CN101618069A - 一种兼治瘀肿、出血和镇痛的胶囊制剂，其制备方法及用途 - Google Patents
一种兼治瘀肿、出血和镇痛的胶囊制剂，其制备方法及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种兼治瘀肿、出血和镇痛的胶囊制剂，其制备方法及用途。本发明所提供的胶囊制剂由1份独一味和0.1－50份三七制成，其中以独一味提取物为粘合剂，以三七提取物及药学上可接受的填充剂如淀粉为底料制粒。本发明还提供一种制备该胶囊制剂的方法及该胶囊制剂在制备用于治疗兼治瘀肿、出血和镇痛的药物中的应用。本发明同时还提供了由所述方法制备的独一味提取物以及三七提取物。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于兼治瘀肿、出血和镇痛的胶囊制剂、其制备方法及用途，属于医药技术领域。
背景技术
在目前的市场上，虽然已经有分别治疗软组织损伤与月经不调的中成药多种，但兼治瘀肿、出血，还能镇痛的药物品种很少。这些产品，又以粗提取物入药为主。本发明将二味外科要药集于一方，集化瘀、止血、止痛、消肿的功效于一体，能协同增效，且通过现代纯化工艺使得疗效更确切。可见本发明有其明显的特殊性、创新性、先进性和实用性，故有较好的市场空间，其极大的社会效益和经济效益是显而易见的。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供一种用于兼治瘀肿、出血和镇痛的胶囊制剂。本发明的另一个目的在于，提供所述的胶囊制剂在制备用于治疗兼治瘀肿、出血和镇痛的药物中的应用。本发明的又一个目的在于，提供一种制备所述的胶囊制剂的方法。本发明的再一个目的在于，提供一种由所述方法制备的独一味提取物。本发明的还一个目的在于，提供一种由所述方法制备的三七提取物。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一方面，本发明提供一种用于兼治瘀肿、出血和镇痛的胶囊制剂，所述胶囊制剂由以下质量配比的原料药材制成：
独一味 1份，
三七 0.1-50份；
其中，以独一味提取物为粘合剂，以三七提取物及药学上可接受的填充剂为底料制粒，优选地，所述填充剂为淀粉；并且：
在上述重量配比中，所述独一味和三七的重量均为以未经处理前药材计其所入药的重量。
优选地，在所述胶囊制剂中，两种原料的重量配比为，独一味1份，三七0.1-50份；
进一步优选为，独一味1份，三七0.1-10份；
最优选为，独一味1份，三七1份。
优选地，根据本发明所述的胶囊制剂，其中对所述独一味药材的处理包括以下步骤：
将独一味药材水煎液浓缩至相对密度0.9-1.2优选1.05(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量的大孔树脂柱上，所述大孔树脂优选为D101大孔树脂，加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用1-10倍优选5倍药材量体积的15-45％优选30％的乙醇洗脱，收集所述乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩，即得独一味提取物。
优选地，根据本发明所述的胶囊制剂，其中对所述三七药材的处理包括：
将三七醇提液回收乙醇，浓缩至相对密度为0.9-1.2优选为1.10(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量的树脂柱上，所述树脂优选为D141树脂加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用1-10倍优选5倍药材量体积的60-80％优选70％的乙醇洗脱，收集所述乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得三七提取物。
进一步优选地，根据本发明所述的胶囊制剂，其中对所述三七药材的处理还包括：
将三七水煎液浓缩至相对密度为0.9-1.2优选为1.02(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量D001树脂柱上，加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用药材量1-10倍优选5倍体积1-5％优选2％的氨水洗脱，收集所述氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，进一步得三七提取物。
优选地，所述的胶囊制剂包含一种或多种选自如下的药学上可接受的辅料：淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、葡萄糖、甘露醇、木糖醇和甘氨酸。
另一方面，本发明提供所述的胶囊制剂在制备用于治疗兼治瘀肿、出血和镇痛的药物中的应用。
再一方面，本发明提供一种制备所述的胶囊制剂的方法，所述胶囊制剂采用一步制粒法，所述一步制粒法的各项工艺参数如下：
进液速度：50～55ml/分钟；喷雾压力：0.3MPa；物料温度：60～55℃；进风温度：80～90℃；出风温度：40～45℃。
优选地，根据本发明所述的方法，所述一步制粒所得到的颗粒过20目筛整粒。
进一步优选地，根据本发明所述的方法，所述颗粒在温度25℃，相对湿度58％以下分装。
又一方面，本发明提供一种由以下方法制备的独一味提取物：
将独一味药材水煎液浓缩至相对密度0.9-1.2优选1.05(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量的大孔树脂柱上，所述大孔树脂优选为D101大孔树脂，加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用1-10倍优选5倍药材量体积的15-45％优选30％的乙醇洗脱，收集所述乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩，即得独一味提取物。
还一方面，本发明提供一种由以下方法1)和/或2)制备的三七提取物：
1).将三七醇提液回收乙醇，浓缩至相对密度为0.9-1.2优选为1.10(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量的树脂柱上，所述树脂优选为D141树脂加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用1-10倍优选5倍药材量体积的60-80％优选70％的乙醇洗脱，收集所述乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得三七提取物；
2).将三七水煎液浓缩至相对密度为0.9-1.2优选为1.02(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量D001树脂柱上，加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用药材量1-10倍优选5倍体积1-5％优选2％的氨水洗脱，收集所述氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，进一步得三七提取物。
根据本发明一个具体的实施方式，本发明提供一种兼治瘀肿、出血，还能镇痛的胶囊制剂，其处方为：
独一味1000g 三七1000g 淀粉适量
制成1000粒
根据本发明另一个具体的实施方式，本发明提供如前所述的胶囊制剂的制备方法如下：
取独一味药材1000g，粉碎，分别加8倍水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.05(60℃)，放冷，加于已处理好的5kgD101树脂柱上，加15L水洗脱，继用5L30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.10～1.15(60℃)，备用；
另取三七药材1000g，粉碎，加8倍量70％乙醇，回流提取3次，每次1小时，合并提取液，滤过，药渣备用，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.10(60℃)，放冷，加于已处理好的5kgD141树脂柱上，加15L水洗脱，继用5L70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得三七提取物I；
