CN104922477B - 一种增强免疫力的中药片剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种增强免疫力的中药片剂及其制备方法与应用。它是由西洋参185‑190g、马鹿茸35‑40g、红景天370‑380g、枸杞子370‑380g、铁皮石斛120‑130g为主要原料及其它辅料组成。其中铁皮石斛破碎，马鹿茸、西洋参分别粉碎，铁皮石斛、枸杞子、红景天加8倍量水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩至相对密度1.05～1.15的浸膏，喷雾干燥，得干膏粉，然后采用合适的工艺制成片剂。动物试验结果显示：该组合物具有缓解体力疲劳、增强免疫力的功能，同时也具有吸收快，服用、携带方便等特点。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂技术领域，涉及增强免疫力、缓解体力疲劳的中药制剂，更具体的说是一种增强免疫力的中药片剂及其应用。
背景技术
近年来，随着生活水平的不断提高，人们对自身的健康越来越重视，适当服用一些保健食品防治疾病与保持健康已逐渐成为世界各国民众的重要手段，增强免疫力和缓解体力疲劳已成为当今人们日益重视的保健问题。增强免疫力和缓解体力疲劳保健食品的市场一直比较庞大，此类产品在所有保健食品中占据份额较大，消费者需求较多。疲劳是现代人群中最常见的健康问题，各个年龄层次的人都有相当数量为此所困。随着现代生活节奏的加快，社会竞争激烈，生存压力大，本症状的困扰越来越突出。缓解体力疲劳的适宜人群包括：运动员及爱好运动、健身的人群；高温作业人员；军事活动人员；高原地区作业人员以及容易发生疲劳的各类人群。目前，市场上增强免疫力功能的保健品主要有如下几类：
第一类是参类保健品，通过补充运动中所消耗的营养素来达到维持机体正常生理功能，解除疲劳的目的。第二类是维生素类保健品，补充人体必需的维生素和微量元素。第三类是微量元素类保健品，它是通过提高机体器官的功能，特别是循环系统的功能，加速体内代谢物质的清除、排出，来达到抗疲劳目的。很多中草药制剂都属于这一类。第四类是其它一些申报的提高免疫力功能的产品。增强免疫力功能的保健食品在保健食品市场中占据着相当大的份额。经查阅国家食品药品监督管理局保健食品批件数据库，具有增强免疫力、缓解体力疲劳的产品较多，但同时具有二者功能的国产保健食品有200个左右，进口保健食品不足10个，剂型多为片剂、口服液，胶囊剂，也有冲剂、茶饮料等剂型。因此开发具有增强免疫力及缓解体力疲劳的保健食品具有广泛的应用前景。
发明内容
达仁堂牌达仁片主要以西洋参、马鹿茸、红景天、枸杞子、铁皮石斛为主要原料，添加适宜辅料制备而成。主要针对免疫力低下、易疲劳的人群而设计，产品以传统中草药为原料，采用合适的工艺制成片剂，具有吸收快，服用、携带方便等特点。所用原料货源充足、易得；工艺简单可控，质量标准较高，能够保证产品的品质。同时也符合国家食品药品监督管理局对保健食品的要求，安全毒性试验未见毒副作用，具有较高的食用安全性,可长期服用。产品定位准确，优势明显，具有可观的发展前景。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种增强免疫力的中药片剂，其特征在于它是由下述原料组成：
西洋参 185-190g
马鹿茸 35-40g
红景天 370-380g
枸杞子 370-380g
铁皮石斛 120-130g
微晶纤维素 80-240g
甘露醇 90g-290g
交联聚维酮 32-40g
硬脂酸镁 2.4-32g
薄膜包衣剂 30-40g。
优选增强免疫力的中药片剂，其特征在于它是由下述原料组成：
西洋参 187.5g
马鹿茸 37.5g
红景天 375g
枸杞子 375g
铁皮石斛 125g
微晶纤维素 80g
甘露醇 198g-285g
交联聚维酮 32g
硬脂酸镁 2.4g
薄膜包衣剂 32g。
其中的薄膜包衣剂指的是：羟丙甲纤维素、三乙酸甘油酯、胭脂红铝色淀、诱惑红铝色淀、柠檬黄铝色淀、靛蓝铝色淀、二氧化钛或滑石粉。
本发明进一步公开了增强免疫力中药片剂的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）取配方比例的铁皮石斛、枸杞子、红景天加6~10倍量水煎煮1~3次，每次1~2小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩，浓缩至60℃相对密度1.05~1.15的浸膏；
（2）取浸膏进行喷雾干燥，过筛，得干膏粉；
（3）取干膏粉、西洋参粉、马鹿茸粉混合，得到混合粉；
（4）混合粉加入60%（w/w）乙醇制粒；将制好的湿颗粒55℃干燥至水分5%以下，整粒，得干颗粒；
（5）制得的干颗粒加入配方比例的交联聚维酮、硬脂酸镁，混合，得总混物经压片制成片剂。
本发明更进一步公开了增强免疫力中药片剂在制备治疗增强免疫力、缓解体力疲劳药物中的应用。实验结果显示：达仁堂牌达仁片具有缓解体力疲劳、增强免疫力的功能。
本发明更加详细的描述及工艺研究如下:
一、产品配方
表1产品配方
薄膜包衣剂：羟丙甲纤维素、三乙酸甘油酯、胭脂红铝色淀、诱惑红铝色淀、柠檬黄铝色淀、靛蓝铝色淀、二氧化钛、滑石粉。
以上原料共制成1000片，每片重0.824g；
食用方法及食用量：口服，每日2次，每次4片；
保健功能：增强免疫力、缓解体力疲劳。
