 에 있어서의 원료의 글리세리드 획분에 대하여 0.01 ％(w/w) ∼ 30 ％(w/w), 보다 바람직하게는 0.05 ％(w/w) ∼ 5 ％(w/w) 의 범위에서 사용된다.

반응 방법은 소정량의 원료 유지, 반응 첨가제, 알코올 등을 혼합할 수 있으면 특별히 한정되지 않고, 통상적인 리파아제를 사용한 반응에 대한 기술 상식에 따라 실시할 수 있다. 효소가 고활성을 나타내는 반응 온도 (예를 들어, 20 ℃ ∼ 60 ℃) 에서, 1 시간 내지 24 시간 정도의 반응 시간에서, 충분히 혼합되도록 교반하는 것이 일반적이다. 칼럼 등에 충전된 고정화 효소를 반응에 사용해도 된다.

리파아제 반응이 알코올리시스 반응인 경우, 반응 후에는 반응 첨가제 및 효소 등을, 여과 및 수성 용액에 의한 세정 등에 의해 제거할 수 있다.

공정 a) 및 공정 b) 에 있어서의 글리세리드 획분의 분리 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 분자 증류, 단행정 증류 등의 증류법이나 각종 크로마토그래피를 사용한 분리 방법을 이용할 수 있다. 정제 방법도 통상 유지의 정제에 사용되는 방법을 사용하면 되고, 각종 크로마토그래피, 수증기 증류 등이 예시된다.

본 발명의 일 양태에 있어서, 공정 a) 또는 공정 b) 중 어느 하나, 또는 공정 a) 및 공정 b) 의 양방 모두에 있어서, 리파아제 반응을, 반응계 중에 소량의 물을 첨가하여 실시할 수 있다. 물을 첨가하는 경우, 물은 사용하는 저급 알코올에 대하여 1 ％(v/v) ∼ 30 ％(v/v), 보다 바람직하게는 5 ％(v/v) ∼ 20 ％(v/v) 의 양을 첨가한다. 유지 중에 함유되는 수분량에 대해서도 고려하는 것이 바람직하다.

저급 알코올의 양은, 예를 들어 반응계 중의 유지 또는 글리세리드 획분에 함유되는 지방산에 대하여 0.2 ∼ 5 당량, 보다 바람직하게는 0.2 ∼ 1.5 당량 사용한다.

공정 a) 를 함수 저급 알코올의 존재하에서 실시한 경우에 발생하는 지방산 저급 알코올 에스테르 및 유리 지방산은, 증류 (예를 들어, 박막 증류, 분자 증류 및 단공정 증류 등), 알칼리를 사용한 탈산 공정 등에 의해 제거할 수 있다.

이하에 실시예를 나타내어, 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 전혀 한정되는 것은 아니다. 또한 원료유, 및 글리세리드 획분의 EPA 또는 DHA 의 함유량은, 메틸에스테르화한 후에, 가스 크로마토그래피의 면적비에 따라 결정하였다. 또한, 가스 크로마토그래피 측정 전에 실시한 메틸에스테르화는, 일본 유화 (油化) 학회가 정하는 기준 유지 시험법으로 실시하였다 (일본 유화 학회 제정 기준 유지 분석 시험법 (I) 1996년판, 2.4.1 지방산 유도체화법, 2.4.1.2-1996 메틸에스테르화법 (3불화 붕소-메탄올법)).

실시예 1

(1) 공정 a) 의 리파아제 반응

정제 정어리유 (EPA 17.4 ％, DHA 11.9 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1.20 ㎏ 에 리파아제 QLM 을 1.49 g (100 unit/g), 물을 20.7 g, 산화 마그네슘 (쥰세이 화학 (주) 특급 시약 99 ％ 이상, 분말) 을 30 g (기름에 대하여 2.5 ％), 에탄올을 207 ㎖ 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하였다. 반응 후, 고형분을 여과 분리하고, 20 ％ 황산 560 ㎖ 와 식염수 200 ㎖ 각각으로 세정하고, 그 후, 유층 중에 잔존하는 수분과 에탄올을 증류 제거하여, 1.21 ㎏ 의 기름을 얻었다. 얻어진 기름으로부터 소량을 채취하여, 분취 TLC 로 글리세리드 획분을 분리하고, 메틸에스테르화한 후, 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 조성을 분석하였다. 분석 조건은 이하에 나타낸다 (특별히 언급이 없으면, 이후의 분취 TLC 및 가스 크로마토그래피에 의한 분석은 동일한 방법에 의해 실시하였다).

