CN101365338B

CN101365338B - 草药粉末提取物及其制备和使用方法

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Publication number: CN101365338B
Application number: CN2006800411248A
Authority: CN
Inventors: 陈曦龄; 刘碧珊; 周柽森
Original assignee: Ostrolenk Faber Gerb & Soffen
Current assignee: Ostrolenk Faber Gerb & Soffen; Vita Green Health Products Co Ltd
Priority date: 2005-11-08
Filing date: 2006-11-06
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2026-11-06
Also published as: WO2007056271A2; US7829098B2; WO2007056271A3; DE602006016634D1; US20070104727A1; JP2009514960A; CN101365338A; KR20080074872A; EP1945034A2; HK1119526A1; ATE479333T1; EP1945034B1; EP1945034A4

Abstract

公开了从一种富含多糖肽的蘑菇，包括采绒革盖菌(Coriolusversicolor)(云芝)中制备一种草药粉末提取物的方法。同时公开了一种更有效的、高纯度的云芝粉末提取物，以及其制备和应用于抑制癌细胞增殖及肝炎的方法。

Description

草药粉末提取物及其制备和使用方法

发明领域

本发明涉及用来预防、辅助治疗或治疗癌症及肝炎的草药粉末提取物，其包含采绒革盖菌(Coriolus versicolor)(云芝)粉末。本发明也涉及制备及使用富含多糖肽的蘑菇粉末提取物，包括云芝，的方法。

发明背景

云芝，也被称为采绒革盖菌(Coriolus versicolor)或云状蘑菇，是一种可食用真菌，属于真菌属(Polystrictus)、多孔菌(Polyporales)、担子菌类(Basidomycetes)。它被认为是一种药用真菌并在传统中药中使用。云芝包含多糖活性成分，其已被表明可以增强免疫功能，增加免疫细胞数量，吞噬并杀死肿瘤细胞，增加白血球数。它也被用来治疗慢性、顽固性、活动性肝炎，而乙型肝炎一般有效率为82.4％。其治疗慢性支气管炎的有效率达85％。以其抗衰老和保持健康的功能，它可以清除自由基，促进药物功效，增强肾、肝功能。

自从1943年发现云芝在增强免疫系统功能上的效用以来，就有对云芝多糖供应的需求。重要的是，必须知道，并不是所有的云芝提取物在多糖含量上都一样。本发明的目标是，提供一种制备更加有效的及包含高纯度云芝粉末提取物的云芝制剂的方法。

发明概述

本发明涉及制备一种富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法。该方法包括提供一种富含多糖肽的蘑菇，将蘑菇压碎，以烷醇和水溶剂提取，过滤并浓缩提取物，喷雾干燥浓缩物以得到富含多糖肽的蘑菇粉末提取物。烷醇可以是乙醇或乙醇和水的混合物。水溶剂可以是水。

本发明也涉及制备采绒革盖菌(云芝)粉末提取物的方法。该方法包括提供云芝原材料，将原材料压碎，以溶剂提取，过滤并浓缩提取物，喷雾干燥浓缩物以形成云芝粉末提取物。

在优选的实施方案中，本发明的方法进行四次提取：以50％乙醇进行两次，以水进行两次。在另一个优选实施方案中，本发明的方法在下述条件下进行：草药材料和溶剂的重量体积比分别大约是，第1次和第2次提取时为1∶5和1∶2～3，第3次和第4次提取时为1∶2～3和1∶1～3。

在另一个方面，本发明针对一种由本发明的方法制备的包含采绒革盖菌(云芝)粉末的草药粉末提取物。在一个实施方案中，本发明的草药粉末提取物以下述的化学鉴定为特征。这里揭露的草药粉末提取物包含云芝粉末，其在抗癌细胞增殖方面比以其它旧方法制备的云芝粉末效果更强。本发明的草药粉末提取物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂和/或载体，并被制成各种剂型，例如颗粒，胶囊，片剂，粉末以及丸剂，以口服施用。优选的制剂是胶囊。

本发明的草药粉末提取物具有潜在的疾病治疗功效，可通过刺激或调节免疫系统减轻疾病，并可用来预防和/或治疗肝炎及癌症，包括乳癌和白血病。该草药药物组合物可为任何年龄和身体状况的病人使用，包括体弱，年长及操劳过度。

