CN101360831B - 来自原核细胞的重组n-糖基化蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组的N-糖基化蛋白，包括一种或一种以上引入的N-糖基化优化氨基酸序列、编码这些蛋白的核酸和相应的载体和宿主细胞。另外，本发明介绍了所述蛋白、核酸、载体和宿主细胞在制备药物过程中的应用。而且，本发明提供了制备所述蛋白的方法。

Description

来自原核细胞的重组N-糖基化蛋白
本发明涉及N-糖基化蛋白的重组，包括一种或一种以上引入的N-糖基化优化氨基酸共有序列、编码这些蛋白的核酸和相应的载体和宿主细胞。另外，本发明介绍了所述蛋白、核酸、载体和宿主细胞在制备药物过程中的应用。而且，本发明提供了制备所述蛋白的方法。
背景技术
N-连接的蛋白质糖基化作用是真核生物内质网上发生的一种基本的且保守的过程。这一过程对于蛋白质折叠、低聚反应、稳定性、质量控制、分类和分泌物及膜蛋白的传递十分重要(Helenius，A.，and Aebi，M.(2004)。N-连接的聚糖在内质网中的作用Annu.Rev.Biochem.73，1019-1049).
蛋白质糖基化作用对蛋白质的抗原性、稳定性和半衰期具有明显的影响。另外，糖基化作用可以通过色谱法，例如通过结合在固相上的外源凝集素配体与蛋白质糖基化部分的相互作用帮助蛋白质纯化。因此，已经有完整的实施方法在真核细胞中重组生产糖基化的蛋白质，从而提供生物学上和药学上有效的糖基化模式。
近几年，有研究指出，一种细菌，食物传播病原菌空肠弯曲杆菌可以N-糖基化其蛋白质(参见Szymanski，等人1999年所著的文献《空肠弯曲杆菌中普通蛋白糖基化作用的证据》发表于MoI.Microbiol.32，1022-1030)。糖基化作用所需的机理被聚集在所谓PgI区域的12个基因编码。N-糖基化作用的破坏影响空肠弯曲杆菌的侵入和发病机理，但在大多数真核生物中这并不是致命的(参见Burda P.和M.Aebi，1999年发表的文献《N-糖基化作用的长醇途径》Biochim Biophys Acta 1426(2)：239-57)。可以通过在大肠杆菌中同时重组表达pgI区域和受体糖蛋白来重新组成空肠弯曲杆菌蛋白的N-糖基化作用(Wacker等人2002年发表的文献《空肠弯曲杆菌中N-连接的糖基化作用机其向大肠杆菌中的功能性转移》Science 298，1790-1793)。
欧洲专利申请第03 702 276.1号(欧洲专利1 481 057)，是本发明发明人的一个早期的发明，它教导了一种原核生物体，向此原核生物体引入一种核酸，来编码(i)为了在脂质体载体中组成低聚糖的具体的糖基化转移酶，(ii)一种包括共有序列″N-X-S/T″的重组靶向蛋白质，其中X可以是除脯氨酸之外的任何一种氨基酸，和(iii)一种空肠弯曲杆菌的低聚糖基转移酶(OTase)这种转移酶将所述低聚糖共价连接到靶向蛋白质的共有序列上。所述原核生物体产生具有特异性结构的N-聚糖，这种特异性结构是由具体的糖基化转移酶的种类所决定的。
即使在蛋白质中存在的已知的N-糖基化共有序列允许靶向蛋白质，包括空肠弯曲杆菌的低聚糖基转移酶(OTase)，在原核生物体中进行N-糖基化重组，但是这些靶向蛋白质的N-糖基化作用往往效率较低。
本发明的目的是提供蛋白和生产这种具有优化的N-糖基化作用的蛋白的方法和途径，所述N-糖基化作用可以在原核生物体内产生。本发明的另一个目的是在重组蛋白中更有效的引入N-聚糖，从而修饰重组蛋白的抗原性、稳定性、生物活性、预防和/或治疗活性。本发明进一步的目的在于提供一种宿主细胞，所述宿主细胞能够在其表面有效展示本发明的重组N-糖基化蛋白。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种重组N-糖基化蛋白，所述N-糖基化蛋白包括一种或一种以上的以下N-糖基化优化的氨基酸序列：
D/E-X-N-Z-S/T，(优化的共有序列)
其中，X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意天然氨基酸，其中向至少一种中引入所述局部N-糖基化的氨基酸序列。
令人吃惊的发现，向蛋白质中引入指定的部分氨基酸序列(优化的共有序列)能够得到一种蛋白质，这种蛋白质通过低聚糖基转移酶(OST，OTase)在引入位点进行有效地N-糖基化，其中所述低聚糖基转移酶(OST，OTase)来自弯曲杆菌属细菌，优选空肠弯曲杆菌。
文中使用的术语″部分氨基酸序列″是指″优化的共有序列″。优化的共有序列通过低聚糖基转移酶(OST，[MWI]OTase)进行N-糖基化，其中所述低聚糖基转移酶(OST，OTase)来自弯曲杆菌属细菌，优选空肠弯曲杆菌，所述共有序列比本发明所属技术领域的现有技术中常用的共有序列″N-X-S/T″更加有效。
通常，术语″重组N-糖基化蛋白质″是指任何一种产生在宿主细胞中的异源的聚或低聚肽，所述宿主细胞不天然地包括编码所述蛋白质的核酸。在本发明环境中，该术语是指通过在任何一种宿主细胞中重组产生的蛋白质，其中所述宿主细胞例如真核的或原核的宿主细胞，优选原核宿主细胞，例如埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、幽门螺杆菌、假单胞菌属、杆菌，更优选大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌等等，其中编码所述蛋白质的核酸已经被引入所述宿主细胞中，且其中编码的蛋白质通过来自弯曲杆菌属细菌，优选空肠弯曲杆菌的OTase进行N-糖基化，所述转移酶天然存在于宿主细胞中或被重组整入所述宿主细胞。
依照国际上普遍接受的氨基酸字母代码，缩写D、E、N、S和T分别表示天冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、丝氨酸和苏氨酸。本发明蛋白质与天然的或现有技术中记载的蛋白质之间的区别在于引入了一个或一个以上优化的共有序列D/E-X-N-Z-SfT，并发生N-糖基化。因此，本发明的蛋白质与天然存在的空肠弯曲杆菌蛋白质的区别在于，虽然天然存在的空肠弯曲杆菌蛋白质也包含优化的共有序列，但他不包含任何一种其他的(引入的)优化共有序列。
优化的共有序列的引入可以通过添加、删除和/或取代一种或一种以上氨基酸来完成。为了实现引入优化共有序列的目的而进行的一种或一种以上氨基酸的添加、删除和/或取代可以通过本领域普通技术人员已知的化学合成方式来完成，所述本领域普通技术人员已知的化学合成方式例如固相参与的化学肽合成过程。作为选择，本发明的蛋白，可以通过标准重组技术，优选大的多肽的重组技术来制备。
本发明的蛋白质具有以下优点，即它们可以在任何一种原核宿主中高效生产，其中原核宿主包括一种来自弯曲杆菌属细菌、优选空肠弯曲杆菌的功能性pg1操纵子。为了实现本发明的实施方案，优选可供选择的来自弯曲杆菌属细菌的OTases是大肠弯曲杆菌和红嘴鸥弯曲杆菌(参见Szymanski，CM和Wren，B.W.(2005)等人所著的名为《细菌粘膜病原体中的蛋白质糖基化作用》Nat.Rev.Microbiol.3：225-237)。当所述原核宿主是弯曲杆菌属细菌、优选空肠弯曲杆菌时，天然存在功能性pg1操纵子。然而，如本领域之前的研究和上面的描述，pg1操纵子可以被传递进入细胞中并在所述新的细胞环境中保持功能性。
术语″来自弯曲杆菌属细菌、优选空肠弯曲杆菌的功能性pg1操纵子”是指编码功能性弯曲杆菌属细菌，优选空肠弯曲杆菌低聚糖基转移酶(OTase)和一个或一个以上能够在脂类载体中集合低聚糖的特异性糖基化转移酶的核酸簇，其中，所述低聚糖可以通过OTase从脂类载体中转移到靶向蛋白质中，所述靶向蛋白质具有一个或一个以上优化氨基酸序列：D/E-X N-Z-S/T。应当理解本发明中的术语“来自弯曲杆菌属细菌、优选空肠弯曲杆菌的功能性pg1操纵子”不需要涉及单一转录单位的操纵子。该术语仅仅需要在一个宿主细胞中存在用于重组蛋白质N-糖基化作用的功能成分。这种成分可以作为一种或一种以上单独的mRNAs转录并且可以被同时调节或分别。例如，本术语也包括在宿主细胞基因DNA和质粒位点上的功能成分。为了提高效率，优先同时调节并表达功能性pg1操纵子的所有成分。