TLC 에서의 분취 조건, 메틸에스테르화 조건 ;

반응액 50 ㎕ 에 헥산 1 ㎖, 포화 식염수 10 ㎖ 를 첨가하고 헥산 추출하였다. 얻어진 헥산층 150 ㎕ 를 분취용 TLC 에 도포하고, 헥산 : 디에틸에테르 : 아세트산 (70 : 30 : 1, 체적비) 으로 전개하였다. 전개 후, 에틸에스테르 이외의 글리세리드 획분을 긁어모아서, 그대로 메틸레이트법에 의해 메틸에스테르화하였다. 즉 1 N 나트륨메톡시드/메탄올 용액 2 ㎖ 를 첨가하고 80 ℃ 에서 1 분간 가열하였다. 그 후 반응을 정지시키기 위하여, 1 N 염산을 2 ㎖ 첨가하고 80 ℃ 에서 1 분간 가열하였다. 다음으로 헥산 0.5 ㎖, 포화 식염수를 6 ㎖ 첨가하여 진탕 후 정치 (靜置) 하고, 헥산층을 가스 크로마토그래피에 의해 분석하였다.

가스 크로마토그래피 조건 ;

캐필러리 칼럼 : DB-WAX (J&W Scientific), Fused Silica Capillary Column, 0.25 mmI.D. × 30 m, 0.25 ㎛ film thickness

캐리어 가스 : 헬륨

검출기 : 250 ℃, FID

주입구 : 250 ℃, 스플릿비 ＝ 100 : 1

칼럼 온도 : 180 ℃ → 3 ℃/min → 230 ℃ (15 min)

장치 : Hewlett Packard 6890

또, 지질 조성은 TLC /FID 를 사용하여, 5 중량％ 의 헥산 용액 (1 ㎕) 을 실리카 겔 로드에 스포트 후, 헥산 : 디에틸에테르 : 아세트산 (90 : 10 : 1, 체적비) 으로 전개하고 분석하였다. 원료 정어리유의 지질 조성과 지방산 조성, 얻어진 기름의 지질 조성 (면적％) 과 글리세리드 획분의 지방산 조성 (면적％) 을 표 1 및 표 2 에 나타낸다. EPA 및 DHA 는 이 반응에 의해 글리세리드 획분으로 농축되어, 각각 46.7 ％, 20.6 ％ 가 되었다. 또, EPA, DHA 의 회수율은 각각 106.6 ％, 68.7 ％ 로 고회수율이었다. EPA, DHA 의 회수율 (％) 은, (반응 후의 글리세리드 획분의 EPA (또는 DHA) 의 비율 (％) × 글리세리드의 함량 (％))/(반응 전의 유지의 EPA (또는 DHA) 의 비율 (％)) 에 의해 산출하였다.

지질 조성 (면적％)
		정제 정어리유	공정 a) 반응 후
	에틸에스테르	0.0	43.5
글리세리드 획분	트리글리세리드	100.0	0.0
	디글리세리드	0.0	9.1
	모노글리세리드	0.0	30.6
	유리 지방산	0.0	16.9

(2) 글리세리드 획분의 분리

실시예 1 에서 얻어진 기름으로부터, 에틸에스테르 및 지방산을 막증류 장치를 사용하여 증류 제거하였다. 박막 증류 장치는 UIC GmbH 사 제조 단행정 증류 장치 KDL-5 (증발 면적 0.048 ㎡) 를 사용하여, 130 ℃, 1 × 10^-3 mbar, 0.60 ℓ/h 로 2 패스 처리하였다. 증류 제거 후의 잔류유의 지방산 조성 (면적％) 및 지질 조성 (면적％) 을 표 3 및 표 4 에 나타낸다. 지질 조성으로부터 에틸에스테르 및 유리 지방산이 증류 제거되고, EPA, DHA 가 농축된 글리세리드 획분이 얻어지는 것을 확인하였다.