二、所用原料功效作用、用量及各原料配伍关系
（1）所用原料功效作用及用量
表2所用原料用量
本发明所采用的药材的功效如下：
五加科植物西洋参Panaxquinque folium.L的干燥根。又名花旗参，是滋补名贵药材之一，其性味甘、微苦、凉。具有补气养阴、清热生津之功效。临床多用于增强体力、抑制癌细胞生长，增加免疫功能、调节血压、强化心肌及增强心脏之活动能力、增强记忆能力等。西洋参化学成分主要有皂苷、多糖、氨基酸及挥发油、脂肪酸、微量元素、维生素、铁质、钙质等多种营养物质。
鹿科动物马鹿Cervus elaphus Linnaeus 的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。其性味甘、咸，温。归肾、肝经。具有壮肾阳，益精血，强筋骨，调冲任，托疮毒之功效。马鹿茸中化学成分比较复杂，包括有机成分和无机成分。有机成分包括有19种以上氨基酸，9种脂肪酸，10种磷脂成分，其中明显有药理活性的组分是蛋白多肽类、甾体类和多胺类化合物。
红景天Rhodiola crenulata(Hook.f.etThoms.)H.Ohba的干燥根和根茎。性味甘、苦、平。具有益气活血、通脉平喘之功效。用于气虚血瘀、胸弊心痛、中风偏瘫、倦怠气喘。红景天应用历史悠久，两千多年前青藏高原的人以它入药，用于强身健体，抵抗不良环境的影响。民间常用来煎水或泡酒，以消除劳累，同时还可防病健体和滋补益寿。因其有扶正固体、补气养血、滋阴益肺的神奇功效，历代藏医将其视为“吉祥三宝”。其主要化学成份有红景天苷、酪醇及红景天多糖，并且含有黄酮类、蛋白质、脂肪及微量元素、氨基酸等。
宁夏枸杞Lycium barbarum L．的干燥成熟果实。性味甘、平。归肝、肾经。具有滋补肝肾、益精明目之功效。用于虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、阳痿遗精、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明等症。枸杞具有多方面的药理作用和生物活性功能。枸杞子中含多种营养成分和微量元素，其主要有效成分枸杞多糖（LBP)，具有抗疲劳、抗辐射、增强免疫等作用。
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）栽培品的干燥茎。味甘，微寒。归胃、肾经。具有益胃生津，滋阴清热的作用。用于阴伤津亏，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕，病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨萎软。现代药理研究表明，铁皮石斛有增强免疫、抗疲劳、抗氧化、促消化、促进唾液分泌、降血糖、降血压、抗肝损伤、抗肿瘤等方面药理作用。铁皮石斛主要含有多糖、生物碱、菲类化合物、氨基酸类等化合物。
本品配方中五味原料即西洋参、马鹿茸、红景天、枸杞子、铁皮石斛。西洋参甘、微苦，凉，有补气养阴，清热生津功效；马鹿茸甘、咸，温，可壮肾阳，益精血，强筋骨；红景天甘、苦，平，可益气活血，通脉平喘；枸杞子甘，平，有平补肝肾，益精明目功效，铁皮石斛甘，微寒，有益胃生津，滋阴清热的功效。
（2）主要工艺路线
本品经提取、浓缩、干燥、过筛、混合、制粒、干燥、整粒、总混、压片、包衣以及包装等主要工艺制成。
（3）工艺确定依据
1）红景天、枸杞子和铁皮石斛水提条件的优选
以粗多糖、红景天苷为考察指标，以提取时间、加水量、提取次数作为影响因素，设计三因素三水平正交试验，因素水平见表3：
表3 提取正交试验因素水平表
试验方法及结果：称取红景天375g、枸杞子375g、铁皮石斛粗粉125g共九份，每份875g，分别提取，滤过，合并滤液，减压浓缩（70～80℃，-0.06～-0.1Mpa）、减压干燥，测定粗多糖、红景天苷含量。按照L9（34）表安排试验，试验安排及方差分析结果见表4、5、6。
表4正交实验及结果表L9（34）
表5 以粗多糖含量为指标的方差分析表
表6 以红景天苷含量为指标的方差分析表
F0.05(2,2)=19.00 F0.01(2,2)=99.00
以粗多糖为指标的方差分析结果显示，提取次数对粗多糖的提取有显著影响（P＜0.05），加水量和提取时间对粗多糖的提取影响不显著（P＞0.05），结合直观分析结果，确定粗多糖的最优水平组合为A3B3C3。
以红景天苷为指标的方差分析结果显示，提取次数对红景天苷的提取有显著影响（P＜0.05），加水量和提取时间对红景天苷的提取无显著影响（P＞0.05），结合直观分析结果，确定红景天苷的最优水平组合为A2B3C3。
综合上述结果，提取次数粗多糖和红景天苷的提取有显著影响，结合直观分析可知，粗多糖和红景天苷提取2次与提取3次，提取效果相差不大，因此从实际生产节约成本考虑，选择提取2次；加水量对粗多糖和红景天苷的提取影响不显著，从实际生产节约成本考虑，选取加水8倍量；提取时间对粗多糖和红景天苷的提取影响均不显著，结合直观分析，优水平均为C3。故最佳提取工艺定为A2B2C3，即加水8倍量，提取2次，每次2小时为最佳工艺。
）验证试验
对优选出的条件A2B2C3进行验证试验，具体操作如下：
称取红景天375g、枸杞子375g、铁皮石斛粗粉125g共三份，分别提取，滤过，合并滤液，减压浓缩（70～80℃，-0.06～-0.1Mpa）、减压干燥，测定粗多糖及红景天苷含量。结果见表7。
表7 验证试验表
