CN101573133B

CN101573133B - Peg化延长的胰岛素

Info

Publication number: CN101573133B
Application number: CN200780036662.2A
Authority: CN
Inventors: P·马德森; T·B·克尔德森; T·M·塔格莫斯; P·雅各布森
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2006-07-31
Filing date: 2007-07-16
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2027-07-16
Also published as: US20110319591A1; EP2049149A2; WO2008015099A3; JP2009545550A; US8710001B2; US20090306337A1; CN101573133A; JP5550338B2; WO2008015099A2; ES2542146T3; EP2049149B1

Abstract

PEG化延长的胰岛素是与人胰岛素相比具有一个或者更多个从A1、B1、A21和/或B30位延长的胰岛素，所述延长由氨基酸残基构成，其中PEG部分通过接头附加到延长部分中的一个或者更多个氨基酸残基上。PEG是聚乙二醇。与常规胰岛素相比，这些PEG化延长的胰岛素具有较高的生物利用度和较长的作用时间特征，并且特别适于肺部给药，并能便利地用于治疗糖尿病。

Description

PEG化延长的胰岛素

发明领域

本发明涉及PEG化(PEGylated)延长的胰岛素，其具有胰岛素活性，并能被用于糖尿病的治疗。与常规胰岛素相比，PEG化延长的胰岛素具有较高的生物利用率以及较长的作用-时间特征，并且特别适于肺部给药。它们还将具有高物理稳定性以及低纤维化倾向，并在中性pH值时是可溶的。本发明还涉及含有该PEG化延长的胰岛素的药物组合物。

发明背景

胰岛素分子的遗传物理和化学稳定性是糖尿病胰岛素疗法的基本条件。这些基本性质对于胰岛素制剂以及可应用的胰岛素给药方法以及药物制剂贮藏期限和储藏条件是重要的。在胰岛素的给药中使用溶液会将分子暴露到多种因素的组合例如高温、可变的气-液-固界面以及剪切力，这可能导致不可逆的构象变化例如纤维化。

遗憾的是，许多糖尿病患者不愿意接受密集的治疗，因为与维持葡萄糖水平精确控制所要求的多次注射有关的不适。这类治疗在心理上和生理上都可能是痛苦的。在口服给药之后，胰岛素在胃肠道中被迅速地降解并且不被吸收到血流中。因此，许多研究者已经研究了替代的途径用于胰岛素给药，例如口腔、直肠、经皮和经鼻途径。然而，到目前为止这些给药途径还没有产生有效的胰岛素吸收。

有效的肺部递送蛋白质依赖于将蛋白质递送到深层肺泡腔上皮的能力。存储在上呼吸道上皮的蛋白质不会被显著程度地吸收。这是由于存在厚度大约30-40μm并且作为吸收障碍的覆盖粘膜。另外，储存在该上皮的蛋白质被通过黏膜纤毛沿呼吸道向上转运而清除，接着通过胃肠道除去。该机理还显著地造成某些蛋白质颗粒的低吸收。蛋白质不被吸收而是被这些途径除去的程度，依赖于它们的可溶性、它们的尺寸以及其他较少了解的特征。

然而，公知可以通过在它们上面接枝有机链类分子增强肽的性质。此类接枝可以改善药物性质例如血清中的半衰期、针对蛋白质水解降解的稳定性以及降低的免疫原性。

通常用于增强性质的有机链类分子是聚乙二醇-基链，即基于重复单元-CH₂CH₂O-的链。在下文中，缩写“PEG”用于聚乙二醇。

经典的PEG技术利用通过在多肽上附加可溶有机分子而提供提高尺寸(Stoke半径)的多肽(Kochendoerfer，G.，等人，Science(299)884et seq.，2003)。该技术导致与原始多肽相比，在人与动物中激素肽清除的减少。然而，该技术常常受到进行该技术的激素多肽的效力降低的阻碍(Hinds，K.，等人，Bioconjugate Chem.(11)，195-201，2000)。

用于肺部给药的的胰岛素组合物以及其制备方法被公开在WO02/094200和WO 03/022996中，其中所述胰岛素组合物包含共价连接到一个或更多个非天然亲水聚合物(包括聚二醇)分子的双链胰岛素的共轭物。

发明目的

对于与目前已知的胰岛素衍生物相比作用特征更长并且同时在生理pH下是可溶并且与人胰岛素具有相当效力的的胰岛素一直存在需求。而且，对于充分适于肺部应用的进一步胰岛素制剂也存在需求。

本发明的一个方面涉及提供药物，其可以方便地肺部给药以治疗糖尿病患者。

本发明的另一个方面涉及提供药物，其可以方便地被肺部给药以治疗糖尿病患者，并降低某些或者全部通常与糖尿病有关的晚期并发症的风险。

本发明的另一个方面涉及提供药物，其可以方便地肺部给药以治疗糖尿病患者，并且其更方便地用于许多利用注射的患者。

本发明的另一个方面涉及提供药物，其可以方便地肺部给药以治疗糖尿病患者并且具有充分化学稳定性。

本发明的另一个方面涉及提供药物，其可以方便地肺部给药以治疗糖尿病患者并且具有充分物理稳定性。

本发明的另一个方面涉及提供药物，其具有充分的高胰岛素受体亲合力。

本发明的目的是克服或者改善现有技术的至少一个缺点，或者提供有用的替换。

定义

胰岛素是由胰腺β-细胞分泌的多肽激素，其由被称作A链和B链的两条多肽链构成，其中A链和B链通过2个链间二硫桥连接在一起。该激素是作为由24个氨基酸前肽构成的单链前体前胰岛素(前胰岛素原)合成的，接着是下列构造的含有86个氨基酸的前胰岛素：前肽-B-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A，其中C是31个氨基酸的连接肽，A和B分别是胰岛素的A链和B链。Arg-Arg和Lys-Arg是用于切割A链和B链之间的连接肽以形成双链胰岛素分子的切割位点。胰岛素在维持正常代谢调节中是必需的。

本文中，术语胰岛素覆盖了天然存在的胰岛素例如人胰岛素及其胰岛素类似物。

本文中，术语氨基酸残基覆盖了氢原子已经被从氨基除去和/或羟基已经被从羧基除去和/或氢原子已经被从巯基除去的氨基酸。不确切地讲，氨基酸残基可以被认为是氨基酸。

本文中，术语胰岛素类似物，覆盖了具有形式上可以衍生自天然存在胰岛素(例如人胰岛素)结构的分子结构的多肽，其通过在天然胰岛素中缺失和/或取代(替代)一个或者更多个氨基酸残基，和/或通过添加一个或者更多个氨基酸残基。所添加和/或取代的氨基酸残基可以是可编码的氨基酸残基，或者其他天然存在氨基酸残基或者完全合成的氨基酸残基。

本文中，术语延长的胰岛素覆盖了胰岛素类似物，其中(与人胰岛素相比)在胰岛素的A-链或者B-链的C末端或者N-末端添加了一个或者更多个氨基酸残基。例如，A链可以在其C-末端(与人胰岛素相比)被延长例如1、2、3或4个氨基酸残基，其延长部分分别被表示为A22、A23、A24和A25。例如，当A23位的氨基酸残基被PEG化时，A22位的氨基酸可以是除了Cys和Lys外的任何氨基酸等。例如，A链可以在其N-末端(与人胰岛素相比)被延长例如1、2、3或4个氨基酸残基，其延长部分分别被表示为A-1、A-2、A-3和A-4。例如，当A-2位的氨基酸残基被PEG化时，A-1位的氨基酸可以是除了Cys和Lys外的任何氨基酸等。尽管延长的胰岛素在四个末端之一具有延长部分，但在所述延长的胰岛素的其他位置可以存在缺失。与人胰岛素类似，延长的胰岛素由两条链即A链和B链构成。在延长的胰岛素中，存在6个半胱氨酸残基，其中的两个存在于A链中形成链内二硫桥(对应于人胰岛素中的A6和A11)，其中的4个形成两个链间二硫桥(对应人胰岛素中的A7、A20、B7和B19位)。本文中，后面提到的四个半胱氨酸残基被称作链间半胱氨酸残基。在每条链中(A链和B链)，链间半胱氨酸残基之一最靠近每条链的N末端，其他链间半胱氨酸残基最接近每条链的C末端，本文中，这些链间半胱氨酸残基分别被称作N末端链间半胱氨酸残基和C末端链间半胱氨酸残基。在确定胰岛素类似物是否是延长的胰岛素时，人们需要计算在N末端链间半胱氨酸残基的N末端侧上每条链中存在的氨基酸残基的数目，以及计算C末端链间半胱氨酸残基的C末端侧上每条链中存在的氨基酸残基的数目。如果这些数目(轮廓)之一比人胰岛素对应的数目大，则胰岛素被认为是延长的胰岛素。在人胰岛素中，在A链中N末端链间半胱氨酸残基的N末端侧存在6个氨基酸残基，一个氨基酸残基存在于A链中C末端链间半胱氨酸残基的C末端侧，6个氨基酸残基存在于B链中N末端链间半胱氨酸残基的N末端侧，11个氨基酸残基存在于B链中C末端链间半胱氨酸残基的C末端侧。

本文中，术语亲代胰岛素(parent insulin)的意思是没有添加PEG部分(moiety)的延长的胰岛素。

本文中，术语突变覆盖了氨基酸序列中的所有改变(取代和插入可编码氨基酸以及缺失)。

本文中，术语人胰岛素的A链类似物和B链类似物分别覆盖人胰岛素的A链和B链，其分别相对于人胰岛素的A链和B链，分别具有A和B氨基酸链的一个或者更多个取代、缺失和/或延长(添加)。

本文中，类似A1、A2、A3等的术语分别表示胰岛素A链中的1、2和3位(从N末端开始计算)。类似的，类似B1、B2、B3等的术语分别表示胰岛素B链中的1、2和3位(从N末端开始计算)。使用一个字母代表氨基酸，类似A21A、A21G和A21Q的术语分别表示A21位的氨基酸分别是A、G和Q。使用三个字母表示氨基酸，相应的表达分别是AlaA21、GlyA21和GlnA21。

本文中，类似A-1、B-1等的术语分别表示N末端的第一个氨基酸为A1和B1位等。

本文中，类似desB29和desB30的术语表示分别缺失B29或B30氨基酸残基的胰岛素类似物。

本文中术语单链胰岛素覆盖了通用结构B-C-A的多肽序列，其中A是人胰岛素或其类似物的A链，B是人胰岛素或其类似物的B链，C是键或者所谓的连接肽例如连接B链中C末端氨基酸残基例如B30与A链中N末端氨基酸残基例如A1的大约1～35个氨基酸残基的肽链。如果B链是desB30链，则连接肽(C)将连接B29和A1。单链胰岛素将含有3个，和在人胰岛素中一样正确定位的二硫桥，即在Cys^A7和Cys^B7之间，在Cys^A20和Cys^B19之间，以及在Cys^A6和Cys^A11之间。

术语连接肽覆盖了胰岛素中能够连接B链的C-末端氨基酸残基与A链的N-末端氨基酸残基的肽链。本文中，表达式B’A的意思是单链胰岛素，其连接肽不含任何氨基酸，而仅仅由键构成，即在B-链C-末端和A-链N-末端之间存在键。

快速作用胰岛素的意思是开始发挥作用比正常或常规人胰岛素更快的胰岛素。

长效作用胰岛素的意思是作用持续时间比正常或常规人胰岛素长的胰岛素。

对胰岛素类似物、延长的胰岛素和A链和B链中的位置进行编号，以便亲代化合物是具有其所使用编号的人胰岛素。

本文所使用的术语基础胰岛素的意思是胰岛素肽，其具有超过8小时的作用时间，特别的是至少9小时。优选，基础胰岛素具有至少10小时的作用时间。因此，基础胰岛素可以具有在大约8～24小时范围内的作用时间，优选在大约9～大约15小时的范围内。

本文中，术语接头(linker)覆盖了化学部分(chemical moiety)，其连接延长的胰岛素的-HN-基团与PEG部分的-O-基团。接头对最终PEG化延长的胰岛素的期望作用没有任何影响，特别是其不具有任何不利影响。

本文所使用的“PEG”或聚乙二醇的意思是任何水溶性聚(乙二醇)或聚(氧化乙烯)。表达式PEG将包含结构-(CH₂CH₂O)_n-，其中n是2～大约1000的整数。通常使用的PEG是封端PEG，其中PEG末端的一端被相对无活性的基团例如烷氧基封端，而另一端是羟基，其中该羟基可以被接头部进一步修饰。通常使用的封端基团是甲氧基，相应的封端PEG通常被称作mPEG。因此，mPEG是CH₃O(CH₂CH₂O)_n-，其中n是2～大约1000的整数，其足以提供为整个PEG部分指定的平均分子量，例如对于mPEG Mw 2,000，n为大约44(该数目在批次间会存在变化)。概念PEG通常代替mPEG使用。后面接着数字(不是下标)的“PEG”表示PEG部分，其大概分子量等于该数字。因此，“PEG2000”是大概分子量为2000的PEG部分。

本发明的具体PEG形式是支链的、直链的、分叉的、哑铃状的PEG等，PEG基团典型地是多分散的，其具有低于大约1.05的低多分散指数。对于给定的分子量，在延长的胰岛素中存在的PEG部分将典型地由一定范围内的乙二醇(或氧化乙烯)单体构成。例如，分子量2000的PEG部分通常由44±10个单体构成，平均为大约44个单体。分子量(单体的数目)通常在批次之间会存在差异。