지질 조성 (면적％)
	박막 증류 처리 후
	1 패스 후	2 패스 후
에틸에스테르	4.5	0.8
트리글리세리드	0.0	0.0
디글리세리드	35.2	44.2
모노글리세리드	54.5	51.7
유리 지방산	5.8	3.3

(3) 공정 b) 의 리파아제 반응 및 생성물의 분획

상기 공정 (2) 에서 얻은 기름 (글리세리드 획분) 1 g 에, 물 10 ㎕, 리포자임 TL IM 을 20 ㎎ (기름에 대하여 2.0 ％), 산화 마그네슘을 25 ㎎ (기름에 대하여 2.5 ％), 에탄올을 173 ㎕ 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하였다. 그 후, 고형분을 여과 분리하고 식염수로 세정한 후, 얻어진 기름의 지질 조성을 분석하였다. 분취 TLC 로 에틸에스테르와 글리세리드 획분을 각각 분취하여 지방산 조성을 분석하였다. 분취 TLC 의 조건은 실시예 1, (1) 공정 a) 와 동조건에서 실시하고, 이번 경우에는 에틸에스테르, 글리세리드 획분 각각에 대하여 긁어모아서 분석하였다. 반응 후의 지방산 조성 (면적％), 지질 조성을 표 5 및 표 6 에 나타낸다. DHA 는 글리세리드 획분으로 76.4 ％, EPA 는 에틸에스테르 획분으로 52.1 ％ 로 농축되어, DHA 농축유와 EPA 농축유를 동시에 얻을 수 있었다. 이 반응에 있어서의 글리세리드 획분의 DHA 회수율은 71.6 ％, 에틸에스테르 획분의 EPA 회수율은 74.9 ％ 였다. DHA 의 회수율 (％) 은, (반응 후의 글리세리드 획분의 DHA 의 비율 (％) × 반응 후의 글리세리드의 함량 (％))/(반응 전의 글리세리드 획분의 DHA 의 비율 (％)) 에 의해, EPA 의 회수율은, (반응 후의 에틸에스테르의 EPA 의 비율 (％) × 반응 후의 에틸에스테르의 함량 (％))/(반응 전의 EPA 의 비율 (％)) 에 의해 산출하였다.

지질 조성 (면적％)
	공정 b) 반응 후
에틸에스테르	64.8
트리글리세리드	0.0
디글리세리드	1.8
모노글리세리드	17.4
유리 지방산	15.2

실시예 2

실시예 1 의 공정 (3) 의 리포자임 TL IM 의 사용량을 5 ㎎ (기름에 대하여 0.5 ％) 으로 바꾸고, 실시예 1, 공정 (3) 과 동일한 조건에서 반응을 실시하였다. 결과를 표 7 및 표 8 에 나타낸다. 리파아제의 사용량을 줄인 경우에도, DHA 농축유와 EPA 농축유를 동시에 얻을 수 있었다. 이 반응에 있어서의 글리세리드 획분의 DHA 회수율은 114.7 ％, 에틸에스테르 획분의 EPA 회수율은 58.9 ％ 였다 (회수율에 있어서의 100 ％ 를 초과하는 수치는, 본 회수율 계산 방법이 간이 계산법인 점에서 연유한다. 즉, 회수율의 산출에 사용하고 있는 FID 의 측정값은, 분자량이 클수록 상대적인 감도가 높아지기 때문에 DHA 와 같은 분자량이 높은 지방산에서는, 높은 값이 얻어지게 된다. 이후의 실시예에 있어서도 동일하다).