取三七醇提后的药渣，挥尽乙醇，加8倍水提取3次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.02(60℃)，放冷，加于已处理好的5kg的D001树脂柱上，加15L水洗脱，继用5L2％氨水洗脱，收集2％氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，得三七提取物II。
以独一味浓缩液作粘合剂，以三七提取物和淀粉作底料，一步制粒，整粒，装胶囊，包装，即得。
独一味不同提取溶剂提取所得提取物、不同洗脱部位所得提取物都能不同程度抑制小鼠腹腔注射醋酸所引起的扭体反应次数，减少小鼠断尾的出血时间，其中三种不同提取溶剂提取所得提取物的镇痛、止血作用无明显差异，从生产成本考虑，可以选择水作为提取溶剂；四种不同洗脱部位来看，30％乙醇洗脱部位所得提取物的镇痛和止血作用较水、60％乙醇、95％乙醇洗脱部位所得提取物的作用好，其中止血作用与阴性对照组比较P＜0.01，较其它各组样品P＜0.05，可优先选择30％乙醇洗脱部位。根据药效研究，独一味的工艺路线确定为：用水提取后，采用大孔吸附树脂洗脱纯化，收集30％乙醇洗脱部位。
本发明人设计的三七的提取分离工艺是针对具有活血化瘀作用的总皂苷以及具有止血活性的三七素等氨基酸类成分，因此三七的提取路线先用较高浓度的乙醇提取，药液回收乙醇，采用大孔吸附树脂纯化；醇提的药渣再用水提取，药液浓缩后，采用大孔阳离子交换树脂富集纯化。
独一味经研究确定大孔吸附树脂纯化工艺条件为：水煎液浓缩至相对密度1.05(60℃)，放冷，加于已处理好的5倍药材量D101树脂柱上，加15倍体积药材量水洗脱，继用药材量5倍体积30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩，即得。
三七醇提液回收乙醇，浓缩至相对密度1.10(60℃)，放冷，加于已处理好的5倍药材量D141树脂柱上，加药材量15倍体积的水洗脱，继用5倍药材量体积70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得三七提取物I。
三七水煎液浓缩至相对密度1.02(60℃)，放冷，加于已处理好的5倍药材量D001树脂柱上，加药材量15倍体积水洗脱，继用药材量5倍体积2％氨水洗脱，收集2％氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，得三七提取物II。
经预试采用湿法制粒，由于浸膏粉的粘度较大，加大辅料的用量，制粒仍困难。一步制粒具有辅料用量少、干燥时间短、干燥面积大、有效成分破坏少等特点，因此选择一步制粒。进液速度：50～55ml/分钟；喷雾压力：0.3MPa；物料温度：60～55℃；进风温度：80～90℃；出风温度：40～45℃。颗粒的临界相对湿度为58％，故本发明的药物在温度25℃，相对湿度58％以下分装，不会影响产品的质量。
独一味药材纯化后的平均浸出物收率为3.03％，三七药材纯化后的总浸出物收率为：6.83％+0.28％＝7.11％。本发明的药物每次服用药材量为：独一味2g，三七2g，推算可得浸膏：2×3.03％+2×7.11％＝0.20g，加入浸膏0.8倍的淀粉：0.20×0.8＝0.16g，每次服用量为：0.20+0.16＝0.36g，设计成每次服用2粒，则每粒装0.36÷2＝0.18g，本发明的药物的堆密度为0.490g/ml，选择2号空心胶囊填充。制成1000粒的处方为：
独一味1000g 三七1000g 淀粉80g
制成1000粒
再一方面，本发明提供一种药物制剂，所述药物制剂含有如前所述的胶囊制剂，所述药物制剂的剂型选自胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊剂、缓释片、分散片、口腔崩解片、注射液、输液和粉针。
具体地，与任何一种或一种以上药剂学上辅料如淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、葡萄糖、甘露醇、木糖醇、甘氨酸等混合制成的各种剂型。
例如，可制成胶囊剂、片剂、颗粒剂、滴丸、软胶囊剂、缓释片、分散片、口腔崩解片、注射液、输液、粉针等。
本发明在立题思想上遵从中医气血理论，结合现代医学研究，活血止痛、化瘀止血，既符合中医理论，又符合现代医学的临床治则。因此在立题思想及治疗原则上具有一定的创新。
独一味和三七虽都主要含大极性的成分，但最佳粗提工艺却不尽一样，独一味多报道为水提，三七多报道为乙醇提取。所以，本发明人决定分别对独一味和三七进行有效成分群的提取分离。
由于虽然有独一味的活性成分报道，但机理研究尚显不足，本发明人首先采用药效学试验筛选，确定其有效成分群，然后根据筛选结果制定其提取分离工艺。而三七的活血化瘀止血的有效成分非常明确，因此，本发明人设计的三七的提取分离工艺是针对具有活血化瘀作用的总皂苷以及具有止血活性的三七素等氨基酸类成分。经过工艺考察后，确定了工艺路线及相关参数。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1是制备本发明的胶囊制剂的工艺流程图；
图2是制备本发明所述的独一味提取物的工艺流程图；
图3是制备本发明所述的三七提取物的工艺流程图；
图4是本发明的胶囊制剂的平衡吸湿曲线图，其中，以相对湿度为横坐标，吸湿百分率为纵坐标。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
实施例1：本发明胶囊制剂的生产工艺及其研究
1.1处方
独一味1000g 三七1000g 淀粉适量
制成1000粒
1.2制法
取独一味药材1000g，粉碎，分别加8倍水煎煮3次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.05(60℃)，放冷，加于已处理好的5kgD101树脂柱上，加15L水洗脱，继用5L30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩至相对密度1.10～1.15(60℃)，备用；另取三七药材1000g，粉碎，加8倍量70％乙醇，回流提取3次，每次1小时，合并提取液，滤过，药渣备用，滤液回收乙醇，浓缩至相对密度1.10(60℃)，放冷，加于已处理好的5kgD141树脂柱上，加15L水洗脱，继用5L70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得三七提取物I；取三七醇提后的药渣，挥尽乙醇，加8倍水提取3次，每次1小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.02(60℃)，放冷，加于已处理好的5kg的D001树脂柱上，加15L水洗脱，继用5L2％氨水洗脱，收集2％氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，得三七提取物II。以独一味浓缩液作粘合剂，以三七提取物和淀粉作底料，一步制粒，整粒，装胶囊，包装，即得。
该方虽在临床使用上是用传统的汤剂，但独一味和三七所含化学成分复杂，混合水提未必是其最佳工艺，文献报道的最佳粗提工艺也不尽一样，独一味多报道为水提，三七多报道为乙醇提取。介于两味药都有较好的化学、药理研究基础，这为本发明人寻求一种更加有针对性的提取分离工艺提供了依据。为实现提高疗效，增强药品的质量可控性的目的，本发明人决定分别对独一味和三七进行有效成分群的提取分离进行研究。
在分离过程中，由于独一味和三七的粗提物成分复杂，为更好地保证疗效，增加药品的质量可控性，减少剂量，便于制剂，药材需要经过纯化处理，尽可能多的提取有效成分并尽量去除无效杂质成分。基于以上目的，本发明人在纯化分离工艺上选择了大孔吸附树脂。大孔吸附树脂于20世纪60年代开始应用，近年来，运用大孔吸附树脂对中草药有效成分进行分离、富集，取得了很大进展，具有良好的发展前景。该项技术是采用树脂从中药及其复方中有选择性地吸附其中的有效成分，去除无效部分的一种提取精制的新工艺。它的物理化学性质稳定，不受无机盐及强离子低分子化合物存在的影响，不溶于任何酸碱及有机溶剂，对有机物选择吸附性能好；使用寿命长，可反复再生使用。本发明人通过参考文献报道和试验研究，初步拟定的工艺路线为：药材经提取处理后通过大孔树脂吸附纯化，研究结果如下。