其他具体的PEG形式是单分散的，其可以是支链的、直链的、分叉或哑铃状的等。单分散的意思是PEG聚合物的长度(或分子量)是被具体限定的，而不是各种长度(或分子量)的混合物。本文中，概念mdPEG被用于表示mPEG部分是单分散的，使用“d”代表“离散的”。mdPEG后面下标数字例如mdPEG₁₂中的“12”表示在单分散聚合物(寡聚物)中乙二醇单体的数目。

术语PEG化覆盖经过接头附加一个或者更多个PEG对胰岛素进行修饰。PEG部分可以通过亲核取代(酰基化)附加到N-末端α-氨基上或者赖氨酸残基的γ-位上，例如通过OSu-激活酯，或者可以使用PEG-醛试剂和还原剂例如氰基硼氢化钠通过还原烷基化(也是附加到延长的胰岛素分子中存在的氨基上)附加PEG部分，或者可替换地，PEG部分可以在麦克尔加成反应(Michael addition reaction)中使用例如PEG马来酰亚胺试剂附加到未配对半胱氨酸残基的侧链。

具有胰岛素活性的PEG化延长的胰岛素的意思是PEG化延长的胰岛素，其在适当给药例如静脉内、皮下或者肺部给药之后，根据在适当动物模型(可以是大鼠、兔或猪模型)中所测量的，具有降低哺乳动物中血液葡萄糖，或者胰岛素受体结合亲和力的能力。

本文中，术语烷基覆盖饱和的、支链或直链烃基。

本文中，术语烷氧基覆盖自由基“烷基-O-”。代表性的例子是甲氧基、乙氧基、丙氧基(例如1-丙氧基和2-丙氧基)、丁氧基(例如1-丁氧基、2-丁氧基和2-甲基-2-丙氧基)、戊氧基(1-戊氧基和2-戊氧基)、己氧基(1-己氧基和3-己氧基)等。

本文中，术语亚烷基覆盖了饱和的、支链或者直链二价烃基，其具有1～12个碳原子。代表性的例子包括但不限于亚甲基、1，2-亚乙基、1，3-亚丙基、1，2-亚丙基、1，3-亚丁基、1，4-亚丁基、1，4-亚戊基、1，5-亚戊基、1，5-亚己基、1，6-亚己基等。

高物理稳定性的意思是纤维化的倾向低于人胰岛素的50％。可以通过在给定条件下形成纤维之前的滞后时间来描述纤维化。

具有胰岛素受体和IGF-1受体亲和力的多肽是在适当的结合检验中能够与胰岛素受体和人IGF-1受体相互作用的多肽。这些受体检验是本领域中公知的，并在实施例中会进一步描述。本发明的PEG化延长的胰岛素不会结合IGF-1受体，或者与所述受体具有相当低的亲和力。更精确地讲，本发明的PEG化延长的胰岛素对IGF-1受体具有与人胰岛素基本相同量级或较小的亲和力。

本文所使用的术语治疗和处理的意思是为了抗击疾病、紊乱或病症而对患者进行管理和照料。该术语包括延迟疾病、紊乱或病症的进展，缓解或减轻症状和并发症，和/或疾病、紊乱或病症的治愈或排除。待治疗的患者优选是哺乳动物，特别是人。

本文所使用的术语治疗疾病的意思是管理和照料已经产生疾病、病症或紊乱的患者。治疗的目的是抵抗疾病、病症或紊乱。治疗包括给药活性化合物以消除或控制疾病、病症或病症以及缓解与疾病、病症或紊乱相关的症状或并发症。

本文所使用的术语预防疾病被定义为在疾病临床发作之前，管理和照料有产生疾病风险的个体。预防的目的是抵抗疾病、病症或紊乱的产生，并且包括给药活性化合物以预防或延迟病症或并发症的发作，以预防或炎症的相关疾病、病症和紊乱的产生。

本文所使用的术语有效量的意思是，为与不治疗相比足以有效治疗患者的量。

POT是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)磷酸丙糖异构酶基因，TPI1是酿酒酵母(S.cerevisiae)磷酸丙糖异构酶基因。

导肽的意思是由前肽(pre-peptide)(信号肽)和原肽(pro-peptide)构成的氨基酸序列。

术语信号肽被理解成意思是前肽，其作为N-末端序列出现在蛋白质的前体形式上。信号肽的功能是使异源蛋白能够便于迁移到内质网中。通常在该过程中，信号肽被切除。信号肽对于产生该蛋白质的酵母生物体而言可以是异源的或同源的。多种信号肽可以与本发明的DNA构建体(construct)使用，其包括酵母天冬氨酸蛋白酶3(YAP3)信号肽或者任何功能类似物(Egel-Mitani等人(1990)YEAST 6：127-137和US 5,726,038)和MFα1基因的α-因子信号肽(Thorner(1981)in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae，Strathern等人，eds.，pp 143-180，Cold Spring Harbor Laboratory，NY andUS 4,870,00)。

术语原肽的意思是多肽序列，其功能是能够使所表达的多肽从内质网被引导到高尔基体，并进一步到分泌囊泡(vesicle)用于分泌到培养基中(即，将多肽输出穿过细胞壁，或者至少通过细胞膜进入酵母细胞的外周胞质空间)。原肽可以是酵母α-因子原肽，参见US 4,546,082和4,870,008。可替换的，原肽可以是合成原肽，也可以称作天然发现的原肽。适当的合成原肽是被描述在US 5,395,922；5,795,746；5,162,498和WO 98/32867中的那些。优选，原肽在C-末端含有肽链内切酶处理位点，例如Lys-Arg序列或其任何功能类似物。

在本文中，根据在下表中所显示的它们的传统含义，使用三个字母或者一个字母表示氨基酸。除非明确说明，本文所提到的氨基酸都是L-氨基酸。进一步，除非以其他方式说明，肽的氨基酸序列的左端和右端分别是N-末端和C-末端。

氨基酸缩写

优选在本发明的PEG化胰岛素中存在的氨基酸是可以由核酸编码的氨基酸。

在说明书和实施例中已经使用了下列缩写：Da是道尔顿(分子量)，kDa是千道尔顿(＝1000Da)，mPEG-SBA是mPEG-CH₂CH₂CH₂-CO-OSu(mPEG-丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺基酯)，mPEG-SMB是mPEG-CH₂-CH₂CH(CH₃)-CO-OSu(mPEG-α-甲基丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺基酯)，mPEG-SPA是mPEG-CH₂CH₂-CO-OSu(mPEG-丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺基酯)，Mw是分子量。OSu是1-琥珀酰亚胺基氧基＝2，5-二氧代吡咯烷-1-基氧基，R是室温，SA是芥子酸，Su是1-琥珀酰亚胺基＝2，5-二氧代吡咯烷-1-基。

发明概述

在一个方面中，本发明涉及PEG化胰岛素类似物，其与人胰岛素相比，具有从A1、B1、A21和/或B30位延长的一个或者更多个延长部分，所述延长部分由氨基酸残基构成，并且其中PEG部分通过接头附加到延长部分中的一个或者更多个氨基酸残基。

PEG基团可以通过适当的接头基团附加到亲代胰岛素中的赖氨酸或半胱氨酸残基(如果存在的话)的侧链，或者附加到N-末端氨基或者两个位置。接头典型地是羧酸的衍生物，其中羧酸功能团被用于通过酰胺键附加到亲代胰岛素。接头可以是具有连接基序-CH₂CO-的乙酸部分，具有连接基序-CH₂CH₂CO-或-CHCH₃CO-的丙酸部分，具有连接基序-CH₂CH₂CH₂CO-或-CH₂CHCH₃CO-的丁酸部分。可替换的，接头可以是-CO-基团。

由于在人胰岛素B-链B29位中存在的赖氨酸基团的PEG化是不期望的，所以该氨基酸残基需要被另一个氨基酸残基所替代。适当的替代氨基酸残基是Ala、Arg、Gln和His。此外，期望在A链的1～21位(A1～A21)中没有Lys，在B链的1～30位(B1～B30)中没有Lys。

亲代胰岛素分子可以具有被在说明书详细描述部分所描述的其的氨基酸残基所取代的有限数目天然存在氨基酸残基。

在一个实施方式中，本发明涉及PEG化延长的胰岛素，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有一个或者更多个下列缺失或替代：A14位的E或D，A18位的Q，A21位的A、G或Q，B1位的G或Q，或在B1位没有氨基酸残基，B3位的Q、S或T，或B3位没有氨基酸残基，B13位的Q，B25位的H或B25位没有氨基酸残基，B27位没有氨基酸残基，B28位的D、E或R，B29位的P、Q或R，或B29位没有氨基酸残基，B30位没有氨基酸残基。

正如本领域公知的，PEG基团的尺寸可以在大范围内变化。然而，太大的PEG基团可能会以不利的方式干扰PEG化延长的胰岛素分子的生物学活性。

在更进一步的方面中，本发明涉及药物制剂，其包含本发明PEG化延长的胰岛素和适当的佐剂和添加剂例如一种或者更多种适于稳定化、保存或等渗的试剂例如锌离子、苯酚、甲酚、对羟基苯甲酸酯类(parabene)、氯化钠、丙三醇或或甘露醇。本发明制剂的锌含量可以在每个胰岛素六聚物0～大约6个锌原子之间。本发明制剂的pH值可以在大约4和大约8.5之间，大约4和大约5之间，或者大约6.5和大约7.5之间。

在进一步的实施方式中，本发明涉及PEG化延长的胰岛素作为药物的应用，所述药物用于降低哺乳动物中血液葡萄糖的水平，特别是用于治疗糖尿病。

在进一步的方面中，本发明涉及PEG化延长的胰岛素用于制备药物制剂的应用，所述药物制剂用于降低哺乳动物中血液葡萄糖水平，特别是用于治疗糖尿病。

在进一步的方面中，本发明涉及降低哺乳动物中血液葡萄糖的水平的方法，其通过为需要此类治疗的患者给药治疗活性剂量的本发明PEG化延长的胰岛素。

在本发明进一步的方面中，将PEG化延长的胰岛素与一种或者更多种其他活性物质以任何适当的比例联合给药。这些其他活性剂可以选自人胰岛素、快速作用胰岛素类似物、抗糖尿病药物、抗高脂蛋白血药物、抗肥胖症药物、抗高血压药物和用于治疗来自糖尿病或与糖尿病相关的并发症的药物。

在一个实施方式中，将两种活性组分作为混合药物制剂进行给药。在另一个实施方式中，这两种组分被分别同时或连续给药。

在一个实施方式中，本发明PEG化延长的胰岛素可以与快速作用人胰岛素或人胰岛素类似物共同给药。这些快速作用胰岛素类似物可以是B28位的氨基酸残基是Asp、Lys、Leu、Val或Ala，B29位的氨基酸残基是Lys或Pro的，des(B28-B30)、des(B27)或des(B30)人胰岛素，以及B3位的氨基酸残基是Lys并且B29位的氨基酸残基是Glu或Asp的类似物。本发明PEG化延长的胰岛素和快速作用人胰岛素或人胰岛素类似物可以以大约90/10％、大约70/30％或大约50/50％的比例进行混合。

本发明PEG化延长的胰岛素还可以连同抗糖尿病药物用于联合治疗。

抗糖尿病药物包括胰岛素，在WO 98/08871、WO 99/43706、US5424286和WO 00/09666中描述的GLP-1(1-37)(胰高血糖素类肽-1)，GLP-2，艾塞那肽-4(exendin-4)(1-39)，其胰岛素调理素片段，其胰岛素调理素类似物和其胰岛素调理素衍生物。GLP-1(1-37)的胰岛素调理素片段是胰岛素调理素肽，其整个序列可以在GLP-1(1-37)的胰岛素调理素片段中发现，并且其已经缺失至少一个末端氨基酸。

本发明PEG化延长的胰岛素还可以与口服抗糖尿病药物共同用于联合治疗，例如噻唑烷二酮、二甲双胍和其他用于口服治疗的II型糖尿病药物制剂。

此外，本发明PEG化延长的胰岛素可以与一种或者更多种抗肥胖药物或食欲调节药物联合给药。

在一个实施方式中本发明涉及肺部药物制剂，其含有本发明的PEG化延长的胰岛素以及适当的佐剂和添加剂例如一种或者更多种适于稳定化、保存或等渗的试剂例如锌离子、苯酚、甲酚、对羟基苯甲酸类、氯化钠、丙三醇或或甘露醇。

需要理解，PEG化延长的胰岛素与饮食和/或锻炼、一种或者更多种上述化合物以及任选地一种或更多种其它活性物质的任何适当组合也被认为在本发明的范围内。

发明详述

胰岛素的稳定性和溶解度是目前胰岛素治疗的重要根本方面。本发明解决了这些问题，其通过提供稳定的PEG化延长的胰岛素类似物，其中延长部分中的PEG化降低了分子柔性并且同时降低了纤维化倾向以及限制或修改了pH沉淀区。

特别地，本发明PEG化延长的胰岛素是用于肺部给药，因为与例如人胰岛素相比它们具有相对高的生物利用度。而且，PEG化延长的胰岛素具有延长的胰岛素活性。

因为事实上所有的PEG聚合物都是许多大分子的混合物，所以人们必须要采取平均数来描述分子量。在多种可能表达平均数的方式中，通常使用3种：数均分子量，终均分子量以及z-均分子量。重均分子量可能是三个中最有用的，因为其公正地说明了不同尺寸的链对于聚合物整体行为的贡献，并且与大部分感兴趣的物理性质关联性最佳。

数均MW(M_n).