지질 조성 (면적％)
	공정 b) 반응 후
에틸에스테르	48.5
트리글리세리드	0.0
디글리세리드	6.5
모노글리세리드	33.5
유리 지방산	10.2

실시예 3

원료의 지질로서 EPA 농도가 높은 저온 분별 정제 정어리유 (EPA 29.0 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 를 사용하여, DHA 농축유와 EPA 농축유를 조제하였다. 공정 a) 의 반응은, 정제 정어리유 1.2 ㎏, 리파아제 QLM 1.49 g, 물 20.7 ㎖, 산화 마그네슘 60 g, 에탄올 207 ㎖ 를 사용하여 40 ℃ 에서 16 시간 반응시키고, 처리 조작은 실시예 1 과 동일하게 실시하였다. 그 후, 실시예 1 과 동일한 조건에서 2 패스 박막 증류 처리를 실시하여 글리세리드 획분을 얻었다. 공정 b) 의 반응을, 공정 a) 에서 얻어진 기름 1 g, 물 10 ㎕, 리포자임 TL IM 20 ㎎, 산화 마그네슘 25 ㎎, 에탄올 173 ㎕ 를 사용하여 실시하고, 40 ℃ 에서 16 시간 반응시켰다. 분취 TLC 로 에틸에스테르와 글리세리드 획분을 각각 분취하였다 (조건은 실시예 1 과 동일하다). 원료 정제 정어리유 및 공정 a), 박막 증류 처리 2 패스 후의 잔류유, 및 공정 b) 반응 후의 지방산 조성을 표 9 에, 공정 a) 및 공정 b) 반응 후의 지질 조성을 표 10 에 나타낸다. 2 단계의 반응으로 EPA 농도가 73.9 ％, DHA 농도가 50.8 ％ 로 동시에 고농도화될 수 있었다. 공정 a) 반응에 있어서의 EPA 회수율은 95.8 ％, DHA 회수율은 53.7 ％ 이고, 공정 b) 반응에 있어서의 에틸에스테르 획분의 EPA 회수율은 62.6 ％, 글리세리드 획분의 DHA 회수율은 114.6 ％ 였다.

지질 조성 (면적％)
	공정 a) 반응 후	공정 b) 반응 후
에틸에스테르	36.2	52.5
트리글리세리드	0.0	0.0
디글리세리드	6.8	3.0
모노글리세리드	35.7	30.4
유리 지방산	22.3	14.1

이하, 본 발명을 실시하기 위한 조건 검토를, 참고예 1 ∼ 13 으로서 나타낸다.

참고예 1

정제 정어리유 (EPA 28.2 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1 g 에 리파아제 QLM (알칼리게네스 에스피, 메이토 산업 (주) 제조) 을 1.65 ㎎ (100 unit/g), 물을 17 ㎕, MgO (쥰세이 화학 (주) 특급 시약 99 ％ 이상) (기름에 대하여 0.25 ％(w/w) 또는 2.5 ％(w/w)), 에탄올을 170 ㎕ (지방산에 대하여 0.75 당량) 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하였다. 반응 후, 고형분을 여과 분리하고, 여과액을 헥산에 의해 추출하였다. 이하에 나타내는 방법에 의해 분취 TLC 로 글리세리드 획분을 분리하였다.

얻어진 글리세리드 획분을 메틸에스테르화하고, 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 조성을 분석하였다. 분취 TLC, 메틸에스테르화 및 가스 크로마토그래피의 분석 조건은 실시예 1 과 동일하였다.

리파아제 PS (바카홀데리아 세파시아, 아마노 엔자임 (주) 제조) 3.3 ㎎ (100 unit/g) 에 대해서도 동일한 조건에서 반응시켰다.

또한 비교예로서, 각각의 리파아제에 대하여 물 및 MgO 무첨가, 물만 첨가, MgO 만 0.25 ％(w/w) 첨가하는 것 이외에는 상기한 조건으로 에탄올리시스 반응을 실시하였다.

