CN101653437A - 磺酸基苯并-γ-吡喃酮类化合物的新用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及磺酸基苯并－γ－吡喃酮类化合物的新用途。具体而言，本发明涉及通式(I)所示的磺酸基苯并－γ－吡喃酮类化合物抑制HIV病毒的用途，其中通式(I)中的取代基R1、R2、R3、R4、R5和R6如说明书中所定义。
Description
技术领域
本发明涉及磺酸基苯并-γ-吡喃酮类化合物的新用途，特别是抑制HIV病毒的用途。
背景技术
艾滋病为“获得性免疫缺陷综合征”(Acquired Immune DeficiencySyndrome--AIDS)的简称，是人体感染了人类免疫缺陷病毒(HIV，又称艾滋病病毒)所导致的传染病。艾滋病就是人体的免疫系统被艾滋病病毒破坏，使人体对威胁生命的各种病原体丧失了抵抗能力，从而发生多种感染或肿瘤，最后导致死亡的一种严重传染病。多年来，国际社会为防治艾滋病作出了积极努力，防治工作有所进展，但艾滋病在全球范围内的传播仍未得到有效控制。随着艾滋病的迅速蔓延，艾滋病防治已成为全球关注的重要公共卫生社会热点问题。
抗艾滋病药物的研究一直是药物研究领域的重要课题，目前已经有20多个化学药物应用于临床，HARRT疗法(两个逆转录酶抑制剂和一个蛋白酶抑制剂组成的复方制剂)，对于延长病人寿命发挥了积极作用。但是，药物的毒性，特别是病毒耐药性的出现，给药物研究提出了新的课题。作用于HIV新靶点(gp41，整合酶，gp24等)的药物的研究，一直是国际上科学家和制药公司的研究重点。
2002年英国科学家发现某些淋巴细胞具有细胞因子APOBEC家族，他们是具有天然的抗病毒作用，但是HIV的Vif基因与其相吸附，会导致其降解，他们之间的相互作用很快被科学家们看重，认为是寻找新型药物的重要靶点。
年进兴等[1]针对1998年以来国内外学者筛选的具有较强抗HIV活性(IC50＜100μmol/L或100μg/mL)的天然苯并-γ-吡喃酮类化合物进行了综述。日本Ono等[2]1989年报导在对某些植物中提取的苯并-γ-吡喃酮类化合物进行抗HIV活性筛选过程中，首次发现黄芩素在浓度为2μg/mL时，对HIV的RT酶有抑制作用。90年代Matsuse等[3]Kim等[4]从大戟科植物中提取得到槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，体外评价了他们抑制HIV RT的活性。
天然的苯并-γ-吡喃酮类化合物的水溶性较差，很大程度上限制了此类化合物的活性研究及应用。而磺酸基在化合物水溶性改造方面具有有效性且磺酸基自身具有药效团作用。现有技术中，本发明涉及的磺酸基苯并-γ-吡喃酮类化合物的制备可以追溯到上世纪七十年代，通常以羟基取代苯并-γ-吡喃酮类化合物为原料，浓硫酸为反应试剂[5，6]；此外在植物中也提取到了磺酸基苯并-γ-吡喃酮类化合物[7]。
现有技术中披露磺酸基苯并-γ-吡喃酮类化合物的用途主要被用于抗乙肝病毒[8]、抗氧化[9，10，14]、心脑血管疾病的治疗[11]和抗肿瘤[12，13]，目前还未见有磺酸基苯并-γ-吡喃酮类化合物的抗艾滋病毒活性研究的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通式(I)所示化合物在制备抗HIV病毒药物中的应用，
其中：
当R1选自苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、3-(SO2-X)-4-羟基苯基或3-(SO2-X)-4，5-二羟基苯基，其中X选自OH、ONa、NH2、NHCmH2m+1(m＝1-8)、NCnH2n(n＝4或5)、吗啉、NHCHCOOH、NHCH(CH3)COOH、NHCH(CH2OH)COOH、NHCH(CH2SH)COOH、NHCH(CH2CH2CH2SCH3)COOH、NHCH(CH2(CH3))COOH、NHCH(CH2COOH)COOH或NHCH(CH2CH2COOH)COOH时，
R2表示OH，
R3表示H或OH，
R4表示H或OH，
R5表示OH，
R6表示SO2-X，其中X选自OH、ONa、NH2、NHCmH2m+1(m＝1-8)、NCnH2n(n＝4或5)、吗啉、NHCHCOOH、NHCH(CH3)COOH、NHCH(CH2OH)COOH、NHCH(CH2SH)COOH、NHCH(CH2CH2CH2SCH3)COOH、NHCH(CH2(CH3))COOH、NHCH(CH2COOH)COOH或NHCH(CH2CH2COOH)COOH；
或当R1表示H或OH时，