认识到以下几点是非常重要的，即：只有功能性低聚糖基转移酶(OTase)来自弯曲杆菌属细菌、优选空肠弯曲杆菌；且一种或一种以上的能够在脂类载体上集合低聚糖的特异性糖基化转移酶可以来自宿主细胞或者可以被重组引入所述宿主细胞，唯一的功能性限制是通过所述糖基化转移酶集合的低聚糖可以通过OTase从脂类载体转移到具有一个或一个以上优化共有序列的靶向蛋白质中。因此，天然包括特异性糖基化转移酶的宿主细胞和/或非天然存在特异性糖基化转移酶的宿主细胞的选择，和异源特异性糖基化转移酶的引入使本领域技术人员能够改变在本发明蛋白质同一位点进行N-糖基化作用时结合的N-聚糖。
如上所述，本发明提供了本发明蛋白质上不同的N-聚糖-模式设计。因此，这些蛋白质可以通过其N-聚糖模式相区别，从而满足生物学、药学和纯化需要。
在一种优选的实施方案中，本发明蛋白质可能包括一个，也可以多于一个，优选至少两个、优选至少3个、更优选至少5个所述N-糖基化优化氨基酸序列。
在本发明蛋白质中存在的一个或一个以上N-糖基化优化的氨基酸序列对增加它们的抗原性、增加它们的稳定性、改变它们的生物活性、延长它们的生物半衰期和/或简化它们的纯化过程十分有利。
优化的共有序列在X和Z位置可以包括除了脯氨酸之外的任何一种氨基酸。术语″任何一种氨基酸″包括常见的和不常见的天然氨基酸以及合成的氨基酸衍生物和允许通过OTase进一步N-糖基化优化共有序列的类似物。优选用于X和Z的是天然存在的常见的和不常见的氨基酸，且X和Z可以是相同的也可以是不同的。
应当注意，在本发明蛋白质中，对于每个优化的共有序列X和Z可以是不同的。
当在脂类载体上集合低聚糖用于通过OTase传递时，通过特异性糖基化转移酶及其相互作用来确定结合优化共有序列的N-聚糖。通过改变存在于理想宿主细胞中的特异性糖基化转移酶的类型和用量，本领域技术人员可以设计N-聚糖。
这里定义的N-聚糖例如可变组合物的单-、寡-或多糖，该可变组合物在蛋白质中通过N-配糖键与ε-天门冬酰胺残基的酰胺态氮相连。优选地，通过OTase传递的N-聚糖在十一葵烯醇-焦磷酸盐脂质体-载体上集合，所述十一葵烯醇-焦磷酸盐脂质体-载体存在于革兰氏阴性或阳性细菌的细胞质膜上。它们与O抗原、O多糖和肽聚糖的有关(Bugg，T.D.，and Brandish，P.E.(1994).From peptidoglycan to glycoproteins：common features oflipid-linked oligosaccharide biosynthesis.FEMS Microbiol Lett 119，255-262；Valvano，M. A.(2003).Export of O-specificlipopolysaccharide.Front Biosci 8，S452-471).
在一种优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质包括一个或一个以上N-聚糖，所述N-聚糖选自：来自弯曲杆菌属细菌、优选空肠弯曲杆菌的N-聚糖；寡糖和多糖被转入O抗原中在革兰氏阴性细菌中形成的O多糖或在革兰氏阳性细菌，优选绿脓杆菌09、011，大肠杆菌O7、O9、O16、O157和志贺氏痢疾杆菌O1中形成的荚膜多糖衍生得到的N-聚糖及其通过插入或删除糖基化转移酶和差向异构酶改变多糖结构得到的工程变体。
在进一步优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质包括两个或两个以上不同的N-聚糖。
例如，可以通过使用较早或较晚的启动子或引入启动因子、沉默因子、增强因子和/或减少因子来启动、沉默、增强和/或减少单独的特异性糖基化转移酶的启动子活性，来控制特异性糖基化转移酶表达的次数，从而在相同蛋白质上来制备不同的N-聚糖。合适的启动子和调节启动子活性的因子对本领域技术人员来讲是已知的，在此不作进一步论述。
本发明没有限制重组蛋白质的来源。所述蛋白质优选衍生于哺乳动物、细菌、病毒、真菌或植物蛋白。更优选的，蛋白质衍生于哺乳动物，最优选的衍生于人蛋白。为了制备本发明抗原重组蛋白质，尤其是用作疫苗活性组分的蛋白质，优选的重组蛋白质衍生于细菌、病毒或者真菌蛋白质。
在一种进一步优选的实施方案中，本发明提供了一种重组蛋白质其中的蛋白质和/或N-聚糖具有治疗和/或预防活性。至少一个优化的和N-糖基化的共有序列的引入可以为一种蛋白质改进或者引入治疗和/或预防活性。在更优选的实施方案中，蛋白质和/或N-聚糖具有免疫活性。在这种情况下，引入的N-糖基化作用可能对蛋白质生物活性带来一种修饰性影响，和/或引入新的抗原位点和/或可以掩盖蛋白质从而避过降解步骤和/或延长半衰期。
本发明的重组蛋白质可以有效地靶向宿主细胞的外膜和/或表面，其中，所述宿主细胞优选细菌，更优选革兰氏阴性细菌。为了有助于表面表达和/或外膜定位，本发明的重组蛋白质优选进一步包括至少一个多肽序列，该多肽序列能够靶向所述重组蛋白质到细菌、优选革兰氏阴性细菌的外膜和/或细胞表面上。
在一种优选的实施方案中，本发明的重组蛋白质是一种蛋白质，其中所述靶向多肽序列选自由I1型信号肽(Paetzel，M.，Karla，A.，Strynadka，N.C.，and Dalbey，R.E.2002.Signal peptidases.Chem Rev 102：4549-4580.)或外膜蛋白(参见Wemerus，H.，andStahl，S.2004.Biotechnological applications for surface-engineeredbacteria.Biotechnol Appl Biochem 40：209-228.[mk2])组成的组中，优选的选自由空肠弯曲杆菌OmpH1全长蛋白质或信号肽、空肠弯曲杆菌的JIpA、大肠杆菌外膜蛋白、优选OmpS、OmpC、OmpA、OprF、PhoE、LamB、Lpp′OmpA(一种用于表面表达工艺的融合蛋白质，参见Francisco，JA1 Earhart，C.F.，andGeorgiou，G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase tothe external surface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA89：2713-2717.)和来自绿脓杆菌的lnp蛋白质所组成的组中。
在其他方面，本发明涉及一种编码本发明重组蛋白质的核酸。优选的，所述核酸是一种信使核糖核酸、一种DNA或一种PNA，更优选的所述核酸是信使核糖核酸或DNA，最优选的，所述核酸是一种DNA。这种核酸可以包括编码所述蛋白质的序列，另外，其他序列，例如调节序列，例如启动子、增强子、终止密码子、起始密码子和通过之前提到的调节序列调节重组蛋白质表达所需要的基因，等等。术语“编码本发明重组蛋白质的核酸”是指一种核酸，这种核酸包括所述编码序列和任选地其他核酸序列，只要序列信息使核酸在宿主细胞中生产本发明的重组蛋白质，所述宿主细胞包含来自弯曲杆菌属细菌，优选空肠弯曲杆菌的功能性pg1操纵子。更优选地，本发明提供了分离并纯化的核酸，所述核酸与启动子可操作的相连，优选连接的启动子选自由已知可归纳的和构成的原核启动子所组成的组，更优选四环素启动子、阿拉伯糖启动子、水杨酸盐启动子、lac-、trc-、和tac启动子(Baneyx，F.(1999).Recombinant protein expression inEscherichia coli.Curr Opin Biotechnol 10，411-421；Billman-Jacobe，H.(1996).Expression in bacteria other thanEscherichia coli.Curr Opin Biotechnol 7，500-504)。所述可操作连接的核酸可以用于，例如，接种疫苗。
