CN101559356A - 一种三羟甲基氨基甲烷配基琼脂糖亲水色谱介质合成方法 - Google Patents
一种三羟甲基氨基甲烷配基琼脂糖亲水色谱介质合成方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种以三羟甲基氨基甲烷为配基、以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶为基质的亲水吸附色谱介质的合成方法。高浓度、高交联度琼脂糖凝胶介质表面有高密度的可供反应的羟基，用烯丙基溴或环氧氯丙烷或1，4－双－丁烷二缩水甘油醚或季戊四醇三缩水甘油醚或季戊四醇缩水甘油醚或溴代醇活化，加入三羟甲基氨基甲烷作为配基，所制备的介质在亲水吸附反应中作为氢键供体。本合成方法制备的介质刚性强，配基密度高，选择性强，适宜分离多酚蛋白质、亲水性多肽和天然有机小分子。
Description
技术领域
本发明涉及一种色谱介质的合成方法，具体地是涉及一种三羟甲基氨基甲烷配基琼脂糖亲水色谱介质合成方法。
本发明属于生物工程的生化分离领域。
背景技术
生物药物生产过程中分离纯化的费用占成本的绝大部分，其中使用最普遍的是色谱技术及其组合，目前所用介质主要是凝胶过滤、离子交换、疏水相互作用、亲和、反相介质，其基质材料有琼脂糖、葡聚糖、聚苯乙烯和硅胶等。琼脂糖介质是在生物药物生产中使用最为广泛的基质材料。它是一种天然多糖，具有高孔度；具有高的连通性有效保证了分子内物质传递；大比表面积提供很高的吸附能力；易制备成不同琼脂糖浓度、不同尺寸的球形颗粒以满足不同领域的需求；低的非特异性吸附使应用面较广；在氢氧化钠中稳定可满足苛刻的在位清洗步骤；可通过交联使介质具有刚性；可被大量配基取代而应用于多种色谱技术。
琼脂糖介质已经在生物医药领域被使用了40余年，利用琼脂糖基质介质生产的生物药物种类繁多，例如：γ-干扰素、人生长激素、人血清白蛋白、胰岛素、促红细胞生成素、各种单克隆抗体和疫苗等。这些产品的开发和生产有助于保障公共卫生安全、提高人民生活质量。美国公司GE Healthcare Bio-Sciences(原Pharmacia，瑞典)的琼脂糖介质产品均获得美国食品药品监督管理局的认证，表明琼脂糖基质具有优异的安全性和可靠性。琼脂糖介质5.7亿美元约120万升的世界市场被该公司控制了60％，而我国生物制药所使用的琼脂糖介质98％以上依赖进口，每年约耗资5亿元人民币，随着生物药物需求的快速增长、新生物药物种类的增加，对琼脂糖基质介质的需求也将迅猛增长。目前国内有一些企业、研究院所及高校从事该介质的研究开发，但产品种类少、质量稳定性较差、市场占有率非常低，是我国生物技术产业发展急待解决的战略问题。
氢键吸附色谱属于亲水相互作用色谱的一种，是近年来在中药活性成分分离纯化研究过程中提出的概念，常用的氢键吸附色谱介质包括琼脂糖凝胶和聚酰胺，已成功应用于多种中药多酚类化合物的分离纯化，对强极性有机小分子化合物能够实现较好的保留，可分离获得高纯度的中药活性成分。
琼脂糖凝胶适于作为氢键色谱吸附剂。目前国内外市场上没有专用的琼脂糖基质氢键吸附色谱介质。
30μm平均粒径的琼脂糖凝胶微球因粒径小，刚性不足，为了能将其灌装工业色谱柱，需要通过交联提高刚性。国内外琼脂糖介质产品因其主要用于生物大分子蛋白质的分离纯化，大多介质粒径在60-120μm，采用一步或两步交联即可，本项目的纯化目标是分子量明显低于蛋白质的多肽，需要更高的分辨率，也就要求更小的微球粒径，一步或两步交联提供的刚性不能完全满足本项目的需要。
从检出文献看，国内已有多家单位采用琼脂糖为基质制备色谱柱填料，如：中科院过程所、北京化工大学、清华大学、中国药科大学、北京理工大学、上海医药工业研究院、北京大学、中科院生物物理所、南京医科大学、中科院大连化物所、北京北清创业科技开发有限公司、西安交大保赛生物技术股份有限公司、北京东凯元医药生物技术研究院等。但我国目前琼脂糖基质介质产品的种类少、市场占有率低，98％以上的国内市场被国外产品占据，研制具有自主知识产权的琼脂糖介质是急待解决的战略问题。
琼脂糖凝胶介质表面有大量可供反应的羟基，可以通过直接法、间接法引入高密度的配基，作为亲水吸附色谱的分离介质。三羟甲基氨基甲烷，分子量小，是亲水吸附色谱的良好供体偶联作为配基后介质可耐受碱性溶剂清洗。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶微球为基质，制备具有高刚性的、高选择性的、以三羟甲基氨基甲烷为配基的亲水吸附色谱分离材料的合成方法。用于多酚蛋白质、亲水性多肽和天然有机小分子的分离纯化。