R2选自苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、3-(SO2-X)-4-羟基苯基、3，5-二(SO2-X)-4-羟基苯基或3-(SO2-X)-4，5-二羟基苯基，X＝OH、ONa、NH2、NHCmH2m+1(m＝1-8)、NCnH2n(n＝4或5)、吗啉、NHCHCOOH、NHCH(CH3)COOH、NHCH(CH2OH)COOH、NHCH(CH2SH)COOH、NHCH(CH2CH2CH2SCH3)COOH、NHCH(CH2(CH3))COOH、NHCH(CH2COOH)COOH或NHCH(CH2CH2COOH)COOH，
R3表示H或OH，
R4选自H、OH或SO2-X，其中X选自OH、ONa、NH2、NHCmH2m+1(m＝1-8)、NCnH2n(n＝4或5)、吗啉、NHCHCOOH、NHCH(CH3)COOH、NHCH(CH2OH)COOH、NHCH(CH2SH)COOH、NHCH(CH2CH2CH2SCH3)COOH、NHCH(CH2(CH3))COOH、NHCH(CH2COOH)COOH或NHCH(CH2CH2COOH)COOH，
R5表示OH，
R6表示H。
优选的是，在通式(I)所示化合物中，当R1选自苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、3-(SO2-X)-4-羟基苯基或3-(SO2-X)-4，5-二羟基苯基，其中X表示OH、ONa时，
R2表示OH，
R3表示H或OH，
R4表示H或OH，
R5表示OH，
R6表示SO2-X，其中X表示OH、ONa；
或当R1表示H或OH时，
R2选自苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、3-(SO2-X)-4-羟基苯基、3，5-二(SO2-X)-4-羟基苯基或3-(SO2-X)-4，5-二羟基苯基，其中X表示OH、ONa，
R3表示H或OH，
R4表示H、OH或SO2-X，其中X表示OH、ONa，
R5表示OH，
R6表示H。
更优选的是所述的通式(I)化合物选自下列化合物：
(1)2-(3，4-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-苯并-γ-吡喃酮-8-磺酸钠
(2)3-(3-磺酸钠-4-羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮
(3)3-(3-磺酸钠-4，5-二羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮
(4)2-(3-磺酸钠4，5-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-苯并-γ-吡喃酮-8-磺酸钠
(5)3-(3，5-二磺酸钠-4-羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮
(6)3-(3-磺酸钠-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-苯并-γ-吡喃酮-6-磺酸钠
本发明另一个目的在于所述通式(I)化合物对HIV病毒的作用靶点为HIV-1 Vif和APOBEC3G蛋白。
本发明另一个目的在于提供含有所述通式(I)化合物的组合物在制备抗HIV病毒药物中的应用，其中该组合物包括药学上可接受的载体。通常本发明药物组合物含有0.1-95重量％的本发明化合物。
本发明另一个目的在于含有所述的通式(I)化合物的组合物对HIV病毒的作用靶点也为HIV-1 Vif和APOBEC3G蛋白。
本发明另一个目的在于提供一种艾滋病的治疗方法，其中向患者给予治疗有效剂量的所述的通式(I)化合物或者含有通式(I)化合物的组合物。
本发明所述的化合物的剂型包括片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂和栓剂。
本发明所述的含有通式(I)化合物的组合物的剂型包括片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂和栓剂。
结合现有技术，通式(I)化合物的制备方法，
包括：
通式(II)的苯并-γ-吡喃酮类化合物在快速搅拌下加入浓硫酸，0-50℃下反应2-6小时后，加入饱和氯化钠溶液，静置，减压抽滤，得桔黄色产物，经重结晶得式I所示化合物。
具体而言，3mmol的苯并-γ-吡喃酮类化合物(II)在快速搅拌下加入4mL浓硫酸，0-50℃下反应2-6h后，加入饱和氯化钠溶液50mL，静置，减压抽滤，滤饼用饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，抽滤至干，得桔黄色产物。产物经蒸馏水重结晶三次，无水乙醇重结晶一次，冷冻结晶，减压抽滤，干燥，得无定形晶体(I)，其主要成分为苯并-γ-吡喃酮类化合物的单磺酸钠衍生物。作为反应原料的苯并-γ-吡喃酮类化合物选自槲皮素、山奈酚、高良姜素、大豆苷元或染料木素。