此外，本发明的另一方面涉及一种包括本发明核酸和/或载体的宿主细胞。宿主细胞的种类并不仅限于它能够调节来自空肠弯曲杆菌的功能性pg1操纵子和一个或一个以上编码本发明重组靶向蛋白质的核酸。优选的宿主细胞是原核的宿主细胞，更优选的是细菌，最优选的是选自由埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、幽门螺杆菌、假单胞菌属、杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌链Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6和SCM7(Feldman等人的，(2005).《在大肠杆菌中具有不同的O抗原脂多糖结构的N-连接的蛋白质糖基化作用机制》Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 102，3016-3021；Alaimo，C，Catrein，I.，Morf，L.，Marolda，C.L.，Callewaert，N.，Valvano，M.A.，Feldman，M.F.，Aebi，M.(2006).《改变脂质体连接的寡糖的两个不同的但可互换的机理》EMBO Journal 25，967-976)、和肠道沙门菌链SL3261(肠道沙门菌LT2(Δ)aroA，参见Hoiseth、S.K.，和StockerB.A.1981，《芳香-依赖型鼠伤寒沙门氏杆菌是非毒性的且有活性疫苗的效力》和SL3261ΔwaaL所组成的组中。
在一种更优选的实施方案中本发明宿主细胞可以靶向外膜和/或表面显示本发明重组蛋白质，优选所述宿主细胞是一种重组革兰氏阴性细菌，其中具有：i)一种基因型，所述基因型包括一种核苷酸序列，该核苷酸序列用于编码a)至少一个天然的或重组特异性糖基转移酶，用于装配在脂质体载体上的低聚糖，b)至少一个天然的或重组的来自弯曲杆菌属细菌，优选空肠弯曲杆菌的原核低聚糖基转移酶(OTase)，c)至少一个本发明重组蛋白质，优选进一步包括一种靶向多肽的蛋白质；和ii)一种表现型，该表现型包括本发明的重组N-糖基化蛋白质，该蛋白质位于和/或在革兰氏阴性细菌的外膜上。
用于上述实施方案的宿主细胞优选地选自由埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、志贺氏菌属、幽门螺杆菌和假单胞菌属、沙门氏菌、优选大肠杆菌、更优选大肠杆菌链Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6和SCM7、和肠道沙门杆菌链SL3261、SL3749和SL326iΔwaaL(参见Hoiseth，S.K.，和Stocker，B.A.1981.《芳香-依赖型鼠伤寒沙门氏杆菌是是非毒性的且有活性疫苗的效力》Nature 291：238-239)、SL3749(Kaniuk，N.A.，Vinogradov，E.和Whitfield，C.2004.《用于在沙门氏菌中连接O抗原的脂多糖核心受体结构强度规范调查：WaaL″连接酶″不是唯一决定受体特异性的决定簇》，JBiol Chem 279：36470-36480)。
由于本发明优选的蛋白质可以单独和/或通过引入N-糖基化作用位点来具有治疗或预防活性，因此可以用于制备药剂。用于实现本发明的蛋白质的种类不受限制且因此，本发明的蛋白质，列如EPO、IFN-α、TNFa1α、IgG、IgM、IgA、白细胞间介素、细胞因子，用于疫苗的病毒和细菌蛋白质，如空肠弯曲杆菌蛋白质仅举数例例如HisJ(CjO734c)、AcrA(CjO367c)、OmpH1(CjO982c)、白喉毒素(CRM 197)、霍乱毒素、绿脓杆菌外源蛋白，及其具有引入的优化N-糖基化的共有序列，用于制备药剂(Wyszynska、A.，Raczko、A.，Lis，M.、和Jagusztyn-Krynicka，E.K.(2004)。《具有无致病力的沙门氏菌疫苗株，能够传送空肠弯曲杆菌72Dz/92cjaA基因引起人体对野生型弯曲杆菌属细菌入侵的特异性体内免疫反应的鸡口服免疫作用》，Vaccine 22，1379-1389)。
另外，本发明的核酸和/或载体还可用于制备一种药剂，优选用于基因治疗的药剂。
此外，本发明宿主细胞，优选具有包括本发明N-糖基化重组蛋白质表现型的宿主细胞位于和/或在细菌，优选一种革兰氏阴性细菌，更优选上面列举的革兰氏阴性细菌中的任意一个的外膜上，所述宿主细胞尤其可用于制备药剂。
更优选地，本发明的蛋白质用于制备一种用于治疗和/或预防有需要的患者的疫苗。
在更优选的实施方案中本发明涉及本发明的核酸和/或载体在制备用于治疗或预防，优选地通过基因治疗法治疗或预防有需要的患者的药剂中的应用。
展示所述N-糖基化重组蛋白质的本发明宿主细胞尤其可用于制备疫苗，由于被展示的N-糖基化蛋白质在宿主细胞表面上和接近免疫细胞，尤其是其亲水性N-聚糖的孔附近的大量表达，同时由于活性助剂的存在，宿主细胞具有一些附加作用，这些助剂甚至可以在某种程度上进行复制并扩增宿主细胞的疫苗作用。
优选地，用于实现本发明医药的用途的宿主细胞是一种被减弱的或被杀死的宿主细胞。
使用本发明的宿主细胞制备药剂，优选疫苗的另一个优点是由于他们的细胞组分，宿主细胞可以诱导IgA抗体。
优选地，根据本发明所述宿主细胞用于在动物，优选哺乳动物、啮齿动物、绵羊、马、犬齿、牛、或人体内诱导IgA抗体。
优选的，所述需要接种疫苗的患者是鸟类、哺乳动物或鱼，优选哺乳动物，更优选选自由牛、羊、马、家犬、猫、和人所组成的组，最优选是人。也优选家禽。
本发明的进一步方面涉及一种药物组合物，包括至少一个蛋白质，至少一个核酸，至少一个载体和/或至少一个根据本发明的宿主细胞。包括蛋白质或宿主细胞，优选减弱或被杀死的宿主细胞的药剂的制备和包括用于基因治疗的核酸和/或载体的药剂的制备在本领域内是已知的。最终药物组合物的制备方案和其给药的方式和细节取决于使用的蛋白质、宿主细胞、核酸和/或载体。
在本发明优选地实施方案中，本发明的药物组合物包括一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或助剂。
本发明提供的药物组合物包括下列成分中的至少一种：(i)一种重组蛋白质、一种宿主细胞、一种核酸和/或一种作为/编码/表达本发明重组蛋白的重组载体，和(ii)一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或助剂。
合适的赋形剂、稀释剂和/或助剂在本领域内是已知的。一种赋形剂或稀释剂可以是固体材料、半固体材料或液体材料，他们可以用作活性成分的载体或介质。制备组合物领域的普通技术人员根据选择产品的特定性质、需要治疗的疾病或病况、疾病或病况的阶段和其他相关情况可以很容易的选择合适的形式和给药方式(雷明顿药物科学，Mack出版公司(1990))。根据所选择的药学活性化合物的溶解性和化学性质、选择的给药途径和标准药学操作确定药学上可接受的稀释剂或赋形剂的比例和性质。所述药物可以被制成适于口服、肠胃外给药或局部使用的形式，可以作为片剂、胶囊、栓剂、溶液、悬浮液等等对患者给药。本发明药学上可接受的化合物，尽管其本身是有效的，但是为了更加稳定、方便结晶、增加稳定性等等，也可以被配制成或者作为其药学上可接受的盐的形式，例如酸加成盐或减加成盐的形式给药。
本发明的进一步方面介绍了用于生产N-连接的糖基化蛋白质的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供一种重组有机物，优选原核有机物，这种有机物包括用于编码下列物质的核酸：
i)一种来自弯曲杆菌，优选空肠弯曲杆菌的功能性pg1操纵子，和
ii)至少一个重组目标蛋白，该重组目标蛋白包括一个或一个以上的如下N-糖基化优化氨基酸共有序列：D/E-X-N-Z-S/T，其中，X和Z可以是除了辅氨酸之外的任意氨基酸，且其中，至少一个所述N-糖基化优化的氨基酸共有序列是被引入的，且
b)以适于N-糖基化的目标蛋白质生产的方式培养重组有机物。
优选地，目标蛋白质是本发明上述重组蛋白质中的一个。
在本发明优选地方法中，来自弯曲杆菌，优选空肠弯曲杆菌的功能性操纵子pg1包括编码下列物质的核酸：
i)来自弯曲杆菌，优选空肠弯曲杆菌的重组OTase，和
ii)来自弯曲杆菌，优选空肠弯曲杆菌的重组的或天然的特异性糖基化转移酶；和/或
iii)来自除了弯曲杆菌之外的重组的或天然的特异性糖基化转移酶；
用于在脂质载体上组装寡糖并通过OTase转移成目标蛋白。