由验证试验可以看出：平均出膏率为25.2%，粗多糖平均提取量为16.51g，红景天苷平均提取量为1.44g，提取工艺稳定，可行。
综上研究结果，确定提取工艺为：
取配方量铁皮石斛、枸杞子、红景天加8倍量水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩（70~80℃，-0.06~-0.1Mpa）至相对密度1.05~1.15(60℃)的浸膏；取浸膏进行喷雾干燥（进风温度为170-180℃，出风温度为95-100℃），过80目筛，即得。
）成型工艺研究
本品以铁皮石斛、枸杞子、红景天、西洋参、马鹿茸为主要原料，铁皮石斛、枸杞子、红景天经水提而得到干膏粉，本产品含有提取物，为提高产品的稳定性和携带、服用方便性，考虑将本品制成片剂，每日8片，为提高产品稳定性及掩盖片芯颜色及气味，本品设计包薄膜衣。按照确定后工艺提取20倍配方量原料，得干膏粉（出膏率25.2%），用于工艺研究。
）填充剂的种类及用量的确定
片剂常用的填充剂有糊精、蔗糖、乳糖、甘露醇、微晶纤维素等。甘露醇具有不吸湿性和良好的可压性，微晶纤维素能明显改善物料的流动性和可压性，且同时具有崩解性能。取400片的配方原料（浸膏粉88.2g，西洋参粉75g，马鹿茸15g），以硬度、脆碎度、可压性等为指标，分别考察了甘露醇、微晶纤维素作为填充剂的效果，结果见表8-1、表8-2。
表8-1 填充剂用量考察表
通过以下几个指标考察所制得的素片质量，见下表。
表8-2 处方筛选结果
结果表明，处方3制粒容易，所得颗粒均匀，可压性好，硬度适中，脆碎度合格，且所得片面光洁美观。故初步确定本品填充剂为甘露醇和微晶纤维素，甘露醇用量为274.5g/1000片，微晶纤维素用量为80g/1000片；甘露醇用量可做微调。
）润湿剂及其用量的确定
取配方比例的原料混合粉、微晶纤维素及甘露醇混合均匀，加入不同浓度的乙醇制成软材，以制粒过程中的现象对乙醇浓度进行考察。相关数据及结果见表9。
表9 制粒用乙醇浓度和用量的考察表
结果表明，试验2中，用60%乙醇制粒，所得颗粒均匀，故采用60%的乙醇溶液作为润湿剂。
）颗粒干燥时间的确定
本品经湿法制粒后，干燥温度为55℃，分别干燥0.5h、1h、1.5h。考察不同干燥时间，颗粒的水分和压片情况。结果见表10。
表10 干燥时间考察表
结果表明，湿颗粒干燥1小时后，水分在5%左右，压片效果较好。
）崩解剂用量的考察
本品部分原料需要应用提取工艺，所得提取物配合其他原辅料制粒压片，片子不易崩解。故本品选择加入崩解剂以加快崩解速度。交联聚维酮为固体制剂的常用崩解剂，用其作崩解剂压制成片后，片剂崩解时限短、溶出率高。故选定交联聚维酮作为本品的崩解剂并优选其用量，取400片配方量浸膏粉88.2g，西洋参粉75g，马鹿茸15g，微晶纤维素32g，甘露醇的量根据交联聚维酮的加入量进行调整，混合、制粒、干燥、整粒，加入不同量的交联聚维酮，压片后测崩解，结果见表11。
表11 崩解剂用量考察表
结果表明，样品1崩解时间较长，接近标准最低要求；样品2即交联聚维酮用量为32g/1000片，即可达到合适的崩解时限。考虑产品成本，故确定交联聚维酮加入量为32g/1000片。
）混合时间考察：
待确定了辅料种类和用量后，对物料混合时间进行了考察，按配方比例称取各原料粉、微晶纤维素及甘露醇，混合不同时间，从不同部位取样测定红景天苷含量，算出RSD值，以RSD值≤3%为指标，考察混合时间。含量数据及结果见表12：
表12 混合时间的考察
由结果看出，混合30分钟后其物料色泽均一，RSD值＜3%，表明物料已经混合均匀，故确定混合时间为30分钟。
）润滑剂用量的确定：
硬脂酸镁是一种优良的压片润滑剂，故选定硬脂酸镁为本品的润滑剂并优选了其用量，结果见表13。
表13 润滑剂用量考察表
结果表明，硬脂酸镁用量在0.3%时，即可达到较好的流动性及润滑效果，故确定硬脂酸镁的加入量为0.3%，即2.4g/1000片。
）包衣剂用量的考察：
为了增加片剂的稳定性，掩盖气味，故对素片进行薄膜包衣。本品选用薄膜包衣剂，用70%的乙醇配制浓度为12%包衣液进行包衣，考察包衣粉用量，结果见表14。
表14包衣剂的考察表
结果表明，样品1、2不能完全掩盖素片，片面不光洁，样品3薄膜包衣片色泽均有光泽，衣膜完整。故确定薄膜包衣剂的投料量为32g/1000片，包衣增重约3%。
经上述试验，本品配方确定结果见表15：
表15 确定配方
本品素片重为0.8g，包衣增重按3%计，包衣片重约为0.824g，故本品规格确定为0.824g/片。
三、达仁堂牌达仁片缓解体力疲劳功能动物试验报告
l材料与方法
1.1实验动物
SPF级昆明种雄性小鼠，18-22g，160只。小鼠及小鼠饲料由湖北省实验动物研究中心提供，实验动物和饲料生产许可证号为SCXK（鄂）2008-0005，实验动物使用许可证号为SYXK（鄂）2012-0065。动物饲养室温度为20～25℃，湿度为40～70%。
样品来源及处理
达仁堂牌达仁片由天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂提供，人群推荐日摄入量为6.592g/60kg BW。送检单位提供的功能用样品为去除辅料的原料混合物，功能用样品占成品比例为54.60%，功能用样品人群推荐日摄入量为3.599g/60kg BW(即0.060/kg BW)。