本发明化合物也可根据现有技术所述的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明的化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药使用的适当的施用形式或剂量形式。
本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等，优选口服。
给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其它剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂等。
本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露糖、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。其它载体如聚丙稀酸树脂类、脂质体，水溶性载体如PEG4000和PEG6000、PVP等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。
例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。
例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成分本发明化合物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中应用。
例如，将本发明化合物制成液体制剂，如溶液剂、混悬剂、溶液剂、乳剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂。如稀释剂可选自水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。这些辅料是本领域常用的。
此外，如果还需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。
为达到用药目的，增强治疗效果，本发明化合物制成的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。
本发明化合物、药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有大范围的变化。一般来讲，本发明中化学成分的使用剂量可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的化合物实际数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的治疗目的。
本发明化合物的用量为1-80mg/Kg体重，优选为3-20mg/Kg体重。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三、四个剂量形式给药。这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
附图说明
图1：化合物1在MT-4细胞中对HIV-1 BH10wt毒株的抑制作用。
图2：化合物1在H9细胞中对HIV-1 BH10wt毒株的抑制作用。
图3：化合物1在MT-2细胞中对HIV-1 BH10wt毒株的抑制作用。
图4：BIAcore检测化合物1与Vif的相互作用。
图5：BIAcore检测化合物1与APOBEC3G蛋白的相互作用。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图详细描述本发明，该实施例不应解释为对本发明的限制。
实施例1
2-(3，4-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-苯并-γ-吡喃酮-8-磺酸钠(又名：槲皮素-8-磺酸钠)的制备
根据现有技术的的方法[5，6]，将1.0g槲皮素粉末在快速搅拌下加入4mL浓硫酸，0-50℃下反应2-6h后，加入饱和氯化钠溶液50mL，静置，减压抽滤，滤饼用饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，抽滤至干，得桔黄色产物。产物经蒸馏水重结晶三次，无水乙醇重结晶一次，冷冻结晶，减压抽滤，干燥，得无定形晶体1.15g，即2-(3，4-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-苯并-γ-吡喃酮-8-磺酸钠(化合物1)，产率86％。