在本发明的另一方面，提供了一种营养补充物，包括上述提及的草药粉末提取物，麦芽糖糊精和奶粉。在一个优选实施方案中，草药提取物，麦芽糖糊精和奶粉的比例处于1∶1∶10至1∶4∶50范围内。在另一个优选实施方案中，草药提取物，麦芽糖糊精和奶粉的比例大约是1∶2∶22。

在本发明的另一方面，提供了一种营养补充物，包括上述提及的草药粉末提取物，麦芽糖糊精和豆奶粉。在一个优选实施方案中，草药提取物，麦芽糖糊精和奶粉的比例处于1∶1∶10至1∶4∶50范围内。在另一个优选实施方案中，草药提取物，麦芽糖糊精和豆奶粉的比例是大约1∶2∶22。

附图说明

图1显示了云芝粉末提取物F2a和F2在紫外线265nm处的HPLC(高效液相色谱)图谱。

图2显示了以折射率(R.I.)检测的云芝粉末提取物F2a和F2的HPLC(高效液相色谱)图谱。

图3显示了以折射率(R.I.)检测的糊精标准物在堆积色谱中的HPLC(高效液相色谱)图谱。

图4显示了F2和F2a在72小时，不同浓度下对HL-60细胞的抗增殖效果(n＝6孔，三次重复实验)。

图5显示了F2和F2a在48小时，不同浓度下对MCF-7细胞的抗增殖效果(n＝6孔，三次重复实验)。

图6显示了云芝水提取物和F2在HL-60中的细胞毒性。

图7显示了云芝水提取物和F2在MCF-7中的细胞毒性。

图8显示了云芝水提取物和F2在WRL-68中的细胞毒性。

详细描述

本发明提供了制备一种富含多糖肽的蘑菇粉末提取物的方法。该方法包括(a)提供一种富含多糖肽的蘑菇并将其压碎成粗粉；(b)以烷醇提取蘑菇粗粉以得到烷醇提取物，过滤烷醇提取物以得到烷醇滤液；(c)以水溶剂提取步骤(b)的残留物以得到水提取物，过滤水提取物以得到水滤液；(d)合并然后浓缩上述滤液以得到浓缩物；以及(e)喷雾干燥该浓缩物以形成富含多糖肽的蘑菇粉末提取物。

本发明也提供了制备采绒革盖菌(云芝)粉末提取物的方法。该方法包括(a)提供云芝原材料并将其压碎成粗粉；(b)以一种溶剂提取该粗粉以得到液体提取物；(c)过滤液体提取物以得到滤液；(d)浓缩该滤液以得到浓缩物；以及(e)喷雾干燥该浓缩物以形成云芝粉末提取物。

在优选的实施方案中，本发明的方法是用50％的乙醇溶于水作为提取的溶剂。同样在优选的实施方案中，乙醇或水提取的步骤进行多于一次。在一些优选的实施方案中，提取的步骤进行四次，第一次和第二次所用溶剂为50％乙醇，第三次和第四次为水。

以本发明的方法制备的云芝粉末提取物是高纯度的，并且在抑制癌细胞生长方面更加有效。以本发明的方法制备的云芝粉末提取物可用于预防或治疗肝炎，抑制癌细胞生长，包括白血病和乳癌。

烷醇可能是以下范围的烷醇：C₁-C₁₂的烷醇，C₁-C₁₀的烷醇，C₁-C₈的烷醇，C₁-C₆的烷醇，C₁-C₄的烷醇，C₁-C₃的烷醇，C₂-C₁₂的烷醇，C₂-C₁₀的烷醇，C₂-C₉的烷醇，C₂-C₈的烷醇，C₂-C₇的烷醇，C₂-C₆的烷醇，C₂-C₅的烷醇，C₂-C₄的烷醇或C₂-C₃的烷醇，或其混合物。烷醇可能是C₂，C₃，C₄，C₅，C₆，C₇，C₈，C₉，C₁₀，C₁₁或C₁₂的烷醇。该烷醇可单独使用或作为溶剂混合物使用。例如，可能使用一种99∶1至20∶80的烷醇∶水的混合物(重量/重量或体积/体积或重量/体积)。一种烷醇∶水的混合物可作为溶剂用于提取，其范围为10∶90至90∶10(体积/体积)，20∶80至80∶20(体积/体积)，30∶70至70∶30(体积/体积)，40∶60至60∶40(体积/体积)或45∶55至55∶45(体积/体积)。在本说明书和权利要求书中，术语“烷醇”是指其本身或烷醇∶水的混合物。