实施例2：独一味工艺路线的确定
2.1独一味不同提取溶剂筛选药效学试验
本发明人采用小鼠扭体法和断尾法，从镇痛和止血两个方面，对独一味不同提取溶剂提取所得提取物的主要药效进行了比较。
(1)材料
样品1-3：均为棕褐色浸膏，分别为独一味药材以水、50％乙醇、95％乙醇提取所得，每克含生药量分别为5.0g、7.14g、12.5g，临床人日用量：6g生药/天.人，由甘肃独一味生物制药股份有限公司提供，临用前用生理盐水配制成适当浓度备用。复方对乙酰氨基酚片：白色片剂，规格：0.3g/片，吉林省百康药业有限责任公司生产，批号：20070102，临用前用生理盐水配制成适当浓度，备用；云南白药：黄白色粉末，规格：4g/瓶，云南白药集团股份有限公司，批号：20070209，临用前用生理盐水配制成适当浓度，备用。
昆明种小鼠，体重19～24g，雌雄各半。由四川省实验动物专委会养殖场提供，动物级别：一级，许可证号：SCXK(川)2004-14。
(2)方法和结果
①对醋酸致小鼠疼痛作用的影响
方法：取昆明种小鼠50只，按体重性别随机分成5组，每组10只，雌雄各半。阴性对照组每鼠口服灌胃生理盐水10ml/kg体重，阳性对照组灌服复方对乙酰氨基酚0.23g/kg(按照处方中阿司匹林的含量计)体重，给药各组分别灌服样品1-3组2.0g(生药)/kg体重。每日给药1次，连续给药3天，末次给药后30分钟，各组小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/鼠，观察记录各鼠在腹腔注射醋酸后15分钟内扭体次数，进行组间比较其显著差异性。
结果：见表1。
表1对醋酸致小鼠疼痛反应的影响
与阴性对照组比较：P**＜0.01 给药组组间比较：P＞0.05
表1结果表明，样品1-3均以2.0g(生药)/kg给小鼠灌胃给药，每日一次，连续三天，均能抑制小鼠腹腔注射醋酸所引起的扭体反应次数，与阴性对照组比较，具有非常显著性的差异(P＜0.01)，各给药组组间比较无显著差异(P＞0.05)。
②对小鼠断尾出血时间的影响
方法：取昆明种小鼠50只，按体重性别随机分成5组，每组10只，雌雄各半。阴性对照组每鼠口服灌胃生理盐水10ml/kg体重，阳性对照组灌服云南白药1.2g(生药)/kg体重，给药各组分别灌服样品1-3组2.0g(生药)/kg体重。每日给药1次，连续给药3天，末次给药后1h，用利剪将小鼠尾尖3mm处剪断，放入37℃生理盐水中，让血液自行溢出时开始计时，直到出血自行停止为止，计算出血时间，进行组间比较其显著差异性。
结果见表2
表2对小鼠断尾出血时间的影响
与阴性对照组比较：P**＜0.01 给药组组间比较：P＞0.05
表2结果表明，样品1-3均以3.0g(生药)/kg给小鼠灌胃给药，每日一次，连续三天，均能减少小鼠断尾的出血时间，与阴性对照组比较，具有非常显著性的差异(P＜0.01)，各给药组组间比较无显著差异(P＞0.05)。
2.2独一味不同洗脱部位筛选药效学试验
本发明人采用小鼠扭体法和断尾法，从镇痛和止血两个方面，对独一味不同洗脱部位所得提取物的主要药效进行了比较。
(1)材料
药物：样品1-4：均为棕褐色浸膏，分别为独一味药材水提取处理后，水、30％乙醇、60％乙醇、95％乙醇洗脱部位所得的提取物，每克含生药量分别为5.88g、33.0g、29.24g、27.03g，临床人日用量：6g生药/天.人，由甘肃独一味生物制药股份有限公司提供，临用前用生理盐水配制成适当浓度备用。复方对乙酰氨基酚片：白色片剂，规格：0.3g/片，吉林省百康药业有限责任公司生产，批号：20070102，临用前用生理盐水配制成适当浓度，备用；云南白药：黄白色粉末，规格：4g/瓶，云南白药集团股份有限公司，批号：20070209，临用前用生理盐水配制成适当浓度，备用。
动物：昆明种小鼠，体重19～24g，雌雄各半。由四川省实验动物专委会养殖场提供，动物级别：一级，许可证号：SCXK(川)2004-14。
(2)方法和结果
①对醋酸致小鼠疼痛作用的影响
方法：取昆明种小鼠60只，按体重性别随机分成6组，每组10只，雌雄各半。阴性对照组每鼠口服灌胃生理盐水10ml/kg体重，阳性对照组灌服复方对乙酰氨基酚0.23g/kg(按照处方中阿司匹林的含量计)体重，给药各组分别灌服样品1-4组3.0g(生药)/kg体重。每日给药1次，连续给药3天，末次给药后30分钟，各组小鼠腹腔注射0.6％醋酸溶液0.2ml/鼠，观察记录各鼠在腹腔注射醋酸后15分钟内扭体次数，进行组间比较其显著差异性。
结果：见表3。
表3对醋酸致小鼠疼痛反应的影响
与阴性对照组比较：P＊＊＜0.01 给药组组间比较：P＞0.05
表3结果表明，样品1-4均以3.0g(生药)/kg给小鼠灌胃给药，每日一次，连续三天，均能抑制小鼠腹腔注射醋酸所引起的扭体反应次数，与阴性对照组比较，具有非常显著性的差异(P＜0.01)，各给药组组间比较，样品1、3、4的抑制率略低，分别为42.65％、49.75％、44.85％，但四组数据之间无显著差异(P＞0.05)。
②对小鼠断尾出血时间的影响
方法：取昆明种小鼠60只，按体重性别随机分成6组，每组10只，雌雄各半。阴性对照组每鼠口服灌胃生理盐水10ml/kg体重，阳性对照组灌服云南白药1.2g(生药)/kg体重，给药各组分别灌服样品1-4组3.0g(生药)/kg体重。每日给药1次，连续给药3天，末次给药后1h，用利剪将小鼠尾尖3mm处剪断，放入37℃生理盐水中，让血液自行溢出时开始计时，直到出血自行停止为止，计算出血时间，进行组间比较其显著差异性。
结果见表4
表4对小鼠断尾出血时间的影响
与阴性对照组比较：P＊＜0.05，P＊＊＜0.01 给药组组间比较：P#＜0.05
表4结果表明，样品1-4均以3.0g(生药)/kg给小鼠灌胃给药，每日一次，连续三天，均能不同程度减少小鼠断尾的出血时间，与阴性对照组比较，样品2具有非常显著性的差异(P＜0.01)，样品1、3、4具有显著性差异(P＜0.05)；各给药组组间比较，样品2较样品1、3、4具有显著性差异(P＜0.05)。
2.3独一味工艺路线的确定
综合以上试验结果，独一味不同提取溶剂提取所得提取物、不同洗脱部位所得提取物都能不同程度抑制小鼠腹腔注射醋酸所引起的扭体反应次数，减少小鼠断尾的出血时间，其中三种不同提取溶剂提取所得提取物的镇痛、止血作用无明显差异，从生产成本考虑，可以选择水作为提取溶剂；四种不同洗脱部位来看，30％乙醇洗脱部位所得提取物的镇痛和止血作用较水、60％乙醇、95％乙醇洗脱部位所得提取物的作用好，其中止血作用与阴性对照组比较P＜0.01，较其它各组样品P＜0.05，可优先选择30％乙醇洗脱部位。根据药效研究，独一味的工艺路线确定为：用水提取后，采用大孔吸附树脂洗脱纯化，收集30％乙醇洗脱部位。
实施例3：独一味工艺优选的试验方法、数据、结论
3.1工艺研究评价指标及测定方法
根据前述文献及药理筛选研究资料，确定以木犀草素、浸出物收率作为工艺研究评价指标。测定方法拟定如下：
(1)木犀草素照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-0.4％磷酸溶液(55∶45)为流动相；检测波长为350nm。理论板数按木犀草素峰计算应不低于1500。
对照品溶液的制备精密称定木犀草素对照品适量，加甲醇制成每1ml含10μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取提取液适量，置具塞锥形瓶中，水浴蒸干，精密加入2.5mol/L盐酸甲醇溶液25ml，密塞，称定重量，加热回流60分钟，放冷，再称定重量，用2.5mol/L盐酸甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液2.0ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
测定法：精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
(2)浸出物收率
精密量取提取液适量，置已干燥称定重量的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃烘箱中干燥3小时，取出，置干燥器中放置30分钟，称定重量，计算浸出物收率。
3.2仪器与试剂、试药
