CN101422601A - 人中期因子Midkine的制备及新用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，揭示了中期因子重组蛋白的纯化方法，并公开了中期因子的新用途，即用于制备增加血小板的组合物。本发明首先构建了中期因子基因的重组表达载体，将经验证无误的重组载体转入微生物表达菌株，进行诱导表达，其后将该微生物表达菌株超声波裂解得到包涵体蛋白，对包涵体蛋白进行变性复性后再经强阳离子交换层析，获得了中期因子重组蛋白。通过本发明方法的原核表达和纯化系统可以得到纯度很高、内毒素含量低、具有良好的生物学活性的中期因子重组蛋白，且该重组蛋白得率高。本发明方法简单，成本较低，发现的新用途在防治血小板减少相关疾病中具有重要的临床应用价值。

Description

人中期因子Midkine的制备及新用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及人中期因子的制备及其新用途。

背景技术

中期因子(Midkine，简称MK)是一种肝素结合性生长分化因子。它在很多生物过程中均有参与，如神经细胞的存活和分化、肿瘤发生及组织重建。Midkine在胚胎期广泛分布，在妊娠中期表达量最高，随着胚胎的发育和成熟，其表达量逐渐降低。Midkine在正常的成体组织中表达量极低且非常局限，仅在肾脏、胃和小肠中有少量表达。此外，在肿瘤和一些再生组织中Midkine的表达量会明显升高。

MK的受体是一个分子复合体，既包括跨膜蛋白，又包括跨膜蛋白多糖。迄今为止，已经确定的MK受体有受体型蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPζ)、变性淋巴瘤激酶(ALK)以及低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)。此外，一个跨膜的肝素硫酸盐蛋白多糖家族即多配体蛋白聚糖(Syndecans)也作为MK的受体，参与MK相关的信号途径。近来还有报道发现整合蛋白(Integrins)以及神经多糖C(Neuroglycan C)也是MK受体中的新成员。

MK具有较广泛的生理学作用，尤其在促进神经元的生长、发育、分化与成熟，维持神经元的存活及促进神经损伤后的修复与再生方面发挥着重要的作用。近年研究发现，除具有神经营养作用外，MK还表现有一系列与肿瘤的发生和发展密切相关的生物学功能，它在多种肿瘤组织，包括一些癌前病变肿瘤组织中高度表达，并与肿瘤分化程度相关，因此引起人们极大关注。除此之外，MK还与炎症反应密切相关，它可以促进炎性白细胞的迁移。而且，MK还具有抗细胞凋亡的作用，并且在软骨生成以及肝脏再生等再生过程中均有MK的参与。

目前已有的文献报道来看，尽管已经有利用原核系统表达纯化重组人MK蛋白的相关报道。但他们的纯化过程都是用的肝素亲和层析，且对纯化出来的蛋白的纯度和产量都没有很好的描述，质量不高，活性欠佳。而且，以往因为MK在正常成体内几乎不表达，故MK基因一般都是从胎儿肾脏中扩增获得，扩增模板的获得也较为困难。

综上，由于MK具有良好的应用价值，因此迫切的需要一种简便易行且成本低廉的方法，来获得大量的MK重组蛋白；并且，还需要对其进行进一步的功能研究。

发明内容

本发明的目的在于提供中期因子(Midkine)蛋白或其编码基因的新用途。

本发明的目的还在于提供一种制备和纯化中期因子蛋白的方法。

在本发明的第一方面，提供中期因子(Midkine)蛋白或其编码基因的用途，用于制备增加血小板的组合物。

在另一优选例中，所述的组合物用于防治血小板减少相关疾病。

在另一优选例中，所述的血小板减少相关疾病选自：多发性瘀斑、粘膜出血、术后大出血。

在另一优选例中，所述的中期因子是人中期因子。

在本发明的第二方面，提供一种制备和纯化中期因子蛋白的方法，所述方法包括：

(1)利用含有重组表达载体的重组大肠杆菌表达中期因子，获得中期因子表达产物；

其中，所述的重组表达载体中含有中期因子表达盒，所述的中期因子表达盒中含有中期因子编码基因；

(2)利用强阳离子交换层析从步骤(1)获得的表达产物中分离出中期因子蛋白。

在另一优选例中，所述的表达盒含有与启动子操作性相连的中期因子基因。

在另一优选例中，步骤(1)中，所述的获得中期因子表达产物步骤包括：

(a)培养所述的重组大肠杆菌使之表达中期因子，裂解菌体，收集含中期因子包涵体蛋白的裂解产物；

(b)将步骤(a)获得的含中期因子包涵体蛋白的裂解产物进行蛋白变性和复性处理，从而获得可溶性的中期因子表达产物。

在另一优选例中，采用超声破菌和溶菌酶处理双重方法来裂解菌体。

在另一优选例中，所述的蛋白变性采用盐酸胍作为变性剂。

在另一优选例中，所述的盐酸胍的浓度是6±2M；更优选的是6±1M。

在另一优选例中，所述的强阳离子交换层析采用：强阳离子交换凝胶SPSepharose FF作为层析介质。

在另一优选例中，所述的中期因子蛋白纯度大于99％。

在另一优选例中，所述的中期因子蛋白得率大于9mg/400ml菌液。

在另一优选例中，所述的中期因子蛋白中内毒素含量低于0.2EU/ug。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了重组表达载体pET30a(+)-hMK的部分结构的图谱。