实施例

实施例1

云芝纯粉末和制剂

本发明的云芝纯粉末和制剂通过以下程序制备：

(1)制备粗粉

将收集自中国广西、云南和贵州省的云芝原草药，多孔菌家族(Polyporaceae family)的采绒革盖菌(Coriolus versicolor)，也称云芝(Polysticus versicolor)，压碎成粗粉，然后用于制备提取物。自然生长的云芝为优选，但种植的云芝也可用于提取。

(2)制备提取物

云芝粗粉以溶剂反复提取。第一次和第二次提取使用乙醇，优选为50％乙醇溶于水(v/v)。第三次和第四次提取用纯水。优选的粗粉和溶剂的重量体积比在第一、二、三、四次提取分别为大约1∶5，1∶2～3，1∶2～3和1∶1～3。每次提取的时间优选为1.5～2小时。提取物经过滤，滤液被合并、浓缩并制成纯粉末，如下所述。

(3)提取物的浓缩

上述第(2)步得到的滤液在50～85℃经真空蒸发浓缩，直至得到最佳相对密度为1.05～1.12，优选为1.05～1.08的浓缩物。

(4)纯粉末的制备

第(3)步所述浓缩物，进一步经喷雾干燥以形成纯粉末。在进入喷雾干燥器的橱柜前将浓缩物预热至大约60-70℃的温度。喷雾干燥器橱柜的进入温度被调至最适温度。最适温度定义为在该温度下，最终粉末产物中总多糖产量最高。进气的最适温度的范围大约是150～250℃，优选为200～230℃，更优选为150～170℃。流出温度优选为70～100℃。最终粉末产物中可得到最高含量的总多糖的优选温度范围可能根据所用个别喷雾干燥器而变化。干燥的粉末然后经过网格大小为80的筛子，以确保干燥的粉末粒子的大小在可接受范围内。

(5)药物制剂的制备

云芝纯粉末可通过本技术领域，特别是制药业的技术人员熟悉的方法加工成片剂，丸剂，粉末剂，胶囊和颗粒。如有需要，可在纯粉末中加入赋形剂，粘合剂，载体，填充剂以形成各种剂型。

以下实施例为示例性目的，并不是为了限制本发明的范围。可进行合理的改变，例如合理技术人员所理解的，而不脱离本发明的范围。

实施例2

云芝粉末提取物F2和F2a的制备

根据本发明的一个实施方案，命名为F2和F2a的云芝纯粉末按照以下步骤制备。生产F2和F2a的区别在于它们如何被干燥。F2是经喷雾干燥过程干燥，而F2a是经真空干燥过程干燥。

原材料

云芝原草药(Coriolus versicolor，也称Polysticus versicolor)取自中国田林县农业局，是中国大陆广西省田林县野生的采绒革盖菌的子实体。云芝原草药于9、10月份(秋季)采集。采绒革盖菌经詹小青教授(真菌学专家，中国科学院微生物研究所，北京，中国)鉴别确认。干燥凭证标本(No.2003-2510)保存在香港中文大学中药研究所博物馆。

在预处理过程中将子实体洗净，压碎。然后把从预处理得到的加工材料，或云芝粗粉，以50％的乙醇提取。每28kg制成品，需要大约350kg云芝粗粉和2450升50％的乙醇。预处理和提取步骤如下描述：

预处理

云芝原草药首先经混合及压碎预处理以得到云芝加工材料或云芝粗粉，如下所述：

1.混合

云芝原草药经流动自来水快速冲洗以除去泥沙及杂质，然后在不锈钢蒸煮器中蒸1个小时以杀死潜在的寄生虫和卵，然后在空气中或60℃烤箱中干燥。

2.压碎

367.5kg的云芝原草药经具有网格大小12mm的筛子的磨粉机(HammerType Grinder，Model No.9FQ37-18)压碎，以得到小于或约等于12mm大小的加工植物材料，或粗粉。收集粗粉并保存在密封的塑料容器中。每个容器贴上标签表明材料名，批次，日期和重量，并置于制定的位置贮存，温度为0°～30℃左右，湿度为大约60～75％.

