JP2014042533A - 原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 - Google Patents
原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2014042533A JP2014042533A JP2013250586A JP2013250586A JP2014042533A JP 2014042533 A JP2014042533 A JP 2014042533A JP 2013250586 A JP2013250586 A JP 2013250586A JP 2013250586 A JP2013250586 A JP 2013250586A JP 2014042533 A JP2014042533 A JP 2014042533A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- recombinant
- ssp
- glycosylated
- host cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/25—Shigella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/034—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the periplasmic space of Gram negative bacteria as a soluble protein, i.e. signal sequence should be cleaved
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
【解決手段】本発明は、1つまたは複数の導入されたN−グリコシル化された最適化アミノ酸配列を含む組み換えN−グリコシル化タンパク質、これらのタンパク質をコードする核酸、ならびに相当するベクターおよび宿主細胞に関する。さらに、本発明は、医薬品を調製するための、前記タンパク質、核酸、ベクター、および宿主細胞の使用に関する。さらに、本発明は、前記タンパク質を産生するための方法を提供する。
【選択図】なし
Description
N−結合タンパク質のグリコシル化は、真核生物の小胞体で起こる本質的かつ保存されたプロセスである。それは、タンパク質のフォールディング、オリゴマー化、安定性、品質管理、選別、ならびに分泌および膜タンパク質の輸送にとって重要である(ヘレニウス,A(Helenius,A.)およびアービィ,M.(Aebi,M.)(2004年)、「Roles of N−linked glycans in the endoplasmic reticulum.」「Annu.Rev.Biochem.」73、1019〜1049)。
D/E−X−N−Z−S/T(最適化コンセンサス配列)
式中、XおよびZは、Pro以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも1つの前記N−グリコシル化された部分的なアミノ酸コンセンサス配列が導入される。
i)以下をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子型
a)脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための少なくとも1種の天然または組み換え型の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、
b)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の少なくとも1種の天然または組み換え型の原核生物オリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTアーゼ)、
c)本発明の少なくとも1種の組み換えタンパク質、好ましくは、ターゲティングポリペプチドをさらに含むタンパク質、および
ii)グラム陰性細菌の外膜内および/または上に位置する、本発明の組み換えN−グリコシル化タンパク質を含む表現型、
を有するグラム陰性細菌である。
a)以下をコードする核酸を含む組み換え生物、好ましくは原核生物を提供するステップと、
i)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の機能性のpglオペロン、および
ii)1つまたは複数の下記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む少なくとも1種の組み換え標的タンパク質であって:
D/E−X−N−Z−S/T
式中、XおよびZは、Pro以外の任意の天然のアミノ酸であり得、少なくとも1つの前記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される組み換え標的タンパク質、および
b)標的タンパク質の産生およびN−グリコシル化に適した方式で、組み換え生物を培養するステップと、
を含む方法に関する。
OTアーゼによって標的タンパク質に転移されることとなる、脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための、
i)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の組み換えOTアーゼ、および
OTアーゼによって標的タンパク質に転移されることとなる、脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための、
ii)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の組み換え型および/または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、および/または
iii)カンピロバクター種以外の種から得られる組み換え型および/または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、
をコードする核酸を含む。
i)グラム陰性細菌を提供するステップと、
ii)以下をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を前記細菌に導入するステップと、
a)脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための少なくとも1種の組み換え型の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、および/または
b)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の少なくとも1種の組み換えオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTアーゼ)、および/または
c)1つまたは複数の下記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む少なくとも1種の組み換えタンパク質であって:
D/E−X−N−Z−S/T
式中、XおよびZは、Pro以外の任意の天然のアミノ酸であり得、少なくとも1つの前記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される組み換えタンパク質、
iii)c)のヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも1種の組み換えN−グリコシル化タンパク質が、グラム陰性細菌の外膜内および/または上に位置されるまで、前記細菌を培養するステップと、
を含む方法に関する。
a)請求項15または16に記載の宿主細胞を培養するステップ、
b)前記組み換えグラム陰性細菌の外膜を除去するステップ、および
c)前記組み換えタンパク質を回収するステップ。
N−グリコシル化を最適化するためのモデルタンパク質としてのAcrAの選択
N−グリコシル化のためのアクセプタータンパク質の要件を最適化するために、C.ジェジュニ(C.jejuni)糖タンパク質AcrA(Cj0367c)に対して、詳細な研究を実施した。AcrAは、350アミノ酸残基の周辺質リポタンパク質である。脂質に固定されるのではなく周辺質に分泌されることが、グリコシル化のための必要条件であることが示されている(ニタ−ラザー(Nita−Lazar)ら、2005年、上記)。大腸菌(E.Coli)中で発現される場合、搬出のためのシグナルは、天然のAcrAシグナル配列または異種起源のPelBシグナルであり得る。5つの潜在的なN−結合グリコシル化シークオン(sequon)(N117、N123、N147、N273、N274)のうち、2つの同じものが、C.ジェジュニ(C.jejuni)および大腸菌中で使用される(N123およびN273(ニタ−ラザー(Nita−Lazar)ら、2005年、上記))。AcrAは、詳細な構造情報が利用可能であるC.ジェジュニ(C.jejuni)の唯一の周辺質N−糖タンパク質であるので、モデルとして選択された。近年では、AcrA相同体、すなわちグラム陰性細菌緑膿菌(P.aeruginosa)由来のMexAタンパク質の結晶構造が公開されている(ヒギンズ(Higgins)ら(2004年)、「Structure of the periplasmic component of a bacterial drug efflux pump.」「Proc.Natl.Acad.Sci.U S A」101、9994〜9999)。どちらのタンパク質も、いわゆる周辺質排出ポンプタンパク質のメンバーである(PEP、(ジョンソン,J.M.(Johnson,J.M.)およびチャーチ,G.M.(Church,G.M.)(1999年))「Alignment and structure prediction of divergent protein families:periplasmic and outer membrane proteins of bacterial efflux pumps.」「J.Mol.Biol.287、695〜715))。細長い分子は、3つの直線的に配置されたサブドメイン:αらせんの逆平行のコイルドコイルを含有し、これは、リポイルドメインによって塩基で結びつけられ、これに、6本鎖のβバレル構造ドメインが続く。N末端の23〜28残基およびC末端における95〜101残基は、結晶中に組み込まれていない。MexAタンパク質とAcrAタンパク質の配列は、29.3%同一であり、50%類似である。したがって、2つのタンパク質はおそらく、全体的に類似の折りたたみを示す。