Agilent 1200液相色谱仪，可变波长检测器(VWD)，安捷伦化学工作站；Sartorius CP225D电子天平(感量0.1mg；0.01mg 载量220g；80g)。
木犀草素对照品(111520-200504，供含量测定用)，由中国药品生物制品检定所提供。
甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
3.3独一味提取工艺的研究
1、提取条件的优选
独一味采用水煎煮的方法提取，影响提取的主要因数有：加水量、提取时间、提取次数。
因素水平选择：采用正交表L9(34)安排试验，各因素水平选择如下：
表5因素水平表
试验方法：称取独一味药材100g，切碎，分别按正交表试验安排进行提取，合并提取液，过滤，滤液浓缩，即得。
评价指标：测定独一味提取液木犀草素含量和浸出物收率。
表6试验安排及结果
备注：(1)独一味药材木犀草素含量为0.20％，(2)综合评分由公式 计算而得，以木犀草素最高含量172.6mg为60分，浸出物收率最高值20.1％为40分。
表7方差分析表
F0.05(2，2)＝19.00**，F0.10(2，2)＝9.00*。
结果分析：从表6中R值可知，以综合评分为评价指标，各因素的影响大小为C＞B＞A，最佳提取工艺为A3B3C3。由于因素A和因素B对评价指标影响较小，将A、B因素取为第二水平，最终将提取工艺确定为A2B2C3，即取独一味药材，粉碎，加8倍量水煎煮3次，每次提取1小时，提取液过滤，即得。
2、验证试验
取独一味药材，粉碎，取100g，按照原研究筛选的提取条件，进行三次验证试验，结果见表8。
表8验证试验结果
*独一味药材木犀草素含量为0.162％
3、小结
确定提取条件为：取独一味药材，粉碎，加8倍量水煎煮3次，每次提取1小时，过滤，即得。
3.4分离、纯化工艺研究
大孔吸附树脂能选择性地吸附黄酮类、皂苷类、环烯醚萜类等成分。文献报道也采用大孔吸附树脂能较好的富集独一味中的这些成分，为提高药效，减少服用量，适宜于工业化大生产，故拟定采用大孔吸附树脂进一步纯化处理。
1、大孔吸附树脂选型
选择常用于有机物分离的四种大孔吸附树脂D101、D141、D1330、AB-8各100g，经预处理后分别装入四根内径、长度相同的层析柱(2.5×40cm)，将经前处理后的独一味药液50ml(每1ml含原生药0.4g)以1BV/h的速度通过各树脂柱，用水300ml洗涤，再用100ml 30％的乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，分别测定木犀草素含量和浸出物收率，结果见表9。
表9不同型号大孔树脂的比较结果
从上表可知，D101树脂吸附和解吸能力明显优于其余三种，D101树脂已用于多种药物的分离和精制，其安全性已得到了公认，本工艺研究选择D101树脂。
2、上柱参数的确定
药液的浓度、PH值、吸附柱的径高比以及上样的流速等因素不同程度的影响着树脂的吸附性能，实验中本发明人对这四个因素各取三个水平，选择L9(34)正交表安排试验，以木犀草素的含量和浸出物收率为评价指标，筛选最佳的吸附参数。
表10正交试验因素水平表
(2)试验方法取经预处理后的D101大孔吸附树脂100g，9份，分别按照正交表的试验要求装入层析柱中，将经前处理后的独一味药液50ml(每1ml含原生药0.4g)，分别按照正交表的要求处理后，以相应的流速通过树脂柱，用水300ml洗涤，再用100ml30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，分别进行测定，结果见表11。
表11提取正交试验设计及结果
备注：(1)独一味药材木犀草素含量为0.162％，(2)综合评分由公式 计算而得，以木犀草素最高含量15.37mg为60分，浸出物收率最高值2.99％为40分。
(3)结果分析
直观分析可见，各因素中吸附柱径高比是主要因素，且C＞A＞B＞D，因素D对吸附影响不大，故把因素D作为误差，对试验结果以综合评分进行方差分析，结果见表12。
表12综合评分方差分析
F0.01(2，2)＝99.0*** F0.05(2，2)＝19.0** F0.1(2，2)＝9.0*
由表可见，吸附柱径高比对吸附效果有显著的影响，上样流速、药液PH和药液浓度影响不明显，结合生产实际情况分析，选择的最佳条件为：A2B2C2D3，即：吸附柱的径高比为1∶6，上样流速为1BV/h，药液浓度为每1ml相当于生药材0.4g，经测定相对密度为1.05(60℃)。
(4)验证试验
分别按上述方案进行三次重复验证试验，结果见表13。
表13验证试验
由验证结果可以看出，选定的工艺条件稳定可行。
3、D101大孔树脂吸附容量的测定
精密量取提取处理后的药液(每1ml相当于0.4g药材)30ml、40ml、50ml、60ml、70ml，通过预处理好的100gD101大孔吸附树脂层析柱上，用水300ml洗脱，收集水洗脱液，浓缩定容至100ml，分别进行含量测定，结果见表14。
表14D101大孔吸附树脂吸附容量测定结果
由上表可见，1g D101大孔吸附树脂可吸附约0.20-0.24g药材中的木犀草素，即1kg药材制成的水溶液通过4.2-5.0kgD101大孔吸附树脂，为适应工业化生产，保证吸附效果，选择用5倍药材量D101大孔吸附树脂进行分离。
4、水洗脱除杂工艺的考察
独一味提取的水溶液50ml(含药材20g)，通过装有100g预处理好的D101大孔吸附树脂柱，用水洗脱，依次收集洗脱液100ml，共5份，分别测定木犀草素的含量和浸出物收率，结果见表15。
表15水洗除杂工艺条件考察结果
上表可知，经收集原生药量15倍体积(300ml)的水洗脱液后，杂质已被洗脱完全。
5、有效成分解析工艺的考察
经水洗脱除杂后的D101柱，须用适当的洗脱剂将有效成分洗脱下来。根据有效成分的性质与工业生产实际选用不同浓度的乙醇作洗脱溶剂，试验对乙醇浓度及用量进行了考察。
(1)乙醇浓度的选择
取独一味提取的水溶液50ml(含药材20g)，5份，分别通过5根装有100g预处理好的D101大孔吸附树脂柱，用300ml水洗脱，然后分别用不同浓度(10％、30％、50％、70％、90％)的乙醇洗脱，每一浓度收集100ml，分别测定木犀草素含量和浸出物收率，结果见表16。
表16乙醇浓度对有效成分解吸效果的影响
由上可以看出，经30％乙醇洗脱后，木犀草素已基本洗脱完全，结合生产成本考虑，试验选择用30％乙醇作为洗脱溶剂。
(2)30％乙醇用量的考察
将独一味提取的水溶液100ml(含药材40g)，通过装有200g预处理好的D101大孔吸附树脂柱，用600ml水洗脱，再用30％乙醇洗脱，分别收集30％乙醇洗脱液，每份50ml，共收集6份，分别测定木犀草素含量和浸出物收率，结果见表17。
表1730％乙醇用量考察结果
由上表可见，30％乙醇用量在200ml(相当于药材量的5倍体积)时，洗脱率在90％以上。本次工艺研究，选用30％乙醇作溶剂，用量为药材量的5倍体积。
6、验证试验
将独一味提取的水溶液50ml(含药材20g)，通过装有100g预处理好的D101大孔吸附树脂柱，用300ml水洗脱，再用100ml30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液并定容至100ml，测定木犀草素含量及浸出物收率，结果见表18。
表18大孔树脂纯化工艺验证试验
经验证，平均木犀草素的量为：15.33mg，平均浸出物收率：3.03％，工艺稳定可行。
7、浓缩干燥
减压回收乙醇，浓缩，温度：65～70℃，真空度：0.07～0.08Mpa，即得。
8、小结
经研究确定大孔吸附树脂纯化工艺条件为：水煎液浓缩至相对密度1.05(60℃)，放冷，加于已处理好的5倍药材量D101树脂柱上，加15倍体积药材量水洗脱，继用药材量5倍体积30％乙醇洗脱，收集30％乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩，即得。
实施例4：三七工艺优选的试验方法、数据、结论
4.1醇提工艺研究评价指标及测定方法
根据前述文献及药理筛选研究资料，确定以人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1总量和浸出物收率作为工艺研究评价指标，测定方法如下：