提取

云芝粗粉反复以50％的乙醇提取，如下：

1.第一次提取

大约350kg云芝粗粉以1750升50％乙醇∶50％水(或称50％的乙醇)提取。两层纱布排于渗滤器底部，经溶剂运输孔加入足量的50％的乙醇以取代底部的空气。加入大约1/3的云芝粗粉并均匀分布。加入大约875升50％的乙醇，压平渗滤器中的物质。加入余下的2/3云芝粗粉，关闭材料运输孔并密封。加入另外875升50％的乙醇。开启循环泵10分钟，在继续进行蒸气提取前混合物被浸泡超过12小时。循环泵接到渗滤器，以允许渗滤器底部的提取物循环至渗滤器顶部。

为进行蒸气提取，将水蒸气导入渗滤器的蒸气层。通过位于渗滤器蒸气2层的手动蒸气阀控制水蒸气压力控制在0.1～0.2MPa。循环泵每10分钟开启一次，在这期间每次持续10分钟。

随着水蒸气进入渗滤器的蒸气层，溶剂被加热，蒸气上升，冷却，冷凝然后下落到渗滤器的底部。这个循环过程称为溶剂回流。一个连接到渗滤器顶部的蒸气回收管与一个冷凝器和一个冷却器在不同的部分密切相连以使溶剂回流发生。当提取物的温度上升至接近溶剂的沸点时(如果是50％的乙醇，则大约为70℃)，冷却器和冷凝器的入阀开启。水流入冷却器和冷凝器。

发生溶剂回流所需的时间依赖于溶剂的数量，蒸气压力和溶剂的沸点。基于此处所加入的植物材料，乙醇提取时溶剂回流所需的时间大约是30分钟，水提取时大约是1个小时。

一旦溶剂回流开始，即观察并记录时间。溶剂回流状态得以保持的温度为用于混合物慢煮的“确定温度”。混合物在固定温度慢煮大约两个小时，期间渗滤器的内部压力通过蒸气阀保持在大约0.02～0.05MPa。如果用50％的乙醇作提取，固定温度大约是80℃，如果用水，固定温度大约是90～95℃。在这期间，提取物通过循环泵每10～15分钟分散一次，优选为每15分钟一次，每次5分钟。这使得液体提取物定期循环以使草药材料得到完全提取。

提取物以标准操作程序过滤。实践中，提取物脱离渗滤器，通过一个过滤器，滤液通过循环泵进入存贮容器。

2第二次提取

从以上第一次提取的残留物以大约700升50％的乙醇按照上述方法进一步提取，作为第二次提取。第二次提取的滤液与第一次的合并。

3第三次和第四次提取

第二次提取的残留物分别以700升和350升纯水再进行两次提取，作为第三次和第四次提取。按照以上所述方法以环流进行水提取，只是环流下第三次和第四次的提取时间分别为2小时和1.5小时。

浓缩

合并从以上提取获得的滤液，然后进行乙醇回收和浓缩的过程。

1.乙醇回收

在-0.07Mpa的真空和大约0.035Mpa的蒸气压下从滤液回收乙醇。当回收的乙醇浓度低于40％时停止回收过程。

2.浓缩

乙醇回收之后，液体提取物被转移到由3个连续相连的真空浓缩管组成的3倍浓缩器，按照标准操作程序进行同时浓缩(3个室同时运行)。浓缩时，浓缩器中用来加热提取物的蒸气压力保持在0.1～0.2Mpa，第一室为-0.03～0.04Mpa真空，温度为80～85℃；第二室为-0.05～0.06Mpa真空，温度为65～70℃；第三室为-0.07～0.08Mpa真空，温度为50～55℃。当第一室和第二室的提取物体积减小时，浓缩物被转移到第三室继续进行浓缩过程。当第三室浓缩物的相对密度到达大约1.05～1.12(在60±5℃下测量)，优选1.05～1.08时，停止浓缩过程，收集浓缩物以作后面的用途。

喷雾干燥以生产F2

浓缩物被加热至大约65℃的温度并通过离心喷雾注入一个喷雾干燥器的橱柜内(不加糊精)。橱柜的进气和出气温度分别被调至215℃和90℃左右。进气的温度对最终粉末产物中总多糖的产量及最终粉末产物的外观有影响。在160℃，200℃和240℃的进气温度下，最终粉末产物中总多糖的产量分别为20.6％，16.3％和12.1％。云芝粉末味道稍苦。粉末在进气温度为160℃或200℃时是深褐色，在240℃为褐色。