图2显示了用强阳离子交换柱纯化人MK重组蛋白过程的洗脱曲线。

图3显示了SDS-PAGE分析峰2蛋白检测到和目的蛋白大小吻合的单一条带。

图4显示了Western blot检测峰2蛋白的抗原性。其中，泳道1：用抗人MK抗体杂交；泳道2：无抗人MK抗体杂交的对照。

图5a显示了采用SDS-PAGE方法分析纯化得到的人MK重组蛋白，上样量为5μg。

图5b显示了采用银染法检测纯化得到的人MK重组蛋白的纯度，上样量为100ng。

图6显示了人MK重组蛋白对体外培养的NIH3T3细胞增殖率的影响。

图7显示了人MK重组蛋白对正常小鼠血小板水平的影响。其中，图7a为连续注射人MK重组蛋白后小鼠体内血小板水平的变化趋势，分别按3个不同的剂量给药：5μg/kg/天、50μg/kg/天、500μg/kg/天。*p<0.05，**p<0.01是以PBS组为对照用学生检验t检验统计得到的。图7b为分别连续注射人MK重组蛋白1天、2天、3天、4天、5天后小鼠体内血小板水平的变化，给药剂量为500μg/kg/天。*p<0.05，**p<0.01是以未给药的正常组为对照用学生检验t检验得到的。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，首次发现中期因子具有极其显著的增加血小板的功能，该发现对于血小板减少相关疾病的治疗及药物研发具有非常重要的意义。并且，本发明人经过反复试验，开发了一种原核表达和纯化中期因子的方法，该方法不仅产量高、可保留良好的蛋白生物活性、获得的蛋白纯度高且内毒素含量低，而且操作简单，成本低廉。在此基础上完成了本发明。

中期因子

在本发明中，所用的中期因子可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自动物。此外，所述的中期因子也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组中期因子。优选的，本发明可采用重组生产的中期因子。

任何适合的中期因子均可用于本发明。所述的中期因子包括全长的中期因子或其生物活性片段。优选的，所述的中期因子是人中期因子。更优选的，所述的中期因子的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：1所示的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的中期因子的氨基酸序列也包括在本发明中。中期因子或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/CummingsPub.Co.P224。

任何一种中期因子的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，中期因子的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的中期因子的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长中期因子的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长中期因子的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的中期因子，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的中期因子。所述经过修饰或改良的中期因子或者基因可以是与天然存在的中期因子或基因虽然具有一定的不同点，但也能增加血小板的数量，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响中期因子的生物活性或者说是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。

作为本发明的一个实例，所述的中期因子是重组表达的，所述的中期因子蛋白由121个氨基酸组成，该蛋白如SEQ ID NO：1所示。所述的中期因子分子量约为13KDa，富含碱性氨基酸，有10个半胱氨酸构成5对二硫键，这种结构特征增强了其蛋白结构的稳定性。

中期因子的用途

本发明提供了中期因子蛋白或其编码基因的用途，用于制备增加血小板的组合物，从而可用于防治血小板减少相关疾病。所述的血小板减少相关疾病选自(但不限于)：多发性瘀斑、粘膜出血、术后大出血。

血小板数量减少(血小板减少症)或功能减退(血小板功能不全)会导致止血栓形成不良和出血。血小板减少症可能源于血小板产生不足，脾脏对血小板的阻留，血小板破坏或利用增加以及被稀释。无论何种原因所致的严重血小板减少，都可引起典型的出血：多发性瘀斑，最常见于小腿；或在受轻微外伤的部位出现小的散在性瘀斑；粘膜出血(鼻出血，胃肠道和泌尿生殖道和阴道出血)；和手术后大量出血。胃肠道大量出血和中枢神经系统内出血可危及生命。因此，本发明提供了可以使血小板数量增加的蛋白，这对于血小板减少相关疾病的治疗具有十分重要的价值。

中期因子的制备

所述的中期因子可通过常规的基因工程方法生产，一般来说有以下步骤：(1).用含有中期因子编码基因的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化中期因子蛋白。

作为本发明的优选方式，本发明将人MK重组蛋白成熟肽基因克隆到原核表达载体并进行表达，并通过一步离子交换柱得到纯度高、内毒素含量低、具有生物学活性的蛋白。所述方法包括：