本发明的目的是通过如下的技术方案实现的。
本发明提供的使用以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶为基质、以三羟甲基氨基甲烷为配基的亲水吸附介质的合成方法，包括如下步骤：
1)12％浓度、30μm平均粒径琼脂糖凝胶微球100ml，在砂芯漏斗上用水洗后替换成丙酮，转入反应瓶或反应器，加100ml丙酮；
2)加入10-30g缩水甘油醚，搅拌60-120min；
3)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌8-12h；
4)加丙酮搅拌1-2h；
5)用5倍体积的丙酮洗10-20min，用5倍体积的水洗10-20min；
6)加200ml水，加入5-15g硫酸钠，搅拌2-3h；
7)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1-2h；
8)加入10-30ml表氯醇，35-60℃搅拌3-5h；
9)用5倍体积的水洗；
10)加入200ml水，加5-15g硫酸钠，搅拌2-3h；
11)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1-2h；
12)加入30-60ml的1，4-二丁基缩水甘油醚，35-60℃搅拌10-15h；
13)用10倍体积的水洗；
14)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1-2h；
15)加入10-20ml烯丙基溴或环氧氯丙烷或1，4-双-丁烷二缩水甘油醚或季戊四醇三缩水甘油醚或季戊四醇缩水甘油醚或溴代醇，搅拌6-8h；
16)用盐酸调pH 4-6；
17)加入3-10g三羟甲基氨基甲烷，10-20ml的20氢氧化钠，搅拌12-20h；
18)用盐酸调pH 4-6；
19)用10倍体积水洗。
附图说明
图1为三羟甲基氨基甲烷结构式
图2为三羟甲基氨基甲烷配基的琼脂糖凝胶亲水吸附色谱介质纯化缩宫素的色谱图。
图3为三羟甲基氨基甲烷配基的琼脂糖凝胶亲水吸附色谱介质纯化虎杖水提取物的色谱图。
具体实施方式
实施例1、三羟甲基氨基甲烷配基的琼脂糖凝胶亲水吸附色谱介质合成方法1
1)12％浓度、30μm平均粒径琼脂糖凝胶微球100ml，在砂芯漏斗上用水洗后替换成丙酮，转入反应瓶或反应器，加100ml丙酮；
2)加入10g缩水甘油醚，搅拌60min；
3)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌8h；
4)加丙酮搅拌1h；
5)用5倍体积的丙酮洗10min，用5倍体积的水洗10min；
6)加200ml水，加入5g硫酸钠，搅拌2h；
7)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1h；
8)加入10ml表氯醇，35-60℃搅拌3h；
9)用5倍体积的水洗；
10)加入200ml水，加5g硫酸钠，搅拌2h；
11)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1h；
12)加入30ml的1，4-二丁基缩水甘油醚，35-60℃搅拌10h；
13)用10倍体积的水洗；
14)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1h；
15)加入10ml烯丙基溴搅拌6h；
16)用盐酸调pH 4；
17)加入3g三羟甲基氨基甲烷，10-20ml的20氢氧化钠，搅拌12h；
18)用盐酸调pH 6；
19)用10倍体积水洗。
实施例2、三羟甲基氨基甲烷配基的琼脂糖凝胶亲水吸附色谱介质合成方法2
1)12％浓度、30μm平均粒径琼脂糖凝胶微球100ml，在砂芯漏斗上用水洗后替换成丙酮，转入反应瓶或反应器，加100ml丙酮；
2)加入30g缩水甘油醚，搅拌120min；
3)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌12h；
4)加丙酮搅拌2h；
5)用5倍体积的丙酮洗20min，用5倍体积的水洗20min；