浓缩物在橱柜内变干燥。粉末经过80孔筛的磨碎机。收集成品粉末F2。

外包装

粉末(F2)经打包并经真空包装机封装于铝箔袋(3kg每袋)。在每批被证明符合所有的检验后，各袋以第二层铝箔包装并贴上正确的标签。然后将袋子置于桶中，存贮于凉爽干燥的条件下。

真空干燥以生产F2a

为生产F2a，将浓缩物与糊精在混合器中混合25分钟。然后将混合物置于真空干燥器的洁净托盘，在70℃，真空压力小于-0.08Mpa下干燥。当混合物中的水成分等于或小于6％时停止干燥过程。压碎混合物然后经过一个80孔筛的磨碎机。收集成品粉末F2a。所得云芝粉末提取物F2a的主要成分被证明为多糖和三萜系化合物。

实施例3

高效液相色谱研究

本发明利用高效液相色谱(HPLC)来获得以不同的干燥方法制得的云芝粉末产品的指纹图谱。

F2和F2a的区别通过化学鉴定用高效液相色谱(HPLC)系统来测定，高效液相色谱可根据分子大小的区别分离化学成分。HPLC的方法和结果如下所述：

1.材料和方法

1.1 HPLC分析的样品准备

粉末形式的F2或F2a(84mg)分别溶于1ml灭菌的双蒸去离子水，在圆底聚丙烯微管中以100rpm振荡超过12小时。每个溶液经0.45μm尼龙

注射过滤器过滤(Pall Corporation，NY，USA，catalog no.4484)，存贮于4℃。

1.2分子大小标准物

包含分子量为1,010(Fluka，Buchs，瑞士，目录编号31416)和80，900(Fluka，Buchs，瑞士，目录编号31421)的糊精的分子大小标准物(每标准物为50mg/ml)用作大小标记以校验HPLC系统性能的一致性。

1.3 HPLC系统

整套HPLC系统及其机械部件购自美国马萨诸塞州Waters Corporation。所用仪器包括Waters Alliance 2695分离模块，Waters 2410折射率检测器(R.I.)，Waters 996光(电)二极管矩阵检测器(样品在紫外线265nm处分析)。柱以如下方式依次连接：1.Ultrahydrogel保护柱(目录编号11565)；2.Ultrahydrogel 1000(目录编号WAT011535)；3.Ultrahydrogel 500(目录编号WAT011530)；和4.Ultrahydrogel 250(目录编号WAT011525)。Ultrahydrogel保护柱内径6.0mm，长度40mm。Ultrahydrogel分析柱内径7.8mm，长度300mm。

1.4 HPLC运行条件

流动相：双蒸去离子(DDI)水，以0.45μm尼龙膜

过滤

洗脱液：乙腈(ACN)，以0.45μm尼龙膜过滤

流速： 0.3ml/分钟

跑样时间：样品300分钟

糊精标准120分钟

注样体积：样品100μl

糊精标准混合物20μl

Purge检测器： 10分钟(每次注入样品或糊精标准混合物

前)

每次跑样品后的洗涤步骤：

每次跑大小标准物后的洗涤：DDI以0.3ml/分钟进行120分钟样品-标准物运行次序：糊精标准混合物在开始时，跑样中间和跑样结束后各跑一次。

1.5 F2和F2a的化学指纹图谱分析

将从不同样品批次以两种检测方法(R.I.或265nm紫外线)获得的色谱图排列并比较。同时也将从不同批次的糊精标准混合物以R.I检测获得的色谱图排列并比较以校验不同运行的差异。

2结果

基于HPLC的F2a和F2样品分析(以265nm紫外线检测)产生了多于7个不连续峰，如图1所示。除三个峰(A，B，C)的强度差异之外，两个样品的图谱类似。峰B的强度差异显着因为在同一个样品内这个峰相对于其它峰的相对强度在F2a和F2内不同。以差异R.I.检测在两个样品中产生了相似的图案，因此，不适合用来作它们的区分，如图2所示。本测试通过排列糊精标准混合物的图谱得到校验，没有检测到性能上的显着差别，如图3所示。

实施例4

药理学研究

以下的药理学研究证明云芝配方F2在白血病和乳癌细胞系中表现出体外抗增殖活性。并且，F2相对于云芝纯水提取物，具有对癌细胞而不是正常人类细胞的较好的选择性细胞毒性。这些制剂可潜在地用于治疗白血病或乳癌病人。