(1)利用含有重组表达载体的重组大肠杆菌表达中期因子，获得中期因子表达产物；其中，所述的重组表达载体中含有中期因子表达盒，所述的中期因子表达盒中含有中期因子编码基因；

(2)利用强阳离子交换层析从步骤(1)获得的表达产物中分离出中期因子蛋白。

作为本发明的优选方式，由于重组大肠杆菌表达的中期因子大多以包涵体形式存在于菌体中，因此，本发明人还对大肠杆菌进行裂解处理，收集包涵体蛋白，然后进行变性、复性处理，从而获得可溶性的中期因子表达产物。

作为本发明的优选方式，采用超声破菌和溶菌酶处理双重方法来裂解菌体。所述方法的结合可在对蛋白损伤尽可能小的情况下，彻底地裂解菌体，破菌效果优异。所述的超声破菌方法可采用本领域人员常用的方法和参数。所述的溶菌酶可提取自鸡蛋清，或通过商购等方式获得，比如可购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

作为本发明的优选方式，在进行蛋白变性时，采用盐酸胍作为变性剂。因包涵体的溶解必须用很强的变性剂，通过离子间的相互作用破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。本发明人在试验中发现，尿素的增溶效果较差，去污剂如SDS(十二烷基硫酸钠)可以破坏蛋白内的疏水键，虽然可以增溶几乎所有的蛋白，但由于无法彻底去除。因此，本发明人采用了盐酸胍作为变性剂，包涵体蛋白在盐酸胍变性剂作用下，为可溶性伸展态，在变性剂去除或浓度降低时，就会自发的从变性的热不稳状态向热力学稳定状态转变，形成具有生物活性的天然结构；优选的，所述的盐酸胍在变性(缓冲)液中的终浓度是6±2M；更优选的是6±1M。作为本发明的优选方式，采用了稀释复性的方法进行蛋白复性。

作为本发明的优选方式，所述的强阳离子交换层析采用：强阳离子交换凝胶(SP Sepharose^TMFF)作为介质。更优选的，使用HiPrep^TM柱，柱体积20ml，通过蛋白质纯化层析系统(FPLC)进行快速、高效的蛋白质分离和纯化，并自动收集分离样品。本发明人在研究中发现，采用强阳离子交换层析法纯化所述的蛋白，只需一步法进行即可，方便便捷，而且成本低廉，纯化效果好，有利于大规模生产；而采用如亲和层析的方法不仅成本高昂，而且单次纯化的纯度不高，需要进行多次纯化。

本发明的方法克服了现有技术中的不足，生产步骤简单，蛋白的得率高，用尽可能低的成本获得纯度很高且具有生物学活性的重组MK蛋白。此外，不同于以往的报道，本发明人第一次从化疗后处于抑制期的白血病患者骨髓中扩增出了人MK基因。

在本发明的优选实施例中，本发明人首先构建了人MK基因(获自化疗后处于抑制期的白血病患者骨髓)的重组表达载体，然后将重组表达载体转化大肠杆菌DH5α菌株，进行测序，测序验证无误后，将该重组载体转入微生物表达菌株，并进行诱导表达，其后将该微生物表达菌株超声波裂解得到包涵体蛋白，对包涵体蛋白进行变性复性后再经强阳离子交换层析，获得纯度为99％以上的蛋白，且该重组蛋白的得率为9.3mg/400ml菌液，Western blot检测验证了纯化得到的蛋白就是重组人MK蛋白。通过NIH3T3细胞增殖实验验证得知，纯化出来的蛋白具有良好的生物学活性。进一步的动物实验则发现注射重组人MK蛋白能促进小鼠体内血小板的增多。研究内容的具体步骤包括：

(1)以化疗后抑制期的人骨髓细胞cDNA为模板，根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站中提供的人中期因子MK基因序列设计引物，去掉信号肽(第1-20氨基酸)，克隆成熟肽序列363bp，引物序列为：

引物1：5’-GGAATTCCATATGAAAAAGAAAGATAAG-3’(SEQ ID NO：2)；

引物2：5’-CCCAAGCTTAGTCCTTTCCCTTCC-3’(SEQ ID NO：3)。

在引物1和引物2上设置合适的酶切位点、终止密码子，进行聚合酶链式反应扩增，再同步用相应的酶对聚合酶链式反应产物和质粒pET30a(+)进行双酶切，回收酶切产物并将人MK定向插入pET30a(+)构建重组表达载体，即重组质粒pET30a(+)-hMK；

(2)将该重组表达载体转化大肠杆菌DH5 α菌株，而后测序，将序列正确的重组质粒转入大肠杆菌Bl21(DE3)表达菌株，用1mM浓度的IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)进行诱导表达，得到菌液，将菌液离心后获得菌体沉淀；