(1)总皂苷照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以水为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按三七皂苷R1峰计算应不低于4000。
对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Rb1对照品和三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1ml含人参皂苷Rg10.4mg，人参皂苷Rb10.4mg、三七皂苷R10.1mg的混合溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取提取液适量，置具塞锥形瓶中，水浴蒸干，放冷，精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流30分钟，取出，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得
测定法：精密吸取供试品溶液与对照品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
(2)浸出物收率
精密量取提取液适量，置已干燥称定重量的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃烘箱中干燥3小时，取出，置干燥器中放置30分钟，称定重量，计算浸出物收率。
4.2仪器与试剂、试药
Agilent 1100液相色谱仪，可变波长检测器(VWD)，安捷伦化学工作站；Sartorius CP225D电子天平(感量0.1mg；0.01mg 载量220g；80g)。
三七皂苷R1对照品(110745-200516，供含量测定用)，由中国药品生物制品检定所提供。
人参皂苷Rg1对照品(110703-200424，供含量测定用)，由中国药品生物制品检定所提供。
人参皂苷Rb1对照品(110704-200420，供含量测定用)，由中国药品生物制品检定所提供。
乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂为分析纯。
4.3三七提取工艺的研究
1、提取条件的优选
三七采用醇提的方法提取，影响提取的主要因数有：乙醇浓度、溶剂用量、提取时间、提取次数。
(1)因素与水平试验对该四因素各取三个水平，进行L9(34)正交试验，以三七总皂苷的含量和浸出物收率为评价指标，筛选最佳提取条件。
表19正交试验因素水平表
(2)试验方法取三七100g，共9份，按L9(34)正交试验表头安排实验，加入相应浓度的乙醇提取，合并提取液，滤过，回收乙醇，滤液浓缩定容至1000ml，摇匀，按前述方法测定三七总皂苷的含量(折算成三七药材含量)、浸出物收率。
表20提取正交试验设计及结果
备注：(1)三七药材中三七总皂苷含量7.565％，(2)综合评分由公式 计算而得，以三七总皂苷最高含量77.92mg/g为60分，浸出物收率最高值30.62％为40分。
(3)结果分析
直观分析可见，各因素中提取次数是主要因素，且C＞B＞A＞D，因素D对提取效率影响不大，故把因素D作为误差，对试验结果以综合评分进行方差分析，结果见表21。
表21综合评分方差分析
F0.01(2，2)＝99.0*** F0.05(2，2)＝19.0** F0.1(2，2)＝9.0*
由表可见，提取次数和乙醇浓度对提取效果有显著的影响，提取时间和溶剂用量影响不明显，结合生产实际情况分析，选择的最佳提取条件为：A2B3C3D2，即：加入8倍量70％乙醇，回流提取3次，每次1小时。
(4)验证试验
称取三七100g，分别按上述方案进行三次重复验证试验，结果见表22。
表22验证比较试验
由表可见，选定的工艺条件稳定可行。
2、小结
经提取工艺研究，确定提取条件为：加8倍量70％乙醇，回流提取3次，每次1小时。
4.4分离、纯化工艺研究
大孔吸附树脂能选择性地吸附黄酮类、皂苷类、环烯醚萜类等成分。文献报道也采用大孔吸附树脂能较好的富集三七中的皂苷类成分，为提高药效，减少服用量，适宜于工业化大生产。故拟定采用大孔吸附树脂进一步纯化处理。
1、大孔吸附树脂选型
选择常用于有机物分离的四种大孔吸附树脂D101、D141、D1330、AB-8各100g，经预处理后分别装入四根内径、长度相同的层析柱(2.5×40cm)，将经前处理后的三七药液50ml(每1ml含原生药0.4g)缓缓通过各树脂柱，用水300ml洗涤，再用100ml70％的乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，分别测定三七总皂苷的含量和浸出物收率，结果见表23。
表23不同型号大孔树脂的比较结果
从上表可知，D141树脂吸附和解吸能力明显优于其余三种，D141树脂已用于多种药物的分离和精制，其安全性已得到了公认，本工艺研究选择D141树脂。
2、上柱参数的确定
药液的浓度、PH值、吸附柱的径高比以及上样的流速等因素不同程度的影响着树脂的吸附性能，实验中本发明人对这四个因素各取三个水平，选择L9(34)正交表安排试验，以三七总皂苷的含量和浸出物收率为评价指标，筛选最佳的吸附参数。
表24正交试验因素水平表
(2)试验方法取经预处理后的D141大孔吸附树脂100g，9份，分别按照正交表的试验要求装入层析柱中，将经前处理后的三七药液50ml(每1ml含原生药0.4g)，分别按照正交表的要求处理后，以相应的流速通过树脂柱，用水300ml洗涤，再用100ml70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，分别进行测定，结果见表25。
表25提取正交试验设计及结果
备注：(1)三七药材中三七总皂苷含量7.565％，(2)综合评分由公式 计算而得，以三七总皂苷最高含量1020.6mg为60分，浸出物收率最高值6.71％为40分。
(3)结果分析
直观分析可见，各因素中吸附柱径高比是主要因素，且A＞B＞C＞D，因素D对吸附影响不大，故把因素D作为误差，对试验结果以综合评分进行方差分析，结果见表26。
表26综合评分方差分析
F0.01(2，2)＝99.0*** F0.05(2，2)＝19.0** F0.1(2，2)＝9.0*
由表可见，吸附柱径高比对吸附效果有显著的影响，上样流速和药液的浓度影响不明显，药液PH的影响极小，结合生产实际情况分析，选择的最佳提取条件为：A2B1C1D2，即：吸附柱的径高比为1∶6，上样流速为1BV/h，药液浓度为每1ml相当于生药材0.4g，经测定相对密度为1.10(60℃)。
(4)验证试验
分别按上述方案进行三次重复验证试验，结果见表27。
表27验证试验
由验证结果可以看出，选定的工艺条件稳定可行。
3、D141大孔树脂吸附容量的测定
精密量取提取处理后的药液(每1ml相当于0.4g药材)30ml、40ml、50ml、60ml、70ml，通过预处理好的100gD141大孔吸附树脂层析柱上，用水300ml洗脱，收集洗脱液，浓缩定容至100ml，分别进行含量测定，结果见表28。
表28D141大孔吸附树脂吸附容量测定结果
由上表可见，1g D141大孔吸附树脂可吸附约0.20-0.24g药材中的三七总皂苷，即1kg药材制成的水溶液通过4.2-5.0kgD141大孔吸附树脂，可达到吸附平衡，为适应工业化生产，选择用5倍药材量D141大孔吸附树脂进行分离。
4、水洗脱除杂工艺的考察
三七提取液50ml(含药材20g)，通过装有100g预处理好的D141大孔吸附树脂柱，用水洗脱，依次收集洗脱液100ml，共5份，分别测定三七总皂苷和浸出物收率，结果见表29。
表29水洗除杂工艺条件考察结果
上表可知，经收集原生药量15倍体积(300ml)的水洗脱液后，未被吸附成分和杂质已被除尽。
5、有效成分解析工艺的考察
经水洗脱除杂后的D141柱，须用适当的洗脱剂将有效成分洗脱下来。根据有效成分的性质与工业生产实际选用不同浓度的乙醇作洗脱溶剂，试验对乙醇浓度及用量进行了考察。
(1)乙醇浓度的选择
取三七提取液50ml(含药材20g)，5份，分别通过5根装有100g预处理好的D141大孔吸附树脂柱，用300ml水洗脱，然后分别用不同浓度(10％、30％、50％、70％、90％)的乙醇洗脱，每一浓度收集100ml，分别测定三七总皂苷和浸出物收率，结果见表30。
表30乙醇浓度对有效成分解吸效果的影响
由上试验可见，70％乙醇已洗脱完全，试验选择用70％乙醇作为洗脱溶剂。