1H NMR(DMSO-d6)δ6.15(1H，s，H-6)，8.00(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.87(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)，7.89(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.4Hz，H-6′)；13CNMR(DMSO-d6)δ147.5(C-2)，135.8(C-3)，175.7(C-4)，160.4(C-5)，98.0(C-6)，160.7(C-7)，109.7(C-8)，152.8(C-9)，103.1(C-10)，122.0(C-1′)，115.5(C-2′)，144.7(C-3′)，147.9(C-4′)，116.3(C-5′)，120.8(C-6′)。
实施例2
3-(3-磺酸钠-4-羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮(又名：大豆苷元-3′-磺酸钠)的制备[9]
将0.762g大豆苷元粉末在快速搅拌下加入4mL浓硫酸，0-50℃下反应2-6h后，加入饱和氯化钠溶液50mL，静置，减压抽滤，滤饼用饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，抽滤至干，得浅黄色粉末。所得产物经蒸馏水重结晶三次，无水乙醇重结晶一次，冷冻结晶，减压抽滤，干燥，得无定形晶体0.96g，即3-(3-磺酸钠-4-羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮(化合物2)，产率90％。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.34(1H，s，H-2)，7.76(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，6.66(1H，d，J＝8.4Hz，H-6)，6.45(1H，s，H-8)，7.66(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.80(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)，7.37(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.4Hz，H-6′)；13CNMR(DMSO-d6)δ151.8(C-2)，122.9(C-3)，174.2(C-4)，126.3(C-5)，112.4(C-6)，170.6(C-7)，101.8(C-8)，158.7(C-9)，118.5(C-10)，122.5(C-1′)，127.6(C-2′)，130.5(C-3′)，153.2(C-4′)，116.1(C-5′)，131.5(C-6′)。
实施例3
3-(3-磺酸钠-4，5-二羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮(又名：染料木素-3′-磺酸钠)的制备[9，11]
将0.81g染料木素粉末在快速搅拌下加入4mL浓硫酸，0-50℃下反应2-6h后，加入饱和氯化钠溶液50mL，静置，减压抽滤，滤饼用饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，抽滤至干，得浅黄色粉末。所得产物经蒸馏水重结晶三次，无水乙醇重结晶一次，冷冻结晶，减压抽滤，干燥，得无定形晶体0.90g，即3-(3-磺酸钠-4，5-二羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮(化合物3)，产率81％。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.49(1H，s，H-2)，6.26(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，6.43(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，7.71(1H，d，J＝2.0Hz，H-2′)，6.86(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)，7.39(1H，dd，J＝2.0Hz，J＝8.4Hz，H-6′)；13CNMR(DMSO-d6)δ154.3(C-2)，121.1(C-3)，180.0(C-4)，161.9(C-5)，99.1(C-6)，164.5(C-7)，93.8(C-8)，157.6(C-9)，104.4(C-10)，121.8(C-1′)，127.8(C-2′)，130.7(C-3′)，154.3(C-4′)，116.4(C-5′)，131.6(C-6′)。
实施例4