样品配制：准确称取受试样6.Og、12.Og、18.Og，加蒸馏水稀释并搅拌均匀定容至200mL，则受试物浓度分别为0.03g/ml、0.06g/ml、0.09g/ml，作为低、中、高剂量组灌胃使用，阴性对照组给予蒸馏水。
剂量分组
按送检的功能用样品计算人群日推荐用量为3.599g/60kg BW（即0.060/kg BW），作为剂量设计依据，设计0.6、1.2、1.8g/kg BW（分别相当人群推荐量的10、20、30倍）作为三个剂量组，同时设阴性对照（蒸馏水）组。共设4个实验组，每组40只。灌胃容量为20ml/kgBW。30天后开始测试。实验一组负重游泳实验，实验二组血乳酸实验，实验三组血清尿素实验，实验四组肝糖原含量实验。
实验方法
1.4.1负重游泳试验
方法：小鼠连续灌胃30天，末次给受试物后30min，小鼠尾根部负重5％体重，置游泳箱中游泳观察小鼠自游泳至死亡时间。室温：24-26℃，水温：25℃±1℃。
血乳酸含量的测定
方法：小鼠连续灌胃30天，末次给受试物后30min，放入30℃的水中游泳10min，于游泳前、游泳后即刻、游泳休息后20 min分别三次取血（内眦取血）测定血乳酸值。所用试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，试剂盒批号：20140409。室温：24-26℃。
血清尿素含量的测定
方法：小鼠连续灌胃30天，末次给受试物后30min，放入30℃的水中游泳90min，出水后，休息60min，眼球取血测定血清尿素含量。血清尿素测定采用日立7020型全自动生化分析仪测定，所用试剂盒由上海丰汇医学科技有限公司提供，试剂盒批号：140524。室温：24-26℃。
肝糖原含量的测定
方法：小鼠连续灌胃30天，末次给受试物后30min，取肝脏测定肝糖原含量。所用试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，试剂盒批号：20140409。室温：24-26℃。
统计分析
采用方差分析进行统计，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值< FO.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥FO.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
结果
2.1达仁堂牌达仁片对小鼠体重的影响
达仁堂牌达仁片对小鼠体重增长无明显影响，各试验组小鼠试验前、后体重与阴性对照组比较P>O.05（见表16、17、18、19）：
2.2达仁堂牌达仁片对小鼠负重游泳时间的影响
达仁堂牌达仁片高剂量组能延长小鼠负重游泳时间，与阴性对照组比较有显著性差异
(P<0.05)，见表20：
2.3达仁堂牌达仁片对小鼠游泳血乳酸值及血乳酸曲线下面积的影响
与阴性对照组比较，达仁堂牌达仁片中、高剂量组能显著性降低小鼠游泳后血乳酸值(P<0.05)，高剂量组能显著性降低休息后的血乳酸值(P<0.05)，见表22，表23；与阴性对照组比较，中、高剂量能显著性减少小鼠游泳的血乳酸曲线下面积(P<0.05)，见表24；而各剂量组对游泳前血乳酸值无显著性改变(p>0.05)，见表21：
2.4达仁堂牌达仁片对小鼠血清尿素的影响
达仁堂牌达仁片中、高剂量组能显著降低小鼠血清尿素值，与阴性对照组比较有显著性差异(P<0.05)，见表25：
2.5达仁堂牌达仁片对小鼠肝糖原含量的影响
达仁堂牌达仁片各剂量组对小鼠肝糖原含量影响与阴性对照组比较，均无显著性差异(P>0.05)，见表26：
3结论
受试物成品人群推荐日摄入量为6.592g/60kg BW，由于送检单位提供的功能用样品 为去除辅料的原料混合物，功能用样品占成品比例为54.60%，故功能用样品人群推荐日摄入量为3.599g/60kg BW(即0.060/kg BW)，将功能用样品人群推荐日摄入量分别扩大10、20、30倍设计三个剂量组，即0.6、1.2、1.8g/kg BW，同时设阴性对照组。采用SPF级昆明种小鼠，连续灌胃给予，30天后开始测试，实验结果以P<O.05判断为显著性差异，各剂量组与阴性对照组比较，结果显示：
1)各剂量组对小鼠体重均无显著性差异；
2)高剂量组能延长小鼠负重游泳时间；
3)各剂量组对小鼠游泳前血乳酸值无显著性影响；
4)中、高剂量组能降低小鼠游泳后血乳酸值、高剂量组能降低小鼠休息后血乳酸值；
5)中、高剂量组能降低游泳后的血乳酸曲线下面积；
6)中、高剂量组能降低小鼠血清尿素值；
7)各剂量组对小鼠肝糖原含量均无显著性影响。
按照缓解体力疲劳功能作用评价程序规定，综合以上各项试验结果判定，达仁堂牌达仁片具有缓解体力疲劳功能。
达仁堂牌达仁片增强免疫力功能动物试验报告
1材料与方法
1.1样品来源及处理
达仁堂牌达仁片由天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂提供，去除辅料的原料混合物人群推荐日摄入量3.599g/60kg BW(即0.060g/kg BW)。
样品配制：准确量取受试样品6.Og、12.Og、18.Og，分别用蒸馏水定容至200mL，供低、中、高剂量组小鼠灌胃用。阴性对照组给予蒸馏水。
实验动物及环境
SPF级昆明种雌性小鼠，18-22g，200只，小鼠和小鼠饲料均由湖北省实验动物研究中心提供。实验动物和饲料生产许可证号：SCXK（鄂）2008-0005；实验动物使用许可证号：SYXK（鄂）2012-0065。动物饲养室温度为20-25℃，湿度为40-70%。