緑膿菌のMexAと類似である、したがってまた、C.ジェジュニ(C.jejuni)のAcrA中にあるリポイルドメインは、大腸菌において個々に発現させることができるコンパクトなタンパク質を形成することが知られている(バーグ,A.(Berg,A.)、およびデコック,A.(de Kok,A.)(1997年)、「2−Oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes.」「The central role of the lipoyl domain.Biol.Chem.」378、617〜634によって概説される)。どのアクセプターペプチド配列が、大腸菌におけるpgl機構によるN−グリコシル化に必要とされるのかを確認するために、AcrAのリポイルドメインを取り出した。これを、異なる長さのペプチドを周辺質に輸送し、それらをin vivoでpgl機構に与えるための分子骨格として使用した。
構築物Aは、次のタンパク質配列をもたらすA118−S130を含有する:
ペプチドディスプレイ手法による発見を確認するために、アスパラギン酸からアラニンへの突然変異を、位置121(D121A、すなわちグリコシル化されたN123よりも2つ前の残基)に挿入し、AcrAタンパク質の全長の可溶性バージョンにおいて、部位N123が大腸菌中で依然としてグリコシル化され得るかどうかを試験した。試験を行うために、このAcrA−D121Aを発現させ、そのグリコシル化状態を分析した。分析のために、操作されたAcrAを使用した。これは、周辺質への分泌のためのPelBシグナル配列(チェ(Choi)およびリー(Lee)、2004年、上記)、および、精製のためのC末端のヘキサヒスチジンタグを含有するという点で、本来のC.ジェジュニ(C.jejuni)遺伝子とは異なっていた。このAcrA変異体は、脂質に固定された未変性タンパク質として分泌され、シグナルペプチド切断され、グリコシル化されることが示されている(ニタ−ラザー(Nita−Lazar)ら、2005年、上記))。以下は、可溶性のAcrAタンパク質のタンパク質配列である。
アスパラギン酸残基の導入が、グリコシル化部位をもたらすことができるかどうか試験するために、可溶性のAcrAの位置N117およびN147の使用されないグリコシル化部位の−2位置の残基がアスパラギン酸(F115D、T145D)と交換されたAcrAミュータントを産生した。改変されたグリコシル化部位を、実施例2に記載されるのと同じアッセイによってグリコシル化することができるかどうかを、その後試験した。両方の突然変異を、AcrAの可溶性のバージョンの野生型配列に、あるいは、(どちらも使用されるグリコシル化部位を欠損させた)(N123QおよびN273Q)二重のミュータント中に、個々に挿入した。4時間誘導させた培養物の周辺質抽出物を調製し、SDSページによって分離し、ウェスタンブロッティングによって分析した(図2B)。対照として、野生型のサンプルをグリコシル化し、非グリコシル化されたAcrAを、同じゲル上に流した(レーン1および2)。T145D突然変異は、天然には使用されないグリコシル化シークオンN147−S149の−2位置に影響を及ぼした。AcrA−T145Dを発現させると、抗AcrA抗血清を用いるウェスタンブロッティングは、4つのバンドをもたらし、それらの最も高いものは、レーン2における2重にグリコシル化されたタンパク質よりも電気泳動移動度が遅かった(図2Bにおけるレーン3)。R12ブロットによって、第4のバンドは、3重にグリコシル化されたAcrAであることが確認された。抗AcrAに対する低い強度にもかかわらず、最も重いバンドは、グリコシル化特異的なR12抗血清を用いると最も強いシグナルを示した。同じミュータントAcrA−T145Dが、天然のN−グリコシル化配列(AcrA−N123Q−N273Q−T145D)の非存在下で発現された場合、機能性のpglオペロンの存在下で、モノグリコシル化されたAcrAのみが検出され(図2B、レーン4)、機能性のpglオペロンの非存在下では検出されなかった(レーン5)。これは、レーン4中のより重いバンドが、グリコシル化されたことを実証する。したがって、単純にT145D突然変異を導入することによって、最適化グリコシル化部位がもたらされた(DFNNS)。
細菌のグリコシル化部位における−1の位置が、真核生物における+1の位置と同じ制限を示すかどうか試験するために、さらなる実験を実施した(インペリアリ,B.(Imperiali,B.)およびシャノン,K.L.(Shannon,K.L.)(1991年)、「Differences between Asn−Xaa−Thr−containing peptides:a comparison of solution conformation and substrate behaviour with oligosaccharyl−transferase.」「Biochemistry」30、4374〜4380;ラッド,P.M.(Rudd,P.M.)およびドゥウェック,R.A.(Dwek,R.A.)(1997年)、「Glycosylation:heterogeneity and the 3D structure of proteins.」、「Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.」32、1〜100)。+1のプロリン残基は、グリコシル化が抑制されるように、ペプチドを制限すると考えられる。類似の効果が、−1の位置でも観察されることができるかどうか試験するために、第2の天然の部位がノックアウトされた点変異体(AcrA−N273Q−F122P)において、第1の天然に使用される部位のその位置に、プロリン残基を導入した。AcrA−N273Qの対照発現は、機能性のpglオペロンが存在する場合には、モノグリコシル化されたタンパク質を示した(図2D、レーン1および2)。しかし、AcrA−N273Q−F122Pは、グリコシル化されなかった(図2D、レーン3および4)。これは、プロリンは、これがアスパラギンと−2位置の負に荷電する残基との間に残基を構成する場合、細菌のN−グリコシル化を抑制することを示している。
第1の配列要件(最適化コンセンサス配列)が、細菌におけるN−グリコシル化に十分であることを実証するために、非C.ジェジュニ(C.jejuni)タンパク質を、上記の戦略を適用することによってグリコシル化させることができるかどうかを試験した。コレラ毒素Bサブユニット(CtxB)を、グリコシル化標的として用いた。相当する遺伝子を、それが、まさに実施例1における構築物AからCと同様の、N末端上のOmpAシグナル配列のコード配列とC末端のヘキサヒスチジンタグを含有するような方式で、コレラ菌から増幅させた。得られたDNAを、実施例1で用いられたプラスミド中の構築物Aと置き換えるようにクローン化した。W88のDへの点突然変異、またはW88の後のD挿入は、最適化グリコシル化部位(DNNKT)をもたらした。野生型、ならびにシグナル配列およびhis−タグを含有するW88D CtxBタンパク質を、C.ジェジュニ(C.jejuni)由来の機能性のpgl遺伝子座の存在下および非存在下で、大腸菌Top 10および他の細胞型中で発現させた。Top 10細胞由来の周辺質抽出物を、SDS−PAGE、電気移動、およびCtxB抗血清を用いる連続的な免疫ブロット法によって分析すると、CtxB W88Dだけは、pgl遺伝子座バックグラウンドにおいて、より高い、したがって、グリコシル化されたバンドを産生していた(図2E、レーン3と4を比較せよ)。コンセンサス配列(DSNIT)はまた、CtxBのG54またはQ56(後者は、CtxB−Q56/DSNITと表される)、すなわち、CtxBのガングリオシドGM1結合活性に寄与することが報告されたループのうちの1つの中のものを置き換えることによって挿入された。図2Eのレーン5および6は、操作されたタンパク質(Top 10細胞中に発現されるQ56ではなくペプチド配列DSNITを含有する構築物によって例示される)が、上で述べたのと同様に分析した場合、グリコシル化を欠く細胞ではなくグリコシル化コンピテントな細胞において、より移動性が低い、したがって、グリコシル化されたバンドをもたらしたことを実証している。2つの操作、すなわち、W88の後のDの挿入ならびにDSNITのQ56の置き換えを含むCxtBは、SCM7細胞(アライモ(Alaimo)ら、「EMBO journal」25:967〜976(2006年))において2重にグリコシル化されたことも実証された(パネルE、レーン7および8)。レーン7に示される2重にグリコシル化されたタンパク質CtxBを、Ni2+アフィニティ精製し、標準のプロトコルによるゲル内トリプシン処理の後、ESI−MS/MSによって分析した。予測されるグリコペプチドが検出され、細菌のN−グリコシル化はまた、本発明の細菌のN−グリコシル化のための最適化コンセンサス配列を突然変異させる、あるいは挿入することによって、非C.ジェジュニ(C.jejuni)タンパク質も対象とすることが可能であることが確認された(図示せず)。本発明を実践するための他の適切な例示的な大腸菌(E.coli)株の例は、W3110、CLM24、BL21(ストラタジーン(Stratagene)、米国カリフォルニア州、ラホーヤ(La Jolla,CA,USA))、SCM6、およびSCM7である。