6)加200ml水，加入15g硫酸钠，搅拌3h；
7)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌2h；
8)加入10-30ml表氯醇，40℃搅拌5h；
9)用5倍体积的水洗；
10)加入200ml水，加15g硫酸钠，搅拌3h；
11)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌2h；
12)加入60ml的1，4-二丁基缩水甘油醚，35℃搅拌15h；
13)用10倍体积的水洗；
14)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌2h；
15)加入20m季戊四醇三缩水甘油醚搅拌8h；
16)用盐酸调pH 6；
17)加入10g三羟甲基氨基甲烷，20ml的20氢氧化钠，搅拌20h；
18)用盐酸调pH6；
19)用10倍体积水洗。
Claims (2)
1、一种以三羟甲基氨基甲烷为配基、以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶为基质的亲水吸附色谱介质的合成方法。
2、如权利要求1所述的以三羟甲基氨基甲烷为配基、以高浓度、高交联度琼脂糖凝胶为基质的亲水吸附色谱介质的合成方法，包括如下的步骤：
1)12％浓度、30μm平均粒径琼脂糖凝胶微球100ml，在砂芯漏斗上用水洗后替换成丙酮，转入反应瓶或反应器，加100ml丙酮；
2)加入10-30g缩水甘油醚，搅拌60-120min；
3)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌8-12h；
4)加丙酮搅拌1-2h；
5)用5倍体积的丙酮洗10-20min，用5倍体积的水洗10-20min；
6)加200ml水，加入5-15g硫酸钠，搅拌2-3h；
7)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1-2h；
8)加入10-30ml表氯醇，35-60℃搅拌3-5h；
9)用5倍体积的水洗；
10)加入200ml水，加5-15g硫酸钠，搅拌2-3h；
11)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1-2h；
12)加入30-60ml的1，4-二丁基缩水甘油醚，35-60℃搅拌10-15h；
13)用10倍体积的水洗；
14)加入3ml的20％氢氧化钠，搅拌1-2h；
15)加入10-20ml烯丙基溴或环氧氯丙烷或1，4-双-丁烷二缩水甘油醚或季戊四醇三缩水甘油醚或季戊四醇缩水甘油醚或溴代醇，搅拌6-8h；
16)用盐酸调pH 4-6；
17)加入3-10g三羟甲基氨基甲烷，10-20ml的20氢氧化钠，搅拌12-20h；
18)用盐酸调pH 4-6；
19)用10倍体积水洗。
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Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN103028383A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-04-10 | 浙江月旭材料科技有限公司 | 一种硅胶色谱填料及其制备方法 |
| CN103937013A (zh) * | 2014-01-13 | 2014-07-23 | 北京化工大学 | 一种琼脂凝胶微球及其制备方法 |
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103028383A (zh) * | 2012-12-31 | 2013-04-10 | 浙江月旭材料科技有限公司 | 一种硅胶色谱填料及其制备方法 |
| CN103028383B (zh) * | 2012-12-31 | 2014-12-10 | 浙江月旭材料科技有限公司 | 一种硅胶色谱填料及其制备方法 |
| CN103937013A (zh) * | 2014-01-13 | 2014-07-23 | 北京化工大学 | 一种琼脂凝胶微球及其制备方法 |
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Open date: 20091021 |