此外，在一种优选的实施方案中，本发明涉及用于制备本发明宿主细胞的方法，所述方法包括一下步骤：i)提供了一种革兰氏阴性细菌，ii)向所述细菌中引入至少一个核苷酸序列，所述核苷酸序列用于编码a)至少一个用于在脂质体载体上组装低聚糖的重组特异性糖基转移酶，和/或b)至少一个来自弯曲杆菌属细菌、优选空肠弯曲杆菌的重组低聚糖基转移酶(OTase)，和/或c)至少一个重组蛋白质，所述重组蛋白质包括一个或一个以上下述N-糖基化优化的氨基酸共有序列：D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是任何一种除脯氨酸之外的天然的氨基酸，并且其中至少一个所述N-糖基化优化氨基酸共有序列是被引入的，和iii)培养所述细菌直到至少一个c)中核苷酸序列编码的重组N-糖基化蛋白质被放置在革兰氏阴性细菌的外膜中和/或外膜中。
为了实现上述优选的方法，重组原核生物体或宿主细胞优选地选自由埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、幽门螺杆菌、假单胞菌属、杆菌，优选大肠埃希氏杆菌，优选大肠杆菌株Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6和SCM7、和S.enterica株SL3261、SL3749和SL326iΔwaaL。
另一个优选的用于生产、分离和/或纯化本发明重组蛋白质的方法包括以下步骤：a)根据权利要求15或16培养宿主细胞，b)去掉所述重组革兰氏阴性细菌的外膜和c)复原所述重组蛋白质。
用于去掉细胞外膜，优选原核细胞外膜，更优选革兰氏阴性细菌细胞外膜的示范性方法是适当的酶催化处理方法、渗透压休克净化溶解作用和法国热蒸气高压方法。最优选的，本发明涉及一种方法，其中除了来自弯曲杆菌属细菌，优选空肠弯曲杆菌的重组或天然的特异性糖基化转移酶选自来自细菌、archea和/或真核生物的糖基化转移酶和差向异构酶，其中所述真核生物可以在宿主细胞中功能性表达。
附图说明
图1表示了来源于构建物A到C(参见实施例1)的Lip蛋白质的N-糖基化作用。传送来自空肠弯曲杆菌功能性pg1操纵子的大肠杆菌Top 10细胞(Wacker et al.，2002，supra)和编码构建物A(第2条带线)、B(第1条带线)和C(第3条带线)或构建物C具有突变D121A的突变体(第4条带线)的质粒。表达蛋白质并从周质提取物中纯化。图中显示的是SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色剂染色的纯化蛋白质部分。
图2表示了不同蛋白质的N-糖基化作用分析，在CLM24细胞中(Feldman et al.，(2005).在大肠埃希氏杆菌中用不同的O抗原脂多糖结构引发N-连接的蛋白质糖基化作用。Proc.Natl.Acad.Sci.U S A 102，3016-3021)或Top10细胞中(E组第1-6条带)或SCM7细胞中(Alaimo，C，Catrein，I.，Morf，L.，Marolda，C.L.Callewaert，N.Valvano，M.A.，Feldman，M.F.，Aebi，M.(2006).用于改变脂质体-连接寡糖的两个不同但可互换的机理.EMBOJournal 25，967-976)(E组，第7、8条带)表达来自质粒中的所述蛋白质，分析所述蛋白质通过空肠弯曲杆菌pg1操纵子(Wackeret al.，2002，supra)进行的序列特异性N-糖基化作用。显示的是SDS-PAGE分离的周质提取物，所述周质提取物被转入硝化纤维膜并用特异性抗血清目测检验。在组A-D中，最上面的组显示具有抗AcrA免疫血清的免疫印迹探针(Wacker et al.2002，supra；Nita-Lazar，M.，Wacker，M.，Schegg，B.，Amber，S.，andAebi，M.(2005).细菌N-连接的蛋白质糖基化作用需要但并不只需要N-X-S/T共有序列.Glycobiology 15，361-367)，然而底部的组显示具有R12免疫血清的免疫印迹探针(Wacker et al.，2002，supra)。+和-表示细胞中存在功能性或突变体pg1操纵子。组A包含可溶性野生型AcrA的样品，所述样品带有pe1B信号顺序和己histag(第1、2条带)、AcrA-N273Q(第3、4条带)、和AcrA-D121A(第5条带)。组B：AcrA(第1、2条带)、AcrA-T145D(第3条带)、AcrA-N123Q-N273Q-T145D(第4、5条带)。组C：AcrA-F115D-T145D(第1、2条带)、AcrA-N123Q-N273Q-N272D(第3、4条带)。组D：AcrA-N273Q(第1、2条带)、AcrA-N273Q-F122P(第3、4条带)。组E：CtxB(第1、2条带)、CtxB-W88D(第3、4条带)、CtxB-Q56/DSNIT(第5、6条带)和CtxB-W88D-Q56/DSNIT。
图3表示了OmpH1上多重糖基化位点的机制。ΔwaaL株SCM6与质粒pACYCpg1(编码整个pg1位点)和表达野生型OmpH1(第1条带)，OmpH1N139S-myc(第2条带)，OmpH1KGN→NIT，HFGDD→DSNIT_myc(第3条带)QmpH 1 RGD→NIT，HFGDD→DSNIT-myC(第4条带)，QmpH1KGN→NIT，RGD→NIT_myc(第5条带)，OmpH1KQN-NiT.RGD→N.T.HFGDD→DSNIT_myc(第6条带)或OmpH1RGD→NIT V83T-myc(第7条带)的质粒共转化。细胞在有氧条件下生长，分析前用0.5％阿拉伯糖诱变3小时。在如材料和方法部分所述，平衡培养基的光学密度之后，TCA沉淀全细胞溶菌液。用15％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜上。第一组，以抗myc tag抗体为探针的全细胞溶菌液的免疫印迹。下面一组，以聚糖-特异性抗血清为探针的全血溶菌液免疫印迹。右边显示了未进行糖基化的和糖基化的OmpH1。
图4，表达不同OmpH1变体的细胞的荧光显微镜方法。包含野生型OmpH1及其变体表达质粒的大肠杆菌菌株CLM24或SCM6的培养基被平衡为OD600为0.25/ml。用磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞两次，将100μl pH为7.4的细胞悬浮液倒在成凝胶状的玻璃板上，在增湿室中室温条件下(RT)培养30分。全细胞免疫荧光标记的所有随后的步骤都在增湿室中，室温条件下进行。除去未结合的细胞，再室温条件下用4％包含磷酸缓冲液的多聚甲醛固定剩余物30分钟。重要的是，通常认为多聚甲醛不能够使细胞可渗透化但能够通过完整的细胞膜使细胞保持compartimentalization。用磷酸缓冲液洗涤固定细胞两次并在包含5％BSA磷酸缓冲液的封闭液中重悬浮。封闭后，所述细胞与抗-myc单克隆鼠IgG(1∶50，Calbiochem)和/或抗-聚糖抗血清(1∶4000)一起在100μL包含5％BSA的磷酸缓冲液中培养1小时。用100μL磷酸缓冲液洗涤细胞两次，每次5分钟并与结合FITC(1∶250，Jackson lmmunoresearch Laboratories)的第二抗-兔抗体和/或结合Cy3(1∶250，Jackson lmmunoresearchLaboratories)的抗-鼠抗体一起在100μL包含5％BSA的磷酸缓冲液中培养1小时。如果需要的话，在第二抗体培养过程中用4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)(Sigma)(0.5μg/ml)对细菌DNA染色。从细胞磷酸缓冲液中洗去第二抗体，通过使用封片剂(Vector实验室)将盖片盖在玻璃板上封固培养基并用指甲油密封。使用Axioplan2显微镜(Carl Zeiss)进行荧光显微镜方法。使用Adobe Photoshop CS2版处理图片。SCM6细胞表达OmpH1(A组)，OmpH1N139S(B组)，OmpH1C20S(C组)，OmpH1KGN→NIT HFGDD→DSNIT(D组)，OmpH1RGD→NIT，HFGDD→DSNIT(E组)，OmpH1KGN_NIT RGD→NIT(F组)，OmpH1V83T，KGN→NIT(G组)，和OmpH1KGN→NIT RGD→NIT，HFGDD→DSNIT(H组)。第1栏是第2、3、4栏图片的合并，是在黑色背景下由灰色调表示。第2栏：是由于DAPI染色在灰色背景下显示蓝荧光，第3栏：从聚糖特异性荧光中显示绿荧光，第4栏：从抗-myc染色中显示红荧光。