2-(3-磺酸钠-4，5-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-苯并-γ-吡喃酮-8-磺酸钠(又名：槲皮素-8，3′-二磺酸钠)的制备[5，6]
将0.904g槲皮素粉末在快速搅拌下加入4mL浓硫酸，0-50℃下反应48-96h后，加入饱和氯化钠溶液50mL，静置，减压抽滤，滤饼用饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，抽滤至干，得浅土黄色产物。产物经蒸馏水重结晶三次，无水乙醇重结晶一次，冷冻结晶，减压抽滤，干燥，得无定形晶体1.121g，即2-(3-磺酸钠-4，5-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-苯并-γ-吡喃酮-8-磺酸钠(化合物4)，产率74％。
1H NMR(DMSO-d6)δ6.17(1H，s，H-6)，7.94(1H，d，J＝2.0Hz，H-6′)，8.30(1H，s，H-2′)；13C NMR(DMSO-d6)δ146.9(C-2)，136.4(C-3)，175.1(C-4)，160.5(C-5)，98.2(C-6)，160.8(C-7)，109.7(C-8)，152.8(C-9)，103.3(C-10)，121.2(C-1′)，119.5(C-2′)，130.6(C-3′)，145.6(C-4′)，144.4(C-5′)，116.3(C-6′)。
实施例53-(3，5-二磺酸钠-4-羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮(又名：大豆苷元-3′，5′-二磺酸钠)[10]的制备
0.663g大豆苷原粉末在快速搅拌下加入4mL浓硫酸，50-100℃下反应30h后，加入饱和氯化钠溶液50mL，静置，减压抽滤，滤饼用饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，抽滤至干，得为乳白色粉末。所得产物经蒸馏水重结晶三次，无水乙醇重结晶一次，冷冻结晶，减压抽滤，干燥，得结晶性粉末0.574g，即3-(3，5-二磺酸钠-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-苯并-γ-吡喃酮(化合物5)，产率48.0％。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.30(1H，s，H-2)，7.97(1H，d，H-5)，6.97(1H，dd，J＝8.8，2.0Hz，H-6)，6.91(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，7.75(2H，s，H-2′，6′)；13CNMR(DMSO-d6)δ153.6(C-2)，123.3(C-3)，174.8(C-4)，127.5(C-5)，115.7(C-6)，163.2(C-7)，102.5(C-8)，157.8(C-9)，116.8(C-10)，121.4(C-1′)，129.8(C-2′，6′)，132.8(C-3′，5′)，150.6(C-4′)。
实施例6
3-(3-磺酸钠-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-苯并-γ-吡喃酮-6-磺酸钠(又名：染料木素-6，3′-二磺酸钠)的制备[10]
将0.946g染料木素粉末在快速搅拌下加入4mL浓硫酸，0-50℃下反应20d后，加入饱和氯化钠溶液50mL，静置，减压抽滤，滤饼用饱和氯化钠溶液(5mL×3)洗涤，抽滤至干，得为乳白色粉末。所得产物经蒸馏水重结晶三次，无水乙醇重结晶一次，冷冻结晶，减压抽滤，干燥，得无定形晶体0.202g，即3-(3-磺酸钠-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-苯并-γ-吡喃酮-6-磺酸钠(化合物6)，产率12.5％。
1H NMR(DMSO-d6)δ8.39(1H，s，H-2)，6.44(1H，s，H-8)，7.74(1H，s，H-2′)，6.87(1H，d，J＝8.0Hz，H-5′)，7.40(1H，d，J＝8.0Hz，H-6′)；13CNMR(DMSO-d6)δ153.5(C-2)，120.8(C-3)，180.5(C-4)，160.3(C-5)，113.9(C-6)，160.8(C-7)，94.0(C-8)，157.2(C-9)，103.9(C-10)，121.7(C-1′)，127.9(C-2′)，130.7(C-3′)，154.6(C-4′)，116.5(C-5′)，131.6(C-6′)。
实施例7
抗HIV-1活性试验
材料：
细胞：MT-4细胞(允许性细胞，细胞中不表达APOBEC3G)；H9细胞、MT-2细胞(非允许性细胞，细胞中表达APOBEC3G，限制Δvif毒株的复制)。北京工业大学生命科学与生物工程学院培养保存。