細菌におけるN−グリコシル化の潜在的な用途は、遺伝子型に表現型を連結し、それによって特定の遺伝子突然変異について選択するための、細菌の宿主細胞の表面上のグリカンのディスプレイである。N−グリカンを、外膜タンパク質上に提示することが可能であることを実証するために、OmpH1タンパク質を、それが、本発明の複数の最適化コンセンサス部位を含有するように設計した。既知の結晶構造から推測される通り、この部位をタンパク質のループ領域に設計した(ミュラー,A.(Muller,A.)、トーマス,G.H.(Thomas,G.H.)、ホーラー、R.(Horler,R.)、ブラニガン,J.A.(Brannigan,J.A.)、ブラゴヴァ,E.(Blagova,E.)、レヴディコフ,V.M.(Levdikov,V.M.)、フォッグ,M.J.(Fogg,M.J.)、ウィルソン,K.S.(Wilson,K.S.)、およびウィルキンソン,A.J(Wilkinson,A.J.)2005年、「An ATP−binding cassette−type cysteine transporter in Campylobacter jejuni inferred from the structure of an extracytoplasmic solute receptor protein.」「Mol.Microbiol.」57:143〜155)。以前の実験では、最良のグリコシル化配列は、突然変異V83T、K59N−G60I−N61T、R190N−G191I−D192T、およびH263D−F264S−G265N−D266I−D267Tによって産生されたことが示されている。表面ディスプレイについては、最大にN−グリカン特異的なサンプルを確立するために、それらの導入された部位の異なる組み合わせを評価することが所望された。こうした組み合わせを、プラスミド構築物をコードする野生型OmpH1中に作り出し、AcrAについて述べられたのと同様の方式で試験した。図3は、既存の野生型シークオンに加えて、複数のグリコシル化シークオンを有する様々なOmpH1変異体の分析を示す。OmpH1変異体は、3つ(レーン3、4、5および7)、および4つ(レーン6)のグリコシル化シークオンを伴って産生された。グリコシル化シークオンを1つだけ有する野生型OmpH1と、グリコシル化のための重要なアスパラギンを欠くミュータントもまた、この実験に含まれた。ここで試験されるすべての変異体は、高レベルのグリコシル化効率を実証するものに限られるわけではなく、あらゆるグリコシル化シークオンが利用された。結果は、カンピロバクターN−グリカン特異的な免疫血清を用いて確認した(図3、下のパネル)。
複数のグリコシル化されたOmpH1変異体を、細菌細胞の表面上にディスプレイさせることができるかどうかという問題に答えるために、様々なOmpH1変異体を発現している細菌のCLM24またはSCM6(これは、SCM7ΔwaaLである)細胞に、免疫蛍光法を実施した。野生型OmpH1と、グリコシル化のための重要なアスパラギンを欠くミュータントを、実験に含めた。さらに、周辺質内にタンパク質を保持する、したがって、この実験における対象としての役割を果たすために、C20Sミュータントを構築した。パラホルムアルデヒドで処理した細胞に対して免疫染色を行った。パラホルムアルデヒドは、細胞の構造または区画化を壊さずに細胞を固定する。FITCおよびCy3に結合させた相当する二次抗体と組み合わせて、c−Myc−およびN−グリカン−特異的な免疫血清を使用して、細菌細胞表面上のタンパク質(赤色蛍光)およびN−グリカン(緑色)をそれぞれ検出した。さらに、4,6−ジアミノ−2−フェニルインドール(DAPI、青色)を用いて、細菌のDNAを染色し、細菌細胞と細胞残屑を明確に区別した。野生型OmpH1を発現している細胞が染色された場合、タンパク質ならびにN−グリカンに特異的な免疫蛍光が検出された(図4A)。重要なアスパラギンN139Sを欠くミュータントが、抗−Myc−とN−グリカン−の両方に特異的な免疫血清で染色された場合、グリカン特異的なシグナルではなく、タンパク質のみに特異的なシグナルが得られ(パネル4B)、これは、N−グリカン特異的な免疫血清の特異性を示した。タンパク質が、C20Sミュータントにおいて見られるように周辺質内に保持された場合、タンパク質特異的な赤い免疫蛍光は検出されず、これは、抗体が細胞内に拡散することが不可能であっても、任意の表面現象を検出するのに十分コンピテントであったことを示していた(4Cパネル)。次に、グリコシル化において異なる複数のOmpH1変異体を発現している細胞が染色された:OmpH1KGN→NIT、HFGDD→DSNIT(パネル4D)、OmpH1RGD→NIT、HFGDD→DSNIT(パネル4E)、OmpH1KGN→NIT、RGD→NIT(パネル4F)、OmpH1V83T、KGN→NIT(パネル4G)、およびOmpH1KGN→NIT、RGD→NIT、HFGDD→DSNIT(パネル4H)。すべてのOmpH1変異体は、2重に染色され、これは、細菌の表面上のグリコシル化タンパク質の存在を示していた。図4は、グレースケールで表したものであり、第1行は、同じ列の他の画像を組合せた画像である。
Claims (33)
- 1つまたは複数の下記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む組み換えN−グリコシル化タンパク質であって:
D/E−X−N−Z−S/T
式中、XおよびZは、Pro以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも1つの前記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される、組み換えN−グリコシル化タンパク質。 - 少なくとも2つ、好ましくは少なくとも3つ、より好ましくは少なくとも5つの前記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む請求項1に記載の組み換えタンパク質。
- タンパク質が、カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来のN−グリカンの群から選択される1つまたは複数のN−グリカンを含み、前記N−グリカンは、グラム陰性細菌中のO多糖形成O抗原に転移されるオリゴ糖および多糖、あるいは、グラム陽性細菌由来の莢膜多糖、好ましくは:緑膿菌(P.aeruginosa)O9、O11;大腸菌(E.coli)O7、O9、O16、O157、および志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)O1から得られる、請求項1または2に記載の組み換えタンパク質。
- タンパク質が、2つ以上の異なるN−グリカンを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
- タンパク質が、哺乳類、細菌、ウイルス、菌類、または植物タンパク質由来である、請求項1から4のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
- タンパク質および/またはN−グリカンが、治療的および/または予防的に活性である、請求項1から5のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
- タンパク質および/またはN−グリカンが、免疫原的に活性である、請求項1から6のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
- 前記組み換えタンパク質を、グラム陰性細菌の外膜にターゲティングすることが可能な少なくとも1つのポリペプチド配列をさらに含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
- 前記ターゲティングポリペプチド配列が、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来のOmpH1、C.ジェジュニ(C.jejuni)由来のJlpA、大腸菌(E.coli)由来の外膜タンパク質(好ましくはOmpS、OmpC、OmpA、OprF、PhoE、LamB、Lpp;OmpA)、および緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来のlnpタンパク質の全長タンパク質またはシグナルペプチドからなる群から選択される、タイプIIシグナルペプチドまたは外膜タンパク質からなる群から選択される、請求項8に記載の組み換えタンパク質。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸。