重均MW(M_w).

Z均MW(M₂).

其中N_i是聚合物混合物中分子量M_i的分子的摩尔分数(或数目分数)。M_w/M_n的比例被称作多分散指数(PDI)，并且提供了分布宽度的大概指示。对于MW分布非常窄的特殊聚合物，PDI接近1.0(下限)。

尽管通常发现降低胰岛素分子的生物活性可以优选用于提高半衰期例如在用于肺部给药的制剂中，但优选低分子量PEG基团用于提高生物利用度，高分子量PEG链例如具有4000-6000道尔顿或更大分子量。

本发明的PEG基团典型地包含许多(-OCH₂CH₂-)亚基。

对于给定的分子量，本发明的PEG基团将典型地由一定范围内的乙二醇(氧化乙烯)单体构成。例如，分子量2000道尔顿的PEG基团典型地由43±10个单体构成，平均为大约43-44个单体。

在本发明中被PEG化的亲代胰岛素分子是延长的胰岛素分子，即一个或者更多个氨基酸残基附加到亲代A和/或B链的N-末端的胰岛素分子，例如附加到亲代A和/或B链的C-末端的A1和/或B1，例如A21和/或B30，这是指人胰岛素。优选，延长的胰岛素分子即秦代胰岛素含有至少52个氨基酸残基。

本发明的PEG化延长的胰岛素可以是单取代的，其仅具有一个PEG基团附加到亲代胰岛素分子中的赖氨酸氨基酸残基，或者附加到N-末端氨基酸残基。可替换的，本发明PEG化延长的胰岛素可以包含2个、3个或4个PEG基团。如果延长的胰岛素包含超过1个PEG基团，则典型地，其具有附加到每个赖氨酸氨基或附加到N-末端氨基酸残基的相同PEG部分。然而，每个PEG基团也可能相互之间在尺寸和长度上有变化。

例如，与人胰岛素相比具有下列延长的胰岛素被命名为A22K(N^εmPEG2000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素：A22K、B29R、desB30以及在A22的赖氨酸残基中被mPEG-丙酸(2kDa)所PEG化的，例如使用mPEG-SPA。显而易见的是，如果任何相应的含有其他接头(例如丁酸接头)的其他PEG化试剂(Mw 2000Da)用于制备特定的化合物，则特定化合物的“精确”命名将是不同的，但这种小的分子区别不会导致生物学性质的任何区别。在该应用中，PEG化衍长的胰岛素在很大程度上，是如同接头部是丙酸接头进行命名的，而与实际的接头无关。事实上，在蛋白质PEG化的文献中，很少详细描述所使用的接头基团。对于生物学性质，重要的变量是：PEG部分的尺寸(以道尔顿计)和形状，以及蛋白质中PEG附加的位置。

亲代胰岛素是通过在适当的宿主细胞中表达编码所关心的延长的胰岛素的DNA序列而产生的，其通过描述在例如美国专利No.6500645中的公知技术。亲代胰岛素是直接表达的，或者作为前体分子表达的，其中所述前体分子在B-链上具有N-末端延长部分。该N-末端延长部分可以具有提高直接表达的产物的产量的功能，并长度可以最高达到15个氨基酸残基。在从培养培养液分离后，N-末端延长部分将在体外被切除，并因此具有紧接着B1的切割位点。适于本发明的类型的N-末端延长部分被公开在美国专利No.5,395,922和欧洲专利No.765,395A中。

可以通过已经建立的标准方法合成制备编码亲代胰岛素的多核苷酸序列，例如Beaucage等人(1981)Tetrahedron Letters 22：1859-1869或者Matthes等人(1984)EMBO Journal 3：801-805所描述的亚磷酰胺法(phosphoamidite method)。根据亚磷酰胺法，合成寡核苷酸，例如在自动DNA合成仪上，纯化、复制(duplexed)并连接以形成合成的DNA构建体。目前优选的制备DNA构建体的优选方法是聚合酶链式反应(PCR)。

多核苷酸序列也可以是混合的基因组、cDNA和合成来源的。例如，编码导肽的基因组或cDNA序列可以连接到编码A和B链的基因组或cDNA序列上，之后，可以通过插入编码期望氨基酸序列的合成寡核苷酸在位点将DNA序列修饰，用于根据公知方法进行同源重组，或者优选通过使用适当寡核苷酸的PCR来产生。

重组方法典型地利用能够在选定的微生物或宿主细胞中复制并且携带编码亲代胰岛素的多核苷酸序列的载体。重组载体可以是自动复制的载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或者人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的工具。可替换的，载体可以是在被引入宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其整合的染色体共同复制的载体。此外，可以使用单个载体或质粒，或者共同含有将被引入宿主细胞基因组的总DNA的两个或者更多个载体或质粒，或者可以使用转座子。载体可以是线性的或者闭环质粒，并且优选含有能够使载体稳定整合到宿主细胞基因族中并且载体不依赖基因组进行自动复制的元件。

重组表达载体能够在酵母中复制。实现载体在酵母中复制的序列的例子是酵母质粒2μm复制基因REP 1-3以及复制起始点。

载体可以含有一个或者更多个选择性标记，其能够容易选择被转化的细胞。选择性标记是其产物提供生物杀灭剂或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型原养等的基因。细菌选择性标记的例子是来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)或地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的dal基因，或者提供抗生素抗性例如青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于丝状真菌宿主细胞中的选择行标记包括amdS(酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸酯脱羧酶)和trpC(邻氨基苯甲酸酯合成酶)。酵母宿主细胞的适当标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。酵母的非常适当选择性标记是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI基因(Russell(1985)Gene 40：125-130)。

在载体中，多核苷酸序列被可操作地连接到适当的启动子序列。启动子可以是在选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核酸序列，其包括突变、截短和杂合的启动子，并且可以从对于宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因获得。

用于知道细菌宿主细胞中的转录的适当启动子的例子是从大肠杆菌(E.coli)乳糖操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因(amyL)、嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyQ)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)青霉素酶基因(penP)的启动子。用于指导在丝状真菌宿主细胞中转录的适当启动子的例子是从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶和黑曲霉(Aspergillus niger)酸稳定α-淀粉酶基因获得的启动子。在酵母宿主中，可以使用的启动子是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Ma1、TPI、ADH或PGK启动子。

编码亲代胰岛素的多核苷酸序列还典型地可操作地连接到适当的终止子。在酵母中，适当的终止子是TPI终止子(Alber等人(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：419-434)。

分别用于连接编码亲代胰岛素、启动子和终止子的多核苷酸序列并将它们加入到含有在选定宿主中复制所必需信息的适当载体中的程序对于本领域技术人员是公知的。能够理解，可以通过首先制备含有编码本发明延长的胰岛素的整个DNA序列的DNA构建体，随后将该片段插入到适当的表达载体，或者或通过连续插入含有单独元件的遗传信息(例如信号肽、原肽、连接肽、A链和B链)随后进行连接而构建所述载体。

将含有编码亲代胰岛素的多核苷酸序列的载体引入到宿主细胞中，以便载体被保持为染色体整合物，或者作为自复制染色体外载体。术语“宿主细胞”包括亲代细胞的任何后代，其由于在复制过程中发生的突变而与亲代细胞并不一致。宿主细胞可以是单细胞微生物例如原核细胞或非单细胞微生物例如真核细胞。可以使用的单核细胞是细菌细胞例如革兰氏阳性细胞，其包括但不限于芽孢杆菌属(Bacillus)细胞、链霉菌属(Streptomyces)细胞或革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(E.coli)和假单胞菌(Pseudomonas sp)。真核细胞可以是哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个实施方式中，宿主细胞是酵母细胞。酵母生物体可以是任何适当的酵母生物体，通过培养，其产生大量本发明的单链胰岛素。适当的酵母生物体的例子是选自下列的菌株：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、Saccharomyces kluyveri、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、Sacchoromyces uvarum、乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、Pichia kluyveri、耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)、假丝酵母(Candida sp.)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、Candida cacaoi、地霉(Geotrichum sp.)和Geotrichum fermentans。

例如酵母细胞的转化可以通过形成原生质体随后以本身已知的方式进行转化而实现。用于培养细胞的培养基可以是任何适于酵母生物体生长的传统培养基。可以从培养基中回收分泌的延长的胰岛素(其显著的比例将以正确处理的形式存在于培养基中)，这通过传统的程序包括通过离心从培养基分离酵母细胞，通过离子交换基质或反相吸附基质进行过滤或捕获胰岛素前体，通过盐例如硫酸铵沉淀上清或滤液的蛋白质组分，随后各种层析程序例如离子交换层析、亲和层析进行过滤，等。

药物组合物

本发明PEG化延长的胰岛素可以被皮下给药、口腔或肺部给药。

为了皮下给药，类似已知的胰岛素制剂，配制本发明PEG化延长的胰岛素。此外，为了皮下给药，类似已知胰岛素的给药，给药本发明PEG化延长的胰岛素，通常医生了解该程序。

本发明的PEG化延长的胰岛素可以通过以有效提高循环胰岛素水平和/或降低循环葡萄糖水平的剂量进行吸入给药。这类给药能够有效治疗紊乱例如糖尿病或高血糖症。获得胰岛素的有效剂量需要给药超过大约0.5μg/kg达到大约50μg/kg本发明PEG化延长的胰岛素的吸入剂量。有知识的从业者通过考虑多种因素包括胰岛素水平、血液葡萄糖水平、患者的身体条件、患者的肺部状态等能够确定治疗有效量。

可以通过吸入递送本发明PEG化延长的胰岛素，以达到缓慢吸收和/或其降低的系统性清除。当对类似的粒度和类似的药物沉积水平进行比较时，不同的吸入装置典型地提供类似的药物动力学。

可以通过任何多种本领域中已知的用于通过吸入给药治疗药物的吸入装置递送本发明PEG化延长的胰岛素。这些装置包括计量式吸入器、喷雾器、干粉发生器、喷射器等。优选，通过粉末吸入器或喷射器递送这种PEG化延长的胰岛素。存在多种用于给药本发明PEG化延长的胰岛素吸入装置的期望部件。例如通过吸入装置的递送有利地是可靠的、可再生的和精确的。吸入装置需要递送小颗粒或气雾剂，例如低于大约10μm，例如大约1-5μm，用于达到非常适合呼吸。适于实施本发明的商业可以利用的吸入装置的具体例子是Cyclohaler、Turbohaler^TM(Astra)、(Glaxo)、(Glaxo)、Spiros^TMinhaler(Dura)、Inhale Therapeutics所销售的装置、AERx^TM(Aradigm)、nebulizer(Mallinckrodt)、Acornnebulizer(MarquestMedical Products)、剂量施吸入器(Glaxo)、粉末吸入器(Fisons)等。

正如本领域技术人员公认的，本发明PEG化延长的胰岛素的制剂，所递送制剂的量以及单次剂量给药的持续时间依赖于所采用的吸入装置类型。对于气雾剂递送系统，例如喷雾器，给药的频率和系统激活的时间长度将主要依赖于气雾剂中PEG化延长的胰岛素的浓度。例如，对于在喷雾器溶液中较高浓度的PEG化延长的胰岛素，可以使用较短的给药时间段。装置例如剂量式吸入器能够产生较高的气雾剂浓度，并且能够运行较短的时间以递送期望量的PEG化延长的胰岛素。装置例如粉末吸入器递送活性药物，直到从该装置排出给定量的药物。在这种类型的吸入器中，给定量的粉末中本发明胰岛素PEG化延长的胰岛素的量决定了单次给药中所递送的剂量。

在通过吸入装置递送的制剂中本发明PEG化延长的胰岛素的粒度对于胰岛素进入肺部的能力是重要的，优选进入下呼吸道或肺泡。优选，本发明PEG化延长的胰岛素被配置成，至少大约10％所递送的PEG化延长的胰岛素沉积在肺中，优选大约10～20％，或者更多。已知对于口呼吸的人肺部沉积的最大效率是通过使用大约2μm～大约3μm的粒度获得的。当粒度超过大约5μm时，肺部沉积显著降低。低于大约1μm的粒度造成肺部沉积降低，并且难以递送具有充分治疗有效物质的颗粒。因此，通过吸入所递送的PEG化延长的胰岛素的颗粒具有优选低于大约10μm的粒度，更有选在大约1μm～大约5μm的范围内。对PEG化延长的胰岛素的制剂进行选择，以在所选择的吸入装置中产生期望的粒度。

有利地，为了作为干粉进行给药，本发明PEG化延长的胰岛素被制备成颗粒形式，其粒度低于大约10μm，优选大约1～大约5μm。优先的粒度能够有效地递送到患者的肺泡。优选，构成大部分干粉的颗粒被制备成大部分颗粒具有期望范围内的尺寸。有利地，至少大约50％的干粉是由直径低于大约10μm的颗粒制成的。可以通过喷射干燥、制粉、微粉化或临界点冷凝含有本发明PEG化延长的胰岛素和其他成分的溶液而制备这些制剂。同样适于产生可以用于本发明的颗粒的其他方法是本领域中已知的。