毒株：HIV-1 BH10wt和HIV-1BH10Δvif质粒由加拿大LadyDavis Institute for Medical Research岑山教授提供，经转染293T细胞后制备相应的毒株。毒株由北京工业大学生命科学与生物工程学院培养保存。
药物：待测定实施例中得到的化合物1，先测定最大无毒浓度，检测抗HIV-1病毒活性时自最大无毒浓度的药物起以4倍比稀释5个浓度。
方法：
7.1细胞毒的检测
7.1.1将MT-4细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液稀释成细胞悬液，每毫升含50万细胞，加入96孔平底培养板内，每孔0.1ml(含5×104细胞/孔)。向96孔培养板内分别加入2倍比稀释的系列药液0.1ml(药物终浓度为200μg/ml～25μg/ml)，每个药物浓度设立4个复孔。37℃、5％CO2孵箱培养。同时设立正常细胞对照组(不加药物)。逐日观察细胞生长，形态变化。培养第5天，镜下观察各浓度药物组细胞形态有无明显改变。采用MTT法测定细胞活性，反映药物对细胞的毒性。
7.1.2 MTT法测定细胞活性：向培养的MT-4细胞中加入20μl/孔5mg/ml MTT贮存液，37℃孵育4小时，弃去100μl/孔细胞培养上清，加入150μl/孔DMSO或酸化异丙醇，结晶溶解后，测定A570/630nm。以下列公式计算药物对细胞的毒性，结果见表1。
以药物浓度的对数为横坐标，以对MT-4细胞的抑制率为纵坐标绘制曲线，利用直线回归方法计算回归曲线，计算化合物1对MT-4细胞的50％中毒浓度(TC50)为100.44μg/ml。
表1 MTT法测定药物对MT-4细胞的毒性作用结果：
7.1.3 CPE法观察药物对细胞的毒性：逐日观察、记录加药后细胞形态的改变，确定药物的最大无毒剂量。结果见表2。
表2 CPE法观察药物对H-9细胞的毒性作用
样品 最大无毒剂量(μg/ml)
化合物2 1000
化合物3 200
化合物4 200
化合物5 1000
化合物6 500
7.2抗HIV-1活性的检测
分别离心收集500万MT-4(允许性细胞)、H9、MT-2(非允许性细胞)，加入1ml含10000TCID50 HIV-1 BH10wt和HIV-1BH10Δvif的RPMI 1640培养液，37℃、5％CO2孵箱孵育2小时。1500rpm离心后，1640洗涤一次，离心，加入10ml 1640重悬，96孔板每孔加入100μl细胞病毒悬液(含5×104细胞/孔)。选用白最大无毒浓度药物，倍比稀释5个浓度，每个浓度4个复孔，每孔100μl。同时设立病毒对照组(只加病毒，不加药物)、细胞对照组(不加病毒，不加药物)。于37℃、5％CO2孵箱继续培养5天，期间，第3天更换药液。逐日观察细胞生长与形态变化。细胞对照组细胞生长状态良好，病毒对照组于培养后第3～4天出现合胞体。培养第5天，收获培养上清，以测定p24抗原的方法检测培养上清p24抗原含量，以示病毒的增殖情况。将给药组与病毒对照组进行比较，以下列公式计算药物的抑制率：
最后计算50％抑制病毒浓度(IC50)及治疗指数(TI＝TC50/IC50)。
以P24抗原检测法测定药物在MT-4、H9、MT-2细胞中分别对HIV-1 BH10wt和HIV-1 BH10Δvif毒株的抑制作用，结果见表3、4、5。以药物浓度(或药物浓度的对数)为横坐标，以对病毒的抑制率为纵坐标绘制曲线，利用直线回归方法计算回归曲线(见图1、2、3)，计算化合物1对HIV-1 BH10wt毒株的50％抑制病毒浓度(IC50)。
表3 化合物1在MT-4细胞中对HIV-1 BH10wt和HIV-1BH10Δvif毒株的抑制作用
化合物1在MT-4细胞中对HIV-1 BH10wt和HIV-1 BH10Δvif毒株仅有轻微的抑制作用。在MT-4细胞中化合物1对HIV-1 BH10wt毒株的50％抑制病毒浓度(IC50)为9.35μg/ml。
表4 化合物1在H9细胞中对HIV-1 BH10wt和HIV-1 BH10Δvif毒株的抑制作用
化合物1在H9细胞中对HIV-1 BH10wt毒株有明显的抑制作用，对HIV-1 BH10Δvif毒株没有抑制作用。在H9细胞中化合物1对HIV-1BH10wt毒株的50％抑制病毒浓度(IC50)为1.11μg/ml。
表5 化合物1在MT-2细胞中对HIV-1 BH10wt和HIV-1BH10Δvif毒株的抑制作用
化合物1在MT-2细胞中对HIV-1 BH10wt毒株有明显的抑制作用，
对HIV-1 BH10Δvif毒株没有抑制作用。在MT-2细胞中化合物1对HIV-1 BH10wt毒株的50％抑制病毒浓度(IC50)为0.02μg/ml。
根据化合物1对MT-4细胞的毒性及化合物1对HIV-1 BH10wt和HIV-1 BH10Δvif毒株的抑制作用，计算治疗指数(TI＝TC50/IC50)，结果见表6。
表6 化合物1体外药效学检测结果