下面的实施例能够进一步说明本发明，但并不以任何方式作为对本发明的限制。
实施例
AcrA作为模型蛋白的筛选，用于优化N-糖基化
为了优化N-糖基化所需的受体蛋白，在空肠弯曲杆菌糖蛋白AcrA(Cj0367c)上进行详细的研究。AcrA是一种由350个氨基酸残基组成的周质脂蛋白。已有文献表明，向周质部分分泌但并不锚地脂质体的分泌物是糖基化作用所必需的(Nita-Lazar etal.，2005，supra)。当在有5个潜在的N-连接的糖基化sequons(N117，N123，N147，N273，N274)的大肠杆菌中表达时，输出信号即可以是天然的AcrA信号序列也可以是异源的PeIB信号，其中五个sequons中的两个(N123和N273(Nita-Lazar et al.，2005，supra))可以在空肠弯曲杆菌和大肠杆菌中使用。选择AcrA作为模型的原因是AcrA是唯一具有详细的可利用结构信息的空肠弯曲杆菌的周质N-糖基化蛋白。最近公开了来自革兰氏阴性细菌绿脓杆菌的AcrA同族体，MexA蛋白的晶体结构(Higgins et al.，(2004)。细菌药物流出泵周质成分的结构，Proc.Natl.Acad.Sci.US A 101，9994-9999)。两种蛋白都是所谓的周质流出泵蛋白的成员(PEP，(Johnson，J.M.and Church，G.M.(1999).不同蛋白质家族：细菌流出泵周质蛋白和外膜蛋白阵列和结构的预测.J.MoI.Biol.287，695-715))。拉长的分子包含三个线性排列的亚区：α-螺旋、反向卷曲螺旋，该亚基在结构域的底部结合在一起，随后是一种β-桶区域。在结晶中未包括23-28个N-末端残基和95-101个C-末端残基。MexA和AcrA蛋白质序列具有29.3％的同源性和50％的相似性。因此，这两个蛋白基本上表现出相似的全折叠。
实施例1引发糖基化作用的肽初级序列的说明
众所周知，硫辛酸结合结构域与绿脓杆菌的MexA区域相似，因此在空肠弯曲杆菌AcrA中形成一种紧密地蛋白，该蛋白可以在大肠杆菌种单独的表达(参见Berg，A.，and de Kok，A.(1997).2-氧酸脱氢酶多酶复合物。硫辛酸结合结构域的中心作用.Biol.Chem.378，617-634)。为了在大肠杆菌中检验那个受体肽序列在pg1机制带来的N-糖基化作用中是必不可少的，使用了AcrA的硫辛酸结合结构域。该区域用作分子架向周质中传递不同场地的肽并在体内呈递给pg1机制。
因此，构建编码硫辛酸结合结构域(Lip)的质粒并与OmpA信号序列进行N-末端融合(Choi，J.H.，and Lee，S.Y.(2004).使用大肠杆菌分泌和胞外生产重组蛋白质.Appl MicrobiolBiotechnol 64，625-635)，与hexa histag进行C-末端融合。在阿拉伯糖启动字的控制下开始克隆，进行基因表达。选择Lip区域边界氨基酸位点，从而在MexA的同一位点表现硫辛酸结合结构域区域边界。为了不同的肽接受N-聚糖的能力，在Lip区域两个锤头状部分之间插入序列。该序列由包括空肠弯曲杆菌AcrA的N-糖基化位点N 123的序列组成。所得的开放阅读框由编码OmpA信号序列、N-末端AcrA锤头状部分(D60-D95，氨基酸序列的数目是指成熟AcrA多肽序列的数目)、包含不同天然AcrA糖基化N 123位点的序列(见下面)、C-末端AcrA-Lip(L167-D 210)锤头状部分和C-末端his-tag序列所组成。
通过使用标准分子生物技术完成质粒的构建。在Lip两部分中间插入不同长度的三个包含AcrA天然N 123糖基化位点的序列会产生三个不同的ORFs：
构建物A包含A118-S130，得到一种序列为
MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDQASKDF
NRSKALFSQLDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSHHHHH
H(sequence 1)
的蛋白质(序列1)。
构建物B包含F122-E138，得到一种序列为
MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDQFNRSK
ALFSQSAISQKELDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSHHH
HHH(sequence 2).
的蛋白质(序列2)。
构建物C包含D121-A127，得到一种序列为
MKKTAIAIAVALAGFATVAQADVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDQDFNR
 SKALDHTEIKAPFDGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADGSHHHHHH
(sequence 3).
的蛋白质(序列3)。
序列的划线部分表示OmpA信号肽，单独划线的残基由于克隆而引入的，或为了使蛋白质对降解作用有抵抗力而引入的。黑体字：相当于AcrA N 123的糖基化作用位点。斜体字：hexa-histag。在质粒pEC415骨架中，在阿拉伯糖启动子的控制下表达相应基因(Schulz，H.，Hennecke，H.，和Thony-Meyer，L.(1998).血红素陪伴分子的原型对细胞色素C成熟作用是必要的。Science281，1197-1200)。到检验三个序列中的哪个引发了Lip蛋白质的糖基化作用，进行蛋白质表达实验。传送pACYCpg/或pACYCpg/mut(Wacker et al.，2002，supra)的大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和编码构建物A、B或C的质粒在包含氨苄青霉素和氯霉素的LB培养基中生长直到37度下OD值为0.5。为了感应现象，加入1/1000体积的20％阿拉伯糖(w/v)液剂继续培养细胞2小时。然后通过离心作用收集细胞并在20mM Tris/HCI，pH为8.5，20％蔗糖(w/v)、1mM乙二胺四乙酸、1mM PMSF、和1g/l(w/v)溶菌酶中重新悬浮并在40度下培养1小时。得到周质提取物之后制成球丸，并用1/9体积(v/v)的10x缓冲液A(3 M NaCI，0.5M Tris/HCI，pH8.0和0.1M咪唑)稀释，同时添加MgSO4到2.5mM。从在缓冲液A中的Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala，Sweden)中使用1ml Ni-琼脂糖凝胶色谱柱进行Ni-亲合纯化。在包含0.25 M咪唑的缓冲液A中洗提蛋白质。
图1显示了从Ni-纯化的周质提取物中洗提出的考马斯亮蓝染色的聚丙烯酰胺凝胶的峰值部分。表达分析表明构建物B生产了一种重要的单一蛋白质种类(图1，第1条带)。构建物A和C产生除了重要蛋白质之外的具有减慢电泳迁移率的第二蛋白带(图1，第2、3条带)。通过MALDI-TOF/TOF(未显示)证明大的蛋白质种类的确被糖基化。在构建物B中不存在但在构建物A和C中存在的唯一的氨基酸是D121，天冬氨酸残基2位点N-末尾连接到糖基化的N 123。这说明D121通过OTase对糖基化过程起了重要的作用。为了验证D121对糖基化作用是必不可少的，天冬氨酸残基在构建物C中突变为丙氨酸。表达分析只产生一个蛋白带(图1，第4条带)，因此表示了D121对于糖基化作用是重要的。此外，人工肽显示的蛋白质可以被糖基化，这一事实表示D/E-X-N-Y-S/T型的短肽包含所有用于空肠弯曲杆菌-进行N-糖基化作用的信息。
实施例2实施例1的核实：AcrA-D 121A在N123位点没有 进行糖基化
为了证实肽显示方法的发现，在全长可溶性AcrA蛋白质121位点(D121A，那就是说在糖基化N 123之前的2位残基)上插入天冬氨酸到丙氨酸的突变，该实验在大肠杆菌中进行无论位点N123是否可以被糖基化。为了检验这些，表达AcrA-D121A并分析它的糖基化作用状态。为了分析，使用一种引发的AcrA。这不同于原始空肠弯曲杆菌基因的地方在它包含用于向周质中分泌的PeIB信号顺序(Choi and Lee，2004，supra)和用于纯化的C-末端hexa histag。已经表明，这种AcrA变体被分泌、信号肽-裂解和糖基化为脂质体固定器、天然蛋白质(Nita-Lazar et al.，2005，supra)。以下是可溶性AcrA蛋白质的蛋白质序列：