剂量分组
按人群推荐日摄入量0.060g/kg BW扩大10、20、30倍设置低、中、高三个剂量组，即0.60g/kg BW、1.20g/kg BW、1.80g/kg BW，共分五个实验组，每实验组包括阴性对照组、低、中、高剂量组，各剂量组实验动物数为10只。免疫实验一组进行迟发型变态反应实验；免疫实验二组进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定；免疫实验三组进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验；免疫实验四组进行血清溶血素的测定和抗体生成细胞检测；免疫实验五组进行淋巴器官／体重比值测定和碳廓清实验。小鼠连续灌胃35天后开始试验。各实验组小鼠均按0.20ml/lOg BW容量经口灌胃给予。
试验方法
1.4.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验
方法：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心lOmin (lOOOr/min)。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/mL。将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLCon A液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5%CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL) 50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔（1OOμL /孔），用酶标仪以570nm波长测定光密度值。
二硝基氟苯(DNFB)诱导迟发型变态反应(DTH)
方法：耳肿胀法。用1%DNFB（以1:1的丙酮麻油溶液配制）致敏小鼠后，第5天再用DNFB攻击右耳，24h后处死动物剪下左右耳壳用打孔器取下直径8mm的耳片，称重，以左右耳的重量之差来表示DTH的程度。
抗体生成细胞检测
取脱纤维的羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min) lOmin，每只鼠经腹腔注射2% (v/v) SRBC O.2mL。将SRBC免疫4～5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，放在盛装有Hank's液的小平皿内，轻轻磨碎脾脏，制成细胞悬液，经200目筛网过滤，离心(1000/min) lOmin，用Hank's液洗2遍，最后将细胞悬浮在5mL RPMI1640培养液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。
空斑的测定：将表层培养基(lg琼脂糖加双蒸水至lOOmL)加热溶解后，放入45～50℃水浴保温，与等量pH7.2～7.4、2倍浓度的Hank's液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加50μL 1O%SRBC（v/v，用SA缓冲液配制），20μL脾细胞悬液(5×106个/mL)，迅速混匀，倾倒于己刷琼脂糖薄层的玻片上，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中孵育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1：8)加入玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。
血清溶血素的测定
方法：血凝法。取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min) lOmin。将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每只鼠腹腔注射0.2mL进行免疫。4～5天后，除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心lOmin，收集血清。
凝集反应：用生理盐水将血清倍比稀释，将不同稀释度的血清分别置于微量血凝实验板内，每孔1OOμL，再加入lOOμL0.5% (v/v)SRBC悬液，混匀，放入湿润的平盘内并加盖，于37℃温箱孵育3h，观察血球凝集程度。根据血清凝聚程度的级别计算出抗体积数。
小鼠碳廓清试验
方法：按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁(lOmL/kg)，待墨汁注入，立即计时注入墨汁后2、lOmin，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mLO.1%Na2CO3溶液中。各吸0.1mL于96孔酶标板中，用酶标仪在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2C03溶液作阴性对照。
将小鼠处死，取肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称重。