虽然云芝配方F2和F2a均证明在白血病和乳癌细胞系中的效用，F2似乎在实现肿瘤细胞系50％生长抑制(IC₅₀)所需浓度(按照MTT分析)方面比F2a优越。虽然在两个人类癌细胞系中云芝纯水提取物的IC₅₀值比F2小，该提取物也在人类正常细胞系中表现出很高的细胞毒性和低IC₅₀值。因此，云芝纯水提取物不像F2一样具备选择性细胞毒性，F2被证明对所选癌细胞系而不是正常细胞系有显着的细胞毒性。因此，我们做出结论：F2是比云芝纯水提取物更好的抗癌药物候选。

实施例5

研究F2和F2a的细胞培养和MTT分析的程序

细胞培养

在细胞培养之前，将F2，F2a和云芝纯水提取物溶于普通RPMI 1640培养液(Invitrogen GIBCO，纽约州，美国)，分别作为3.0mg/ml，2.2mg/ml和1.15mg/ml的贮备液(由于溶解性不同)，室温下48小时持续振荡。离心除去不溶物，可溶性上清以0.22μm过滤器灭菌，然后进一步以普通细胞培养液稀释。对于F2和F2a，稀释后的浓度范围是25-1600μg/ml(2倍终浓度)，对于云芝纯水提取物，浓度是1142.86μg/ml(对于最终800μg/ml的剂量)，其范围是25-800μg/ml(2倍终浓度)。人类急性早幼粒细胞白血病(HL-60)细胞系，乳癌(MCF-7)细胞系和正常肝脏(WRL-68)细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，马里兰州，美国)。细胞系生长并保养于37℃和5％CO₂环境的加湿培养箱。补充了20％胎牛血清(FBS)，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Invitrogen GIBCO)的RPMI 1640培养液用于HL-60的细胞培养。补充了10％胎牛血清(FBS)，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI培养液用作MCF-7和WRL-68细胞的培养液。

从培养瓶收集以后，细胞以血球计数器计数，并以台盼蓝不兼容方法确定细胞存活性。对于以F2和F2a进行的测试，在96孔平底Costar培养板(Corning Inc.，马萨诸塞州，美国)的每个孔内，10⁴个处于对数培养期的HL-60细胞植于100μl补充了40％FBS的RPMI培养液中；对于MCF-7细胞，每个孔内为5000个细胞植于100μl补充了20％FBS的RPMI培养液中。每孔加入100μl的溶液，其含有普通培养液中F2和F2a终浓度的两倍。对照孔只加入100μl普通培养液。加入终浓度为20μg/ml的一种化疗抗肿瘤药，丝裂霉素C(MMC，Sigma Chemical Co，密苏里州，美国)作为阳性对照。对于以云芝纯水提取物进行的测试，每个孔内为10⁴个HL-60细胞系的细胞植于60μl补充了66.7％FBS的RPMI培养液中；5000个MCF-7或WRL-68细胞系的细胞植于60μl补充了33.3％FBS的RPMI培养液中。对于800μg/ml的剂量，每孔加入140μl的普通培养液中浓度为1142.86μg/ml稀释提取物。对于12.5-400μg/ml的剂量，每孔加入100μl的稀释提取物，其含有普通培养液中终浓度的两倍。对照孔只加入140μl普通培养液。然后以药物培养细胞48小时(MCF-7)或72小时(HL-60)。以MTT分析确定接经处理的细胞的增殖反应。

MTT细胞毒性分析

MTT分析可测定MTT[溴化3-(4，5-二甲基-噻唑基)-2，5-二苯基-四唑，Sigma]被线粒体脱氢酶还原成一种绿色甲产物，反映出线粒体的正常功能及活细胞。以F2，F2a或云芝纯水提取物培养细胞48小时(MCF-7或WRL-68)或72小时(HL-60)后，在每个孔加入30μl溶于磷酸缓冲液(PBS，Invitrogen GIBCO)的5mg/ml的MTT，并将培养板于37℃培养2小时。然后离心培养板，除去上清。每孔加入100μl的二甲亚砜(DMSO，Sigma)。于37℃培养5分钟后，用Benchmark微量滴定板读数器(Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚州，美国)在540nm下以分光光度法测定溶解液的吸光度。未处理的细胞其吸光度认为是100％。结果以MTT吸光度平均值(云芝粉末提取物处理的细胞的吸光度除以对照细孔的吸光度比率×100％)±标准偏差表示，3次独立实验，每次6孔。经处理和未处理对照(100％)孔之间的差异以Student不成对检验测定。