通常从容器中的干粉制剂分离这些颗粒，接着通过载体气流转运到患者的肺中。典型的，在目前的干粉吸入器中，用于破碎固体的力完全是由患者的吸入提供的。在另一类型的吸入器中，患者的吸入所产生的气流驱动了叶轮马达，这破碎了颗粒。

用于从干粉给药的本发明PEG化延长的胰岛素制剂典型地包括含有该衍生物的精细分开的干粉，但粉末还可以包含填充剂、载体、赋形剂、其他添加剂等。在PEG化延长的胰岛素的干粉制剂中可以包含添加剂，例如为了对于从具体粉末吸入器递送所必需的稀释粉末，为了辅助处理制剂，为了对制剂提供有利的粉末性质，为了辅助从吸入装置分散粉末，为了稳定制剂(例如抗氧化剂或缓冲剂)，为了为制剂提供味道等。有利地，添加剂并不负面影响患者的气道。PEG化延长的胰岛素可以在分子水平上与添加剂混合，或者固体制剂可以包括PEG化延长的胰岛素的颗粒，所述PEG化延长的胰岛素的颗粒与添加剂混合或者涂覆在颗粒上。典型的添加剂包括单糖、双糖和多糖；糖醇和其他多元醇例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、乳糖纯、麦芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇、淀粉或其组合；表面活性剂例如山梨糖醇、二磷酯酰胆碱或卵磷脂；等。典型地，添加剂例如填充剂以有效达到上述目的的量存在，通常占制剂的大约50重量％～大约90重量％。在制剂中还可以包含其它本领域中已知用于蛋白质(例如胰岛素类似物蛋白质)制剂的试剂。

可以通过迫使PEG化延长的胰岛素的悬浮液或溶液在压力下通过喷嘴而产生包含本发明PEG化延长的胰岛素的喷剂。可以对喷嘴尺寸和结构、所采用的压力以及液体供给速度进行选择以达到期望的输出和粒度。可以产生电喷射，例如通过与毛细管或喷嘴供给连接的电场。有利地，通过喷射器递送的胰岛素偶联物的颗粒具有低于大约10μm的粒度，优选在大约1μm～大约5μm的范围内。

适于用于喷射器的本发明PEG化延长的胰岛素的制剂典型地在水溶液中包含PEG化延长的胰岛素，其浓度为每毫升溶液大约1mg～大约500mgPEG化延长的胰岛素。根据所选择的PEG化胰岛素以及医学顾问已知的其它因素，上限可以较低，例如每毫升溶液450、400、350、300、250、200、150、120、100或50mg PEG化胰岛素。制剂可以包含试剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂以及优选锌。制剂还可以包含赋形剂或者用于稳定PEG化延长的胰岛素的实际，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白质(bulk protein)或糖类。可以用于配制胰岛素偶联物的填充蛋白质包括白蛋白、鱼精蛋白等。可以用于配制胰岛素偶联物的典型糖类包括蔗糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。PEG化延长的胰岛素制剂还可以包含表面活性剂，其降低或者防止在形成气雾剂中由于溶液的雾化而造成的表面诱导胰岛素偶联物聚合。可以采用各种传统的表面活性剂，例如聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，聚氧化乙烯山梨醇脂肪酸酯。量筒厂在制剂的大约0.001～大约4重量％之间。

含有本发明PEG化延长的胰岛素的药物组合物可以被肠胃外给药给需要此治疗的患者。肠胃外给药可以通过皮下、利用注射器(任选钢笔样注射器)肌内或静脉注射进行。可替换的，肠胃外给药可以利用输注泵进行。

可以使用药物工业的常规技术制备本发明PEG化延长的胰岛素的可注射组合物，其包括根据需要溶解和混合成分以提供期望的产物。因此，根据一个程序，将PEG化延长的胰岛素溶解在一定量的水中，这比将制备的组合物的最终体积有些低。根据需要加入Zink、等渗剂、防腐剂和/或缓冲剂，并如果必要的话，根据需要使用酸例如盐酸或碱例如氢氧化钠水溶液对溶液的pH值进行调节。最终，用水调节溶液的体积，以提供期望的成分浓度。

在本发明进一步的实施方式中，缓冲剂选自醋酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠，以及三(羟甲基)氨基甲烷、N-二羟乙基甘氨酸、曲辛、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些具体缓冲剂的每一种都构成了本发明的可替换实施方式。

在本发明进一步的实施方式中，制剂进一步包含药物上可以接受的防腐剂，其可以选自苯酚、邻-甲酚、间-甲酚、对-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苯甲醇、氯代丁醇、以及硫柳贡(thiomerosal)、溴硝丙二醇、安息香酸、咪唑烷脲、双氯苯双胍已烷、脱氢醋酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、氯化苄乙氧铵、氯酚醚(3-(4-氯苯氧基-)-1，2-丙二醇)或其混合物。在本发明进一步实施方式中，防腐剂以大约0.1mg/ml～20mg/ml的浓度存在。在本发明进一步实施方式中，防腐剂以大约0.1mg/ml～5mg/ml的浓度存在。在本发明进一步实施方式中，防腐剂以大约5mg/ml～10mg/ml的浓度存在。在本发明进一步实施方式中，防腐剂以大约10mg/ml～20mg/ml的浓度存在。这些具体防腐剂的每一种都构成了本发明的可替换实施方式。防腐剂在药物组合物中的应用是本领域技术人员公知的。为了方便，参考Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

在本发明进一步实施方式中，该制剂还包含等渗剂，其选自盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸或苏氨酸)、醛醇(例如丙三醇(甘油)、1，2-丙二醇(丙烯基二醇)、1，3-丙二醇或1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)或其混合物。可以使用任何糖例如单糖、双糖或更多糖或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、普鲁兰多糖(pullulan)、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。在一个实施方式中，糖添加剂是蔗糖。糖醇被定义为具有至少一个-OH基的C4-C8烃，其包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方式中，糖醇添加剂是甘露醇。上面所提到的糖或糖醇可以单独使用或组合使用。所使用的量没有固定的量，只要糖或糖醇能够溶于液体制剂中，并且不会对使用本发明的方法所达到的稳定化作用造成不利影响。在一个实施方式中，糖或糖醇浓度在大约1mg/ml～大约150mg/ml之间。在本发明的进一步实施方式中，等渗剂以大约1mg/ml～50mg/ml的浓度存在。在本发明进一步的实施方式中，等渗剂以大约1mg/ml～7mg/ml的浓度存在。在本发明进一步的实施方式中，等渗剂以大约8mg/ml～24mg/ml的浓度存在。在本发明进一步的实施方式中，等渗剂以大约25mg/ml～50mg/ml的浓度存在。这些具体的等渗剂的每一种均构成本发明的可替换实施方式。等渗剂在药物组合物中的应用是本领域技术人员公知的。为了方便，参考Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。

典型的等渗剂是氯化钠、甘露醇、二甲砜和丙三醇，典型的防腐剂是苯酚、间-甲酚、对羟基苯甲酸甲酯和苯甲醇。

适当的缓冲剂的实例是醋酸钠、甘氨酰甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)和磷酸钠。

用于经鼻给药本发明PEG化延长的胰岛素的组合物可以例如根据在欧洲专利No.272097中所描述的进行制备。

含有本发明PEG化延长的胰岛素的组合物可以用于治疗对胰岛素敏感的状态。因此，它们可以用于治疗I型糖尿病、II型糖尿病和高血糖症例如某些时候在严重受伤的人和已经经历重大手术的人中所观察到的状态。对于任何患者的最佳剂量将依赖于多种因素，包括所采用具体胰岛素衍生物的效率、体重、身体活性和患者的饮食，依赖于与其他药物的可能组合，依赖于待治疗的状态的严重性。推荐本发明PEG化延长的胰岛素的每日剂量是由本领域技术人员以与已知胰岛素组合物类似的方式对每个单独的患者进行确定的。

发明的优选特征

总而言之，本发明的特征如下：

1.PEG化胰岛素类似物，与人胰岛素相比，其具有从A1、B1、A21和/或B30位延长的一个或更多个含PEG的延长部分，所述延长部分由氨基酸残基构成，其中PEG部分通过接头附加到延长部分中的一个或者更多个氨基酸残基上。

2.根据第1项的PEG化胰岛素类似物，其中在延长部分之一中的氨基酸残基只有一个携带PEG部分。

3.根据第1项的PEG化胰岛素类似物，其中延长部分中只有两个携带PEG部分，优选仅存在两个PEG部分。

4.根据第1项的PEG化胰岛素类似物，其中携带PEG部分的延长部分位于A1位的N末端位置。

5.根据第1项的PEG化胰岛素类似物，其中携带PEG部分的延长部分位于B1位的N末端位置。

6.根据第1项的PEG化胰岛素类似物，其中携带PEG部分的延长部分位于A21位的C末端位置。

7.根据第1项的PEG化胰岛素类似物，其中携带PEG部分的延长部分位于B30位的C末端位置。

8.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中每个胰岛素分子的延长部分数目是4。

9.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中每个胰岛素分子的延长部分数目是3。

10.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中每个胰岛素分子的延长部分数目是2。

11.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中每个胰岛素分子的延长部分数目仅是1。

12.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有一个或者更多个下列延长部分：A-3位中的G，A-2位中的G，A-1位中的K或R，A22位中的G或K，A23位中的G或K，A24位中的G或K，A25位中的K以及B31位中的K，与人胰岛素相比，在缺失、取代和添加氨基酸残基中另外存在最高达到12个突变，优选在所述胰岛素类似物中不存在其他突变。

13.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中延长部分由下式的一种或者更多种构成，其中PEG部分在如果存在赖氨酸或半胱氨酸残基时附加到到赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链，或者PEG部分附加到N-末端氨基上(或者二者)：

-AAx1K(对于C-末端延长部分)，其中x1是0、1、2、3、4、5、6、7或8(其中K是赖氨酸)，

K-AAx2-(对于N-末端延长部分)，其中x2是0、1、2、3、4、5、6、7或8(其中K是赖氨酸)，

-AAx3C(对于C-末端延长部分)，其中x3是0、1、2、3、4、5、6、7或8(其中C是半胱氨酸)，

C-AAx4-(对于N-末端延长部分)，其中x4是0、1、2、3、4、5、6、7或8(其中C是半胱氨酸)，

AAx5-Ry-(对于N-末端延长部分)，其中x5是0、1、2、3、4、5、6、7或8，y是0或1(其中R是精氨酸)，

其中AA是除了Lys和Cys之外的任何可编码氨基酸残基残基，优选AA是肽链，其中每一个可编码氨基酸残基相同或不同。

14.根据前述任一项的PEG化胰岛素类似物，其中AA是甘氨酸、丙氨酸或谷氨酰胺残基，优选AA是肽链，其中每一个可编码氨基酸残基相同或不同。

15.根据前述任一项的PEG化胰岛素类似物，其中AA是甘氨酸残基。

16.根据前述任一项的PEG化胰岛素类似物，其中AA是丙氨酸残基。

17.根据前述任一项的PEG化胰岛素类似物，其中AA是谷氨酰胺残基。

18.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中延长部分由下列式的一个或者更多个构成，其中PEG部分在如果存在赖氨酸或半胱氨酸残基时附加到到赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链，或者PEG部分附加到N-末端氨基上(或者二者)：

-Gx1K(对于C-末端延长部分)，其中x1是0、1、2、3、4、5、6、7或8(其中G和K分别是甘氨酸和赖氨酸)，

K-Gx2-(对于N-末端延长部分)，其中x2是0、1、2、3、4、5、6、7或8(其中G和K分别是甘氨酸和赖氨酸)，

-Gx3C(对于C-末端延长部分)，其中x3是0、1、2、3、4、5、6、7或8(其中G和C分别是甘氨酸和半胱氨酸)，

C-Gx4-(对于N-末端延长部分)，其中x4是0、1、2、3、4、5、6、7或8(其中G和C分别是甘氨酸和半胱氨酸)，

Gx5-Ry-(对于N-末端延长部分)，其中x5是0、1、2、3、4、5、6、7或8，y是0或1(其中G和R分别是甘氨酸和精氨酸)。

19.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素任选地含有一个或者更多个下列突变：A14E/D、A18Q、A21G/A/Q、desB1、B1G/Q、B3Q/S/T、B13Q、desB25、B25H、desB27、B28D/E/R、des B29、B29P/Q/R或desB30。

20.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

21.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22G、A23K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

22.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22G、A23G、A24K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

23.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22G、A23G、A24G、A25K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

24.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B3Q、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

25.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B3S、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

26.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B3T、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

27.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B1Q、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

28.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A18Q、A22K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

29.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B3Q、B29R、desB1和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

30.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有B29Q和B31K，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

31.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21G、B29Q和B31K，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

32.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21A、B29Q和B31K，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

33.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21Q、B29Q和B31K，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

34.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A-1K和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

35.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A-1K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

36.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A-3G、A-2G、A-1R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

37.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B28E、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

38.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B28D、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

39.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B28E、B29R，desB27和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

40.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有B28E、B29Q和B31K，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

41.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有B28E、B29Q、B31K和desB27，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

42.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B28R、desB29和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

43.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有B28R、B29P和B31K，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

44.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B3Q、B28E、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

45.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21G、B3Q、B28E、B29Q和B31K，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

46.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B13Q、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

47.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A22K、B29R、desB1和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

48.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A14E、A22K、B25H和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

49.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A14E、B25H、B29Q和B31K，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

50.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A13E、A22K、B25H和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

51.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21Q、A22K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