글리세리드 획분의 지질 조성은 TLC /FID (이아트로스캔 TH-10, 미츠비시 화학 야트론사 제조) 를 사용하고, 5 중량％ 의 헥산 용액 (1 ㎕) 을 실리카 겔 로드에 스포트한 후, 헥산 : 디에틸에테르 : 아세트산 (90 : 10 : 1, 체적비) 으로 전개하여 분석하였다. 결과는, 얻어진 차트로부터 글리세리드, 에스테르의 피크 면적비를 얻고, 그에 기초하여 글리세리드 회수율을 산출하였다. EPA 및 DHA 의 회수율은, (반응 후의 글리세리드의 PUFA 의 비율 (％) × 글리세리드의 함량 (％))/(반응 전의 PUFA 의 비율 (％)) 에 의해 산출한다. EPA 및 DHA 의 면적％, EPA 및 DHA 의 지방산 회수율 및 글리세리드 회수율의 결과를 표 11 에, 비교예의 결과를 표 12 에 나타낸다.

표 11 의 결과를 표 12 의 비교예의 결과와 비교하면, 리파아제량이 동일해도 물, MgO 를 첨가함으로 인한 EPA 및 DHA 의 농축에 미치는 효과가 명백하다. 또, MgO 첨가량 증가에 수반하여, EPA 및 DHA 가 농축된 것을 알 수 있다. 또한, EPA 및 DHA 회수율이 매우 높고, 당해 반응의 지방산 선택성이 유지되고 있다.

참고예 2

참고예 1 에서 사용한 정어리유보다 EPA 및 DHA 의 함유량이 적은 정어리유 (EPA 15.7 ％, DHA 8.99 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 를 원료로서 사용하고, 참고예 1 과 동일한 조건, 유지 1 g 에 리파아제 QLM 1.65 ㎎ (100 uni/g), 물 17 ㎕, MgO 2.5 ％(w/w), 에탄올 170 ㎕ 로 40 ℃ 에서 16 시간 에탄올리시스 반응을 실시하였다. EPA 및 DHA 면적％, 회수율, 글리세리드 회수율의 결과를 표 13 에 나타낸다.

참고예 3

정제 다랑어유 (EPA 6.75 ％, DHA 24.3 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 2 g 에 리포자임 TL IM (서모마이세스 라누기노서스, 노보자임사 제조) 2 ㎎ (기름에 대하여 0.1 ％(w/w)), 물 34 ㎕, MgO (0.25 ％(w/w) 또는 2.5 ％(w/w)), 에탄올 340 ㎕ 를 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하였다. 또한 비교예로서, 물 및 MgO 무첨가, 물만 첨가, MgO 만 0.25 ％(w/w) 첨가하는 것 이외에는 상기한 조건으로 에탄올리시스 반응을 실시하였다. 반응 후, 고형분을 여과 분리하고, 분취 TLC 로 글리세리드 획분을 분리하고, 메틸에스테르화한 후 지방산 조성을 분석하였다. EPA 및 DHA 의 지방산 회수율, 글리세리드 회수율을 표 14 에, 비교예의 EPA 및 DHA 의 면적％ 와 지방산 회수율, 글리세리드 회수율을 표 15 에 나타낸다.

리포자임 TL IM 을 사용한 경우에는, DHA 농도의 농축도가 높아지는 한편으로, EPA 의 에탄올리시스가 진행되고 있는 것을 알 수 있다. MgO 의 첨가량의 증가에 수반하여, DHA 농도의 농축도는 향상되었다. 비교예에서는, 동일한 효소량을 사용하고 있음에도 불구하고, DHA 는 거의 농축되지 않았다.

참고예 4

MgO 이외의 반응 첨가제의 효과를 조사하기 위하여, 참고예 1 과 동일한 반응 조건에서, 반응 첨가제 9 종류를 원료유에 대하여 1 ％(w/w) 첨가하였다. 즉, 정제 정어리유 (EPA 28.2 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1 g 에 리파아제 QLM (알칼리게네스 에스피, 메이토 산업 (주) 제조) 을 1.65 ㎎ (100 unit/g), 물을 17 ㎕, 표 16 에 나타내는 반응 첨가물 9 종류를 기름에 대하여 1 ％(w/w), 에탄올을 170 ㎕ (지방산에 대하여 0.75 당량) 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하였다. 반응 후, 고형분을 여과 분리하고, 분취 TLC 로 글리세리드 획분을 분리하고, 메틸에스테르화한 후 지방산 조성을 측정하였다. 표 16 에 글리세리드 획분의 EPA 면적％ 를 나타낸다. MgO 외에 수산화 마그네슘, 산화 칼슘 및 수산화 칼슘에 EPA 농축 효과가 보였다.