实验结果显示在非允许性细胞(MT2、H9)中，化合物1发挥其抗病毒作用，对BH10wt毒株有明显的抑制作用，其抑制作用强于对BH10Δvif毒株的抑制作用；而且与允许性细胞(MT4)中相比，化合物1在非允许性细胞中对BH10wt毒株具有较强的抑制作用。鉴于HIV-1 Vif在病毒感染非允许性细胞时起着重要的作用，这些结果提示，化合物1可以拮抗Vif蛋白，从而发挥其抗病毒活性。
采用同样的实验方法，分别测定了化合物2、化合物3、化合物4、化合物5、化合物6在H9细胞中对BH10wt毒株和H9-BH10Δvif毒株的抑制作用。此外，还采用了单轮感染实验测定了化合物在MAGI细胞中对HIV-1 IIIB毒株的抑制作用。MAGI(Multinuclear Activation ofGalactosidase Indicator)细胞，为HeLa-CD4-LTR-β-gal。HIV-1毒株可以感染MAGI细胞，若病毒感染后表达出病毒调节蛋白Tat后，激活LTR启动的β-gal基因，表达β-半乳糖苷酶，可以使X-Gal底物分解，在细胞核处产生蓝斑。通过比较蓝斑数目的多少，可以反映病毒的感染力。该实验常常被用于测定病毒单个复制周期的感染力。实验方法如下：
96孔培养板每孔接种6000细胞，次日细胞达50％成层。吸弃培养基，每孔加入100μl 50倍稀释的HIV-1 IIIB病毒贮存液(相当于每孔加入2μl病毒原液)，之后，每孔加入相应浓度的稀释药液100μl，每个浓度4个复孔，同时设立病毒对照组(只加病毒，不加药物)、细胞对照组(不加病毒，不加药物)。于37℃、5％CO2孵箱继续培养40-48小时。固定、染色，全自动显微镜下扫描，计数蓝斑数目。将给药组与病毒对照组进行比较，计算药物的抑制率、IC50及TI。结果见表7、8。
表7 其它化合物体外药效学检测结果(原始数据)
表8 其它化合物体外药效学检测结果分析
实施例8
抗HIV-1活性靶点的确定(BIAcore)
本研究采用本发明化合物进行其对HIV-1 Vif(病毒感染因子)结合作用的结果见图4，图5。将基因重组的Vif偶联BIAcore检测仪的芯片上，分别加入20μg/mL化合物1溶液，可检测到化合物1与Vif的结合可达461.9RU(图4)，与APOBECG结合可达668.5RU9(图5)。各化合物在浓度为20μg/ml时与HIV Vif蛋白间的相互作用检测结果见表9。
表9 BIACore技术测定化合物(20μg/ml)与HIV Vif蛋白间的相互作用
样品 RU
化合物1 461.9
化合物2 56.1
化合物3 44.6
化合物4 601.6
化合物5 52.4
化合物6 73.1
实施例9
化合物1对Vif降解APOBEC3的保护作用
试验方法如下：
(1)将293T细胞铺到六孔板中第二天用来做转染(做转染时细胞密度达到70％～80％)
(2)次日，用vif及APOBEC3G质粒对293T细胞进行共转染：每孔vif质粒1μg，APOBEC3G质粒0.25～0.5μg(APOBEC3G的浓度过高时，影响vif对其的降解效果，不利于药物筛选)，lipofectamine2000 10ul，严格按试剂的说明操作。
(3)在转染后24小时加药物(可适当提前，因为24小时的时候vif及APOBEC3G都已经大量的表达，降解已经开始)，48小时收细胞并裂解。裂解液中要有蛋白酶抑制剂，防止对样品的降解。
(4)Western Blot检测(常规方法)跑胶后之胶片以扫描仪扫描得扫描值，以仅有H3G为对照组，此组扫描值为1.0，给药组与对照组进行比较，得降解/保护百分率。
试验结果：化合物1可以保护H3G减少Vif对其降解，随着剂量增加，保护率增加。(见下表)
综合化合物1在MT2、H9和MT4中的抗HIV-1活性及BIAcore检测结果，可以认为化合物1的作用靶点是HIV-1 Vif与APOBEC3G蛋白。
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Claims (10)
1、一种通式(I)所示化合物在制备抗HIV病毒药物中的用途，
其中：
当R1选自苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、3-(SO2-X)-4-羟基苯基或3-(SO2-X)-4，5-二羟基苯基，其中X选自OH、ONa、NH2、NHCmH2m+1(m＝1-8)、NCnH2n(n＝4或5)、吗啉、NHCHCOOH、NHCH(CH3)COOH、NHCH(CH2OH)COOH、NHCH(CH2SH)COOH、NHCH(CH2CH2CH2SCH3)COOH、NHCH(CH2(CH3))COOH、NHCH(CH2COOH)COOH或NHCH(CH2CH2COOH)COOH时，
R2表示OH，
R3表示H或OH，
R4表示H或OH，
R5表示OH，