以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力。
按下式计算吞噬指数a。受试样品组的吞噬指数显著高于对照组，可判定该项实验结果阳性：
1.4.6腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
方法：半体内法。制备20%的鸡红细胞悬液；每只鼠腹腔注射1mL该悬液，30min后处死动物，将其仰位固定于鼠板上，开腹，经腹腔注入生理盐水2mL，转动鼠板1min，然后，吸出腹腔洗液1mL，平均分滴于2片载玻片上，37℃温育30min；育毕用生理盐水漂洗，晾干，以1:1的丙酮甲醇溶液固定，4％Giemsa-磷酸缓冲液染色3min，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：
1.4.7 NK细胞活性测定
方法：乳酸脱氢酶(LDH)测定法。
靶细胞的传代(YAC-1细胞)：
实验前24h将靶细胞进行传代培养。用前以Hank's液洗3次，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。
脾细胞悬液的制备（效应细胞）：
无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hank's液洗2次，每次离心lOmin (lOOOr/min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank's液及8mLHanks液，lOOOr/min，lOmin离心，用1mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数（活细胞数应在95%以上），用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），最后用RPM11640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL。
NK细胞活性检测：
取靶细胞和效应细胞各100μL(效靶比50:1)，加入U型96孔培养板中：靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各lOOμL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各1OOμL；上述各项均设三个平行孔，于37℃、5%C02培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清1OOμL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液1OOμL，根据室温不同反应3～lOmin，每孔加入1mol/L的HCL 30μL，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。按下式计算NK细胞活性，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，即可判定该项实验结果阳性：
1.5统计方法
用SPSS软件，单因素方差分析方法及多个实验组和一个对照组均数的两两比较的方法，比较剂量组和对照组是否有差异。如果任何一个剂量组与对照组比较差异具有显著性且增强(P<0.05)，则该实验为阳性。
一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值<FO.05，结论：各组均数间差异无显著性：F值≥FO.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。
对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。
结果
2.1达仁堂牌达仁片对小鼠体重的影响：
达仁堂牌达仁片对小鼠体重无明显影响，各剂量组与阴性对照组比较P>O.05，见表27、表28、表29、表30、表31：
2.2达仁堂牌达仁片对小鼠淋巴器官／体重比值的影响：
达仁堂牌达仁片各剂量组均不能明显增强动物淋巴器官／体重比值，与阴性对照组比较，P>O.05，见表32：
2.3达仁堂牌达仁片对小鼠脾淋巴细胞转化的影响：
达仁堂牌达仁片各剂量组均不能明显增强小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力，与阴性对照组比较P>O.05，见表33。
2.4达仁堂牌达仁片对小鼠迟发型变态反应的影响：
达仁堂牌达仁片各剂量组均不能明显增强小鼠对DNFB诱发的DTH反应，与阴性对照组比较P>O.05，见表33：
2.5达仁堂牌达仁片对小鼠抗体生成细胞检测的影响：
达仁堂牌达仁片高剂量组能显著提高小鼠抗体生成细胞数量，与阴性对照组比较，P<O.05；见表34：
2.6达仁堂牌达仁片对小鼠血清溶血素滴度水平的影响：
达仁堂牌达仁片中、高剂量组能显著性升高小鼠血清溶血素含量，与阴性对照组比较，均为P<O.05；见表35：
2.7达仁堂牌达仁片对小鼠碳廓清功能的影响：
达仁堂牌达仁片高剂量组能显著提高小鼠碳廓清吞噬指数，与阴性对照组比较P<O.05；见表36：
2.8达仁堂牌达仁片对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的影响：