	EPA 면적％	메이커	그레이드	순도 min ％
산화 마그네슘	56.3	준세이 화학 (주)	특급	99
수산화 마그네슘	54.5	와코 쥰야쿠 공업 (주)	1 급	97
탄산 마그네슘 (염기성)	44.7	나카라이테스크 (주)	특급	MgCo₃ 60 - 55 ％ MgO 40 - 45 ％
염화 마그네슘	30.7	와코 쥰야쿠 공업 (주)	특급	98
산화 칼슘	46.9	와코 쥰야쿠 공업 (주)	특급	99.9
수산화 칼슘	46.6	나카라이테스크 (주)	특급	95
염화 칼슘	29.6	나카라이테스크 (주)	특급	98.5
질산 칼슘	30.1	나카라이테스크 (주)	특급	99.5
탄산 나트륨	29.9	와코 쥰야쿠 공업 (주)	특급	99.5
탄산 수소 칼륨	36.2	나카라이테스크 (주)	특급	99.7

참고예 5

리파아제 QLM 에 의한 EPA 농축 유지의 제조

정제 정어리유 (EPA 28.2 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1 ㎏ 에 리파아제 QLM (알칼리게네스 에스피, 메이토 산업 (주) 제조) 0.83 g, 물 17 g, MgO 2.5 g, 에탄올을 173 ㎖ 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하였다. 원심 분리 후 고형분을 제거하고, 에탄올을 증류 제거하여 1.06 ㎏ 얻었다. 묽은 황산으로 세정한 후 탕 (湯) 세정하고, 박막 증류 장치에 의해 에스테르, 지방산을 증류 제거하여, 글리세리드 획분으로서의 EPA 농축유를 583 g 얻었다. 지방산 조성을 측정한 결과, EPA 48.3 ％, DHA 17.3 ％ 였다.

참고예 6

리포자임 TL IM 에 의한 DHA 농축 유지의 제조

정제 다랑어유 (EPA 6.75 ％, DHA 24.3 ％) 1 ㎏ 에 리포자임 TL IM (서모마이세스 라누기노서스, 노보자임사 제조) 1 g, 물 17 g, MgO 5 g, 에탄올 173 ㎖ 를 첨가하고 40 ℃ 16 시간 교반하였다. 고형분을 여과 후, 에탄올을 증류 제거하여 1.07 ㎏ 을 얻었다. 인산으로 세정한 후 탕세정하고, 분자 증류 장치에 의해 에스테르, 지방산을 증류 제거하여, 글리세리드 획분으로서의 DHA 농축유 416 g 을 얻었다. 지방산 조성을 측정한 결과, EPA 9.4 ％, DHA 52.8 ％ 였다.

참고예 7

MgO 의 첨가량의 검토

참고예 1 과 동일한 조건, 즉, 정제 정어리유 (EPA 28.2 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1 g 에 리파아제 QLM 을 1.65 ㎎ (100 unit/g), 물을 17 ㎕, MgO (기름에 대하여 0 ∼ 10 ％(w/w)), 에탄올을 170 ㎕ (지방산에 대하여 0.75 당량) 첨가하고 40 ℃ 16 시간 교반하는 조건에서 알코올리시스를 실시하였다.

결과를 표 17 에 나타낸다. MgO 의 첨가량은 많을수록 반응을 촉진시켜 EPA 를 농축시켰다.

참고예 8

에탄올량의 검토

정제 정어리유 (EPA 28.2 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1 g 에 리파아제 QLM 을 0.83 ㎎ (50 unit/g), 물을 17 ㎕, MgO (기름에 대하여 0.25 ％(w/w)), 에탄올을 지방산에 대하여 0.5 ∼ 1.5 당량 첨가하고 40 ℃ 16 시간 교반하는 조건에서 알코올리시스를 실시하였다.

