CN101367823B - 从吴茱萸中分离柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法 - Google Patents
从吴茱萸中分离柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种从吴茱萸药材中同时分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，它按如下工艺步骤进行：A.加热提取：乙醇或甲醇温浸后除渣；B.溶剂萃取：采用有机溶剂萃取提取浓缩液；C.色谱柱层析：用氧化铝或硅胶作为填料，石油醚—乙酸乙酯或者石油醚—丙酮梯度洗脱，分段收集半成品；D.高效制备液相分离；E.结晶：采用两相溶剂结晶法，将分段收集的半成品用乙醇、石油醚—丙酮或石油醚—乙酸乙酯混合溶剂结晶，得到纯度达99％以上的柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱无色针状结晶产品。本发明分离速度快、溶剂消耗少，经济环保，且得率高，可以一次性制备得到较大量的产品，具有较高的经济价值和学术价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种从中草药药材中分离活性成分的方法，具体而言，是一种从吴茱萸药材中同时大量地快速分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法。
背景技术
柠檬苦素(limomin)、吴茱萸碱(evodiamin)和吴茱萸次碱(rutaecarpin)分别是从芸香科植物吴茱萸(Fructus Evodia)中分离出的生理活性较高的三萜内酯和生物碱化合物；柠檬苦素(也称吴茱萸内酯)具有降压、抗炎、镇痛、抗肿瘤、抑制HIV-1病毒、抗动脉粥样硬化和杀虫等作用，其与生物碱类有效成分(主要是吴茱萸碱和吴茱萸次碱)共同表达吴茱萸的药理作用。目前主要采用常压柱层析，同时分离出这三种有效成分耗时长，溶剂耗费大，环境污染大，且一次性分离的量很小，无法满足日益增长的市场需要，且不利于环保和高效率高得率生产。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，提供一种从吴茱萸药材中同时大量地分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法。该方法分离速度快、得率高、利于环保。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从吴茱萸药材中同时分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.加热提取：选取粒度为20—60目的吴茱萸果实粗粉，按质量比加入8倍量的醇溶剂，于25—65℃加热2—5小时，经过滤除渣，滤液减压回收除去醇溶剂后，得到水悬浮液；
所述醇溶剂选自体积百分比浓度为95％的乙醇或100％的甲醇，优选95％的乙醇。
所述吴茱萸果实粗粉的粒度优选30目。
所述吴茱萸果实粗粉与醇溶剂的加热温度优选56℃。
B.溶剂萃取：将步骤A所得水悬浮液，先用2倍体积比的石油醚萃取，水相再用氯仿或者二氯甲烷萃取，各萃取3—5次，每次用量按体积比，均为水悬浮液的4—5倍，石油醚层回收石油醚后弃去，合并氯仿或者二氯甲烷层萃取液，于45—65℃温度下经减压浓缩得到黑色浓浸膏(密度为1.26)。
所述石油醚、氯仿或者二氯甲烷均为分析纯。
C.色谱柱层析：将B步骤所得的黑色浓浸膏甲醇溶解干法拌样后进行常压色谱柱层析。其中，层析柱填料为中性氧化铝或者硅胶，粒度为100—400目；色谱柱规格据分离量而定，直径为5—50cm。梯度洗脱所选用的洗脱剂为石油醚—乙酸乙酯或者石油醚—丙酮的混合溶剂，按体积比由高到低，依次按50：1—1：1的洗脱剂比例，分段收集半成品。
D.高效制备液相分离：将C步骤分段收集的半成品合并后，加入甲醇至刚好溶解，再经高效制备液相分离得到柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱馏分。
所述高效制备液相填料为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)，柱规格为25cm*10cm或25cm*5cm，色谱条件：检测波长210nm，流动相为甲醇—水(甲醇的体积百分比为50％—90％)或者乙腈—水(乙腈的体积百分比35％—55％)，含量都可达90％。
E.结晶：将D步骤分离所得三种馏分，采用两相溶剂结晶法进一步纯化分别得到纯度达99.0％以上的柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱无色针状结晶产品。
所用结晶溶剂选用体积百分比浓度为80％—95％的乙醇，或者体积比为5：1—2：1的石油醚—丙酮混合溶剂，亦或者体积比为5：1—2：1的石油醚—乙酸乙酯混合溶剂。
本发明的优点在于：
1、步骤少，耗时短，得率高，操作简便，易于工业化生产。
2、溶剂消耗少，提取、萃取、柱层析、制备液相分离等步骤中的溶剂都可回收再利用。
3、所用溶剂毒性较小，层析过程中所用的石油醚、乙酸乙酯、丙酮等，可替代通常柱层析采用的氯仿、甲醇等，安全无毒，环保。
4、经济效益好，能进行大规模生产，且工序简便，仅包括5个步骤，易于控制，分离效率高。
5、具有较高的学术价值。目前国内关于柠檬苦素等的分离纯化的文献报道都是常规柱层析，高效制备液相色谱用于柠檬苦素的分离纯化也属首次。本发明为柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的进一步开发利用提供了药理原料、理论和实践支持。
附图说明
图1为本发明B步骤所述HPLC检测图谱
图2为本发明制备分离在线监测图谱
图3为本发明E步骤所述柠檬苦素的HPLC检测图谱
图4为本发明E步骤所述吴茱萸碱的HPLC检测图谱
图5为本发明E步骤所述吴茱萸次碱的HPLC检测图谱
具体实施方式
实施例1