(2)70％乙醇用量的考察
将三七提取液100ml(含药材40g)，通过装有200g预处理好的D141大孔吸附树脂柱，用600ml水洗脱，再用70％乙醇洗脱，分别收集70％乙醇洗脱液，每份50ml，共收集6份，分别测定三七总皂苷和浸出物收率，结果见表31。
表3170％乙醇用量考察结果
由上表可见，70％乙醇用量在200ml(相当于药材量的5倍)时，洗脱率在90％以上。本次工艺研究，选用70％乙醇作溶剂，用量为药材量的5倍体积。
6、验证试验
将三七提取液50ml(含药材20g)，通过装有100g预处理好的D141大孔吸附树脂柱，用300ml水洗脱，再用100ml70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液并定容至100ml，测定含量及浸出物收率，结果见表32。
表32大孔树脂纯化工艺验证试验
由上表可见，三七总皂苷量的平均值为：1063.8mg，浸出物收率平均为：6.83％，工艺稳定可行。
7、浓缩干燥
减压回收乙醇，浓缩，温度：65～70℃，真空度：0.07～0.08Mpa，即得。
8、小结
经研究确定大孔吸附树脂纯化工艺条件为：三七醇提液回收乙醇，浓缩至相对密度1.10(60℃)，放冷，加于已处理好的5倍药材量D141树脂柱上，加药材量15倍体积的水洗脱，继用5倍药材量体积70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，得三七提取物I。
4.5水提工艺研究评价指标及测定方法
根据前述文献研究资料，确定以总氨基酸含量和浸出物收率作为工艺研究评价指标，测定方法如下：
(1)总氨基酸照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)测定。
对照品溶液的制备精密称取精氨酸对照品适量，加水制成每1ml含0.1mg的溶液，即得。
标准曲线的制备分别精密吸取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml于50ml容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀，吸取上述标准系列溶液各1.0ml，置10ml具塞试管中，加入乙酸-乙酸钠缓冲液(pH为5.5)2ml，充分摇匀后，加2ml3％茚三酮乙二醇溶液，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放入冷水中冷却至室温，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法(中国药典2005年版一部附录VA)，在570nm波长处测定吸光度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备精密吸取供试品溶液适量置于50ml容量瓶中，加入2ml乙酸锌溶液和2ml亚铁氰化钾溶液，摇匀，定容至刻度，静置沉淀后，过滤，即得。
测定法精密量取供试品溶液1.0ml，置10ml具塞试管中，照标准曲线制备项下的方法，自“加入乙酸-乙酸钠缓冲液(pH为5.5)2ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中精氨酸的重量，计算，即得。
(2)浸出物收率
精密量取提取液适量，置已干燥称定重量的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃烘箱中干燥3小时，取出，置干燥器中放置30分钟，称定重量，计算浸出物收率。
4.6试剂、试药
精氨酸对照品(140685-200401，供含量测定用)，由中国药品生物制品检定所提供。
其余试剂为分析纯。
4.7三七水提取工艺的研究
1、提取条件的优选
三七采用水提的方法提取，影响提取的主要因数有：浸泡时间、溶剂用量、提取时间、提取次数。
(1)因素与水平试验对该四因素各取三个水平，进行L9(34)正交试验，以总氨基酸含量和浸出物收率为评价指标，筛选最佳提取条件。
表33正交试验因素水平表
(2)试验方法取三七100g，共9份，分别加8倍量70％乙醇，回流提取3次，每次1小时，合并提取液，滤过，滤液另器贮存备用，药渣，挥尽乙醇，按L9(34)正交试验表头安排实验，加入相应量的水提取，合并提取液，滤过，滤液浓缩定容至2000ml，摇匀，按前述方法测定总氨基酸含量和浸出物收率。
表34提取正交试验设计及结果
综合评分由公式 计算而得，以总氨基酸最高含量189.28mg为60分，浸出物收率最高值6.21％为40分。
(3)结果分析
直观分析可见，各因素中提取次数是主要因素，且C＞D＞A＞B，B因素对提取效率影响不大，故把因素B作为误差，对试验结果以综合评分进行方差分析，结果见下表35。
表35综合评分方差分析
F0.01(2，2)＝99.0*** F0.05(2，2)＝19.0** F0.1(2，2)＝9.0*
由表可见，因素C(提取次数)对试验的结果有显著影响，因素A(提取时间)、因素D(溶剂用量)没有显著影响，结合生产成本分析，选择的提取条件为：A2C3D2，即：加8倍水提取3次，每次1小时。
(4)验证试验
称取三七100g，3份，分别按上述方案进行三次重复验证试验，结果见表36。
表36验证试验
由表32可见，选定的工艺条件稳定可行。
2、小结
经提取工艺研究，确定提取条件为：取三七醇提后的药渣，挥尽乙醇，加8倍水提取3次，每次1小时。
4.5分离、纯化工艺研究
经文献报道，三七水提部位的主要成分为氨基酸类化合物，选用离子交换树脂富集三七氨基酸较好。
1、大孔吸附树脂选型
选择常用的四种阳离子交换树脂7320、D001、D113、DK110各100g，经预处理后分别装入四根内径、长度相同的层析柱(2.5×40cm)，将经前处理后的三七药液25ml(每1ml含原生药0.8g)缓缓通过各树脂柱，以300ml水洗脱，再用100ml2％氨水洗脱，收集2％氨水洗脱液，测定总氨基酸含量和浸出物收率，结果见表37。
表37不同型号树脂的比较结果
从上表可知，D001树脂浸出物收率和总氨基酸洗脱率明显优于其余三种，本工艺研究选择D001树脂。
2、上柱参数的确定
药液的浓度、PH值、吸附柱的径高比以及上样的流速等因素不同程度的影响着树脂的吸附性能，实验中本发明人对这四个因素各取三个水平，选择L9(34)正交表安排试验，以总氨基酸和浸出物收率为评价指标，筛选最佳的吸附参数。
表38正交试验因素水平表
(2)试验方法取经预处理后的D001大孔吸附树脂100g，9份，分别按照正交表的试验要求装入的层析柱中，将经前处理后的三七药液25ml(每1ml含原生药0.8g)，分别按照正交表的要求处理后，以相应的流速通过树脂柱，以300ml水洗脱，再用100ml2％氨水洗脱，收集2％氨水洗脱液，测定总氨基酸和浸出物收率，结果见表39。
表39提取正交试验设计及结果
综合评分由公式 计算而得，以总氨基酸最高含量31.83mg为60分，浸出物收率最高值0.26％为40分。
(3)结果分析
直观分析可见，各因素中吸附柱径高比是主要因素，且C＞A＞D＞B，因素B对吸附影响不大，故把因素B作为误差，对试验结果以综合评分进行方差分析，结果见表40。
表40综合评分方差分析
F0.01(2，2)＝99.0*** F0.05(2，2)＝19.0** F0.1(2，2)＝9.0*
由表可见，吸附柱径高比和上样流速对吸附效果有显著的影响，药液的浓度影响不明显，药液PH的影响极小，结合生产实际情况分析，选择的最佳纯化条件为：A2B3C1D2，即：吸附柱的径高比为1∶8，上样流速为1BV/h，药液浓度为每1ml相当于生药材0.8g，经测定相对密度为1.02(60℃)。
(4)验证试验
分别按上述方案进行三次重复验证试验，结果见表41。
表41验证试验
由验证结果可以看出，选定的工艺条件稳定可行。
3、D001大孔树脂吸附容量的测定
精密量取提取处理后的药液(每1ml相当于0.8g药材)15ml、20ml、25ml、30ml、35ml，分别通过预处理好的100gD001树脂层析柱上，以300ml水洗脱，浓缩定容至100ml，测定总氨基酸量，结果见表42。
表42D001树脂吸附容量测定结果
由上表可见，1gD001大孔吸附树脂吸附约0.20-0.24g药材时，总氨基酸的损失小，即1kg药材制成的水溶液通过4.2-5.0kgD001大孔吸附树脂，可达到吸附平衡，为适应工业化生产，选择用5倍药材量D001大孔吸附树脂进行分离。