- 請求項10に記載の核酸を含むベクター。
- 請求項10に記載の核酸および/または請求項11に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 宿主細胞が、原核性または真核性、好ましくは原核性である、請求項12に記載の宿主細胞。
- 宿主細胞が、エシェリキア亜種(Escherichia ssp.)、カンピロバクター亜種(Campylobacter ssp.)、サルモネラ亜種(Salmonella ssp.)、シゲラ亜種(Shigella ssp.)、ヘリコバクター亜種(Helicobacter ssp.)、シュードモナス亜種(Pseudomonas ssp.)、バチルス亜種(Bacillus ssp.)、好ましくは、大腸菌(Escherichia coli)、より好ましくは、大腸菌(E.coli)株Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6、およびSCM7、ならびにS.エンテリカ(S.enterica)株SL3261、SL3749、およびSL3261ΔwaaLからなる細菌の群から選択される、請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、
i)以下をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子型、
a)脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための少なくとも1種の天然または組み換え型の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、
b)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の、少なくとも1種の天然または組み換え型のオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTアーゼ)、
c)請求項1から9のいずれか一項、好ましくは、請求項8または9に記載の少なくとも1種の組み換えタンパク質、および
ii)グラム陰性細菌の外膜内および/または上に位置する請求項1から9のいずれか一項に記載の組み換えN−グリコシル化タンパク質を含む表現型、
を有する組み換えグラム陰性細菌である、請求項12から14のいずれか一項に記載の宿主細胞。 - エシェリキア亜種(Escherichia ssp.)、カンピロバクター亜種(Campylobacter ssp.)、シゲラ亜種(Shigella ssp)、ヘリコバクター亜種(Helicobacter ssp.)、およびシュードモナス亜種(Pseudomonas ssp.)、サルモネラ亜種(Salmonella ssp.)、好ましくは、大腸菌(E.coli)、より好ましくは、大腸菌(E.coli)株Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6、およびSCM7、ならびにS.エンテリカ(S.enterica)株SL3261、SL3749、およびSL3261ΔwaaLからなる群から選択される、請求項15に記載の宿主細胞。
- 医薬品の調製のための、請求項1から9のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質の使用。
- 医薬品の調製のための、請求項10に記載の核酸および/または請求項11に記載のベクターの使用。
- 医薬品の調製のための、請求項15または16に記載の宿主細胞の使用。
- その必要性のある対象の治療および/または予防用ワクチン接種のための医薬品の調製のための、請求項17に記載のタンパク質の使用。
- その必要性のある対象の治療および/または予防用ワクチン接種のための医薬品の調製のための、請求項18に記載の核酸および/またはベクターの使用。
- その必要性のある対象の治療および/または予防用ワクチン接種のための医薬品の調製のための、請求項15または16に記載の宿主細胞の使用。
- 動物(好ましくは哺乳類、より好ましくはげっ歯類、ヒツジ、ウマ、イヌ、ウシ、またはヒト)においてIgA抗体を誘導するための、請求項19または22に記載の宿主細胞の使用。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の少なくとも1種のタンパク質を含む薬剤組成物。
- 少なくとも1種の請求項10に記載の核酸および/または請求項11に記載のベクターを含む薬剤組成物。
- 請求項16または17に記載の少なくとも1種の宿主細胞を含む薬剤組成物。
- 薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、および/または補助剤をさらに含む、請求項24から26のいずれか一項に記載の薬剤組成物。
- N−結合グリコシル化タンパク質を産生するための方法であって
a)以下をコードする核酸を含む組み換え生物、好ましくは原核生物を提供するステップ:
i)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の機能性のpglオペロン、および
ii)1つまたは複数の下記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む、少なくとも1種の組み換え標的タンパク質であって:
D/E−X−N−Z−S/T
式中、XおよびZは、Pro以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも1つの前記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される組み換え標的タンパク質、および
b)標的タンパク質の産生およびN−グリコシル化に適した方式で、組み換え生物を培養するステップ、
を含む方法。 - 標的タンパク質が、請求項1から9のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質である、請求項28に記載の方法。
- カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の機能性のpglオペロンが、
OTアーゼによって標的タンパク質に転移されることとなる、脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための、
i)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の組み換えOTアーゼ、および
ii)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni))由来の組み換え型および/または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、および/または
iii)カンピロバクター種以外の種由来の組み換え型および/または天然の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、
をコードする核酸を含む、請求項28または29に記載の方法。 - 請求項15または16に記載の宿主細胞を調製するための方法であって、
i)グラム陰性細菌を提供するステップと、
ii)以下をコードする少なくとも1つのヌクレオチド配列を前記細菌に導入するステップと、
a)脂質担体上へのオリゴ糖の構築のための少なくとも1種の組み換え型の特異的なグリコシルトランスフェラーゼ、および/または
b)カンピロバクター種、好ましくはC.ジェジュニ(C.jejuni)由来の少なくとも1種の組み換えオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OTアーゼ)、および/または
c)1つまたは複数の下記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列を含む少なくとも1種の組み換えタンパク質であって:
D/E−X−N−Z−S/T
式中、XおよびZは、Pro以外の任意の天然のアミノ酸であり得、かつ少なくとも1つの前記N−グリコシル化された最適化アミノ酸コンセンサス配列が導入される組み換えタンパク質、
iii)c)のヌクレオチド配列によってコードされる少なくとも1種の組み換えN−グリコシル化タンパク質が、グラム陰性細菌の外膜内および/または上に位置されるまで、前記細菌を培養するステップと、
を含む方法。 - 組み換え型の原核生物または宿主細胞が、エシェリキア亜種(Escherichia ssp)、カンピロバクター亜種(Campylobacter ssp.)、サルモネラ亜種(Salmonella ssp.)、シゲラ亜種(Shigella ssp.)、ヘリコバクター亜種(Helicobacter ssp.)、シュードモナス亜種(Pseudomonas ssp.)、バチルス亜種(Bacillus ssp.)、好ましくは、大腸菌(Escherichia coli)、好ましくは、大腸菌(E.coli)株Top10、W3110、CLM24、BL21、SCM6、およびSCM7、ならびにS.エンテリカ(S.enterica)株SL3261、SL3749、およびSL3261ΔwaaLからなる細菌の群から選択される、請求項28から31のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から9のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質を産生、単離、および/または精製するための方法であって、