52.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21Q、A22G、A23K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

53.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21Q、A22G、A23G、A24K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

54.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

55.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21A、A22K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

56.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21A、A22G、A23K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

57.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21A、A22G、A23G、A24K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

58.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21A、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

59.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21G、A22K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

60.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21G、A22G、A23K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

61.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21G、A22G、A23G、A24K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

62.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

63.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21Q、A22K、B3Q、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

64.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21G、A22K、B3Q、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

65.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A21A、A22K、B3Q、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

66.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中亲代胰岛素类似物衍生自人胰岛素，其具有A14E、A22K、B25H、B29R和desB30，并且优选在所述胰岛素类似物中没有其他突变。

67.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中所述含有PEG的基团附加到在延长部分中存在的赖氨酸残基和/或半胱氨酸残基的-NH-基团上，或者附加到延长部分的N-末端上。

68.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其包括-(OCH₂CH₂)_n-部，其中n是2～大约1000范围内的整数，优选2～大约500，优选2～大约250，优选2～大约125，优选2～大约50，优选2～大约25范围内的整数范围内的整数。

69.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部具有大约200～大约40,000范围内的标称分子量，优选大约200～大约30,000，优选大约200～大约20,000，优选大约200～大约10,000，优选大约200～大约5,000，优选大约200～大约2,000，优选大约200～大约1,000，优选大约200～大约750范围内的标称分子量。

70.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇是单分散的。

71.根据前述任一项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部具有通式-(OCH₂CH₂)_n-部分，其中n是至少大约6的整数，优选至少大约10，并且不超过大约110，优选不超过大约75，更优选在大约6～大约30的范围内，优选在大约10～大约48的范围内。

72.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部是多分散的。

73.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中聚乙二醇部是直链、支链分叉的或哑铃状的。

74.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其包含通式-Q¹-(OCH₂CH₂)_n-R¹的基团，其中Q¹是将聚乙二醇连接到延长部分中氨基酸的α-或γ-NH-基团的接头上，优选通过酰胺或氨基甲酸键连接，n是2～大约1000范围内的整数，R¹是烷氧基或羟基，优选甲氧基。

75.根据前述任一项的PEG化胰岛素类似物，其中n是2～大约500范围内的整数，优选2～大约250，优选2～大约125，优选2～大约50，优选2～大约25。

76.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中Q¹是-亚烷基-CO-，其通过羰基连接到延长的胰岛素的-NH-残基。

77.根据前述任一项的PEG化胰岛素类似物，其中Q¹是-亚乙基羰基(-(CH₂)₂-CO-)，其通过羰基连接到延长的胰岛素的-NH-残基。

78.根据前述除了最后两项以外任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中Q¹是-亚烷基-NHCO-亚烷基-CO-，其通过羰基连接到延长的胰岛素的-NH-残基。

79.根据前述除了最后3项以外任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中Q¹是-CO-亚烷基-CO-。

80.根据前述除了最后4项以外任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中Q¹是-CO-(4-硝基苯氧基)。

81.根据前述除了最后5项以外任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中其中Q¹是(-亚烷基-NHCO-亚烷基-O-亚烷基-)_pCH_q-NHCO-亚烷基-(O-CH₂CH₂)_r-NHCO-亚烷基-CO-，其中p是1、2或3，q是0、1或2，p+q等于3，r是1～大约12范围内的整数，其通过羰基连接到延长的胰岛素的-NH-残基上。

82.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中其中Q¹是-CH₂CO-、-CH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂CH₂CO-、-CH₂CH(CH₃)CO-、-CH₂CH₂-CH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂CH(CH₃)CO-、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CO-、-CH₂CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CH₂CO-、-COCH₂CH₂CO-、-COCH₂CH₂CH₂CO-、-CO-(4-硝基苯氧基)、(-CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂OCH₂)₃CNHCOCH₂CH₂(OCH₂CH₂)₄NHCO-CH₂CH₂CO-或者(-CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂OCH₂)₃CNH-COCH₂CH₂(OCH₂CH₂)₄NHCOCH₂CH₂CH₂CO-。

83.根据前述任一可能项的PEG化胰岛素类似物，其中R¹是烷氧基。

84.根据前述任一项的PEG化胰岛素类似物，其中R¹是甲氧基。

85.根据前述任一产品项的化合物，其是在上面说明书中具体提到的任一化合物，例如在具体实施例，特别是在实施例1等所列出的任一化合物。

86.前述任一产品项的化合物在制备用于治疗糖尿病的药物组合物中的用途。

87.前述任一产品项的化合物在制备药物组合物中的用途，其中所述药物组合物能够肺部给药用于治疗糖尿病。

88.前述任一产品项的化合物在制备药物组合物中的用途，其中所述药物组合物能够肺部给药用于治疗糖尿病，并且提供长期作用效果。

89.前述任一产品项的化合物在制备粉末药物组合物中的用途，其中所述粉末药物组合物可以肺部给药用于治疗糖尿病。

90.前述任一产品项的化合物在制备液体药物组合物中的用途，其中所述液体药物组合物可以肺部给药用于治疗糖尿病。

91.治疗糖尿病的方法，该方法包括为有此需要的对象给药治疗有效量的前述任一产品项的化合物。

92.组合物，其含有人胰岛素以及前述任一产品项的PEG化胰岛素类似物。

93.组合物，其含有门冬氨胰岛素以及前述任一项的PEG化胰岛素类似物。

94.组合物，其含有赖氨酸脯氨酸胰岛素以及前述任一项的PEG化胰岛素类似物。

95.组合物，其含有胰岛素Glulisine以及前述任一项的PEG化胰岛素类似物。

96.本文所描述的任何新型特征或特征组合。

整体评论

本文所引用的所有参考文献包括出版物、专利申请和专利通过参照整体并入本文，达到将通过参照所并入本文的参考文献单独和具体地描述、并将其在本文中整体列出的相同程度(达到法律允许的最大程度)。

这里所使用的所有标题(heading)和下标仅是为了方便，而不应该以任何方式构成对本发明的限制。

除非以其他方式说明，使用本文所提供的任何和全部实施例和示范性语言(例如“诸如”)仅仅是为了更好地说明本发明，而不会为本发明的范围造成限制。说明书中的所有语言都不应该被认为表示所有实施本发明所必要的未要求保护成分。

在本文中引用和并入专利文件仅仅是为了方便而进行的，并不会反应任何有效性、专利性和/或这些专利文件的可实施性。本文所提到的文献不承认它们构成现有技术。

本文中，文字“包含”需要被宽广地解释为意味着“含”、“含有”或“包括(comprehend)”(EPO审查指南C 4.13)。

本发明包括所使用法律允许的所附权利要求中所引用的对象的所有修饰和等同。

将本文所描述的实施方式的一个或者更多个进行结合，任选地还结合一个或者更多个下面的权利要求，得到了本发明的其他实施方式，其涉及所述实施方式和权利要求的所有可能的组合。

为了完整，需要指出，本发明并不涉及亲代胰岛素类似物被称为单链胰岛素的PEG化胰岛素类似物(丹麦申请号No.：2005/00400和WO申请号No.：EP2006/060816；我方案号：7148)。因此，在本发明中，我们声明放弃保护通过参照并入本文的该内容。

通过描述而不是限制方式提供下列实施例。

在下面的列表中，所选择的PEG化试剂被列举为激活的N-羟基琥珀酰亚胺酯(OSu)。显然，可以采用其他活性酯，例如4-硝基苯氧基和需要本领域技术人员已知的其他酯。PEG(或mPEG)部、CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-可以是最高达到Mw 40,000Da的任意尺寸，例如750Da、2000Da、5000Da、20,000Da和40,000Da。mPEG部分可以是多分散的，也可以是由12个或24个重复的乙二醇的明确限定链长度(进而分子量)的mPEG构成的单分散，其标记为mdPEG_x，其中m为甲基/甲氧基封端，d：分散，和x为重复乙二醇残基的数目，例如12或24。PEG部分是直链或支链的。可以通过将各种PEG化试剂的离去基团替换为“NH-胰岛素”而形式上获得延长的胰岛素上的PEG-残基的结构/顺序，其中胰岛素在赖氨酸残基的ε位中或者在A-链或B-链的α-氨基位中被PEG化(或者二者)：

mPEG-COCH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-COCH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CH(CH₃)CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂CH(CH₃)CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mPEG-CO-(4-硝基苯氧基)，

(mdPEG₁₂-CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂OCH₂)₃CNH-COCH₂CH₂(OCH₂CH₂)₄NHCOCH₂CH₂CO-OSu(或者简写为：(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-OSu)，

(mdPEG₁₂-CH₂CH₂NHCOCH₂CH₂OCH₂)₃CNH-COCH₂CH₂(OCH₂CH₂)₄NHCOCH₂CH₂CH₂CO-OSu(或者简写为：(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-OSu)，

mdPEG_x-COCH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-COCH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH(CH₃)CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂CH(CH₃)CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CH₂CH₂NH-COCH₂CH₂CH₂CO-OSu，

mdPEG_x-CO-(4-硝基苯氧基)，

其中x是大约6～大约48范围内的整数，例如12或24。

另外，可以总过将两个或者更多个PEG试剂组装而制备更大的PEG化试剂。例如类似上述任一种的封端PEG如N-羟基琥珀酰亚胺酯可以被连接到任选被保护的PEG部分，所述PEG部分在一端被氨基功能团化，另一端被羧酸(酯)功能团化。例如在N-羟基琥珀酰亚胺酯时，在羧酸去保护之后(如果必要)，羧酸被激活，以得到更长的PEG化试剂。如果期望，可以通过重复一次或者更多次而将所得到的PEG化试剂进一步延长。在实施例中对该原理和方法进行了描述。

该方法实现了构建定制大小的较大单分散(和多分散)PEG化试剂。

本发明PEG残基的例子包括：

mPEG750(其中“750”是指以Da表示的平均分子量)，

mPEG2000，

mPEG5000，

mPEG10000，

mPEG20000，

mPEG30000，

mPEG40000，

mdPEG₁₂，(其中下标中的“12”表示PEG单体的数目-本文中根据例如Quanta BioDesign Ltd.所确定的)

mdPEG₂₄，

mdPEG_3×12(其中下标中的“3×12”表示PEG是支链的，并且包括3个臂，每个臂包括12个PEG单体-本文中根据例如Quanta BioDesignLtd.所确定的)，

mdPEG₁₂-dPEG₁₂，

mdPEG₁₂-dPEG₂₄，

mdPEG₂₄-dPEG₁₂，

mdPEG₂₄-dPEG₂₄，

mdPEG₂₄-dPEG₂₄-dPEG₂₄，

mdPEG_3×12-dPEG₁₂，

mdPEG_3×12-dPEG₂₄-dPEG₂₄

下面，列出作为马来酰亚胺的所选择PEG化试剂。显而易见，作为马来酰亚胺基团的替代，可以采用其他Michael受体，例如乙烯基砜和许多本领域技术人员已知的其他Michael受体。PEG(或mPEG)部CH₃O-(CH₂CH₂O)_n-可以是最高达到Mw大约40,000Da的任何尺寸。根据下面的方案，可以通过将各种PEG化试剂的“MAL”替换为“3-硫代-琥珀酰亚胺基-Ala-胰岛素”而形式上获得延长的胰岛素上PEG-残基的结构/顺序，其中PEG在自由半胱氨酸残基处被PEG化：

该方案描述了在末端Cys上的PEG化。显然，对于实现PEG化Cys不必要置于末端。

PEG-MAL的例子：mPEG-MAL。

下面的本发明PEG化延长的胰岛素全部被按照所有情况中连接PEG部分和胰岛素的接头都是(3-)丙酰基接头(-CH₂-CH₂-CO-)进行命名的。通过前述明显的是，许多类型的接头是商业上可以获得的，因为并不是接头的具体结构/组成影响将PEG部分置于常规胰岛素序列之外残基上的有益效果，需要理解所有类型的接头(见上)也在本发明的范围内。

本发明的亲代延长的胰岛素包括下列：

A22K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A22K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A21Q、A22K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A21G、A22K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A21Q、A22G、A23K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A21G、A22G、A23K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A21Q、A22G、A23G、A24K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A21G、A22G、A23G、A24K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

B29Q、B31K人胰岛素；

A22K、B3Q、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、B3S、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、B3T、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、B1Q、B29R、desB30人胰岛素；

A18Q、A22K、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、desB1、B3Q、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、B29Q、B31K人胰岛素；

A21A、B29Q、B31K人胰岛素；

A21Q、B29Q、B31K人胰岛素；

A-1K、desB30人胰岛素；

A-1K、B29R、desB30人胰岛素；

A-3G、A-2G、A-1R desB30人胰岛素；(对于N-末端A-3-PEG化)

A22K、B28E、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、B28D、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、desB27、B28E、B29R、desB30人胰岛素；

B28E、B29Q、B31K人胰岛素；

desB27、B28E、B29Q、B31K人胰岛素；

A22K、B28R、desB29、desB30人胰岛素；

B28R、B29P、B31K人胰岛素；

A22K、B3Q、B28E、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、B3Q、B28E、B29Q、B31K人胰岛素；

A22K、B13Q、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、desB1、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A22K、B25H、desB30人胰岛素；

A14E、B25H、B29Q、B31K人胰岛素；

A13E、A22K、B25H、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30人胰岛素；

A21A、A22K、B29R、desB30人胰岛素；

A21A、A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A21A、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30人胰岛素；