达仁堂牌达仁片高剂量组能显著提高小鼠吞噬百分率和小鼠吞噬指数，与阴性对照组比较，P<O.05；见表37：
2.9达仁堂牌达仁片对小鼠NK细胞活性的影响：
达仁堂牌达仁片高剂量组能明显增强小鼠NK细胞活性，与阴性对照组比较，P<O.05，见表38：
3．结论
根据送检单位提供的去除辅料的原料混合物人群推荐日摄入量0.060g/kg BW扩大10、20、30倍设置低、中、高三个剂量组，即0.60g/kg BW、1.20g/kg BW、1.80g/kg BW，另设阴性对照组。采用SPF级昆明种小鼠，连续灌胃给予，30天后开始检测有关指标。实验结果以P<O.05判断为显著性差异，各剂量组与阴性对照组比较，结果显示：
1)各剂量组均不能明显增强动物淋巴器官／体重比值；
2)各剂量组均不能明显增强小鼠ConA诱导的脾淋巴细胞增殖能力；
3)各剂量组均不能明显增强小鼠对DNFB诱发的DTH反应；
4)高剂量组能显著性提高小鼠抗体生成细胞数量；
5)中、高剂量组能显著性升高小鼠血清溶血素含量；
6)高剂量组能显著性提高小鼠碳廓清吞噬指数；
7)高剂量组能显著性提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数；
8)高剂量组能明显增强小鼠NK细胞活性；
按照增强免疫力功能作用评价程序规定，该受试物具有增强免疫力功能作用。
达仁堂牌达仁片毒理试验：
毒理试验样品采用去辅料的受试样品，每0.546g毒理试验样品相当于定型成品1.0g，定型成品的人群推荐量6.592g/人（60kg）/天等同于受试样品的人群推荐量3.599g/人（60kg）/天，即0.060g/kg.BW。实验结果如下：
（1）达仁堂牌达仁片对两种性别的SPF级昆明种小鼠急性经口毒性试验，累积两次灌胃剂量达15.0g/kg BW（相当于该受试物除去辅料后，成人推荐日摄入量0.060g/kg BW的250倍），在14天的观察期内动物未见明显中毒症状和死亡，该产品MTD值大于15.0g/kg BW，依据急性毒性分级评价标准规定，该受试样品属无毒级；
（2） 二项致突变试验（小鼠骨髓细胞微核试验和精子畸形试验）结果均为阴性；
（3） 30天喂养试验结果表明：将受试样品按1.50、3.00、6.00g/kg BW剂量（分别相当于该受试物除去辅料后，成人推荐日摄入量0.060g/kg BW的25、50、100倍）对SPF级Wistar大鼠连续给予30天，动物未见明显的中毒症状和死亡。受试样品各剂量组大鼠体重、进食量、食物利用率、血液学、血液生化、脏器重量、脏/体比值以及病理组织学等指标与阴性对照组比较，差异均无显著性，结果为未发现该受试样品有明显的毒性作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，实施例仅为解释性的，决不意味着它以任何方式限制本发明的范围，本发明所用到的原料均有市售。其中：
西洋参购自天津格斯宝药业有限公司，中国医药保健品股份有限公司生产。
马鹿茸购自亳州市鸿利德药业有限责任公司，长春市双阳区博隆鹿业有限公司生产。
红景天购自天津市中药饮片厂有限公司。
枸杞子购自天津中新药业集团股份有限公司药材公司。
铁皮石斛购自光明食品集团云南宏晟生物制品有限公司中药饮片厂。
实施例1
西洋参 187.5g 马鹿茸 37.5g
红景天 375g 枸杞子 375g
铁皮石斛 125g 微晶纤维素 80g
甘露醇 198g 交联聚维酮 32g
硬脂酸镁 2.4g 薄膜包衣剂 32g。
其中的薄膜包衣剂指的是：羟丙甲纤维素、三乙酸甘油酯、胭脂红铝色淀、诱惑红铝色淀、柠檬黄铝色淀、靛蓝铝色淀、二氧化钛或滑石粉。
制备方法：
1.前处理：破碎：铁皮石斛破碎，备用；粉碎、灭菌：马鹿茸、西洋参分别粉碎过80目筛，辐照灭菌，备用；过筛：微晶纤维素、甘露醇、交联聚维酮、硬脂酸镁分别过80目筛，备用。
提取、浓缩：取配方量铁皮石斛、枸杞子、红景天加8倍量水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩（80℃，-0.1Mpa）至相对密度1.05～1.15(60℃)的浸膏；
3.稠膏干燥：取浸膏进行喷雾干燥（进风温度为170-180℃，出风温度为95-100℃），过80目筛，得干膏粉；
4.混合：取上述干膏粉、西洋参粉、马鹿茸粉、甘露醇、微晶纤维素用三维混合机混合30分钟，得到混合粉；
5.制粒：混合粉加入60%乙醇制软材，18目筛制粒；将制好的湿颗粒55℃干燥1h至水分5%以下，16目整粒，得干颗粒；
6.总混及压片：制得的干颗粒加入配方比例的交联聚维酮、硬脂酸镁，混合15分钟，得总混物，经压片、包衣制成片剂。
实施例2
西洋参 187.5g 马鹿茸 37.5g
红景天 375g 枸杞子 375g
铁皮石斛 125g 微晶纤维素 80g
甘露醇 285g 交联聚维酮 32g
硬脂酸镁 2.4g 薄膜包衣剂 32g。
其中的薄膜包衣剂指的是：羟丙甲纤维素、三乙酸甘油酯、胭脂红铝色淀、诱惑红铝色淀、柠檬黄铝色淀、靛蓝铝色淀、二氧化钛或滑石粉。
制备方法：
1.前处理：破碎：铁皮石斛破碎，备用；粉碎、灭菌：马鹿茸、西洋参分别粉碎过80目筛，辐照灭菌，备用；过筛：微晶纤维素、甘露醇、交联聚维酮、硬脂酸镁分别过80目筛，备用。
提取、浓缩：取配方量铁皮石斛、枸杞子、红景天加6倍量水煎煮3次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩（70℃，-0.06Mpa）至相对密度1.05～1.15(60℃)的浸膏；