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAMHMSKEEAPKIQMPPQPVTTMSAKSEDLPLSFTYPAK
LVSDYDVIIKPQVSGVIVNKLFKAGDKVKKGQTLFIIEQDKFKASVDSAYGQALMAKATFE
NASKDFNRSKALFSKSAISQKEYDSSLATFNNSKASLASARAQLANARIDLDHTEIKAPF
DGTIGDALVNIGDYVSASTTELVRVTNLNPIYADFFISDTDKLNLVRNTQSGKWDLDSIHA
NLNLNGETVQGKLYFIDSVIDANSGTVKAKAVFDNNNSTLLPGAFATITSEGFIQKNGFK
VPQIGVKQDQNDVYVLLVKNGKVEKSSVHISYQNNEYAIIDKGLQNGDKIILDNFKKIQVG
SEVKEIGAQLEHHHHHH(sequence 4)
划线的残基是PeIB信号肽，斜体字的是hexa-histag，粗体的是在N 123和N273上两个天然的糖基化作用位点。在pEC415质粒(Schulz et al.，1998)中，构建一种包含上述ORF蛋白质的质粒来生产pAcrAper。检验AcrA和其突变体糖基化作用状态的试验(见下文)如下所述：在大肠杆菌CLM24(Feldman et al.，2005，supra)细胞指数生长期用0.02％阿拉伯糖诱导AcrA表达，其中所述大肠杆菌CLM24细胞包含活性或非活性形式质粒-bome pg1操纵子(pACYCpg/pACYCpg/mut，参见(Wacker et al.，2002，supra))和编码AcrA的质粒(pAcrAper)。在四小时感应现象之后，如上所述制备周质提取物并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳、电转化和用抗AcrA免疫血清或R12免疫血清免疫检测的方法进行分析。后者对于空肠弯曲杆菌包含蛋白质的N-聚糖具有特异性(Wacker et al.，2002，supra)。
图2A的头两个条带显示了在不存在功能性pg1操纵子和存在功能性pg1操纵子情况下的AcrA。在三个存在功能性pg1操纵子的情况下只有一个色带缺失(图2A，顶部组)。这相当于未糖基化的AcrA(第1条带)和非、单和二糖基化的AcrA(第2条带)。在条带2种巨大蛋白质的糖基化通过R12蛋白印迹进行确认(第2条带，底部组)。当突变体AcrA-N273Q进行同样地表达时，在功能性糖基化作用pg1操纵子(第3条带)存在的条件下只有单糖基化的AcrA被检测到。在不存在功能性pg1地点的情况下检测到未糖基化的AcrA(第4条带)。突变体AcrA-D121A的分析只生产两个条带，其中之一被糖基化(第5条带)如在第3条带用AcrA-N273Q观察到的。这说明D121对于在位点123-125进行有效的糖基化作用是必不可少的。
实施例3向AcrA中引入人工糖基化位点
为了检验引入的天冬氨酸残基是否能够产生糖基化位点，可溶性AcrA的N 117和N 147位点中未使用的-2位糖基化位点被换成天冬氨酸(F115D，T145D)，从而产生AcrA突变体。然后检测修饰后的糖基化位点是否可以被如权利要求2所述的实验糖基化。这两种突变体分别被插入到可溶性AcrA的野生型序列中或被插入到双突变体中，所述双突变体中删除了两个使用的糖基化位点(N 123Q和N 273Q)。制备经过4小时诱变的培养基的周质提取物，用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并用蛋白印记法(图2B)沉淀。如参照物一样，野生型糖基化AcrA和未糖基化的AcrA样品在同一个凝胶上实验(第1条带和第2条带)。T 145D突变体影响N 147-S 149的天然未使用的糖基化序列-2位点。AcrA-T 145与抗AcrA抗血清进行的蛋白印记得到四条条带，其中最高的具有比在第2条带的双糖基化蛋白质更慢的电泳移动率(见图2B中的第3条带)。R12印记实验确定了第四带是三糖基化的AcrA。尽管对抗AcrA具有低的强度，但是最大的带产生特异性R12抗血清糖基化作用最强的信号。当相同的突变体AcrA-T 145D在不存在天然N-糖基化序列(AcrA-N 123Q-N 273Q-T 145D)的条件下表达时，在功能性pg1操纵子存在的条件下只检测到单糖基化的AcrA(图2B，第4条带)，在不存在功能性pg1操纵子的条件下则不能检测到(第5条带)。这说明在第4条带中的重带进行了糖基化，因此，通过简单的引入T145D突变体可以产生一种优化的糖基化作用位点(DFNNS)。
为了进一步确定可以通过在-2位插入天冬氨酸残基来引入糖基化作用位点，改变天然未使用的位点N 117-S 119和N274-T 276来优化N-糖基化作用。为了这个目的，产生了进一步的突变(图2C)。AcrA-F 115D-T 145D在上述系统中的表达产生5种蛋白质，这五种蛋白质可以被抗-AcrA抗血清(第2条带)检测到。这一结果暗示同一个AcrA分子上可以发生4个糖基化作用。当用空肠弯曲杆菌N-聚糖-特异性R12抗血清进行检测时，可以检测到5个带的梯度。最弱的带是未糖基化的AcrA，因为在没有进行糖基化时也存在于该带(第1条带)，最强信号的最高结果可能是由于四重糖基化AcrA的五个抗原决定簇造成的。因此，两个引入的位点(在N 117和N 147)和两个原有的使用位点(N 123和N 273)被使用且通过pg1机制被糖基化。AcrA-N 123Q-N 273Q-N 272D在存在或不存在pg1操纵子条件下的表达表示了一种第三人工引人的糖基化位点，N274(DNNST)，该第三人工引入的糖基化位点也可以被pg1操纵子识别(图2C，第3和第4条带)。
上述实验证实了一个发现，即空肠弯曲杆菌OTase识别的细菌N-糖基化作用位点部分地由与真核共有序列相同的共有序列(N-X-S/T，其中X≠P)组成，但另外在-2位点加入天门冬氨酸对于提高其功效是必须的。另外，这说明通过重组引入这种优化的共有序列，可以在理想的位点糖基化蛋白质。
实施例4在优化的N-糖基化作用序列中-1位的确认
为了检测细菌糖基化位点的-1位显示与真核生物+1位相同的限制作用，进行了进一步的实验(Imperiali，B.，and Shannon，K.L.(1991).Differences between Asn-Xaa-Thr-包含肽之间的区别：寡糖转移酶溶液构造和底物行为的比较Biochemistry 30，4374-4380；Rudd，P.M.，and Dwek，R.A.(1997).糖基化作用：蛋白质的异源成份和3D构造.Crit.Rev.Biochem.MoI.Biol.32，1-100)。+1位的脯氨酸残基抑制糖基化作用从而限制肽。为了检验在-1位置是否也能观察到相似的作用，向第二天然位点敲除的点突变中的第一天然使用位点中引入脯氨酸残基(AcrA-N 273 Q-F 122P)。AcrA-N 273Q的控制表达表明在功能性pg1操纵子存在的情况下的单糖基化蛋白质(图2D，第1和2条带)。然而，AcrA-N 273Q-F 122P并没有进行糖基化(图2D，第3和4条带)。这说明当在天门冬氨酸和-2位负电荷残基之间有脯氨酸残基的时候，脯氨酸抑制细菌N-糖基化作用。
通过空肠弯曲杆菌pg1机制被糖基化的所有已知位点的序列阵表明他们都在-2位点包括D或E(Nita-Lazar et al.，2005，supra；Wacker et al.，2002，supra；Young et al.，(2002).革兰氏阴性细菌中多重糖蛋白上存在的N-连接的聚糖的结构，Campylobacterjejuni.J.Biol.Chem.277，42530-42539)。因此，可以确定，细菌的糖基化共有序列可以被位于-2位的负电荷氨基酸优化，产生D/E-X-N-Z-SfT，其中X&Z≠P.