A21A、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30人胰岛素；

A21Q、A22K、B3Q、B29R、desB30人胰岛素；

A21A、A22K、B3Q、B29R、desB30人胰岛素；

A21G、A22K、B3Q、B29R、desB30人胰岛素。

实施例

一般方法

构建表达载体，转化酵母细胞以及表达本发明的胰岛素前体

所有的表达质粒都是C-POT型的，这与EP 171142中所描述的类似，其特征在于含有粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)磷酸丙糖异构酶基因(POT)用于质粒选择和在酿酒酵母(S.cerevisiae)中稳定化的目的。这些质粒还含有酿酒酵母(S.cerevisiae)磷酸丙糖异构酶启动子和终止子。这些序列与质粒pKFN1003(WO 90/10075中所描述的)的相应序列类似，并且是是除了编码导肽和胰岛素产物融合蛋白的EcoRI-XbaI片段之外的全部序列。为了表达不同的融合蛋白，仅仅将pKFN1003的EcoRI-XbaI片段替换为感兴趣的编码导肽-胰岛素融合蛋白。可以根据标准技术使用合成的寡肽和PCR合成这些EcoRI-XbaI片段。

通过转化宿主菌株酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株MT663(MATa/MATa pep4-3/pep4-3 HIS4/his4tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir⁺)而制备酵母转化体。在提交WO 92/11378时，将酵母菌株MT663保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，并提供了保藏号DSM 6278。

将MT663培养在YPGaL(1％Bacto酵母提取物、2％Bacto蛋白胨、2％半乳糖、1％乳酸盐)上，达到600nm处的O.D.为0.6。通过离心收集100ml培养物，使用10ml进行清洗，重离心并重悬浮在10ml含有1.2M山梨醇、25mM Na₂EDTA pH＝8.0和6.7mg/ml二硫代苏糖醇的溶液中。将悬浮液在30℃下孵育15分钟，离心，并将细胞重悬浮在10ml含有1.2M山梨醇、10mM Na₂EDTA、0.1M柠檬酸钠pH 05.8和2mg234的溶液中。将悬浮液在30℃下孵育30分钟，通过离心收集细胞，在10ml 1.2M山梨醇和10ml CAS(1.2M山梨醇，10mM CaCl₂，10mM Tris HCl(pH＝7.5)中进行清洗，并重悬浮在2mlCAS中。为了进行转化，将1ml CAS-悬浮的细胞与大约0.1mg质粒DNA混合，并保持在室温15分钟。加入1ml(20％聚乙二醇4000、10mM CaCl₂、10mM Tris HCl pH＝7.5)，并将该混合物在室温下再保持30分钟。对混合物进行离心，并将沉淀重悬浮在0.1ml SOS(1.2M山梨醇，33％v/v YPD，6.7mM CaCl₂)中，并在30℃下孵育2小时。接着离心悬浮液，并将沉淀重悬浮在0.5ml 1.2M山梨醇中。接着，在52℃下加入6ml含有1.2M山梨醇+2.5％琼脂的顶层琼脂(Sherman等人(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory中的SC培养基)，并将悬浮液倒在含有相同琼脂固化、含有山梨醇的培养基的平板的顶部。30℃下在YPD中培养被转化表达载体的酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株MT663持续72小时。

本发明PEG化胰岛素衍生物的制备、纯化和鉴定

如上所述制备多种胰岛素前体，并从培养基中分离和纯化。根据下面实施例中所述的，对胰岛素前体进行PEG化和处理，以制备最终的胰岛素衍生物(通用方法(A))。任选地，可以在PEG化之前，使用胰蛋白酶对这些前体进行处理(通用方法(B))。如下所述，根据相对于人胰岛素，与人胰岛素受体的结合亲和力进行测量的，对这些胰岛素衍生物进行胰岛素活性的测试。

下面的例子是指在说明书和实施例中所确定的中间化合物和最终产物。使用下面的实施例详细描述本发明胰岛素衍生物的制备，但是所描述的化学反应和纯化方案是根据它们用于制备本发明胰岛素衍生物的通常实用性所公开的。有时候，所公开的反应可能不能适用于本发明所公开范围的每一种化合物。发生这种情况的化合物容易被本领域技术人员识别。在这些情况中，可以通过本领域技术人员已知的常规修饰而成功进行这些反应，即通过适当保护嵌入基团、通过变成其他常规试剂或通过反应条件的常规修饰。可替换的，本文所公开的其他反应或常规的反应能够应用于制备本发明的相应化合物。在所有的制备方法中，所有的起始材料都是已知的，并且可以容易地从已知的起始材料进行制备。除非以其他方式说明，所有的温度都是以摄氏度列出的，在提到产量时所有的份数和百分比都是以重量计，在提到溶剂和洗脱剂时所有的份数都是以体积计。

可以通过采用下列本领域中典型的程序的一种或者更多种纯化本发明的胰岛素衍生物。如果需要，在梯度、pH、盐浓度、流、柱等方面，这些程序可以被改动。根据多种因素例如杂质特征、所关心胰岛素的溶解度等，本领域技术人员容易认识到并进行这些改动。

用于制备本发明PEG化延长的胰岛素的通用方法(A)

下面略述了通用方法(A)，并在第一个实施例中进行描述：

实施例1，通用方法(A)

A22K(N^ε-mPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

步骤1：胰岛素前体LysA22 ArgB29 B29R desB30 B’A的制备和纯化

根据下面纯化步骤A～C中所描述的，可以纯化胰岛素前体A22K、B29R、desB30、B’A单链胰岛素。

纯化步骤A：捕获

在步骤A中，通过加入4.5升99％的乙醇而将10.75升清澈的培养基进行稀释，以得到15.25升含有30％体积乙醇(导电率2.7mS/cm，pH＝3.4)。在装载15.25升所准备的培养基(流速大约10ml/分钟)过夜之前，使用1升0.1M柠檬酸pH 3.5(流速大约20ml/分钟)对300mlSP Big Beads Sepharose柱(100-300μm，Amersham Biosciences)进行平衡。接着使用1.5升0.2M醋酸钠、35％体积乙醇，pH 5.75(流速：1.5ml/分钟，所洗脱前体的体积：400ml，前体的量：220mg)洗脱所结合的胰岛素前体A22K、B29R、desB30、B’A单链胰岛素。

纯化步骤B：反相HPLC

在步骤B中，将洗脱物蒸发至干燥，并将沉淀重溶解在0.25M醋酸中。在通过反相HPLC在C 18柱(ODDMS C 18，20×250mm，20010μm，FeF Chemicals A/S)上进行纯化之前，立即进一步将pH降低至1.5。在施加到柱之前，将前体溶液无菌过滤(22μm，Low Protein Binding(PVDF)，Millipore)。在柱上运行15％B～50％B的梯度，其中缓冲液A：0.2M(NH₄)₂SO₄、0.04M正磷酸、10％体积乙醇，pH 2.5，和缓冲液B：70％体积乙醇。使用5ml/分钟，4℃的柱温度，运行该梯度120分钟。洗脱并收集胰岛素前体A22K、B29R、desB30、B’A单链胰岛素(总体积75ml)。

纯化C：通过凝胶过滤进行脱盐

在步骤C中，使用旋转蒸发器(新体积：～50ml)将来自反相HPLC的洗脱物中乙醇的含量降低至5％体积。在0.5M醋酸中对1000ml G25Sephadex柱(5×55cm，Amersham Biosciences)进行清洗，并接着将胰岛素前体A22K、B29R、desB30、B’A单链胰岛素施加到柱上，接着通过在0.5M醋酸中凝胶过滤而脱盐。随后在280nm处对胰岛素前体进行UV检测，而对盐进行导电率测量。脱盐之后，立即将胰岛素前体进行冻干。

步骤2：A22K(N ^ε -mPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30B’A人胰岛素前体的合成

将0,15mmol冻干的胰岛素前体LysA22 ArgB29 desB30 B’A溶解在碳酸钠水溶液(3ml，100mM)中。将PEG化试剂mPEG2000-SPA-OSu在乙腈中的溶液(3ml中0.15mmol)加入到前体溶液中，并轻轻搅拌混合物1小时。冻干混合物，通过HPLC进行纯化，并冻干以得到PEG化前体。

步骤3：转化成A22K(N ^ε -mPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

将PEG化胰岛素前体A22K(N^ε-mPEG2000-丙酰基)、desB30B’A单链人胰岛素前体(3.9μmol)溶解在4.2ml 50mM甘氨酸，20％体积乙醇pH 10.0中。将3.6mg冻干的猪胰蛋白酶(Novo Nordisk A/S)也溶解在3.5ml 50mM甘氨酸，20％体积乙醇pH 10.0中。接着将0.5ml的该胰蛋白酶溶液加入到胰岛素前体溶液中(因此，胰岛素前体过量200倍)。接着在室温下孵育该混合物15分钟，之后，通过将pH降低至pH＜3(使用0.5M醋酸，达到pH＝2.08)停止胰蛋白酶活性。接着通过反相HPLC纯化PEG化胰岛素类似物A22K(N^ε-mPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素(除去胰蛋白酶和所有未酰基化、双酰基化等或未切割胰岛素分子)，冻干以得到标题胰岛素。

用于制备本发明PEG化延长的胰岛素的通用方法(B)

该方法与通用方法(A)非常类似。改变了每个步骤的顺序，以便在PEG化之前，B’A-前体被胰蛋白酶切割。在第一个实施例中对通用方法(B)进行了描述。

实施例2，通用方法(B)：

A22K(N^εmPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

将A22K、B29R、desB30人胰岛素(125mg)溶解在0.1M Na₂CO₃(2.8ml)中。加入溶解在乙腈(1,25ml)中的mPEG-SPA 2000(50mg)。使用0.1N NaOH将pH从10.2调节到10.4。再过50分钟后，加入溶解在乙腈(1,25ml)中的mPEG-SPA 2000(25mg)。在缓慢搅拌80分钟之后，加入水(4.5ml)，并使用1N HCl将pH调节到5。冻干混合物。通过制备型HPLC纯化获得标题化合物。柱：C4，2cm。A-缓冲液：MiliQWater水中的0.1％TFA；B-缓冲液：乙腈中的0.1％TFA。梯度30-65％B经过30分钟。产量43mg。

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：8114。

实施例3，通用方法(B)：

A22K(N^εmPEG750-丙酰基、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：5862。

实施例4，通用方法(B)：

A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基、B29R、desB30人胰岛素

MALDI(基质：芥子酸)；m/z：6432。

实施例5，通用方法(B)：

A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基、B29R、desB30人胰岛素

MALDI(基质：芥子酸)；m/z：6962。

实施例6，通用方法(B)：

A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：8167。

实施例7，通用方法(B)：

A22G、A23G、A24G、A25K(N^εmPEG750-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：6807

实施例8，通用方法(B)：

A22G、A23K(N^εmPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：8170

实施例9，通用方法(B)：

A22K(N^εmdPEG₈-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：6258。

实施例10，通用方法(B)：

A22K(N^εmdPEG₄-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：6082。

实施例11，通用方法(B)：

A22K(N^εmPEG5000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：大约11600。

实施例12，通用方法(B)：

A22K(N^εmPEG20000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：大约21500。

实施例13，通用方法(B)：

A14E、A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：7520。

实施例14，通用方法(B)：

A14E、A22K(N^εmdPEG₁₂-dPEG₂₄-丙酰基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：7520。

根据下面所描述的制备PEG化试剂：

制备Ω-(甲氧基-PEG ₁₁ -丙酰基氨基)-PEG ₂₄ -丙酸(mdPEG ₁₂ -dPEG ₂₄ 酸)

将mdPEG₁₂NHS酯(0.457mmol，Quanta BioDesign Ltd.产品号：10262)和氨基-dPEG₂₄叔丁酯(0.416mmol，Quanta BioDesign，产品号：10311)分别溶解在乙腈(均为10ml)中，接着混合这两种溶液。使用DIPEA将pH调节至pH8(使用指示条进行pH的测量)。在室温下搅拌所得到的混合物过夜，随后蒸发至干燥，接着使用TFA/DCM(1/1)，10mL在室温下进行处理。接着将混合物蒸发至干燥，并使用DCM汽提2此。将残余物使用HPLC(2cm，C18柱)进行纯化，其使用乙腈(AcCN)/0，1％TFA和水/0,1％TFA作为洗脱剂。梯度：10-80％AcCN/TFA 5～20分钟。收集含有期望化合物的级分，合并，并蒸发至干燥，得到油状的Ω-(甲氧基-PEG ₁₁ -丙酰胺基)PEG ₂₃ -丙酸(249mg，35％)。

LCMS：m/z：1718(M+1)⁺。

制备Ω-(甲氧基-PEG ₁₁ -丙酰基氨基)-PEG ₂₄ -丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(mdPEG ₁₂ -dPEG ₂₄ -NHS或mdPEG ₁₂ -dPEG ₂₄ -丙酸OSu酯)

将Ω-(甲氧基-PEG₁₁-丙酰胺基)PEG₂₄-丙酸(249mg，0.145mmol)溶解在乙腈中(10mL)，并通过加入DIPEA将pH调节到8(使用指示条进行pH的测量)。加入乙腈(10mL)中的TSTU(48mg，0.16mmol)，并在室温搅拌混合物1.5小时，蒸发至干燥。将残余物溶解在DCM中，并使用盐酸(0.01M)清洗，干燥有机相(MgSO₄)，过滤并将滤液蒸发至干燥。所得到的Ω-(甲氧基-PEG ₁₁ -丙酰基氨基)PEG ₂₄ 丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯用于连接到胰岛素，而不进一步纯化。