결과를 표 18 에 나타낸다. 에탄올의 사용량은 지방산량에 대하여 0.5 ∼ 1.5 당량이 바람직한 것을 알 수 있었다.

참고예 9

리파아제 사용량의 검토

정제 정어리유 (EPA 28.2 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1 g 에 리파아제 QLM 을 10 ∼ 50 unit/g, 물을 17 ㎕, MgO (기름에 대하여 0.25 ∼ 2.5 ％(w/w)), 에탄올을 지방산에 대하여 0.75 당량 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하는 조건에서 알코올리시스를 실시하였다.

결과를 표 19 에 나타낸다. 리파아제의 사용량은 25 unit/g 이상이 바람직한 것을 알 수 있었다. 또, 동일 리파아제량에서도 MgO 량을 증가시킴으로써 반응성을 높일 수 있는 것이 확인되었다.

참고예 10

반응 시간의 검토

정제 정어리유 (EPA 28.2 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1 g 에 리파아제 QLM 을 1.65 ㎎ (100 unit/g), 물을 17 ㎕, MgO (기름에 대하여 0.25 ％(w/w)), 에탄올을 지방산에 대하여 1 당량 첨가하고 40 ℃ 에서 0 ∼ 24 시간 교반하는 조건에서 알코올리시스를 실시하였다.

결과를 표 20 에 나타낸다.

[비교예]

MgO, 물을 사용하지 않는 경우의 리파아제의 반응

정제 정어리유 (EPA 28.2 ％, DHA 12.5 ％, 닛폰 수산 (주) 제조) 1 g 에 리파아제 QLM 을 100 ∼ 1000 unit/g), 에탄올을 지방산에 대하여 1 당량 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하는 조건에서 알코올리시스를 실시하였다.

참고예 11

은연어 추출유에 대한 적용

은연어 추출유 (EPA 9.8 ％, DHA 14.0 ％) 1 g 에 리포자임 TL IM (서모마이세스 라누기노서스, 노보자임사 제조) 을 2 ㎎ (0.2 ％), 물을 10 ㎕, MgO (쥰세이 화학 (주) 특급 시약 99 ％ 이상) (기름에 대하여 0.5 ％(w/w) 또는 2.5 ％(w/w)), 에탄올을 170 ㎕ (지방산에 대하여 0.75 당량) 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 교반하였다. 반응 후, 고형분을 여과 분리하고, 분취 TLC 로 글리세리드 획분을 분리하고 메틸에스테르화한 후, 가스 크로마토그래피에 의해 지방산 조성을 분석하였다. 분취 TLC, 메틸에스테르화, 가스 크로마토그래피의 분석 조건은 실시예 1 과 동일.

또한 비교예로서, 물 및 MgO 무첨가 이외에는 상기한 조건으로 에탄올리시스 반응을 실시하였다.

글리세리드 획분의 EPA, DHA 의 면적％, EPA, DHA 의 지방산 회수율 및 글리세리드 회수율의 결과를 표 22 에, 비교예의 결과를 표 23 에 나타낸다.

참고예 12

명태 추출유에 대한 적용

명태 추출유 (EPA 12.3 ％, DHA 7.9 ％) 를 원료로서 사용하고, 유지 1 g 에 리파아제 QLM 1.65 ㎎ (100 unit/g), 물 17 ㎕, MgO 2.5 ％(w/w), 및 에탄올 170 ㎕ 를 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 에탄올리시스 반응을 실시하였다. 또 리포자임 TL IM 5 ㎎ (0.5 ％) 에 대해서도 동일하게 물, MgO 를 첨가하고 에탄올리시스 반응을 실시하였다. EPA, DHA 면적％, 회수율, 글리세리드 회수율의 결과를 표 24 에 나타낸다. 리파아제 QLM 에서는 EPA 가 농축되고 리포자임 TL IM 에서는 DHA 가 농축되었다. 모두 EPA 와 DHA 를 합한 면적％ 는 원료의 배 이상으로 농축되었다.