a)請求項15または16に記載の宿主細胞を培養するステップと、
b)前記組み換えグラム陰性細菌の外膜を除去するステップと、
c)前記組み換えタンパク質を回収するステップと、
を含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP05010276 | 2005-05-11 | ||
EP05010276.3 | 2005-05-11 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012001342A Division JP5687637B2 (ja) | 2005-05-11 | 2012-01-06 | 原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014042533A true JP2014042533A (ja) | 2014-03-13 |
JP2014042533A5 JP2014042533A5 (ja) | 2014-05-08 |
JP5827303B2 JP5827303B2 (ja) | 2015-12-02 |
Family
ID=37396912
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008510495A Active JP5356807B2 (ja) | 2005-05-11 | 2006-05-10 | 原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 |
JP2012001342A Active JP5687637B2 (ja) | 2005-05-11 | 2012-01-06 | 原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 |
JP2013250586A Active JP5827303B2 (ja) | 2005-05-11 | 2013-12-03 | 原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 |
Family Applications Before (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008510495A Active JP5356807B2 (ja) | 2005-05-11 | 2006-05-10 | 原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 |
JP2012001342A Active JP5687637B2 (ja) | 2005-05-11 | 2012-01-06 | 原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8753864B2 (ja) |
EP (3) | EP1888761B1 (ja) |
JP (3) | JP5356807B2 (ja) |
KR (2) | KR101524636B1 (ja) |
CN (2) | CN103396478B (ja) |
AT (1) | ATE483027T1 (ja) |
AU (1) | AU2006245969B8 (ja) |
CA (1) | CA2607595C (ja) |
CY (1) | CY1116285T1 (ja) |
DE (1) | DE602006017207D1 (ja) |
DK (2) | DK1888761T3 (ja) |
ES (3) | ES2703061T3 (ja) |
HK (3) | HK1113588A1 (ja) |
HR (1) | HRP20150312T1 (ja) |
IL (2) | IL187293A (ja) |
PL (1) | PL2311972T3 (ja) |
PT (2) | PT2311972E (ja) |
SI (1) | SI2311972T1 (ja) |
WO (1) | WO2006119987A2 (ja) |
Families Citing this family (70)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7214660B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-05-08 | Neose Technologies, Inc. | Erythropoietin: remodeling and glycoconjugation of erythropoietin |
US7173003B2 (en) | 2001-10-10 | 2007-02-06 | Neose Technologies, Inc. | Granulocyte colony stimulating factor: remodeling and glycoconjugation of G-CSF |
CA2477794C (en) | 2002-03-07 | 2013-08-20 | Eidgenoessische Technische Hochschule Zuerich | System and method for the production of recombinant glycosylated proteins in a prokaryotic host |
MXPA05010773A (es) | 2003-04-09 | 2005-12-12 | Neose Technologies Inc | Metodos de glicopegilacion y proteinas/peptidos producidos por los metodos. |
US8791070B2 (en) | 2003-04-09 | 2014-07-29 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated factor IX |
WO2005012484A2 (en) | 2003-07-25 | 2005-02-10 | Neose Technologies, Inc. | Antibody-toxin conjugates |
US20080305992A1 (en) | 2003-11-24 | 2008-12-11 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated erythropoietin |
US8633157B2 (en) | 2003-11-24 | 2014-01-21 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylated erythropoietin |
US20060040856A1 (en) | 2003-12-03 | 2006-02-23 | Neose Technologies, Inc. | Glycopegylated factor IX |
BRPI0506741A (pt) | 2004-01-08 | 2007-05-15 | Neose Technologies Inc | glicosilação de peptìdeos ligados a o |
US9211248B2 (en) | 2004-03-03 | 2015-12-15 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for topical application and transdermal delivery of botulinum toxins |
US8092788B2 (en) * | 2004-03-03 | 2012-01-10 | Revance Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for topical diagnostic and therapeutic transport |
US20080300173A1 (en) | 2004-07-13 | 2008-12-04 | Defrees Shawn | Branched Peg Remodeling and Glycosylation of Glucagon-Like Peptides-1 [Glp-1] |
JP5948627B2 (ja) | 2004-10-29 | 2016-07-20 | レイショファーム ゲーエムベーハー | 線維芽細胞成長因子(fgf)のリモデリングと糖質ペグ化 |
EP1858543B1 (en) | 2005-01-10 | 2013-11-27 | BioGeneriX AG | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
EP1861112A4 (en) | 2005-03-03 | 2009-07-22 | Revance Therapeutics Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR TOPICAL APPLICATION AND TRANSDERMAL DELIVERY OF BOTULINUM TOXINS |
US20070154992A1 (en) | 2005-04-08 | 2007-07-05 | Neose Technologies, Inc. | Compositions and methods for the preparation of protease resistant human growth hormone glycosylation mutants |