LCMS：m/z 1813.8(M+1)⁺。

实施例15，通用方法(B)：

A14E、A22K(N^εmdPEG₂₄-dPEG₁₂-丙酰基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：7519。

与上面所述类似，从mdPEG₂₄NHS酯(Quanta BiodDesign Ltd.产品号：10304)和氨基-dPEG₁₂叔丁酯(Quanta BioDesign Ltd.产品号：10281)经由Ω-(甲氧基-PEG₂₃-丙酰基氨基)PEG₁₂丙酸叔丁酯、Ω-(甲氧基-PEG₂₃-丙酰基氨基)PEG₁₂丙酸和Ω-(甲氧基-PEG₂₃-丙酰基氨基)PEG₁₂丙酸NHS酯制备N-羟基琥珀酰亚胺激活的PEG试剂。

LCMS：m/z 1814(M+1)⁺。

实施例16，通用方法(B)：

A14E、A22K(N^εmPEG2000-丙酰基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：大约8200。

实施例17，通用方法(B)：

A14E、A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：8123。

使用PEG试剂NHS-dPEG₄-(m-dPEG₁₂)₃酯(Quanta BioDesign Ltd.产品号：10401)制备该胰岛素。

实施例18，通用方法(B)：

A14E、A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基-dPEG 12-基)、B25H、B29R、

desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：8724。

与上面所述类似，使用PEG试剂NHS-dPEG₄-(m-dPEG₁₂)₃酯(Quanta BioDesign Ltd.产品号：10401)和氨基-dPEG₁₂叔丁酯(QuantaBioDesign产品号：10281)制备该胰岛素。

实施例19，通用方法(B)：

A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基-dPEG 12-基)、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：8768。

实施例20，通用方法(B)：

A22K(N^ε(mdPEG₂₄-丙酰基)、A14E、B25H、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：6918。

实施例21，通用方法(B)：

A22K(N^ε(mPEG5.000-丙酰基))，A14E、B25H、B29R、desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：大约11400。

实施例22，通用方法(B)：

B29Q、B31K(N^ε(mPEG2000-丙酰基))人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：大约8268。

实施例23：

本发明胰岛素衍生物的胰岛素受体结合

通过SPA检验(闪烁接近检验)微孔板抗体捕获检验测定本发明胰岛素衍生物与人胰岛素受体的亲和力。将SPA-PVT抗体结合珠、抗-小鼠试剂(Amersham Biosciences，目录号：PRNQ0017)与25ml结合缓冲液混合(100mM HEPES pH 7.8；100mM氯化钠，10mM MgSO₄，0.025％吐温-20)混合。对于单个Packard Optiplate(Packard No.6005190)，试剂混合物包含2.4μl 1∶5000稀释的纯化重组人胰岛素受体(具有或者不具有外显子11)，对应每100μl试剂混合物5000cpm的量的A14Tyr[¹²⁵I]-人胰岛素存储溶液，12μl 1∶1000稀释的F12抗体，3ml SPA-珠以及结合缓冲液达到12ml。接着，将总共100μl试剂混合物加入到Packard Optiplate中的每个孔中，并在Optiplate中从适当的样品进行胰岛素衍生物的系列稀释。接着随着轻轻摇晃将样品孵育16小时。接着通过离心1分钟而将这些相进行分离，并在Topcounter中对板进行计数。使用非线性回归运算法则在GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software，San Diego，CA)中进行结合数据的拟合。

本发明所选择化合物的胰岛素受体结合亲和力：

实施例No：相对于人胰岛素的胰岛素受体结合，

A-同种型(不具有外显子11)：

1，2 90％

3 123％

实施例4 188％

实施例6 120％

实施例5 118％

实施例7 44％

实施例8 58％

实施例9 128％

10 123％

15 20％

13 24％

14 16％

17 19％

18 16％

19 106％

20 24％

22 14％

16 15％

实施例24：

在大鼠中i.v.快速浓注(bolus injection)本发明的胰岛素衍生物后血液葡萄糖降低效果

对禁食18小时的雄性Wistar大鼠200-300g，皮下应用枸橼酸芬太尼-马来酸咪达唑仑(1.25mg/ml马来酸咪达唑仑，2.5mg/ml氟阿尼酮，0.079mg/ml芬太尼柠檬酸盐)以2ml/kg作为启动剂量(在给药测试物质之前的时间点-30分钟)以及每20分钟附加1ml/kg进行麻醉。

将这些动物进行静脉注射(尾部静脉)给药1ml/kg的对照和测试化合物(通常剂量范围是0.125-20nmol/kg)。在肝素化的10μl玻璃管中通过刺破尾尖的毛细血管收集用于测定全血葡萄糖浓度的血液样品，达到时间-20分钟和0分钟(给药前)，以及达到给药后的时间10、20、30、40、60、80、120和180分钟。在分析缓冲液中稀释之后，通过固定葡萄糖氧化酶法使用EBIO Plus自动分析仪(Eppendorf，Germany)测量血液葡萄糖浓度。对于每种剂量和每种化合物记录平均血浆葡萄糖浓度过程(平均值±SEM)。

实施例25：

本发明胰岛素衍生物相对于人胰岛素的能力

在实验日将体重238-383g的Sprague Dawley雄性大鼠用于夹钳实验(clamp experiment)。在控制的周围环境下，对大鼠进行自由饲养，并在夹钳实验前禁食过夜(从下午3点开始)。

实验规程：

在外科手术程序之前，使大鼠适应动物设备至少1星期。在夹钳实验钱大约1星期，在三氟溴氯乙烷麻醉时，将聚乙烯导管(Tygoncatheter)插入到颈静脉中(进行输注)和颈动脉中(用于血液取样)，用手术从腹中取出并固定在颈部的后边。在外科手术之后为大鼠vet.给药链霉素(Streptocilin)(Boehringer Ingelheim；0.15ml/rat，i.m.)，并在恢复期中置于动物饲养单元(25℃)中。为了达到麻醉，在麻醉过程中给药Anorphin(0.06mg/大鼠，皮下)，并在完全从麻醉恢复后给药Rimadyl(1.5mg/kg，皮下)，再次每日一次持续两天。

在实验日的早上7点，将禁食过夜(从前一天的下午3点)的大鼠进行称重，并连接到取样注射器和灌注系统(Harvard 22 Basicpumps，Harvard，以及Perfectum Hypodermic glass syringe，Aldrich)，接着置于单独的夹笼中，在此处它们在开始实验前休息约45分钟。在整个实验过程中，这些大鼠能够自由地在它们的常规垫子上移动，并且自由获取饮用水。在30分钟基础时段后(在该过程中以10分钟间隔测量血浆葡萄糖水平)，以恒定的速度输注(i.v.)待测试的胰岛素衍生物和人胰岛素(每只大鼠一种剂量水平，每个剂量水平n＝6-7)持续300分钟。在整个过程中，以10分钟的间隔测量血浆葡萄糖水平，并依此调节20％葡萄糖水溶液的的输注，以维持血糖正常(euglyceamia)。汇集来自每只大鼠的重悬浮红细胞样品，并通过颈动脉导管返回大约1/2体积。

在每个实验日，在夹钳实验之前和最后，采用每种待测试的胰岛素衍生物的溶液样品以及人胰岛素溶液，并通过HPLC确认肽的浓度。在研究之前和最后的相关时间点测量待测量胰岛素和C-肽以及胰岛素衍生物的血浆浓度。在实验最后使用过量的戊巴比妥处死大鼠。

实施例26：

为大鼠肺部递送胰岛素衍生物

通过滴注法肺部给药测试物质。简言之，将雄性Wistar大鼠(大约250g)在大约60ml芬太尼/dehydrodenzperidol/-马来酸咪达唑仑中进行麻醉，其是以6.6ml/kg sc启动剂量提供的，并且随后以30分钟的间隔提供3次维持剂量的3.3ml/kg sc。在诱导麻醉之后10分钟，从尾部静脉获得基础样品(t＝-20分钟)，接着在给药测试物质之前立即获得基础样品(t＝0)。在t＝0时，将测试物质气管内给药到一个肺中。将具有圆末端的特殊导管固定在含有200μl空气和测试物质(1ml/kg)的注射器上。通过孔，将套管引入到器官中，并向前进入主要支气管之一-刚刚通过分叉(bifurcature)。在插入的过程中，从外部对颈部进行触诊，以确认气管内的定位。随后注射注射器的内含物，接着停顿2秒。之后，将套管缓慢向后拉。在测试的过程中，将大鼠保持麻醉(血液样品持续最高达到4或8小时)，并在实验后进行安乐死。

与上面所述的类似，可以制备在下列实施例中的PEG化延长的胰岛素：

实施例27-419

实施例#：PEG化延长的胰岛素：

27 A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

28 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

29 A22G A23K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

30 A22G A23K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

31 A22G A23K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

32 A22G A23K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

33 A22G A23K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

34 A22G A23K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

35 A22G A23K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

36 A22G A23K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

37 A22G A23G A24K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

38 A22G A23G A24K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

39 A22G A23G A24K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

40 A22G A23G A24K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

41 A22G A23G A24K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

42 A22G A23G A24K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

43 A22G A23G A24K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

44 A22G A23G A24K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

45 A22G A23G A24K(N^ε(mdPEG12)₃-dPEG₄-基)B29RdesB30人胰岛素；

46 A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

47 A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

48 A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

49 A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

50 A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

51 A22G A23G A24G A25K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

52 A22G A23G A24G A25K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

53 A22G A23G A24G A25K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29RdesB30人胰岛素；

54 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

55 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

56 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

57 A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

58 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

59 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

60 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

61 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

62 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

63 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B3S B29R desB30人胰岛素；

64 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B3S B29R desB30人胰岛素；

65 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B3S B29R desB30人胰岛素；

66 A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B3S B29R desB30人胰岛素；

67 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B3S B29R desB30人胰岛素；

68 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B3S B29R desB30人胰岛素；

69 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B3S B29R desB30人胰岛素；

70 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B3S B29R desB30人胰岛素；

71 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B3S B29R desB30人胰岛素；

72 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B3T B29R desB30人胰岛素；

73 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B3T B29R desB30人胰岛素；

74 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B3T B29R desB30人胰岛素；

75 A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B3T B29R desB30人胰岛素；

76 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B3T B29R desB30人胰岛素；

77 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B3T B29R desB30人胰岛素；

78 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B3T B29R desB30人胰岛素；

79 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B3T B29R desB30人胰岛素；

80 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B3T B29R desB30人胰岛素；

81 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

82 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

83 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

84 A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

85 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

86 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

87 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

88 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

89 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B1Q B29R desB30人胰岛素；

90 A18Q A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

91 A18Q A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

92 A18Q A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

93 A18Q A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

94 A18Q A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

95 A18Q A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

96 A18Q A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

97 A18Q A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

98 A18Q A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

99 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)desB1 B3Q B29R desB30人胰岛素；

100 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)desB1 B3Q B29R desB30人胰岛素；

101 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)desB1 B3Q B29R desB30人胰岛素；

102 A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)desB1 B3Q B29R desB30人胰岛素；

103 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)desB1 B3Q B29R desB30人胰岛素；

104 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)desB1 B3Q B29R desB30人胰岛素；

105 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)desB1 B3Q B29R desB30人胰岛素；

106 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)desB1 B3Q B29R desB30人胰岛素；

107 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)desB1 B3Q B29RdesB30人胰岛素；

108 B29Q B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

109 B29Q B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

110 B29Q B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

111 B29Q B31K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)人胰岛素；

112 B29Q B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

113 B29Q B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

114 B29Q B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

115 B29Q B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

116 B29Q B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

117 A21G B29Q B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

118 A21G B29Q B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

119 A21G B29Q B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

120 A21G B29Q B31K(N^εmPEG10.000-丙酰基)人胰岛素；

121 A21G B29Q B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

122 A21G B29Q B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

123 A21G B29Q B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

124 A21G B29Q B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

125 A21G B29Q B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

126 A21A B29Q B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

127 A21A B29Q B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

128 A21A B29Q B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

129 A21A B29Q B31K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)人胰岛素；

130 A21A 29Q B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

131 A21A B29Q B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

132 A21A B29Q B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

133 A21A B29Q B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

134 A21A B29Q B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

135 A21Q B29Q B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

136 A21Q B29Q B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

137 A21Q B29Q B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

138 A21Q B29Q B31K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)人胰岛素；

139 A21Q B29Q B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

140 A21Q B29Q B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

141 A21Q B29Q B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

142 A21Q B29Q B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

143 A21Q B29Q B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

144 A-1K(N^εmPEG750-丙酰基)desB30人胰岛素；

145 A-1K(N^εmPEG2.000-丙酰基)desB30人胰岛素；

146 A-1K(N^εmPEG5.000-丙酰基)desB30人胰岛素；

147 A-1K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)desB30人胰岛素；

148 A-1K(N^εmPEG20.000-丙酰基)desB30人胰岛素；

149 A-1K(N^εmPEG40.000-丙酰基)desB30人胰岛素；

150 A-1K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)desB30人胰岛素；

151 A-1K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)desB30人胰岛素；

152 A-1K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)desB30人胰岛素；

153 A-1K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

154 A-1K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

155 A-1K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

156 A-1K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

157 A-1K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

158 A-1K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

159 A-1K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

160 A-1K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

161 A-1K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

162 A-3G(N^αmPEG750-丙酰基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

163 A-3G(N^αmPEG2.000-丙酰基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

164 A-3G(N^αmPEG5.000-丙酰基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

165 A-3G(N^αmPEG 10.000-丙酰基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

166 A-3G(N^αmPEG20.000-丙酰基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

167 A-3G(N^αmPEG40.000-丙酰基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

168 A-3G(N^αmdPEG₁₂-丙酰基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

169 A-3G(N^αmdPEG₂₄-丙酰基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

170 A-3G(N^α(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)A-2G A-1R desB30人胰岛素；

171 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B28E B29R desB30人胰岛素；

172 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B28E B29R desB30人胰岛素；

173 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B28E B29R desB30人胰岛素；

174 A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B28E B29R desB30人胰岛素；

175 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B28E B29R desB30人胰岛素；

176 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B28E B29R desB30人胰岛素；

177 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B28E B29R desB30人胰岛素；

178 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B28E B29R desB30人胰岛素；

179 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B28E B29R desB30人胰岛素；

180 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B28D B29R desB30人胰岛素；

181 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B28D B29R desB30人胰岛素；

182 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B28D B29R desB30人胰岛素；

183 A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B28D B29R desB30人胰岛素；

184 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B28D B29R desB30人胰岛素；

185 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B28D B29R desB30人胰岛素；

186 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B28D B29R desB30人胰岛素；

187 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B28D B29R desB30人胰岛素；

188 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B28D B29R desB30人胰岛素；

189 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)desB27 B28E B29R desB30人胰岛素；