F2和F2a对人类急性早幼粒细胞白血病(HL-60)和乳癌(MCF-7)细胞体外抗肿瘤活性MTT分析结果的比较

图4和5表明两个云芝配方，F2和F2a，对人类急性早幼粒细胞白血病(HL-60)和乳癌(MCF-7)细胞均具有体外抗增殖效应。细胞以浓度渐增(12.5～800μg/ml，以两倍增长)的云芝粉末提取物在培养液中培养48小时(MCF-7细胞)或72小时(HL-60细胞)，增殖反应以MTT分析测定。两个云芝粉末提取物，F2和F2a，均以剂量依赖性方式显着性抑制MCF-7细胞(50-800μg/ml)和HL-60细胞(100-80μg/ml)的增殖。

这些药理学研究证明F2具有较低的IC₅₀值，因此比F2a更有活性。因此，从本发明得到的云芝证明相对于由其它过程生产的为较好的制剂。

表1

“*”表示该数据是显着的

图6，7和8表明了云芝配方，F2和云芝纯水提取物，对人类急性早幼粒细胞白血病(HL-60)，乳癌(MCF-7)和正常肝脏细胞(WRL-68)体外抗增殖效应的结果。细胞以浓度渐增(12.5～800μg/ml，以两倍增长)的云芝配方在培养液中培养48小时(MCF-7细胞或WRL-68细胞)或72小时(HL-60细胞)，增殖反应以MTT分析测定。两个云芝配方，F2和云芝纯水提取物，均能以剂量依赖性方式显着性抑制MCF-7细胞(50-800μg/ml)和HL-60细胞(100-80μg/ml)的增殖。但是，只有云芝纯水提取物证明可显着抑制WRL-68细胞(100-800μg/ml)的增殖，F2在所测浓度范围内(12.5-800μg/ml)未显示任何显着性抑制。

表2表明了云芝配方F2和云芝纯水提取物在所测细胞系上的IC₅₀值。从100μg/ml开始，IC₅₀值分别为235.45±41.23g/ml和59.39±5.92g/ml，MCF-7细胞的增殖可被F2和云芝纯水提取物显着性抑制。从100μg/ml开始，IC₅₀值分别为150.62±5.65g/ml and 14.85±1.18g/ml，HL-60细胞的增殖可被F2和云芝纯水提取物显着性抑制。从100μg/ml开始，IC₅₀值为127.91±17.85g/ml，WRL-68细胞的增殖可被云芝纯水提取物显着性抑制。F2在所测浓度范围12.5-800μg/ml内对WRL-68细胞的增殖无显着性抑制。

结果清晰表明，虽然在人类癌细胞系HL-60和MCF-7两种情况下云芝纯水提取物的IC₅₀值均比F2小，该提取物也在正常人类细胞系WRL-68中显示出很高的细胞毒性及低IC₅₀值。因此，云芝纯水提取物不像F2一样具有选择性细胞毒性，F2被证明对所选癌细胞系而不是正常细胞性具有显着的细胞毒性。因此，这些药理学研究证明本发明证明为是比云芝纯水提取物更好的抗癌药物候选。

表2

“*”表示该数据是显着的

本发明也提供了两种包含云芝提取物的配方。以下描述了这两种配方的实施例及其制作方法。

实施例6

云芝奶粉

配方：

云芝纯粉：40kg

麦芽糖糊精：80kg

奶粉：880kg

I.云芝纯粉的制备

(1)云芝粗药的预处理

云芝原草药经洗涤，清洗以除去杂质例如尘土或沙粒，经干燥并压碎成粗粉备用。

(2)第一次提取

在以标准程序提取之前，将500kg云芝粗粉以5倍50％的乙醇浸泡超过12小时。溶剂被加热至微沸状态，并保暖回流2小时(溶剂每15分钟被强制循环5分钟)，过滤以产生滤液和第一次残留物。收集滤液备用。