3.稠膏干燥：取浸膏进行喷雾干燥（进风温度为170-180℃，出风温度为95-100℃），过80目筛，得干膏粉；
4.混合：取上述干膏粉、西洋参粉、马鹿茸粉、甘露醇、微晶纤维素用三维混合机混合30分钟，得到混合粉；
5.制粒：混合粉加入60%乙醇制软材，18目筛制粒；将制好的湿颗粒55℃干燥1h至水分5%以下，16目整粒，得干颗粒；
6.总混及压片：制得的干颗粒加入配方比例的交联聚维酮、硬脂酸镁，混合15分钟，得总混物，经压片、包衣制成片剂。
实施例3
西洋参 185g 马鹿茸 35g
红景天 370g 枸杞子 370g
铁皮石斛 120g 微晶纤维素 80g
甘露醇 90g 交联聚维酮 32g
硬脂酸镁 2.4g 薄膜包衣剂 30g。
其中的薄膜包衣剂指的是：羟丙甲纤维素、三乙酸甘油酯、胭脂红铝色淀、诱惑红铝色淀、柠檬黄铝色淀、靛蓝铝色淀、二氧化钛或滑石粉。
制备方法：
1.前处理：破碎：铁皮石斛破碎，备用；粉碎、灭菌：马鹿茸、西洋参分别粉碎过80目筛，辐照灭菌，备用；过筛：微晶纤维素、甘露醇、交联聚维酮、硬脂酸镁分别过80目筛，备用。
提取、浓缩：取配方量铁皮石斛、枸杞子、红景天加10倍量水煎煮2次，每次1小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩（70℃，-0.06Mpa）至相对密度1.05～1.15(60℃)的浸膏；
3.稠膏干燥：取浸膏进行喷雾干燥（进风温度为170-180℃，出风温度为95-100℃），过80目筛，得干膏粉；
4.混合：取上述干膏粉、西洋参粉、马鹿茸粉、甘露醇、微晶纤维素用三维混合机混合30分钟，得到混合粉；
5.制粒：混合粉加入60%乙醇制软材，18目筛制粒；将制好的湿颗粒55℃干燥1h至水分5%以下，16目整粒，得干颗粒；
6.总混及压片：制得的干颗粒加入配方比例的交联聚维酮、硬脂酸镁，混合15分钟，得总混物，经压片、包衣制成片剂。
实施例4
西洋参 190g 马鹿茸 40g
红景天 380g 枸杞子 380g
铁皮石斛 130g 微晶纤维素 240g
甘露醇 290g 交联聚维酮 40g
硬脂酸镁 32g 薄膜包衣剂 40g。
其中的薄膜包衣剂指的是：羟丙甲纤维素、三乙酸甘油酯、胭脂红铝色淀、诱惑红铝色淀、柠檬黄铝色淀、靛蓝铝色淀、二氧化钛或滑石粉。
制备方法：
1.前处理：破碎：铁皮石斛破碎，备用；粉碎、灭菌：马鹿茸、西洋参分别粉碎过80目筛，辐照灭菌，备用；过筛：微晶纤维素、甘露醇、交联聚维酮、硬脂酸镁分别过80目筛，备用。
提取、浓缩：取配方量铁皮石斛、枸杞子、红景天加8倍量水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液减压浓缩（70℃，-0.06Mpa）至相对密度1.05～1.15(60℃)的浸膏；
3.稠膏干燥：取浸膏进行喷雾干燥（进风温度为170-180℃，出风温度为95-100℃），过80目筛，得干膏粉；
4.混合：取上述干膏粉、西洋参粉、马鹿茸粉、甘露醇、微晶纤维素用三维混合机混合30分钟，得到混合粉；
5.制粒：混合粉加入60%乙醇制软材，18目筛制粒；将制好的湿颗粒55℃干燥1h至水分5%以下，16目整粒，得干颗粒；
6.总混及压片：制得的干颗粒加入配方比例的交联聚维酮、硬脂酸镁，混合15分钟，得总混物，经压片、包衣制成片剂。
Claims (3)
1.一种增强免疫力的中药片剂，其特征在于原料由下述成分组成：
西洋参 185-190g
马鹿茸 35-40g
红景天 370-380g
枸杞子 370-380g
铁皮石斛 120-130g
微晶纤维素 80-240g
甘露醇 90g-290g
交联聚维酮 32-40g
硬脂酸镁 2.4-32g
薄膜包衣剂 30-40g。
2.权利要求1所述增强免疫力的中药片剂，其特征在于原料由下述成分组成：
西洋参 187.5g
马鹿茸 37.5g
红景天 375g
枸杞子 375g
铁皮石斛 125g
微晶纤维素 80g
甘露醇 198g-285g
交联聚维酮 32g
硬脂酸镁 2.4g
薄膜包衣剂 32g。
3.权利要求1所述增强免疫力的中药片剂在制备用于增强免疫力、缓解体力疲劳药物中的应用。
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| 石斛洋参冲剂的药理作用研究;李莉等;《中成药》;19951231(第10期);第28-30页 * |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: No.21, 10th Street, Binhai New Area Development Zone, Tianjin 300457 Patentee after: Jinyao Darentang Group Co.,Ltd. Darentang Pharmaceutical Factory Address before: No. 21, Tenth Street, Development Zone, Tanggu District, Tianjin 300457 Patentee before: DARENTANG PHARMACEUTICAL FACTORY, TIANJIN ZHONGXIN PHARMACEUTICAL GROUP Co.,Ltd. |