(3)将菌体进行超声和溶菌酶双重裂解，获得包涵体蛋白，表达产物存在于包涵体沉淀中，重组蛋白在宿主系统中高水平表达时，会形成包涵体，包涵体的形成也是有利的，不仅可获得高表达、高纯度的重组蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白质的破坏，由于包涵体是蛋白质聚集而成的致密颗粒，分离的第一步是对培养收集的细胞进行破碎，采用超声波破碎结合溶菌酶处理，然后离心，可使大部分包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离；

(4)将步骤(3)所得包涵体蛋白进行变性、复性以得到变性-复性后蛋白溶液，变性采用6M盐酸胍作为变性剂，复性采用稀释复性的方法；

(5)将步骤(4)所得变性-复性后蛋白溶液经过强阳离子交换层析纯化，获得纯度为99％以上的蛋白，Western blot结果表明纯化得到的就是人MK重组蛋白；

所述的纯化，具体步骤包括：①用双蒸水洗整个管路及柱子，直至电导、UV值平衡，流速3ml/min；②用pH8.0柱平衡液洗整个管路及柱子，直至电导、UV值平衡，流速3ml/min；③上样：约0.5ml/min；④上样结束后，用上述柱平衡液再冲洗并平衡柱子，直至电导、UV值平衡，流速0.5～1ml/min；⑤用1M NaCl进行浓度梯度洗脱，直至电导、UV值平衡，流速1ml/min，收集人MK重组蛋白。

对前面纯化获得的人MK重组蛋白进行测序，结果其氨基酸序列(SEQ ID NO：1)为：

KKKDKVKKGGPGSECAEWAWGPCTPSSKDCGVGFREGTCGAQTQRIRCRVPCNWKKEFGAD

CKYKFENWGACDGGTGTKVRQGTLKKARYNAQCQETIRVTKPCTPKTKAKAKAKKGKGKD

在本发明的优选实施例中，对利用本发明的方法获得的人MK重组蛋白生物学性质进行鉴定，结果表明：(1)人MK重组蛋白具有体外促进NIH3T3细胞增殖活性；(2)人MK重组蛋白内毒素含量小于0.2EU/μg；(3)人MK重组蛋白具有促进小鼠血小板增加的作用。

本发明的主要优点在于：

(1)首次揭示中期因子具有极其显著的增加血小板的功能，该发现对于血小板减少相关疾病的治疗及药物研发具有非常重要的意义。

(2)首次揭示一种原核表达和纯化中期因子的方法，该方法不仅得率高、纯度高，而且操作简单，成本低廉。通过本发明的方法可以得到纯度大于99％，蛋白定量结果为每400ml菌液可得到大于9mg的人MK重组蛋白。

(3)尽管大肠杆菌是一种常用的表达系统，但由于用大肠杆菌生产的蛋白质活性不高、且易产生内毒素和包涵体而一直限制着其在药学方面的应用。本发明的方法克服了现有技术的缺陷，经验证获得的蛋白保留了良好的生物活性、且其中内毒素含量非常低。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1 人MK基因的克隆及重组质粒的构建

根据NCBI(美国国立生物技术信息中心)网站提供的人MK基因序列(GB：NM_001012334)设计引物，去掉信号肽序列(第1-20氨基酸)相应的编码基因，仅克隆成熟肽的编码基因363bp，引物序列为：

引物1：5’-GGAATTCCATATGAAAAAGAAAGATAAG-3’(SEQ ID NO：2)；

引物2：5’-CCCAAGCTTAGTCCTTTCCCTTCC-3’(SEQ ID NO：3)。

以常规方法制备的化疗后抑制期的人骨髓cDNA为模板，用上述引物进行聚合酶链式反应扩增，取50ng/μl人的骨髓cDNA为模板2μl，10μM上述引物各1.5μl，2mM浓度的dNTP 4μl，25mM的MgSO₄ 2μl，5U/μl KOD高保真酶1μl，10×KOD缓冲液5μl，用双蒸水补足到总体系50μl。扩增程序为：95℃预变性5分钟；94℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸30秒，共30个循环。

反应产物经琼脂糖凝胶电泳分离得到380bp左右的条带，与理论大小相符。用胶回收试剂盒(博大泰克公司，MK006-1A型)回收目的条带。

将质粒pET30a(+)和前述回收的目的产物(人MK片段)分别经Nde I和HindIII双酶切，质粒pET30a(+)的酶切体系如下：总体系20μl，其中双蒸水9μl，质粒5μl，10×Tango 4μl，10U/μl Nde I 1μl，10U/μl HindIII 1μl。人MK片段的酶切体系为：总体系50μl，其中双蒸水3μl，聚合酶链式反应回收产物35μl，10×Tango缓冲液10μl，10U/μl Nde I 1μl，10U/μl HindIII 1μl。将酶切体系于37℃过夜。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离，割胶回收目的条带。将酶切回收产物按照以下连接体系：10×T4 DNA连接酶缓冲液2μl，4U/μl T4 DNA连接酶1μl，pET30a质粒4μl，人MK片段13μl。16℃条件下反应4个小时，建立重组表达载体pET30a(+)-hM，该表达载体的主要结构见图1。