4、水洗脱除杂工艺的考察
三七提取的水溶液25ml(含药材20g)，通过装有100g预处理好的D001树脂柱，用水洗脱，依次收集洗脱液100ml，共5份，分别测定浸出物收率和总氨基酸含量，结果见表43。
表43水洗除杂工艺条件考察结果
上表39可知，经收集原生药量15倍(300ml)的水洗脱液后，未被吸附的成分和杂质已洗脱完全，选择药材量15倍体积的水来除杂。
5、有效成分解析工艺的考察
经水洗脱除杂后的D001柱，须用适当的洗脱剂将有效成分洗脱下来。离子交换树脂使用的洗脱剂的离子强度须强于被交换物质，根据三七中所含氨基酸种类，考虑到后期的氨水易于除去，因此选用不同浓度的氨水，试验对氨水浓度及用量进行了考察。
(1)氨水浓度的选择
取三七提取的水溶液25ml(含药材20g)，4份，分别通过4根装有100g预处理好的D001大孔吸附树脂柱，用300ml水洗脱，然后分别用不同浓度(1％、2％、4％、8％)的氨水洗脱，每一浓度收集100ml，分别测定浸出物收率和总氨基酸含量，结果见表44。
表44氨水浓度对解吸效果的影响
由试验结果可以看出，氨水的浓度在2％及以上的洗脱能力一致，试验选择用2％氨水作为洗脱溶剂。
(2)2％氨水用量的考察
将三七提取的水溶液50ml(含药材40g)，通过装有200g预处理好的D001大孔吸附树脂柱，用600ml水洗脱，再用2％氨水洗脱，分别收集2％氨水洗脱液，每份50ml，共收集6份，分别测定浸出物收率和总氨基酸含量，结果见表45。
表452％氨水用量考察结果
由上表可见，2％氨水用量在200ml(相当于药材量的5倍体积)时，洗脱率在90％以上。选用2％氨水的用量为药材量的5倍体积。
6、验证试验
将三七提取的水溶液25ml(含药材20g)，通过装有100g预处理好的D001大孔吸附树脂柱，用300ml水洗脱，再用100ml2％氨水洗脱，收集2％氨水洗脱液并定容至100ml，测定浸出物收率和总氨基酸含量，结果见表46。
表46工艺验证试验
经验证，平均浸出物收率：0.28％，平均总氨基酸量为：30.39mg，工艺稳定可行。
7、浓缩干燥
浓缩除氨，真空干燥，温度：65～70℃，真空度：0.07～0.08Mpa，即得。
8、小结
经研究确定大孔吸附树脂纯化工艺条件为：三七水煎液浓缩至相对密度1.02(60℃)，放冷，加于已处理好的5倍药材量D001树脂柱上，加药材量15倍体积水洗脱，继用药材量5倍体积2％氨水洗脱，收集2％氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，得三七提取物II。
实施例5制粒工艺研究
经预试采用湿法制粒，由于浸膏粉的粘度较大，加大辅料的用量，制粒仍困难。一步制粒具有辅料用量少、干燥时间短、干燥面积大、有效成分破坏少等特点，因此选择一步制粒。
影响一步制粒的因素较多，有浸膏液的相对密度、喷雾速率、雾化压力、进风温度、出风温度等。本发明人以独一味提取纯化后的药液作粘合剂，以三七提取纯化的干膏粉和淀粉作底料，进行一步制粒工艺的研究。
1.浸膏液相对密度的确定
浓缩液为粘合剂进行一步制粒时，其相对密度对制粒的效果有很大影响，为此需对不同的浓缩液相对密度进行筛选，结果见表49。
表49浓缩液相对密度对制粒的影响
由表可见：浓缩液相对密度在1.10～1.15(60℃)制粒情况良好，试验选用浓缩液相对密度为1.10～1.15(60℃)。
2.一步制粒主要技术参数的确定
在确定浓缩液相对密度、辅料种类及用量的条件下，对一步制粒的关键技术参数进行了筛选。结果见表50。
表50一步制粒主要技术参数考察
由表可知一步制粒的主要技术参数为：进液速度：50～55ml/分钟；喷雾压力：0.3MPa；物料温度：60～55℃；进风温度：80～90℃；出风温度：40～45℃。
3.整粒
一步制粒所得颗粒过20目筛整粒。
12.4.4颗粒物理状态研究
1.性状
为棕色至棕褐色的颗粒；味苦。
2.堆密度
取合格颗粒适量，精密称定，置于25ml量筒中，测定颗粒体积，计算堆密度，测定结果见表51。
表51颗粒堆密度测定
本发明的药物堆密度为：0.490g/ml。
3.休止角
采用固定漏斗法测定颗粒的流动性，计算休止角，测定结果见表52。
表52颗粒流动性测定
由表可见：本发明的药物休止角为34.7°，颗粒的流动性良好，不需加入助流剂。
4.临界相对湿度
为考察原料分装时是否受环境的影响，尤其是相对湿度的影响，采用颗粒进行平衡吸湿性试验，即吸湿平衡曲线测定。取颗粒各约2g，共七份，置称量瓶中，精密称定，将称量瓶盖打开，分别放入相对湿度为22.45％、33.00％、42.76％、57.70％、75.28％、84.26％和92.48％的环境中，于25℃恒温培养箱内放置72小时，取出称量瓶，加盖后精密称定，计算吸湿百分率，以相对湿度为横坐标，吸湿百分率为纵坐标，绘制吸湿平衡曲线见图4，试验结果见表53。
表53填充颗粒的吸湿百分率(％)
试验结果表明：颗粒的临界相对湿度为58％，故本发明的药物在温度25℃，相对湿度58％以下分装，不会影响产品的质量。
处方及服用量的确定
由试验研究结果可知：独一味药材纯化后的平均浸出物收率为3.03％，三七药材醇提后纯化的平均浸出物收率为6.83％，三七醇提后药渣水提纯化的平均浸出物收率为0.28％，即三七药材纯化后的总浸出物收率为：6.83％+0.28％＝7.11％。本发明的药物每次服用药材量为：独一味2g，三七2g，推算可得浸膏：2×3.03％+2×7.11％＝0.20g，加入浸膏0.8倍的淀粉：0.20×0.8＝0.16g，每次服用量为：0.20+0.16＝0.36g，设计成每次服用2粒，则每粒装0.36÷2＝0.18g，本发明的药物的堆密度为0.490g/ml，选择2号空心胶囊填充。制成1000粒的处方为：
独一味1000g 三七1000g 淀粉80g
制成1000粒
实施例6：不同方法制备的独一味三七组合物的促凝、止血效果对比实验
1实验材料
(1)药物：
组合物1：由独一味提取物和三七提取物按临床用生药量1∶1混合，混合后为临床人日用量：12g生药/天.人。其中独一味提取物的提取方法是：将独一味药材，净选，切成1-2cm小段；加水煎煮三次，第一次加20倍的水，浸泡0.5小时，煎煮1小时，第二次、第三次各加15倍量水，分别煎煮1小时，合并煎煮液，浓缩至相对密度1-2；加乙醇，使溶液中乙醇含量达到60％，静置，滤过；加乙醇，使溶液中乙醇含量达到60％-70％，静置，滤过；加乙醇，使溶液中乙醇含量达到70％-80％，静置，滤过；回收乙醇；将溶液过树脂后加水冷藏12-50小时；将溶液微孔滤膜过滤后，调节PH后至4.8-6；浓缩，干燥，得独一味提取物。三七提取物的提取方法为：将三七药材淋洗、切片、干燥后，加15-70％乙醇回流提取1-2次，每次1-3小时，提取液回收乙醇后，浓缩，加水沉淀，过滤；取上清液过树脂后加水冷藏12-50小时；将溶液微孔滤膜过滤后，调节PH后至4.8-6；浓缩，干燥，得三七总皂苷粉。
组合物2：由独一味提取物和三七提取物按临床用生药量1∶1混合，混合后为临床人日用量：12g生药/天.人。独一味提取物和三七提取物的制备方法均为实施例1-4中的提取方法。即成人每日每公斤体重用量为0.2g生药(以60kg体重计算)。小鼠高、低剂量组的给药剂量分别为人用量的20、5倍；即实际给药量为4.0g生药/kg、1.0g生药/kg。
各受试药物按剂量设计表(见表54)用蒸馏水配成水溶液。组合物1、2均为深褐色的液体，各不同剂量组由于浓度不一而颜色深浅不同。以上各组药物4℃冷藏，灌胃给药前温水浴预热30分钟左右，充分摇匀后给药。
表54小鼠药效实验剂量设计表
云南白药：购自云南白药集团股份有限公司，规格：4g/瓶，批准文号：国药准字Z53020798，批号：20070919。
(2)实验器材：PC396电子秒表，深圳市惠波工贸公司；毛细管，华西医科大学仪器厂。
(3)动物：昆明种小鼠，SPF级，18～22g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供；小鼠合格证号为：SCXK(川)2004-16。
(4)统计方法：用统计软件SPSS13.0处理数据，结果均采用均数±标准差表示(x±s)，组间差异比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)，方差齐者组间比较用LSD检验，方差不齐者用Tamhane′s T2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2方法和结果