(3)第二次提取

第一次残留物以3倍50％的乙醇浸泡并加热至微沸状态，并保暖回流2小时(溶剂每15分钟被强制循环5分钟)，过滤以产生滤液和第二次残留物。收集滤液备用。

(4)第三次提取

第二次残留物以3倍的水浸泡并加热至微沸状态，并保暖回流2小时(溶剂每15分钟被强制循环5分钟)，过滤以产生滤液和第三次残留物。收集滤液备用。

(5)第四次提取

第三次残留物以3倍的水浸泡并加热至微沸状态，并保暖回流1.5小时(溶剂每15分钟被强制循环5分钟)，过滤以产生滤液和第四次残留物。收集滤液备用。丢弃第四次残留物。

(6)浓缩

根据标准程序合并并浓缩以上步骤所得滤液至相对密度为1.05～1.08(65℃±5℃)。收集并检测(水含量和微生物)浓缩物，备用。

(7)干燥

根据标准程序在进气温度120℃～130℃及出气温度50℃±20℃下喷雾干燥纯净的糊状物。通过120孔筛收集干燥的粉末(云芝纯粉)，备用。

II.与麦芽糖糊精和奶粉混合

(8)干燥，混合和粒化

用少量90％的乙醇做粘合剂将云芝纯粉(40kg)和麦芽糖糊精(80kg)充分混合，使云芝纯粉和麦芽糖糊精完全混合。依次加入120kg，240kg，520kg的牛奶并与云芝纯粉和麦芽糖糊精充分混合。加入适量95％的乙醇作为粘合剂使之成为软性糊状物。该软性糊状物以高效湿法制粒机或摆动制粒机(用16孔筛)制粒。湿粒被置于真空干燥管内在0.08～0.09Mpa，60℃±5℃下干燥。收集干粒(水含量≤6.0％)，备用。

(9)包装

干粒过40目筛。收集通过筛子的颗粒并包装。每包称4kg。

(10)贮存

密封产品包以防止受潮。

实施例7

云芝豆奶粉

云芝豆奶粉也可以类似于实施例6中所示生产云芝奶粉的程序生产，除了配方中880kg的奶粉换成880kg的豆奶粉，干粒过20孔筛而不是40孔筛。

Claims

1.一种制备采绒革盖菌(Coriolus versicolor)（云芝）粉末提取物的方法，包括：

a.提供云芝原材料并将其压碎成粗粉；

b.以一种溶剂提取所述粗粉以得到液体提取物；

c.过滤所述液体提取物以得到滤液；

d.浓缩所述滤液以得到浓缩物；以及

e.喷雾干燥所述浓缩物以形成云芝粉末提取物;

其中所述提取步骤b执行4次，所用的溶剂于第1次和第2次的提取为50%乙醇：50%水（v/v），于第3次和第4次的提取为水。

2.如权利要求1的一种制备采绒革盖菌（云芝）粉末提取物的方法，其中云芝原材料与溶剂的重量体积比分别是，第1次和第2次提取时为1：5和1：2～3，第3次和第4次提取时为1：2～3和1：1～3。

3.一种包含采绒革盖菌(Coriolus versicolor)（云芝）的草药粉末提取物，其中云芝粉末提取物通过权利要求1所述方法获得。

4.如权利要求3所述的草药粉末提取物，其中所述草药粉末提取物能够抑制人类或其它哺乳动物中白血病或乳癌癌细胞的生长。

5.如权利要求3所述的草药粉末提取物，其中所述草药粉末提取物制成制剂，选自如下一组：颗粒、胶囊、片剂、粉末或丸剂。

6.如权利要求3所述的草药粉末提取物，其中所述草药粉末提取物的制剂形式为胶囊。

7.一种抑制人类或其它哺乳动物中白血病或乳癌癌细胞的生长的药物，包括有效剂量的如权利要求3的草药粉末提取物。

8.一种营养补充物，包括如权利要求3的草药粉末提取物、麦芽糖糊精和奶粉。

9.如权利要求8所述的营养补充物，其中草药提取物、麦芽糖糊精和奶粉的比例处于1:1:10至1:4:50范围内。

10.如权利要求8的营养补充物，其中草药提取物、麦芽糖糊精和奶粉的比例是1:2:22。

11.一种营养补充物，包括如权利要求3所述的草药粉末提取物、麦芽糖糊精和豆奶粉。

12.如权利要求11的营养补充物，其中草药提取物、麦芽糖糊精和豆奶粉的比例处于1:1:10至1:4:50范围内。

13.如权利要求11的营养补充物，其中草药提取物、麦芽糖糊精和豆奶粉的比例是1:2:22。