实施例5非空肠弯曲杆菌蛋白的N-糖基化作用
为了证明初级序列已足够满足细菌N-糖基化作用的需要，使用上述方法来检验是否非空肠弯曲杆菌蛋白可以被糖基化。使用霍乱毒素B亚基(CtxB)作为糖基化作用的目标。在霍乱弧菌中扩增相应的基因从而使其在N-末端包括编码OmpA信号序列的编码序列，在C-末端包括hexahistag，如实施例1中的A到C一样。在实施例1中使用的质粒中克隆所得到的DNA代替构建物A。W88到D或在W88之后插入D的点突变产生一种优化的糖基化作用位点(DNNKT)。在来自空肠弯曲杆菌功能性pg1区域存在和不存在的条件下，在大肠杆菌或其他细菌类型中表达包含信号序列和his-tag的野生型和W88D CtxB蛋白。当来自Top 10细胞的周质提取物用聚丙烯酰胺凝胶电泳、电转化和用CtxB抗血清进行连续免疫印迹时，只有CtxB W88D在pg1区域背景下产生高的糖基化带(图2E，比较第3和第4条带)。通过取代CtxB的G 54或Q 56，即在环结构的其中之一中(后者表示为CtxB-Q 56/DSNIT)引入共有序列(DSNIT)，其中所述环结构据报道对CtxB结合神经节苷脂GM1结合活性有贡献。图2E的第5和第6条带显示基因工程蛋白质(例如包括DSNIT肽序列而不是在Top 10中表达的Q 56序列的构建物)具有低的移动率因此当按照上面描述的方法进行分析时，能够糖基化细胞带，其中，所述细胞具有糖基化作用能力不属于糖基化作用缺陷型。这还说明，包含两种操作的CtxB，即在W88之后插入D和用DSNIT取代Q56的CtxB在SCM 7细胞中被双糖基化(Alaimoet al.，EMBO Journal 25：967-976(2006))  (E组，第7和第8条带)。在第7条带中表示的双糖基化的蛋白质CtxB是经过Ni2+亲和纯化的，并根据标准方法进行胶内胰蛋白酶化作用之后用ESI-MS/MS分析。检测到期望的糖基化作用，从而确定，通过突变或插入本发明的用于细菌N-糖基化作用(未显示)的优化的共有序列，非空肠弯曲杆菌蛋白质可以进行细菌N-糖基化作用。适于实现本发明的其他合适的大肠杆菌菌株是W 3110，CLM24，BL 21(Stratagene，La JoIIa，CA，USA)，SCM6和SCM7。
这里使用的CtxB蛋白的氨基酸序列如下所示(划线的是重组OmpA信号序列，斜体的是hexa-histag，黑体的是W88)：
MKKTAIAIAVALAGFATVAQATPQNITDLCAEYHNTQIHTLNDKIFSYTESLAGKREMAIIT
FKNGATFQVEVPGSQHIDSQKKAIERMKDTLRIAYLTEAKVEKLCVWNNKTPHAIAAISM
ANGSHHHHHH(sequence 5)
实施例6向空肠弯曲杆菌外膜蛋白OmpH1中引入人工的N -糖基化作用位点
细菌的N-糖基化作用的一种潜在的应用在于在细菌宿主细胞表面上展示聚糖，从而将显性与基因型相连并因此选择特异性基因型突变体。为了说明N-聚糖可以在外膜蛋白质表面呈递，制备基因工程OmpH1蛋白使其含有多个本发明优化的共有位点。如已知晶体结构所述，将这些位点制备在蛋白的环区域(Muller，A.，Thomas，G.H.，Horler，R.，Brannigan，J.A.，Blagova，E.，Levdikov，V.M.，Fogg，M.J.，Wilson，K.S.，and Wilkinson，A.J.2005.An ATP-binding cassette-type cysteine transporter inCampylobacter jejuni inferred from the structure of anextracytoplasmic solute receptor protein.MoI.Microbiol.57：143-155)。之前的实验表明，通过V 83T，K 59N-G 60I-N 61T，R 190N-G 191 I-D 192T和H 263D-F 264S-G 265N-D266I-D 267T突变可以产生最佳的糖基化作用位点。为了表面显示，需要对这些引入位点的不同结合作用进行评价，从而确定最佳N-聚糖-特异性样品。在编码质粒构建物的野生型OmpH1中产生结合作用并用与AcrA相似的方法进行检测。图3表示了多种OmpH1变体的分析，其中所述OmpH1变体在存在野生型糖基化作用序列子之外还包括多重糖基化作用序列子。产生带有三(第3、4、5和7条带)到四个糖基化作用序列子的OmpH1变体。一种只带有一个糖基化作用序列子的野生型OmpH1和缺乏用于糖基化作用的重要天门冬氨酸的突变体也包括在本实验中。这里检测的所有的变体不只显示高水平的糖基化功效，还利用了每一个糖基化作用序列子。用弯曲杆菌属N-聚糖特异性免疫血清确定实验结果(图3，下面一组)。
下面表示了空肠弯曲杆菌(81-176菌株)OmpH1蛋白的蛋白质序列，其附有斜体字的myc tag：
MKKILLSVLTTFVAWLAACGGNSDSKTLNSLDKIKQNGWRIGVFGDKPPFGYVDEKG
NNQGYDIALAKRIAKELFGDENKVQFVLVEAANRVEFLKSNKVDIILANFTQTPERAEQV
DFCLPYMKVALGVAVPKDSNITSVEDLKDKTLLLNKGTTADAYFTQDYPNIKTLKYDQNT
ETFAALMDKRGDALSHDNTLLFAWVKDHPDFKMGIKELGNKDVIAPAVKKGDKELKEFI
DNLIIKLGQEQFFHKAYDETLKAHFGDDVKADDWIEGGKILEQKLISEEDL(sequence 6)
在蛋白质中，天然糖基化作用位点是黑体的，加下划线的是信号序列。
实施例7：空肠弯曲杆菌N-聚糖在大肠杆菌细胞外膜上 OmpH1上的表面展示
为了回答多重糖基化的OmpH1变体是否可以在细菌细胞表面上展示的问题，对能够表达不同OmpH1变体的细菌细胞CLM24或SCM6(也是SCM7ΔwaaL)进行免疫荧光试验。野生型OmpH1和缺失对糖基化作用很重要的天门冬氨酸变体被包括在实验中。另外，构建C20S突变体从而在周质中保持蛋白质，因此在实验中作为参照物，对用多聚甲醛处理的细胞进行免疫染色。多聚甲醛固定的细胞不会破坏细胞结构或compartimentalization。C-Myc-和N-glycan-特异性免疫血清与相应的二级抗体结合，连接到FITC和Cy3上，分别用于检测细胞表面的蛋白质(红荧光)和N-聚糖(绿荧光)。另外，使用4，6-二胺基-2-苯基吲哚(DAPI，蓝莹光)对细菌DNA染色使细菌细胞和细胞碎片之间有明显的区别。当表达野生型OmpH1的细胞被染色时，检测对蛋白质和N-聚糖有特异性的免疫荧光(图4A)。当缺失重要的天门冬氨酸N 139S的突变体被抗-Myc-和N-聚糖-特异性免疫血清染色时，只获得蛋白质而不是聚糖特异性信号(4B组)，这表明N-聚糖-特异性免疫血清的特异性。在非蛋白特异性的C20S突变体中，当蛋白质被保持在周质中时可以检测到红色免疫荧光，这说明抗体不能再细胞中扩散，并且有足够能力检测任意表面表现型(组4C)。接下来，表达糖基化位点不同的多重OmpH1变体的细胞进行如下染色：OmpH1 KGN→NIT，HFGDD→DSNIT(组4D)，OmpH1RGD_*NIT，HFGDD→DSNIT(组4E)，OmpH1 KGN_NIT，RGD→NIT(组4F)，OmpH1 V83T KGN→NIT(组4G)和OmpH1KGN→NIT，RGD→NITHFGDD_，DSNIT(组4H)。所有的OmpH1变体都是双链的，表示细菌表面糖基化蛋白的存在。图4用灰色模式表示，第一栏是同行其他图的结合图。
Figure FYZ000005285131100021
Figure FYZ000005285131100041

Claims (29)

1.一种生产N一连接的糖基化蛋白的方法，包括：
a)提供用于编码至少一种重组目标蛋白的核酸；
b)向a)中所述的核酸中引入编码一个或一个以上如下N-糖基化优化氨基酸共有序列的核酸：
D/E-X-N-Z-S/T
其中X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意天然氨基酸；
c)提供一种重组生物体，包括用于编码下列物质的核酸：
(i)一种来自弯曲杆菌的功能性pgl操作子，和
(ii)至少一个步骤b)所得核酸编码的重组目标蛋白质，和
d)以适合目标蛋白质生产和N-糖基化的方式培养重组生物体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，用于编码至少一个步骤c)(ii)所述重组目标蛋白的核酸能够编码至少2种所述N-糖基化优化的氨基酸共有序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述重组目标蛋白的核酸能够编码至少3种所述N-糖基化优化的氨基酸共有序列.