连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑选阳性克隆，经质粒提取、酶切分析后测序，测序结果与理论序列相符。

实施例2 人MK蛋白的诱导表达和纯化

1.表达

将前述经测序验证插入了正确的MK基因序列的质粒转化大肠杆菌表达菌株Bl21(DE3)。挑取阳性克隆于50ml LB培养基(含100mg/L卡那霉素)中37℃振荡培养12小时，转接20ml到400ml新的LB培养基(含100mg/L卡那霉素)中，培养至OD600为0.6-0.8时加入500mM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，42℃摇床培养3-5小时，得到菌液，将菌液在8000rpm下离心15min，收集菌体。

2.纯化

将前述收集的菌体按下面的步骤进行纯化：

(1)将菌体用磷酸缓冲液充分悬浮，之后将菌液合并至1个50mL灭菌离心管内，5000rpm×10min离心，再收集菌体，菌体称重；

(2)将步骤(1)得到的菌体用预冷超声缓冲液(1mM乙二胺四乙酸，5mM二硫苏糖醇，0.1mM苯甲基磺酰氟，1×磷酸缓冲液)重悬，超声缓冲液的用量为20ml超声缓冲液/g菌体，然后进行超声破菌，破菌条件为：用超声波破碎仪(soniprep150，SANYO公司)超声破菌，超声400W，超声30S，停30S为一个循环，超声30-35个循环，至菌液清亮；

(3)将菌液于4℃，在15000rpm下离心20min，将超声并离心后的上清取样50μl用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，收集超声并离心后的沉淀，待用；

(4)用15ml预冷1×磷酸缓冲液重悬步骤(3)所得沉淀，将重悬液取样50μl用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，加150μl溶菌酶(10mg/ml)，置于冰上20min，搅拌混合，然后37℃温育10min，期间需不断搅拌以使溶菌酶充分作用；

(5)将上述溶菌酶作用后的重悬液于4℃在10000rpm下离心15min，离心后去上清，将沉淀沥干；

(6)将上述沥干后的沉淀称重，然后按每克沉淀对应18ml包涵体洗涤缓冲液(0.5％Triton X-100，10mM乙二胺四乙酸，0.1mM苯甲基磺酰氟)的用量充分悬浮，离心，去上清，重复以上步骤两次，保留沉淀；

(7)将步骤(6)所得沉淀称重，用1×磷酸缓冲液重悬，然后在10000rpm下离心5min，去上清，保留沉淀，再次称重，把沉淀在漩涡振荡器上震散，然后按每克沉淀加9ml的变性缓冲液(6M盐酸胍，20mM Na₂HPO₄，1mM乙二胺四乙酸，50mM NaCl，0.1mM苯甲基磺酰氟)的用量，于室温下置于摇床上缓慢振摇，重悬1小时，得到重悬液；

(8)将步骤(7)所得重悬液，于4℃在10000rpm下离心15min，离心后，把上清转移至一洁净的50ml离心管中，并取上清50μl用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，离心所得沉淀备用；

(9)将步骤(8)所得沉淀用1ml双蒸水充分悬浮，然后取50μL悬浮液用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测；

(10)用流动泵将步骤(8)所得的上清缓慢滴加到10倍于变性缓冲液体积的pH7.4的复性液(20mM Na2HPO4，1mM乙二胺四乙酸，50mM NaCl)内，流速2ml/min，同时进行搅拌，并持续检测溶液，使之维持pH为7.4；

(11)按照1:1的比例，用流动泵加pH8.0的稀释液(20mM Na₂HPO₄，1mM乙二胺四乙酸)使复性后的溶液稀释，流速2mL/min，调节溶液的pH值至8.0，将此变性-复性后蛋白溶液取样50μl用作变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

(12)将步骤(11)所得变性-复性后蛋白溶液于18000rpm离心30min，离心后，收集上清液，装入50ml灭菌离心管内待上柱。

复性后蛋白溶液过强离子交换柱纯化：

纯化采用强阳离子交换凝胶(SP Sepharose^TMFF)作为介质，购买自Amersham公司，使用HiPrep^TM柱，柱体积20ml，通过蛋白质纯化层析系统(FPLC)进行快速、高效的蛋白质分离和纯化，并自动收集分离样品。