JP5216580B2 (ja) | 2005-05-25 | 2013-06-19 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | グリコペグ化第ix因子 |
US20070105755A1 (en) | 2005-10-26 | 2007-05-10 | Neose Technologies, Inc. | One pot desialylation and glycopegylation of therapeutic peptides |
US20090048440A1 (en) | 2005-11-03 | 2009-02-19 | Neose Technologies, Inc. | Nucleotide Sugar Purification Using Membranes |
CN101516388B (zh) | 2006-07-21 | 2012-10-31 | 诺和诺德公司 | 通过o-联糖基化序列的肽的糖基化 |
EP2054521A4 (en) | 2006-10-03 | 2012-12-19 | Novo Nordisk As | METHODS OF PURIFYING CONJUGATES OF POLYPEPTIDES |
RS52845B (en) | 2007-04-03 | 2013-12-31 | Biogenerix Ag | TREATMENT PROCEDURES USING GLYCOPEGILATED G-CSF |
US9493499B2 (en) | 2007-06-12 | 2016-11-15 | Novo Nordisk A/S | Process for the production of purified cytidinemonophosphate-sialic acid-polyalkylene oxide (CMP-SA-PEG) as modified nucleotide sugars via anion exchange chromatography |
CN107119095B (zh) | 2008-01-03 | 2022-07-05 | 康乃尔研究基金会有限公司 | 原核生物中的糖基化蛋白表达 |
JP5647899B2 (ja) * | 2008-01-08 | 2015-01-07 | ラツィオファルム ゲーエムベーハーratiopharm GmbH | オリゴサッカリルトランスフェラーゼを使用するポリペプチドの複合糖質化 |
CA2716187C (en) * | 2008-02-20 | 2020-01-07 | Glycovaxyn Ag | Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells |
EP2257311B1 (en) | 2008-02-27 | 2014-04-16 | Novo Nordisk A/S | Conjugated factor viii molecules |
US9309493B2 (en) * | 2009-03-27 | 2016-04-12 | Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich | Salmonella enterica presenting C. jejuni N-glycan or derivatives thereof |
NO2501406T3 (ja) * | 2009-11-19 | 2018-05-19 | ||
AU2011214871A1 (en) | 2010-02-11 | 2012-09-06 | The Governors Of The University Of Alberta | N-Linked Glycan Compounds. |
HUE037956T2 (hu) | 2010-05-06 | 2018-09-28 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Kapszuláris Gram-pozitív bakteriális biokonjugátum vakcinák |
US20130266604A1 (en) * | 2010-09-03 | 2013-10-10 | The Governors of the University of Alberta a non-profit educational institution | Peptide containing multiple n-linked glycosylation sequons |
US20140336366A1 (en) | 2011-09-06 | 2014-11-13 | Glycovaxyn Ag | Bioconjugate vaccines made in prokaryotic cells |
EP3444352B1 (en) | 2012-11-07 | 2020-12-16 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Production of recombinant vaccine in e. coli by enzymatic conjugation |
IL273685B2 (en) | 2013-01-17 | 2023-10-01 | X4 Pharmaceuticals Austria Gmbh | Immunogens and vaccines containing O25b antigens |
CA2923957C (en) | 2013-01-18 | 2021-08-31 | London School Of Hygiene And Tropical Medicine | Glycosylation method |
GB201301085D0 (en) | 2013-01-22 | 2013-03-06 | London School Hygiene & Tropical Medicine | Glycoconjugate Vaccine |
EP2970128B1 (en) * | 2013-03-15 | 2019-12-04 | Asieris Pharmaceutical Technologies Co., Ltd. | Base addition salts of nitroxoline and uses thereof |
RU2671473C2 (ru) * | 2013-04-05 | 2018-10-31 | Де Гавенерс Оф Де Юниверсити Оф Альберта | Вакцина против кампилобактериоза |
JP2016533719A (ja) * | 2013-10-11 | 2016-11-04 | グリコヴァキシン アーゲー | 宿主細胞改変方法 |
SG11201606889PA (en) | 2014-02-24 | 2016-09-29 | Glycovaxyn Ag | Novel polysaccharide and uses thereof |
EP3131577B1 (en) * | 2014-04-17 | 2020-04-22 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Modified host cells and uses thereof |
US10307474B2 (en) | 2014-08-08 | 2019-06-04 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Modified host cells and hybrid oligosaccharides for use in bioconjugate production |
EP3240895B1 (en) * | 2014-12-30 | 2022-01-26 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Compositions and methods for protein glycosylation |
TWI715617B (zh) | 2015-08-24 | 2021-01-11 | 比利時商葛蘭素史密斯克藍生物品公司 | 對抗腸道外病原性大腸桿菌之免疫保護之方法及組合物 |
GB201518668D0 (en) | 2015-10-21 | 2015-12-02 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Immunogenic Comosition |
GB201610599D0 (en) | 2016-06-17 | 2016-08-03 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic Composition |
AR109621A1 (es) | 2016-10-24 | 2018-12-26 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Formulaciones de vacunas contra glucoconjugados de expec |
CN110520153B (zh) * | 2017-01-27 | 2024-04-02 | 佛罗里达大学研究基金公司 | 在禽类中控制肠道沙门氏菌和减少弯曲杆菌的食品安全疫苗 |