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述重组目标蛋白的核酸能够编码至少5种所述N-糖基化优化的氨基酸共有序列.
5.根据权利要求1所述的方法，其中，产生的N-连接的糖基化目标蛋白包括一种或一种以上N-聚糖，所述N-聚糖选自(i)弯曲杆菌N-聚糖，(ii)衍生自转移到革兰氏阴性细菌中的O抗原的寡糖和聚糖的N-聚糖和(iii)衍生自转移到在革兰氏阳性细菌中形成荚膜多糖的O抗原的寡糖和聚糖的N-聚糖。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，产生的N-连接的糖基化目标蛋白包括两种或两种以上不同的N-聚糖。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，产生的N-连接的糖基化目标蛋白衍生自哺乳动物、细菌、病毒、真菌或植物蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法，其中用于编码步骤c)(ii)所述重组目标蛋白的核酸进一步能够编码至少一种多肽序列，所述多肽序列能够将所述重组蛋白靶向到革兰氏阴性细菌的外膜上。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述能够将所述重组蛋白靶向到革兰氏阴性细菌外膜上的序列选自II型信号肽或外膜蛋白。
10.根据权利要求1所述的方法，其中重组生物体选自细菌所组成的组，所述细菌选自由埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、沙门氏菌、志贺氏菌属、幽门螺杆菌、假单胞菌属和杆菌属所组成的组。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组生物体是重组革兰氏阴性细菌，所述细菌包括：
i)一种基因型包括编码
a)至少一种天然的或重组特异性糖基化转移酶，用于在脂质载体上组装寡糖，
b)至少一种来自弯曲杆菌的天然的或重组寡糖转移酶(OTase)，
c)至少一种权利要求1步骤b)所得的重组蛋白，和
ii)一种表现型，包括一种重组的N-糖基化蛋白质，该蛋白质位于革兰氏阴性细菌的外膜内和/或外膜上。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述重组革兰氏阴性细菌选自：埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、志贺氏菌属、幽门螺杆菌、假单胞菌属、和沙门氏菌。
13.根据权利要求1所述的方法，其中来自弯曲杆菌的功能性pgl操作子包括一种核酸，所述核酸编码：
i)来自弯曲杆菌的重组OTase；和
ii)来自弯曲杆菌的重组和/或天然特异性糖基化转移酶；和/或
iii)来自除了弯曲杆菌之外的菌种的重组的和/或天然的特异性糖基化转移酶，
用于在脂质载体上组装一种寡糖，所述转移酶被OTase转移到目标蛋白上。
14.一种制备革兰氏阴性细菌的方法，所述细菌具有：
i)一种基因型包括编码如下的核酸：
a)至少一种天然的或重组特异性糖基化转移酶，用于在脂质载体上组装寡糖，
b)至少一种来自弯曲杆菌的天然的或重组寡糖转移酶(OTase)，
c)至少一种重组目标蛋白包括一个或一个以上如下N-糖基化优化氨基酸共有序列：
D/E-X-N-Z-S/T
其中X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意天然氨基酸；和
ii)一种表现型，包括一种重组的N-糖基化目标蛋白质，该蛋白质位于革兰氏阴性细菌的外膜内和/或外膜上；
所述方法包括如下步骤：
A)提供用于编码至少一种重组目标蛋白的核酸；
B)向A)中所述的核酸中引入编码一个或一个以上如下N-糖基化优化氨基酸共有序列的核酸：
D/E-X-N-Z-S/T
其中X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意天然氨基酸；
C)提供一种革兰氏阴性细菌；
D)向所述细菌中引入至少一种核酸序列，所述核酸序列用于编码：
a)至少一种重组特异性糖基化转移酶用于在脂质载体上组装寡糖，和/或
b)至少一种来自弯曲杆菌的重组寡糖转移酶(OTase)，和
c)至少一种步骤2所得核酸编码的重组目标蛋白，和
E)培养所述细胞直到至少一种步骤D)核苷序列编码的重组N-糖基化蛋白位于革兰氏阴性细菌的外膜内和/或外膜上。
15.根据权利要求14所述的方法，其中革兰氏阴性细菌选自由埃希氏杆菌属、弯曲杆菌属细菌、志贺氏菌属、幽门螺杆菌和假单胞菌属、和沙门氏菌所组成的组。
16.一种原核生物体，向其中引入的基因信息包括一种核酸，所述核酸用于编码：
A)一种或一种以上重组靶向蛋白，所述重组靶向蛋白包括一种共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意氨基酸，并且，一致序列被重组引入目标蛋白；和
B)一种寡糖转移酶；
其中，所述寡糖转移酶将所述寡糖连接到所述一个或一个以上重组靶向蛋白质的共有序列上。
17.一种第一原核生物体，向其中引入包括核酸的基因信息，所述核酸编码：
A)衍生自第三原核生物体的一种或一种以上重组靶向蛋白，所述重组靶向蛋白包括一种共有序列D/E-X-N-Z-S/T，其中X和Z可以是除了脯氨酸之外的任意氨基酸，并且，一致序列被重组引入目标蛋白；和
B)一种寡糖转移酶；
其中，所述寡糖转移酶将所述寡糖连接到所述一个或一个以上重组靶向蛋白质的共有序列上，且其中所述第二和第三原核生物体是不同的生物体。
18.根据权利要求17所述的第一原核生物体，其中所述寡糖转移酶衍生自第四原核生物体，所述第四原核生物体与第二和/或第三原核生物体不同。
19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述重组生物体是原核生物体。
20.根据权利要求1、5、11、13、14中任意一项所述的方法，其中，所述弯曲杆菌选自空肠弯曲杆菌。
21.根据权利要求5所述的方法，其中，所述革兰氏阴性细菌是绿脓杆菌，大肠杆菌和志贺氏痢疾杆菌。
22.根据权利要求9所述的方法，其中，所述信号肽是来自空肠弯曲杆菌OmpH1的全长蛋白或信号肽、来自空肠弯曲杆菌的JIpA的全长蛋白或信号肽、来自大肠杆菌的外膜蛋白和来自绿脓杆菌的Inp蛋白。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述来自大肠杆菌的外膜蛋白是OmpS，OmpC，OmpA，OprF，PhoE，LamB，Lpp或者OmpA。
24.根据权利要求1所述的方法，其中，所述共有序列是D-X-N-Z-S/T。
25.根据权利要求14、16或者17中任意一项所述的原核生物体，其中，所述共有序列是D-X-N-Z-S/T。
26.制备N-糖基化蛋白的方法，包括在适合产生蛋白和从培养物中分离N-糖基化蛋白的条件下培养权利要求16-18中任意一项所述的原核生物体。
27.由权利要求25所述的方法产生的N-糖基化蛋白。
28.根据权利要求16所述的原核生物体，其中，所述原核生物体包括一类能够将寡糖装配到脂质载体上的糖基转移酶。
29.根据权利要求17所述的第一原核生物体，其中，所述原核生物体包括一类能够将寡糖装配到脂质载体上的糖基转移酶。
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