또한 비교예로서, MgO 및 물 무첨가 이외에는 상기한 조건으로 에탄올리시스 반응을 실시한 결과를 표 25 에 나타낸다.

참고예 13

개복치 간유에 대한 적용

개복치 간유 (아라키돈산 (AA) 5.1 ％, EPA 4.2 ％, 도코사펜타엔산 (DPA) 7.7 ％, DHA 10.5 ％) 를 원료로서 사용하고, 유지 1 g 에 리파아제 QLM 1.65 ㎎ (100 unit/g), 물 17 ㎕, MgO 2.5 ％(w/w), 및 에탄올 170 ㎕ 를 첨가하고 40 ℃ 에서 16 시간 에탄올리시스 반응을 실시하였다. 또 리포자임 TL IM 5 ㎎ (0.5 ％) 에 대해서도 동일하게 물, MgO 를 첨가하고 에탄올리시스 반응을 실시하였다. AA, EPA, DPA, DHA 면적％, 회수율, 글리세리드 회수율의 결과를 표 26 에 나타낸다. 리파아제 QLM 에서는 AA, EPA, DPA 및 DHA 가 농축된 것에 반해, 리포자임 TL IM 은 DHA 만이 농축되었다.

또한 비교예로서, MgO 및 물 무첨가 이외에는 상기한 조건으로 에탄올리시스 반응을 실시한 결과를 표 27 에 나타낸다.

Claims

에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산을 구성 지방산으로서 함유하는 유지로부터 에이코사펜타엔산 농축유 및 도코사헥사엔산 농축유를 제조하는 방법으로서,
a) 반응 첨가물로서 산화 마그네슘, 수산화 마그네슘, 산화 칼슘, 수산화 칼슘 중에서 선택된 적어도 1 종의 화합물, 및 알코올 또는 함수 알코올의 존재하에서, 그 유지를 탄소수 18 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 리파아제에 의한 알코올리시스 반응 또는 가수 분해 반응을 수반하는 알코올리시스 반응에 제공하고, 얻어진 반응 혼합물로부터, 에이코사펜타엔산 및 도코사헥사엔산이 농축된 글리세리드 획분을 얻는 공정 ;
b) 반응 첨가물로서 산화 마그네슘, 수산화 마그네슘, 산화 칼슘, 수산화 칼슘 중에서 선택된 적어도 1 종의 화합물, 및 알코올 또는 함수 알코올의 존재하에서, 상기 글리세리드 획분을 탄소수 20 이하의 지방산에 기질 특이성을 갖는 리파아제에 의한 알코올리시스 반응 또는 가수 분해 반응을 수반하는 알코올리시스 반응에 제공하고, 얻어진 반응 혼합물로부터, 에이코사펜타엔산이 농축된 에스테르의 획분, 및 도코사헥사엔산이 농축된 글리세리드 획분을 분리하는 공정 ; 을 포함하는 상기 방법.
제 1 항에 있어서,
공정 a) 에서 사용하는 리파아제가 알칼리게네스 에스피 (Alcaligenes sp.) 에 속하는 미생물에서 얻어지는 리파아제인 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
공정 b) 에서 사용하는 리파아제가 서모마이세스 라누기노서스 (Thermomyces lanuginosus) 에 속하는 미생물에서 얻어지는 리파아제인 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 a) 에서 사용하는 리파아제가 리파아제 QLM (상품명) 인 방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 b) 에서 사용하는 리파아제가 리포자임 TL IM (상품명) 인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 a) 및/또는 공정 b) 의 반응 첨가물이 산화 마그네슘인 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 a) 및/또는 공정 b) 의 반응 첨가물의 첨가량이 유지에 대하여 0.01 ∼ 30 ％(w/w) 인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
알코올이 저급 알코올인 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
함수 알코올이 물을 1 ∼ 30 ％(w/w) 함유하는 것인 방법.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
공정 a) 에서 사용하는 유지가 어유인 방법.