将上述变性-复性后蛋白溶液离心所得的上清液经过FPLC蛋白纯化仪(GE公司)按以下步骤纯化：①双蒸水洗整个管路及柱子，流速为3ml/min，直至电导、UV值平衡；②取洗脱缓冲液(pH8.0)洗整个管路及柱子，流速为3ml/min，直至电导、UV值平衡；③上样：关闭B泵，从A泵上样，上样量50ml，流速0.5ml/min；④上样结束后以洗脱缓冲液再冲洗并平衡柱子，直至电导、UV值平衡(0.5-1ml/min)；⑤用1M NaCl进行梯度洗脱蛋白，流速1ml/min，出峰时开始收集蛋白，3ml收为一管。

由图2可见，整个洗脱过程中出现了两个峰，第一个峰(峰1)出现在电导率为30mS/cm(图中虚线表示电导率曲线，峰对应到相应的坐标即可确定电导率)时，第二个峰(峰2)则出现在60mS/cm时。

由图3可见，SDS-PAGE分析显示，峰2蛋白检测到和目的蛋白大小吻合的单一目的条带。

3.Western blot检测前述强离子交换柱纯化的蛋白的抗原性

电泳

(1)SDS-PAGE胶的配制：参考分子克隆实验指南进行配制。

(2)样品处理：在收集的蛋白样品中加入2×的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

(3)上样及电泳：冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，每孔上样量为100ng蛋白。

转膜(用转移槽转印蛋白质)

(1)制备抗原样品，并用电泳分离蛋白，在一个泳道分离预染色的蛋白质分子量标准。

(2)电泳完成后，拆卸凝胶夹层，去除浓缩胶。以适量的转移缓冲液室温平衡凝胶30min。

(3)将转移盒放入一个较大的托盘中，加入足量的能盖没整个转移盒的转移缓冲液。

(4)在塑料转移盒的底边，依次将下面物品组装转印夹层：Scotch-Brite垫或海绵---一张剪切得如凝胶大小的滤纸，并预先以转移缓冲液润湿---凝胶用一试管或玻璃棒在凝胶表面缓慢滚动，以排去凝胶和滤纸间的气泡。(凝胶朝向滤纸的一面绝对应是凝胶的阴极面，也就是当放入转移槽时，最终是朝向负极)。

(5)准备转印膜，按凝胶大小但各边都比凝胶大约1mm剪膜。成45度角慢慢将凝胶放入蒸馏水中，水将会渗进膜中并润湿整个表面。然后在转移缓冲液中平衡10-15min，PVDF膜则短暂地在100％甲醇中放一下，然后在转移缓冲液中平衡10-15min。

(6)用转移缓冲液润湿凝胶表面，直接将已经润湿的膜放在凝胶顶部(即阳极面)，排去气泡。

(7)润湿另一张滤纸，并置于膜的阳极面，排去所有气泡。在滤纸的顶部放另一块Scotch-Brite垫或海绵。

(8)将转移盒顶部的半面放置适当，扣紧，完成组装。

(9)往转移槽中加入转移缓冲液，按正确的极性方向将转移盒放进电转仪中，连接电源。

(10)在冷却条件下100V电转30-60min，或者在冷室中14V电转过夜。

(11)关闭电源，拆卸转印装置，取出转印膜，并在膜上剪一小角或用软性铅笔或PaperMate笔作上标记定位。(膜可待干后放在可密封的塑料袋中保存一年以上，在进一步操作之前，干的PVDF膜须在小量100％甲醇中润湿，然后用蒸馏水洗去甲醇)。

封闭、一抗及二抗孵育

(1)将膜放入可15ml离心管内，加入5ml封闭液，盖紧管口。4℃封闭过夜。

(2)用封闭液稀释第一抗体即抗人MK抗体，多次实验验证最佳稀释度为1：2000。

(3)打开离心管，弃封闭液，以稀释的第一抗体工作液代替。在室温下摇动1-2h。

(4)带着手套从离心管中取出膜，放在塑料盒子中摇动着，用200ml TTBS洗4次，每次10-15min。

(5)用封闭液稀释二抗，稀释度为1:2000。

(6)将膜放进一新离心管内，加入稀释的二抗。在室温下摇动30-60min。

(7)从离心管中取出膜，按步骤4洗膜。

用发光底物显迹

(1)在室温以PBS洗膜15min以去除过量的磷酸盐和Tween20。

(2)将膜放入发色底物显迹液，条带应在10-30min内出现。

(3)用蒸馏水洗膜，终止反应。晾干后拍照。

Western blot检测结果表明，前述纯化得到的蛋白正是人MK重组蛋白，见图4。

4.SDS-PAGE及银染法分析前述强离子交换柱纯化的人MK重组蛋白的纯度

SDS-PAGE分析洗脱得到的人MK重组蛋白的纯度，5μg的Peak2蛋白样品上到SDS-PAGE胶加样孔内。

由图5a可见，除了目的条带没有其他杂带的出现。由于蛋白染色的灵敏度约为50ng，因此样品中50ng的杂蛋白即可被检测出来，这就表明得到的人MK重组蛋白的纯度大于99％。