一种从吴茱萸药材中同时分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.加热提取：选取粒度为20目的吴茱萸果实粗粉10kg，按1：8的质量比加入95％的乙醇，在56℃下加热3小时，经过滤除渣，滤液减压回收除去乙醇后，得到水悬浮液；
B.溶剂萃取：取步骤A所得水悬浮液5L，先用10L石油醚萃取，水相再用20L二氯甲烷萃取，各萃取3次。石油醚层回收石油醚后弃去，二氯甲烷萃取液合并后55℃浓缩，得到黑色浓浸膏500g(密度为1.26)。
C.色谱柱层析：将B步骤所得的500g黑色浓浸膏甲醇溶解干法拌样后进行常压色谱柱层析。层析柱填料为硅胶，粒度为300—400目，色谱柱规格为直径5cm；梯度洗脱，洗脱剂为石油醚—乙酸乙酯的混合溶剂，按体积比，由高到低，依次按50：1，20：1，10：1，5：1和1：1，分段收集半成品。
D.高效制备液相分离：将C步骤分段收集的半成品合并后，加入甲醇至刚好溶解，再经高效制备液相分离得到含量分别达92％、90％和95％的柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱馏分。
所述制备液相填料为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)，柱规格为25cm*5cm，色谱条件：检测波长210nm，流动相为乙腈—水(乙腈的体积百分比为45％)。
E.结晶：将D步骤分离所得三种馏分，采用两相溶剂结晶法进一步纯化分别得到纯度达99.0％以上的无色针状结晶产品，即柠檬苦素10g、吴茱萸碱8g和吴茱萸次碱5g，所用结晶溶剂选用石油醚—丙酮，其体积比为3：1。
实施例2
一种从吴茱萸药材中同时分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.加热提取：选取粒度为30目的吴茱萸果实粗粉200kg，按1：8的质量比加入95％的乙醇，在56℃下加热5小时，经过滤除渣，滤液减压回收除去乙醇后，得到水悬浮液；
B.溶剂萃取：取步骤A所得水悬浮液75L，先用150L石油醚萃取，水相再用300L二氯甲烷萃取，各萃取3次。石油醚层回收石油醚后弃去，二氯甲烷萃取液合并后55℃浓缩，得到黑色浓浸膏800g(密度为1.26)。
C.色谱柱层析：将B步骤所得的800g黑色浓浸膏甲醇溶解干法拌样后进行常压色谱柱层析。层析柱填料为氧化铝，粒度为300—400目，色谱柱规格为直径15cm；梯度洗脱，洗脱剂为石油醚—丙酮，洗脱剂比例分别为50：1，30：1，20：1，10：1和2：1，分段收集半成品。
D.高效制备液相分离：将C步骤分段收集的半成品合并后，加入甲醇至刚好溶解，再经高效制备液相分离得到含量分别达90％、89％和92％的柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱馏分。
所述制备液相填料为十八烷基硅烷键合硅胶(C18)，柱规格为25cm*5cm，色谱条件：检测波长210nm，流动相为乙腈—水(乙腈的体积百分比为46％)。
E.结晶：将D步骤分离所得三种馏分，采用两相溶剂结晶法进一步纯化分别得到纯度达99％以上的无色针状结晶产品，即柠檬苦素200g、吴茱萸碱150g和吴茱萸次碱100g，所用结晶溶剂选用石油醚—乙酸乙酯，其体积比为5：1。
Claims (4)
1.一种从吴茱萸药材中同时分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.加热提取：选取粒度为20-60目的吴茱萸果实粉，按质量比加入8倍量的醇溶剂，于25-65℃加热2-5小时，经过滤除渣，滤液减压回收除去醇溶剂后，得到水悬浮液；所述醇溶剂是指体积百分比浓度为95％的乙醇；
B.溶剂萃取：将步骤A所得水悬浮液，先用2倍体积比的石油醚萃取，水相再用氯仿或者二氯甲烷萃取，各萃取3-5次，每次用量按体积比，均为水悬浮液的4-5倍，石油醚层回收石油醚后弃去，合并氯仿或者二氯甲烷层萃取液，于45-65℃温度下经减压浓缩得到密度为1.26的黑色浓浸膏；
C.色谱柱层析：将B步骤所得的黑色浓浸膏甲醇溶解干法拌样后进行常压色谱柱层析，其中，层析柱填料为中性氧化铝或者硅胶，粒度为100-400目；色谱柱规格据分离量而定，直径为5-50cm；梯度洗脱所选用的洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯或者石油醚-丙酮的混合溶剂，按体积比由高到低，依次按50∶1-1∶1的洗脱剂比例，分段收集半成品；
D.高效制备液相分离：将C步骤分段收集的半成品合并后，加入甲醇至刚好溶解，再经高效制备液相分离得到柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱流分；
所述高效制备液相填料为十八烷基硅烷键合硅胶，柱规格为25cm*10cm或25cm*5cm，色谱条件：检测波长210nm，流动相为乙腈-水，其中乙腈的体积百分比为35％-55％；
E.结晶：将D步骤分离所得三种流分，采用两相溶剂结晶法进一步纯化分别得到纯度达99.0％以上的柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱无色针状结晶产品，所用结晶溶剂为石油醚-丙酮混合溶剂，或者石油醚-乙酸乙酯混合溶剂。
2.根据权利要求1所述从吴茱萸药材中同时分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，其特征在于步骤A所述吴茱萸果实粉与醇溶剂的加热温度为56℃。
3.根据权利要求1所述从吴茱萸药材中同时分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，其特征在于步骤E所述石油醚-丙酮的体积比为5∶1-2∶1。
4.根据权利要求1所述从吴茱萸药材中同时分离高纯度柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱的方法，其特征在于步骤E所述石油醚-乙酸乙酯的体积比为5∶1-2∶1。
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