2.1对小鼠凝血时间的影响
取昆明种小鼠，18-22g，雌雄各半，随机分为空白对照组、阳性对照组、组合物1高、低剂量组、组合物2高、低剂量组，每组10只。各受试药物组小鼠均按表1设计的剂量以20ml/kg的给药容量灌胃给药，空白对照组给予等容积蒸馏水，阳性对照组灌胃予云南白药(330mg/kg)，连续5天，于末次给药1h后，各组小鼠用内径为1mm的毛细玻管插入小鼠内毗球后静脉丛取血，自血液流入管内开始计时，流满后取出毛细管平放桌面上，每隔30s左右折断两端毛细玻管一小截(约0.5cm)，缓慢左右拉开，检查断处有无血凝丝出现。记录从毛细玻管采血到出现血凝丝的时间，此即为凝血时间。实验结果见表55。
表55对小鼠凝血时间的影响(x±s)
与空白对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；药物相同剂量组间比较：P＞0.05
表55结果显示：与空白对照组相比，组合物1高剂量，组合物2高、低剂量能明显缩短小鼠的凝血时间(P＜0.05～0.01)；组合物1低剂量未表现出显著差异(P＞0.05)。
2.2对小鼠出血时间的影响
取昆明种小鼠，18-22g，雌雄各半，随机分为空白对照组、阳性对照组、组合物1高、低剂量组、组合物2高、低剂量组，每组10只。各受试药物组小鼠均按表1设计的剂量以20ml/kg的给药容量灌胃给药，空白对照组给予等容积蒸馏水，阳性对照组灌胃予云南白药(330mg/kg)，连续5天，于末次给药1h后，将小鼠固定露鼠尾，用剪刀距尾尖全尾长的7mm处快速剪断，待血液自行溢出开始计时，每隔30s左右用滤纸吸去血滴一次，直至血流自然停止(滤纸吸时无血)为止，即为出血时间。实验结果见表56。
表56对小鼠断尾出血时间的影响(x±s)
与空白对照组相比：*P＜0.05，**P＜0.01；药物相同剂量组间比较：P＞0.05
表56结果显示：与空白对照组相比，组合物2高、低剂量均能明显缩短小鼠断尾后的出血时间(P＜0.05～0.01)，组合物1高、低剂量则无显著差异(P＞0.05)。
3小结
独一味提取物和三七提取物(总皂苷+三七素)组成的组合物2在4.0g生药/kg、1.0g生药/kg剂量下均有明显的促凝、止血作用(P＜0.05～0.01)，独一味提取物和三七总皂苷组成的组合物1仅在4.0g生药/kg剂量下有促凝作用(P＜0.05)，在1.0g生药/kg剂量促凝、止血作用均不明显(P＞0.05)。
Claims (10)
1.一种用于兼治瘀肿、出血和镇痛的胶囊制剂，其特征在于，所述胶囊制剂由以下质量配比的原料药材制成：
独一味 1份，
三七 0.1-50份；
其中，以独一味提取物为粘合剂，以三七提取物及药学上可接受的填充剂为底料制粒，优选地，所述填充剂为淀粉；并且
在上述重量配比中，所述独一味和三七的重量均为以未经处理前药材计其所入药的重量；
优选地，在所述胶囊制剂中，两种原料的重量配比为，独一味1份，三七0.1-50份；进一步优选为，独一味1份，三七0.1-10份；最优选为，独一味1份，三七1份。
2.根据权利要求1所述的胶囊制剂，其特征在于，对所述独一味药材的处理包括以下步骤：
将独一味药材水煎液浓缩至相对密度0.9-1.2优选1.05(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量的大孔树脂柱上，所述大孔树脂优选为D101大孔树脂；加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用1-10倍优选5倍药材量体积的15-45％优选30％的乙醇洗脱，收集所述乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩，即得独一味提取物。
3.根据权利要求1或2所述的胶囊制剂，其特征在于，对所述三七药材的处理包括：
将三七醇提液回收乙醇，浓缩至相对密度为0.9-1.2优选为1.10(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量的树脂柱上，所述树脂优选为D141树脂；加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用1-10倍优选5倍药材量体积的60-80％优选70％的乙醇洗脱，收集所述乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得三七提取物。
4.根据权利要求3所述的胶囊制剂，其特征在于，对所述三七药材的处理还包括：
将三七水煎液浓缩至相对密度为0.9-1.2优选为1.02(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量树脂柱上，所述树脂优选为D001树脂柱；加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用药材量1-10倍优选5倍体积1-5％优选2％的氨水洗脱，收集所述氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，进一步得三七提取物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的胶囊制剂，其特征在于，所述的胶囊制剂包含一种或多种选自如下的药学上可接受的辅料：淀粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、羟丙甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚维酮、羧甲基淀粉钠、聚乙二醇、硬脂酸镁、微粉硅胶、葡萄糖、甘露醇、木糖醇和甘氨酸。
6.权利要求1-5中任一项所述的胶囊制剂在制备用于治疗兼治瘀肿、出血和镇痛的药物中的应用。
7.一种制备权利要求1-5中任一项所述的胶囊制剂的方法，其特征在于，所述胶囊制剂采用一步制粒法，所述一步制粒法的各项工艺参数如下：
进液速度：50～55ml/分钟；喷雾压力：0.3MPa；物料温度：60～55℃；进风温度：80～90℃；出风温度：40～45℃；
优选地，所述一步制粒所得到的颗粒过20目筛整粒；
进一步优选地，所述颗粒在温度25℃，相对湿度58％以下分装。
8.一种由以下方法制备的独一味提取物：
将独一味药材水煎液浓缩至相对密度0.9-1.2优选1.05(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量的大孔树脂柱上，所述大孔树脂优选为D101大孔树脂；加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用1-10倍优选5倍药材量体积的15-45％优选30％的乙醇洗脱，收集所述乙醇洗脱液，回收乙醇并浓缩，即得独一味提取物。
9.一种由以下方法1)和/或2)制备的三七提取物：
1).将三七醇提液回收乙醇，浓缩至相对密度为0.9-1.2优选为1.10(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量的树脂柱上，所述树脂优选为D141树脂；加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用1-10倍优选5倍药材量体积的60-80％优选70％的乙醇洗脱，收集所述乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩成稠膏，干燥，粉碎，即得三七提取物；
2).将三七水煎液浓缩至相对密度为0.9-1.2优选为1.02(60℃)，放冷，加于已处理好的1-10倍优选5倍药材量树脂柱上，所述树脂优选为D001树脂；加10-20倍药材量体积优选15倍药材量体积的水洗脱，继用药材量1-10倍优选5倍体积1-5％优选2％的氨水洗脱，收集所述氨水洗脱液，浓缩除氨，干燥，粉碎，进一步得三七提取物。
10.一种用于兼治瘀肿、出血和镇痛的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求8所述的独一味提取物和如权利要求9所述的三七提取物。
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