190 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)desB27 B28E B29RdesB30人胰岛素；

191 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)desB2 7B28E B29RdesB30人胰岛素；

192 A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)desB27 B28E B29RdesB30人胰岛素；

193 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)desB27 B28E B29RdesB30人胰岛素；

194 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)desB27 B28E B29RdesB30人胰岛素；

195 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)desB27 B28E B29R desB30人胰岛素；

196 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)desB27 B28E B29R desB30人胰岛素；

197 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)desB27 B28E B29RdesB30人胰岛素；

198 B28E B29Q B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

199 B28E B29Q B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

200 B28E B29Q B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

201 B28E B29Q B31K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)人胰岛素；

202 B28E B29Q B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

203 B28E B29Q B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

204 B28E B29Q B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

205 B28E B29Q B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

206 B28E B29Q B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

207 desB27 B28E B29Q B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

208 desB27 B28E B29Q B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

209 desB27 B28E B29Q B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

210 desB27 B28E B29Q B31K(N^εmPEG10.000-丙酰基)人胰岛素；

211 desB27 B28E B29Q B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

212 desB27 B28E B29Q B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

213 desB27 B28E B29Q B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

214 desB27 B28E B29Q B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

215 desB27 B28E B29Q B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

216 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

217 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

218 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

219 A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

220 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

221 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

222 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

223 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

224 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B28R desB29 desB30人胰岛素；

225 B28R B29P B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

226 B28R B29P B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

227 B28R B29P B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

228 B28R B29P B31K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)人胰岛素；

229 B28R B29P B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

230 B28R B29P B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

231 B28R B29P B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

232 B28R B29P B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

233 B28R B29P B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

234 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

235 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

236 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

237 A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

238 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

239 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

240 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

241 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

242 A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B3Q B28E B29R desB30人胰岛素；

243 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

244 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

245 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

246 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^εmPEG10.000-丙酰基)人胰岛素；

247 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

248 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

249 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

250 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

251 A21G B3Q B28E B29Q B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

252 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

253 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

254 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

255 A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

256 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

257 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

258 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

259 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

260 A22K(N^ε((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B13Q B29R desB30人胰岛素；

261 A22K(N^εmPEG750-丙酰基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

262 A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

263 A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

264 A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

265 A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

266 A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

267 A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

268 A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

269 A22K(N^ε((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)desB1 B29R desB30人胰岛素；

270 A14E A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

271 A14E A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

272 A14E A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

273 A14E A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

274 A14E A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

275 A14E A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

276 A14E A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

277 A14E A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

278 A14E A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B25H desB30人胰岛素；

279 A14E B25H B29Q B31K(N^εmPEG750-丙酰基)人胰岛素；

280 A14E B25H B29Q B31K(N^εmPEG2.000-丙酰基)人胰岛素；

281 A14E B25H B29Q B31K(N^εmPEG5.000-丙酰基)人胰岛素；

282 A14E B25H B29Q B31K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)人胰岛素；

283 A14E B25H B29Q B31K(N^εmPEG20.000-丙酰基)人胰岛素；

284 A14E B25H B29Q B31K(N^εmPEG40.000-丙酰基)人胰岛素；

285 A14E B25H B29Q B31K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)人胰岛素；

286 A14E B25H B29Q B31K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)人胰岛素；

287 A14E B25H B29Q B31K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)人胰岛素；

288 A13E A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

289 A13E A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

290 A13E A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

291 A13E A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

292 A13E A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

293 A13E A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

294 A13E A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

295 A13E A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B25H desB30人胰岛素；

296 A13E A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B25H desB30人胰岛素；

297 A21Q A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

298 A21Q A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

299 A21Q A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

300 A21Q A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

301 A21Q A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

302 A21Q A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

303 A21Q A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

304 A21Q A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

305 A21Q A22K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

306 A21Q A22G A23K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

307 A21Q A22G A23K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

308 A21Q A22G A23K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

309 A21Q A22G A23K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

310 A21Q A22G A23K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

311 A21Q A22G A23K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

312 A21Q A22G A23K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

313 A21Q A22G A23K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

314 A21Q A22G A23K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

315 A21Q A22G A23G A24K(N^εmPEG750-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

316 A21Q A22G A23G A24K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

317 A21Q A22G A23G A24K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

318 A21Q A22G A23G A24K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

319 A21Q A22G A23G A24K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

320 A21Q A22G A23G A24K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

321 A21Q A22G A23G A24K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

322 A21Q A22G A23G A24K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

323 A21Q A22G A23G A24K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29RdesB30人胰岛素；

324 A21Q A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

325 A21Q A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

326 A21Q A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

327 A21Q A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

328 A21Q A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

329 A21Q A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

330 A21Q A22G A23G A24G A25K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

331 A21Q A22G A23G A24G A25K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

332 A21Q A22G A23G A24G A25K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

333 A21A A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

334 A21A A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

335 A21A A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

336 A21A A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

337 A21A A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

338 A21A A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

339 A21A A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

340 A21A A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

341 A21A A22K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

342 A21A A22G A23K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

343 A21A A22G A23K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

344 A21A A22G A23K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

345 A21A A22G A23K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

346 A21A A22G A23K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

347 A21A A22G A23K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

348 A21A A22G A23K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

349 A21A A22G A23K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

350 A21A A22G A23K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

351 A21A A22G A23G A24K(N^εmPEG750-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

352 A21A A22G A23G A24K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

353 A21A A22G A23G A24K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

354 A21A A22G A23G A24K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

355 A21A A22G A23G A24K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

356 A21A A22G A23G A24K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

357 A21A A22G A23G A24K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

358 A21A A22G A23G A24K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

359 A21A A22G A23G A24K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29RdesB30人胰岛素；

360 A21A A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

361 A21A A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

362 A21A A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

363 A21A A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

364 A21A A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

365 A21A A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

366 A21A A22G A23G A24G A25K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

367 A21A A22G A23G A24G A25K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

368 A21A A22G A23G A24G A25K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

369 A21G A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

370 A21G A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

371 A21G A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

372 A21G A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

373 A21G A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

374 A21G A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

375 A21G A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

376 A21G A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

377 A21G A22K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

378 A21G A22G A23K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

379 A21G A22G A23K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

380 A21G A22G A23K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

381 A21G A22G A23K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

382 A21G A22G A23K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

383 A21G A22G A23K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

384 A21G A22G A23K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

385 A21G A22G A23K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

386 A21G A22G A23K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

387 A21G A22G A23G A24K(N^εmPEG750-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

388 A21G A22G A23G A24K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

389 A21G A22G A23G A24K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

390 A21G A22G A23G A24K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

391 A21G A22G A23G A24K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

392 A21G A22G A23G A24K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

393 A21G A22G A23G A24K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

394 A21G A22G A23G A24K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29RdesB30人胰岛素；

395 A21G A22G A23G A24K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29RdesB30人胰岛素；

396 A21G A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG750-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

397 A21G A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

398 A21G A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

399 A21G A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

400 A21G A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

401 A21G A22G A23G A24G A25K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

402 A21G A22G A23G A24G A25K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

403 A21G A22G A23G A24G A25K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B29R desB30人胰岛素；

404 A21G A22G A23G A24G A25K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B29R desB30人胰岛素；

405 A21Q A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

406 A21Q A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

407 A21Q A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

408 A21Q A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

409 A21Q A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

410 A21Q A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

411 A21Q A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

412 A21Q A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

413 A21Q A22K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

414 A21G A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

415 A21G A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

416 A21G A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

417 A21G A22K(N^εmPEG 10.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

418 A21G A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

419 A21G A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

420 A21G A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

421 A21G A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

422 A21G A22K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

423 A21A A22K(N^εmPEG750-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

424 A21A A22K(N^εmPEG2.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

425 A21A A22K(N^εmPEG5.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

426 A21A A22K(N^εmPEG10.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

427 A21A A22K(N^εmPEG20.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

428 A21A A22K(N^εmPEG40.000-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

429 A21A A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

430 A21A A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)B3Q B29R desB30人胰岛素；

431 A21A A22K((mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)B3Q B29R desB30人胰岛素。

附图简要描述

图1和图2是大鼠气管内滴注实施例1和2的胰岛素。图3是大鼠气管内滴注实施例6的胰岛素。图4是大鼠气管内滴注实施例5的胰岛素。图5是大鼠气管内滴注实施例16的胰岛素。图6是大鼠气管内滴注实施例18的胰岛素。图7是大鼠气管内滴注实施例17的胰岛素。图8是大鼠气管内滴注实施例19的胰岛素。图9是大鼠气管内滴注实施例22的胰岛素。图10是通过为小型猪进行肺部给药实施例1和2的胰岛素喷雾干燥粉末而得到的血液葡萄糖特征，其中递送的平均剂量为0.037±0.009mg/kg。图11是通过为小型猪进行肺部给药实施例1和2的胰岛素喷雾干燥粉末而得到的药物动力学特征，其中递送的平均剂量为0.037±0.009mg/kg。

Claims

1.PEG化胰岛素类似物，其具有从A22K、A23K、A25K或B31K位延长的含PEG延长部分，其中PEG部分通过接头附加到所述位置中的氨基酸残基上，所述PEG化胰岛素类似物衍生自下列胰岛素类似物之一：

A14E、A22K、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30人胰岛素；

A22G、A23K、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、A14E、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A22K、B29R、desB30人胰岛素；以及

B29Q、B31K人胰岛素。

2.根据权利要求1的PEG化胰岛素类似物，其具有PEG部分-(OCH₂CH₂)_n-，其中n是2～1000范围内的整数。

3.根据权利要求2的PEG化胰岛素类似物，其中n是2～500范围内的整数。

4.根据权利要求2的PEG化胰岛素类似物，其中n是2～250范围内的整数。

5.根据权利要求2的PEG化胰岛素类似物，其中n是2～125范围内的整数。

6.根据权利要求2的PEG化胰岛素类似物，其中n是2～50范围内的整数。

7.根据权利要求2的PEG化胰岛素类似物，其中n是2～25范围内的整数。

8.根据权利要求1-7中任一项的PEG化胰岛素类似物，其中通过酰胺键或氨基甲酸酯键将所述聚乙二醇部分连接到所述氨基酸残基的α-或γ-NH-基团上。

9.根据权利要求1的PEG化胰岛素类似物，其是

A22K(N^ε-mPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(N^εmPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(N^εmPEG750-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(N^εmdPEG₁₂-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(N^εmdPEG₂₄-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(Nε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22G、A23G、A24G、A25K(N^αmPEG750-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22G、A23K(N^εmPEG2000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(NεmdPEG₈-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(NεmdPEG₄-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(N^εmPEG5000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(NεmPEG20000-丙酰基)、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A22K(NεmdPEG₁₂-丙酰基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A22K(N^εmdPEG₁₂-dPEG₂₄-丙酰基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A22K(N^εmdPEG₂₄-dPEG₁₂-丙酰基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A22K(N^εmPEG2000-丙酰基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A14E、A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基-dPEG12-基)、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(N^ε(mdPEG₁₂)₃-dPEG₄-基-dPEG12-基)、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(N^ε(mdPEG₂₄-丙酰基)、A14E、B25H、B29R、desB30人胰岛素；

A22K(N^ε(mPEG5.000-丙酰基))、A14E、B25H、B29R、desB30人胰岛素；或

B29Q、B31K(N^ε(mPEG2000-丙酰基))人胰岛素。

10.包含根据权利要求1-9中任一项的PEG化胰岛素类似物的药物组合物。

11.根据权利要求1-9中任一项的PEG化胰岛素类似物，其用作药物用于肺部给药于糖尿病患者。

12.根据权利要求1-9中任一项的PEG化胰岛素类似物，其用作药物用于治疗糖尿病。