为了进一步确定人MK重组蛋白的纯度，本发明人使用了灵敏度极高的银染的方法，用快速银染试剂盒(碧云天)对蛋白胶进行了银染。

(1)固定：

电泳结束后，取凝胶放入约100ml固定液中，在摇床上室温摇动20分钟，摇动速度为60-70rpm。固定40分钟以上甚至过夜可以进一步降低背景。

固定液的配制：依次加入50ml乙醇、10ml乙酸和40ml MilliQ级纯水或双蒸水，混匀后即成100ml固定液。

(2)30％乙醇洗涤：

弃固定液，加入100ml 30％乙醇，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

30％乙醇的配制：70ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入30ml乙醇，混匀后即成100ml 30％乙醇。

(3)水洗涤：

弃30％乙醇，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

(4)增敏：

弃水，加入100ml银染增敏液(1×)，在摇床上室温摇动2分钟，摇动速度为60-70rpm。

银染增敏液(1×)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银染增敏液(100X)，混匀后即为银染增敏液(1×)。银染增敏液(1×)配制后需在2小时内使用。

(5)水洗涤(共2次)：

弃原有溶液，加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。

弃水，再加入200ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1分钟，摇动速度为60-70rpm。

(6)银染：

弃水，加入100ml银溶液(1×)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。

银溶液(1×)的配制：99ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入1ml银溶液(100X)，混匀后即为银溶液(1×)。银溶液(1×)配制后需在2小时内使用。

(7)水洗涤：

弃原有溶液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动1-1.5分钟，摇动速度为60-70rpm。水洗涤的时间不超过1.5分钟。

(8)显色：

弃水，加入100ml银染显色液，在摇床上室温摇动3-10分钟，直至出现比较理想的预期蛋白条带，摇动速度为60-70rpm。

银染显色液的配制：90ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入10ml银染基本显色液(10X)，再加入0.05ml银染显色加速液(2000X)，混匀后即为银染显色液。银染显色液配制后需在20分钟内使用。

(9)终止：

弃银染显色液，加入100ml银染终止液(1×)，在摇床上室温摇动10分钟，摇动速度为60-70rpm。终止时有气体产生属正常现象，产生的气体为二氧化碳。

银染终止液(1×)的配制：95ml MilliQ级纯水或双蒸水中加入5ml银染终止液(20×)，混匀后即为银染终止液(1×)。银染终止液(1×)配制后宜当天使用。

(10)水洗涤：

弃银染终止液，加入100ml MilliQ级纯水或双蒸水，在摇床上室温摇动2-5分钟，摇动速度为60-70rpm。

(11)保存：

可在MilliQ级纯水或双蒸水中保存。或采用适当的方式制备成干胶。

用凝胶成像系统拍照见图5b，染色结果除了目的蛋白未见任何杂蛋白条带，进一步验证了得到的人MK重组蛋白的高纯度，纯度99％以上。

此外，采用其它方法如亲和层析进行纯化的试验发现，对于中期蛋白而言，采用其它一些方法的纯化效果不够理想，例如亲和层析方法纯化得到的蛋白的纯度很难达到高于99％的水平且内毒素含量难以控制到很低。

实施例3 人MK重组蛋白生物学活性测定

1、蛋白活性测定

利用MK能促进NIH3T3细胞(购自中国科学院细胞库，目录号GNM6)扩增的原理，用MTT法对人MK重组蛋白生物学的活性进行测定。

将NIH3T3细胞以5×10³/孔的密度分别接种于96孔培养板，在0.1ml DMEM培养液(含1％小牛血清)中于37℃、含5％CO₂的孵箱中培养12h；待细胞贴壁良好后，吸去培养液，加入0.1ml新鲜DMEM培养液(不含小牛血清，但含有不同浓度的重组hMK纯品)继续培养72h。共设四个不同的重组hMK蛋白浓度，分别为50ng/ml、500ng/ml、5000ng/ml、8000ng/ml。终止培养前加入5％MTT20μl/孔，37℃避光温育4-8h后吸尽上清，每孔加入DMSO 100μl，混匀震荡至完全溶解，测定D570值。同时设置调零孔(培养液、MTT、二甲基亚砜)，对照孔(细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜)，每组设定6复孔，结果取其平均值，计算增殖率＝[(给药-空白)-(对照-空白)]/(对照-空白)×100％。

由图6可见，纯化的人MK重组蛋白具有明显的促NIH3T3细胞增殖的活性，表明获得的人MK重组蛋白具有良好的生物活性。

2、蛋白内毒素含量测定

根据显色基质鲎试剂盒(鼓浪屿牌，厦门鲎试剂实验有限公司)提供的方法进行蛋白内毒素含量的测定。用无热源水配制不同的内毒素标准品溶液，浓度为0.1、0.25、0.5、1.0EU/ml；待检人中期因子重组蛋白用无热源水进行稀释，取100μl浓度为0.5μg/ml的待检样品和内毒素标准品分别加入到装有鲎试剂的无热源试管中，另用等体积的无热源水作阴性对照。按显色基质鲎试剂盒提供方法中的步骤进行：

1)准备一系列的无热源试管于试管架中，把试管架置于冰水中；

2)每支试管中加入0.1ml的鲎试剂溶液；

3)将不同浓度内毒素标准溶液和供试品分别加0.1ml到试管中，加样后封闭管口，振荡10s，然后置入37℃水浴箱中10分钟；

4)将试管取出置于冰水中，各管分别加入显色基质溶液0.1ml，混匀。再置入37℃水浴箱中6分钟；

5)将试管取出置于冰水中，各管均加入0.5ml反应终止液(盐酸+偶氮化试剂1)，使反应终止并开始染色；

6)加入偶氮化溶液2号0.5ml于各试管中，混匀；

7)加入偶氮化溶液3号0.5ml于各试管中，混匀；

8)各试管在振荡器中振荡10秒钟，然后静置五分钟，置于分光光度计，于OD545nm测吸光度。

根据内毒素标准溶液的吸光度值作出标准曲线，按此曲线计算待检样品的内毒素含量。结果表明人MK重组蛋白的内毒素含量约为0.2EU/μg，远低于常规方法制备和纯化的重组蛋白的内毒素含量(通常蛋白内毒素含量标准为1EU/μg)。

实施例4 人MK重组蛋白对小鼠血小板水平的影响

将实验小鼠分成4组，每组4只，给药组皮下注射100μl不同浓度的人MK重组蛋白，剂量分别为按小鼠体重5μg/kg/天，50μg/kg/天和500μg/kg/天，每天注射一次，连续注射7天，对照组给予等量的磷酸缓冲液，第0，5，10，14天检测小鼠外周血中血小板的数目。

由图7a可见不同剂量的给药组血小板水平第5天都比对照组显著升高，第10天和第14天只有最高剂量组的血小板水平比对照组显著升高，且在第14天有极显著的差异(p<0.01)。说明通过连续注射蛋白提高血液中人MK蛋白的水平可以促进小鼠体内血小板的增多，而且MK蛋白的这种功能与剂量有关，较高剂量500μg/kg/天可以维持血小板持续升高。

确定了最佳给药剂量后，再进行如下的实验：将实验小鼠分成6组，每组4只，给药组皮下注射100μl的人MK重组蛋白，剂量为500μg/kg/天，每天注射一次，分别连续注射1天、2天、3天、4天、5天，对照组则为不给药的正常小鼠。分别于最后一次给药后24小时取血测血小板的数目。

由图7b可见，连续给药2天、3天、4天、5天后，血小板数目均比正常组显著升高，连续给药3天后血小板数目达到最高，且和对照组相比具有极显著的差异(p<0.01)。该结果进一步验证了通过注射人MK重组蛋白能够促进小鼠体内血液中血小板的增多。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>再生医药有限公司

<120>人中期因子Midkine的制备及新用途

<130>076282

<160>3

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>121

<212>PRT

<213>智人(Homo Sapies)

<400>1

<210>2

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>2

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

Claims (10)

1.中期因子蛋白或其编码基因的用途，其特征在于，用于制备增加血小板的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物用于防治血小板减少相关疾病。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的血小板减少相关疾病选自：多发性瘀斑、粘膜出血、术后大出血。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的中期因子是人中期因子。

5.一种制备和纯化中期因子蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)利用含有重组表达载体的重组大肠杆菌表达中期因子，获得中期因子表达产物；

其中，所述的重组表达载体中含有中期因子表达盒，所述的中期因子表达盒中含有中期因子编码基因；

(2)利用强阳离子交换层析从步骤(1)获得的表达产物中分离出中期因子蛋白。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的获得中期因子表达产物步骤包括：

(a)培养所述的重组大肠杆菌使之表达中期因子，裂解菌体，收集含中期因子包涵体蛋白的裂解产物；

(b)将步骤(a)获得的含中期因子包涵体蛋白的裂解产物进行蛋白变性和复性处理，从而获得可溶性的中期因子表达产物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，采用超声破菌和溶菌酶处理双重方法来裂解菌体。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的蛋白变性采用盐酸胍作为变性剂。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的强阳离子交换层析采用：强阳离子交换凝胶SP Sepharose FF作为层析介质。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的中期因子蛋白纯度大于99％。

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