R6表示SO2-X，其中X选自OH、ONa、NH2、NHCmH2m+1(m＝1-8)、NCnH2n(n＝4或5)、吗啉、NHCHCOOH、NHCH(CH3)COOH、NHCH(CH2OH)COOH、NHCH(CH2SH)COOH、NHCH(CH2CH2CH2SCH3)COOH、NHCH(CH2(CH3))COOH、NHCH(CH2COOH)COOH或NHCH(CH2CH2COOH)COOH；
或当R1表示H或OH时，
R2选自苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、3-(SO2-X)-4-羟基苯基、3，5-二(SO2-X)-4-羟基苯基或3-(SO2-X)-4，5-二羟基苯基，X＝OH、ONa、NH2、NHCmH2m+1(m＝1-8)、NCnH2n(n＝4或5)、吗啉、NHCHCOOH、NHCH(CH3)COOH、NHCH(CH2OH)COOH、NHCH(CH2SH)COOH、NHCH(CH2CH2CH2SCH3)COOH、NHCH(CH2(CH3))COOH、NHCH(CH2COOH)COOH或NHCH(CH2CH2COOH)COOH，
R3表示H或OH，
R4选自H、OH或SO2-X，其中X选自OH、ONa、NH2、NHCmH2m+1(m＝1-8)、NCnH2n(n＝4或5)、吗啉、NHCHCOOH、NHCH(CH3)COOH、NHCH(CH2OH)COOH、NHCH(CH2SH)COOH、NHCH(CH2CH2CH2SCH3)COOH、NHCH(CH2(CH3))COOH、NHCH(CH2COOH)COOH或NHCH(CH2CH2COOH)COOH，
R5表示OH，
R6表示H。
2、根据权利要求1所述的用途，其中：通式(I)所示化合物中
当R1选自苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、3-(SO2-X)-4-羟基苯基或3-(SO2-X)-4，5-二羟基苯基，其中X表示OH、ONa时，
R2表示OH，
R3表示H或OH，
R4表示H或OH，
R5表示OH，
R6表示SO2-X，其中X表示OH、ONa；
或当R1表示H或OH时，
R2选自苯基、4-羟基苯基、3，4-二羟基苯基、3-(SO2-X)-4-羟基苯基、3，5-二(SO2-X)-4-羟基苯基或3-(SO2-X)-4，5-二羟基苯基，其中X表示OH、ONa，
R3表示H或OH，
R4表示H、OH或SO2-X，其中X表示OH、ONa，
R5表示OH，
R6表示H。
3、根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物选自下列化合物：
(1)2-(3，4-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-苯并-γ-吡喃酮-8-磺酸钠
(2)3-(3-磺酸钠-4-羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮
(3)3-(3-磺酸钠-4，5-二羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮
(4)2-(3-磺酸钠4，5-二羟基苯基)-3，5，7-三羟基-苯并-γ-吡喃酮-8-磺酸钠
(5)3-(3，5-二磺酸钠-4-羟基苯基)-7-羟基-苯并-γ-吡喃酮
(6)3-(3-磺酸钠-4-羟基苯基)-5，7-二羟基-苯并-γ-吡喃酮-6-磺酸钠
4、根据权利要求1至3任何一项所述的通式(I)化合物的用途，其特征在于所述化合物对HIV病毒的作用靶点为HIV-1 Vif和APOBEC3G蛋白。
5、含有如权利要求1至3任何一项所述的通式(I)化合物的组合物在制备抗HIV病毒药物中的用途，其中该组合物包括药学上可接受的载体。
6、根据权利要求5所述的含有通式(I)化合物的组合物的用途，其特征在于所述含有通式(I)化合物的组合物对HIV病毒的作用靶点为HIV-1 Vif和APOBEC3G蛋白。
7、根据权利要求1至3任何一项所述的通式(I)化合物的用途，其特征在于，所述的化合物的剂型包括片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂和栓剂。
8、根据权利要求5所述的含有通式(I)化合物的组合物的用途，其特征在于，所述的含有通式(I)化合物的组合物的剂型包括片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂和栓剂。
9、一种艾滋病的治疗方法，其中向患者给予根据权利要求1-3任何一项所述的治疗有效剂量的通式(I)化合物。
10、一种艾滋病的治疗方法，其中向患者给予根据权利要求5所述的治疗有效剂量的含有通式(I)化合物的组合物。
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