GB201712678D0 (en) | 2017-08-07 | 2017-09-20 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Process for the manipulation of nucleic acids |
US11898187B2 (en) | 2017-08-15 | 2024-02-13 | Northwestern University | Protein glycosylation sites by rapid expression and characterization of N-glycosyltransferases |
GB201721582D0 (en) | 2017-12-21 | 2018-02-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | S aureus antigens and immunogenic compositions |
GB201721576D0 (en) | 2017-12-21 | 2018-02-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Hla antigens and glycoconjugates thereof |
WO2019175145A1 (en) | 2018-03-12 | 2019-09-19 | Janssen Vaccines & Prevention B.V. | Vaccines against urinary tract infections |
US11530432B2 (en) | 2018-03-19 | 2022-12-20 | Northwestern University | Compositions and methods for rapid in vitro synthesis of bioconjugate vaccines in vitro via production and N-glycosylation of protein carriers in detoxified prokaryotic cell lysates |
WO2019204346A1 (en) | 2018-04-16 | 2019-10-24 | Northwestern University | METHODS FOR CO-ACTIVATING IN VITRO NON-STANDARD AMINO ACID (nsAA) INCORPORATION AND GLYCOSYLATION IN CRUDE CELLLYSATES |
JP2022513458A (ja) | 2018-12-12 | 2022-02-08 | グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム | O-結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質 |
SG11202110303XA (en) | 2019-03-18 | 2021-10-28 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Methods of producing bioconjugates of e. coli o-antigen polysaccharides, compositions thereof, and methods of use thereof |
UY38616A (es) * | 2019-03-18 | 2020-09-30 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Bioconjugados de polisacáridos del antígeno-o de e. coli y métodos de producción y de uso de los mismos. |
EP3757217A1 (en) | 2019-06-27 | 2020-12-30 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Methods for protein purification |
EP3770269A1 (en) | 2019-07-23 | 2021-01-27 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Quantification of bioconjugate glycosylation |
EP3777884A1 (en) | 2019-08-15 | 2021-02-17 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Immunogenic composition |
IL294445B2 (en) | 2020-01-16 | 2023-10-01 | Janssen Pharmaceuticals Inc | FIMH mutant, its preparations and their use |
EP4168040A1 (en) | 2020-06-18 | 2023-04-26 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Shigella-tetravalent (shigella4v) bioconjugate |
US20230226175A1 (en) | 2020-06-25 | 2023-07-20 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modified exotoxin a proteins |
WO2022058945A1 (en) | 2020-09-17 | 2022-03-24 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Multivalent vaccine compositions and uses thereof |
IL303954A (en) | 2021-01-12 | 2023-08-01 | Janssen Pharmaceuticals Inc | FIMH mutants, their compositions and their use |
BR112023019874A2 (pt) | 2021-04-01 | 2023-11-07 | Janssen Pharmaceuticals Inc | Produção de bioconjugados de e. coli o18 |
WO2023118033A1 (en) | 2021-12-22 | 2023-06-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Vaccine |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003074687A1 (en) * | 2002-03-07 | 2003-09-12 | Eidgenössische Technische Hochschule Zürich | System and method for the production of recombinant glycosylated proteins in a prokaryotic host |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE67786T1 (de) | 1984-08-01 | 1991-10-15 | Boehringer Ingelheim Int | Neue genetische sequenzen, die durch sie codierten interferon-peptide vom typ i und diese sie produzierende organismen. |
US5643758A (en) | 1987-03-10 | 1997-07-01 | New England Biolabs, Inc. | Production and purification of a protein fused to a binding protein |
WO1994026906A2 (en) | 1993-05-14 | 1994-11-24 | The Upjohn Company | CLONED DNA ENCODING A UDP-GALNAc:POLYPEPTIDE,N-ACETYLGALACTOS AMINYLTRANSFERASE |
US6503744B1 (en) | 1999-02-01 | 2003-01-07 | National Research Council Of Canada | Campylobacter glycosyltransferases for biosynthesis of gangliosides and ganglioside mimics |
AU3508300A (en) | 1999-03-02 | 2000-09-21 | Human Genome Sciences, Inc. | Engineering intracellular sialylation pathways |
US20020127219A1 (en) * | 1999-12-30 | 2002-09-12 | Okkels Jens Sigurd | Lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators |
HUP0302299A2 (hu) | 2000-05-12 | 2003-10-28 | Neose Technologies, Inc. | Rekombináns glikopeptidek glikozilezési mintázatának in vitro módosítása |
EP2028275A3 (en) | 2000-06-30 | 2009-05-06 | VIB vzw | Protein glycosylation modification in pichia pastoris |
DE10113573A1 (de) * | 2001-03-20 | 2002-02-28 | Messer Griesheim Gmbh | Verfahren zum Regenerieren von Schwefelsäure aus schwefelhaltigen Reststoffen |
US20040265954A1 (en) | 2002-03-07 | 2004-12-30 | Markus Aebi | System and method for the production of recombinant proteins |
US7598354B2 (en) * | 2002-08-01 | 2009-10-06 | National Research Council Of Canada | Campylobacter glycans and glycopeptides |
-
2006
- 2006-05-10 PT PT101792083T patent/PT2311972E/pt unknown
- 2006-05-10 PT PT06753552T patent/PT1888761E/pt unknown
- 2006-05-10 EP EP06753552A patent/EP1888761B1/en active Active
- 2006-05-10 ES ES14199949T patent/ES2703061T3/es active Active
- 2006-05-10 PL PL10179208T patent/PL2311972T3/pl unknown
- 2006-05-10 CA CA2607595A patent/CA2607595C/en active Active
- 2006-05-10 KR KR1020147001671A patent/KR101524636B1/ko active IP Right Grant
- 2006-05-10 CN CN201310241471.7A patent/CN103396478B/zh active Active
- 2006-05-10 DE DE602006017207T patent/DE602006017207D1/de active Active
- 2006-05-10 WO PCT/EP2006/004397 patent/WO2006119987A2/en active Application Filing
- 2006-05-10 JP JP2008510495A patent/JP5356807B2/ja active Active
- 2006-05-10 CN CN200680020861XA patent/CN101360831B/zh active Active
- 2006-05-10 DK DK06753552.6T patent/DK1888761T3/da active
- 2006-05-10 AU AU2006245969A patent/AU2006245969B8/en active Active
- 2006-05-10 SI SI200631910T patent/SI2311972T1/sl unknown
- 2006-05-10 EP EP10179208.3A patent/EP2311972B1/en active Active
- 2006-05-10 EP EP14199949.0A patent/EP2853600B1/en active Active
- 2006-05-10 KR KR1020077028970A patent/KR101408653B1/ko active IP Right Grant
- 2006-05-10 ES ES06753552T patent/ES2353814T3/es active Active
- 2006-05-10 AT AT06753552T patent/ATE483027T1/de active
- 2006-05-10 US US11/920,175 patent/US8753864B2/en active Active
- 2006-05-10 ES ES10179208.3T patent/ES2535084T3/es active Active
- 2006-05-10 DK DK10179208T patent/DK2311972T3/en active
-
2007
- 2007-11-11 IL IL187293A patent/IL187293A/en active IP Right Grant
-
2008
- 2008-08-14 HK HK08109020.7A patent/HK1113588A1/xx unknown
-
2011
- 2011-10-19 HK HK11111186.8A patent/HK1156983A1/zh unknown
-
2012
- 2012-01-06 JP JP2012001342A patent/JP5687637B2/ja active Active
-
2013
- 2013-06-10 IL IL226857A patent/IL226857A/en not_active IP Right Cessation
- 2013-12-03 JP JP2013250586A patent/JP5827303B2/ja active Active
-
2014
- 2014-02-06 US US14/174,742 patent/US9551019B2/en active Active
-
2015
- 2015-03-18 HR HRP20150312TT patent/HRP20150312T1/hr unknown
- 2015-04-15 CY CY20151100351T patent/CY1116285T1/el unknown
- 2015-06-09 HK HK15105466.7A patent/HK1205193A1/xx unknown
-
2016
- 2016-05-19 US US15/159,535 patent/US20160326563A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003074687A1 (en) * | 2002-03-07 | 2003-09-12 | Eidgenössische Technische Hochschule Zürich | System and method for the production of recombinant glycosylated proteins in a prokaryotic host |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6011035339; Glycobiology, 15[4](2005-Apr) p.361-367 * |
JPN6011035341; Science, 298[5599](2002) p.1790-1793 * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5827303B2 (ja) | 原核細胞由来の組み換えn−グリコシル化タンパク質 | |
US11944675B2 (en) | Bioconjugates made from recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells | |
AU2011218682B2 (en) | Recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells | |
AU2014200938A1 (en) | Recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131220 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20131220 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140325 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150219 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150518 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150924 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20151015 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5827303 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |