ES2535543T3 - Compuestos de glicano N-enlazado - Google Patents

Compuestos de glicano N-enlazado Download PDF

Info

Publication number
ES2535543T3
ES2535543T3 ES11741801.2T ES11741801T ES2535543T3 ES 2535543 T3 ES2535543 T3 ES 2535543T3 ES 11741801 T ES11741801 T ES 11741801T ES 2535543 T3 ES2535543 T3 ES 2535543T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
campylobacter
fetus
formula
organism
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11741801.2T
Other languages
English (en)
Inventor
Christine Szymanski
Harald Nothaft
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Alberta
Original Assignee
University of Alberta
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Alberta filed Critical University of Alberta
Application granted granted Critical
Publication of ES2535543T3 publication Critical patent/ES2535543T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/121—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Helicobacter (Campylobacter) (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/105—Delta proteobacteriales, e.g. Lawsonia; Epsilon proteobacteriales, e.g. campylobacter, helicobacter
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H13/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids
    • C07H13/02—Compounds containing saccharide radicals esterified by carbonic acid or derivatives thereof, or by organic acids, e.g. phosphonic acids by carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/205—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Campylobacter (G)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

Un compuesto aislado o purificado que comprende A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc QuiNAc4NAc, en el que A es Glc-NAc o Glc.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11741801
24-04-2015
DESCRIPCIÓN
Compuestos de glicano N-enlazado
Campo de la invención
La invención se refiere a un compuesto de glicano N-enlazado de fórmula 1, que opcionalmente puede estar condensado o unido a un aminoácido, un péptido, una proteína o un lípido. La invención se refiere también a anticuerpos y a antisueros contra dicho compuesto, y a su uso para diagnosticar una infección provocada por un patógeno de Campylobacter. La invención se refiere también al uso del compuesto como una vacuna para tratar o prevenir una infección por un patógeno de Campylobacter.
Antecedentes
Campylobacter jejuni y Campylobacter coli son las dos especies de Campylobacter que se aislan con más frecuencia que provocan una infección en seres humanos. Estos organismos provocan una altas tasas de gastroenteritis en todo el mundo y, a menudo, el número de casos es mayor que para Salmonella, Shigella y E. coli enterotoxigénica combinadas (Butzler J.P., Clinical Microbiology and Infection, 2004). Además, la infección por C. jejuni se ha relacionado con el desarrollo del síndorme de Guillain-Barré, la causa más común de parálisis provacada por patógenos desde la erradicación de la polio (véanse los artículos: Kaida K., Glycobiology, 2009; Bereswill S. y Kist M., Current Opinion in Infectious Diseases, 2003). Otras especies de Campylobacter han sido reconocidas como patógenos emergentes en la gastroenteritis humana (C. upsaliensis, C. hyointestinalis), han sido asociadas con la enfermerdad del intestino inflamatoria en niños, con la gingivitis, la periodontitis y abortos en mujeres (C. retus, C. concisus) (Zhang L.S. et al., Journal of Clinical Microbiology, 2009) y en la causa de enfermedad venérea e infertilidad en ganado (en especial ganado vacuno; C. fetus venerealis), y abortos en ovejas
(C. fetus fetus) (Butzler J.P., Clinical Microbiology and Infection, 2004, y las referencias citas allí).
Desde la publicación de la primera secuencia del genoma de C. jejuni en 2000 (Parkhill J. et al., Nature, 2000), se han indicado varias otras secuencias genómicas de Campylobacter. A diferencia de la mayoría de las bacterias que se han descrito hasta la fecha, todas las Campylobacter contienen los genes pgl conservados necesarios para la glicosilación de proteínas N-enlazadas (Szymanski C.M. y Wren B.W., Nature Reviews Microbiology, 2005; Nothaft
H. y Szymanski C.M., Nature Reviews Microbiology, 2010).
En eucariotas, las proteínas glicosiladas son componentes ubicuos de las matrices extracelulares y las superficies celulares. Sus restos oligosacáridos están implicados en una amplia gama de acontecimientos de reconocimiento entre células y entre células y matriz que son vitales en procesos biológicos que varían desde el reconocimiento inmunológico hasta el desarrrollo de cáncer. La glicosilación se ha considerado limitada a eucariotas, aunque debido a los avances en los métodos analíticos y la secuenciación genómica, cada vez existen más informes de vías de glicosilación de proteínas O-enlazadas y N-enlazadas en bacterias (Nothaft H. y Szymanski C.M., Nature Reviews Microbiology, 2010). Desde el descubrimiento de la primera vía de glicosliación de proteínas general en bacterias (Szymanski C.M. et al., Molecular Microbiology, 1999), la demostración de que los glicanos de C. jejuni se unen a través de un N-enlace al unísono (Kelly J.H. et al., Journal of Bacteriology, 2006; Wacker M. et al., Science, 2002; Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2002) y de que la vía no solo puede transferirse funcionalmente a Escherichia coli (Wacker M. et al., Science, 2002), sino que la enzima oligosacariltransferasa (PgIB) es capaz de añadir azúcares extraños a proteínas (Feldman M. et al., PNAS, 2005), se ha producido una oleada de actividad de investigación que ha dado como resultado una mayor caracterización y aprovechamiento de este sistema.
Se ha descrito la estructura detallada del heptasacárido exclusivo de C. jejuni N-enlazado (Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2002). Empleando métodos, tales como la RMN de giro alrededor del ángulo mágico de alta resolución (HR-MAS) (Szymanski C.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2003), se ha demostrado que este heptasácarido está conservado, en estructura, en C. jejuni y C. coli.
Se ha descrito un intermedio en la vía de glicosilación N-enlazada de C. jejuni, concretamente un (oligo)heptasacárido libre (fOS), un componente soluble del espacio periplásmico de C. jejuni (Liu X. et al., Analytical Chemistry, 2006). Este fOS tiene una estructura idéntica a la de los oligosacáridos N-enlazados añadidos a proteínas (Nothaft H. et al., PNAS, 2009). Bajo condiciones de crecimiento en laboratorio, la proporción de fOS frente a heptasacárido N-enlazado a proteínas es de aproximadamente 9:1. El fOS en C. jejuni desempeña un papel en la osmorregulación similar a los glucanos periplásmicos bacterianos, y esta vía puede manipularse alterando la concentración de osmolitos del entorno (Nothaft H. et al., PNAS, 2009).
La figura 1 muestra la glicosilación de proteínas N-enlazadas y oligosacáridos libres en C. jejuni. El heptasacárido undecaprenil-pirofosfato-enlazado se ensambla en el citosol mediante la adición de azúcares activados por nucleótidos (Szymanski C.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2003; Szymanski C.M. et al., Trends Microbiology, 2003). El heptasacárido completo es translocado a través de la membrana interna hacia el periplasma por el transportador ABC PgIK (Alaimo C. et al., EMBO Journal, 2006). El oligosacárido es transferido al grupo amino de la asparagina en la secuencia de proteína consenso D/E-X1-N-X2-S/T, en la que X1, X2 pueden ser cualquier aminoácido excepto prolina, por PgIB (Kowarik M. et al., EMBO Journal, 2006; Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2002). Además, pueden encontrarse grandes cantidades de heptasacárido libre (fOS) en C.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11741801
24-04-2015
jejuni (Liu X. et al., Analytical Chemistry, 2006); se ha determinado que la proporción de fOS a N-glicanos es de 9:1. GlcNAc, N-acetilgalactosamina; bacilosamina (Bac), 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxiglucosa; GalNAc, Nacetilgalactosamina; Glc, glucosa (adaptado de Szymanski C.M. et al., Trends Microbiology, 2003).
Compendio
Los inventores han determinado las estructuras de N-glicanos y fOS de una serie de especies de Campylobacter, todas las cuales poseen glicanos N-enlazados y fOS. Además, los inventores han demostrado que los N-glicanos y fOS de Campylobacter pueden dividirse en dos grupos estructurales. El primer grupo produce una estructura similar a la publicada para C. jejuni y C. coli (Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2002; Szymanski C.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2003). El segundo grupo produce una estructura de glicano exclusiva que se diferencia de la determinada para C. jejuni y C. coli y que nunca ha sido descrita. Las especies de Campylobacter incluidas en este grupo incluyen Campylobacter fetus venerealis (provoca enfermedad venérea en ganado vacuno), Campylobacter fetus fetus (provoca abortos en ovejas), Campylobacter concisus (asociado con la gingivitis y la periodontitis, y ha sido aislado a partir de heces de pacientes con gastroenteritis), Campylobacter hyointestinalis (al igual que C. jejuni y C. coli, está asociado con enfermedades diarreicas) y subespecies de Campylobacter hyointestinalis.
Se cree que Campylobacter sputorum y subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus (un patógeno entérico emergente que se ha sugerido que está implicado en la gastroenteritis, Bullman S. et al., FEMS Immunology & Medical Microbiology, 2010), Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus (enfermedad periodontal y aborto en mujeres), Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus pertenecen al segundo grupo.
La figura 2 ilustra un análisis filogenético de las secuencias de proteína del componente clave de esta vía, la oligosacariltransferasa (PgIB), que incluye especies de Campylobacter con genoma secuenciado y otros organismos relacioandos, y demuestra que Campylobacter se divide en dos grupos. Dentro de Campylobacter, la rama de las especies que producen la estructura 1 está en el recuadro superior, y las cepas que producen la fórmula 1A y la fórmula 1B están en el recuadro inferior (adaptado de Nothaft H. y Szymanski C.M., Nature Reviews Microbiology, 2010).
La figura 3 ilustra la reactividad del N-glicano contra (A) un antisuero específico del N-glicano de C. jejuni, (B) SBAlectina (que reconoce los restos GalNAc terminales de la estructura 1), (C) reactividad de WGA-lectina (que reconoce los restos GlcNAc terminales de fórmula 1A y 1B con reactividad cruzada con las estructuras GalNAc), y
(D) análisis de fOS basado en la espectroscopía de masas que demuestra que los glicanos derivados de la vía pgl difieren entre las especies de Campylobacter.
Según un aspecto, la invención se refiere a un nuevo compuesto de glicano N-enlazado (denominado N-glicano) de fórmula 1: A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc, en la que A es GlcNAc o Glc. Este compuesto, en su forma nativa, es común a varias especies de Campylobacter. En su forma nativa, el compuesto es soluble en el periplasma, así como está unido a la membrana interna y a proteínas periplásmicas y, de forma más notable, a proteínas de la membrana externa de la superficie de muchas especies de Campylobacter, incluyendo las patógenas. En la presente invención, el compuesto de fórmula 1 se proporciona en forma aislada y/o purificada. El compuesto comprende dos hexasacáridos que se diferencian entre sí en un azúcar terminal, que comprende Glc o GlcNAc. El primero de dichos compuestos es: GlcNAc-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GaINAc-QuiNAc4NAc (en la presente, la fórmula 1A). El segundo de dichos compuestos es: Glc-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc (en la presente, la fórmula 1B).
En la anterior fórmula 1, QuiNAc4NAc representa un significante alternativo del sacárido Bac, que constituye una abreviatura de bacilosamina.
En un aspecto, la invención se refiere a un compuesto aislado o purificado que comprende los compuestos de fórmula 1 conectados o enlazados a un único aminoácido, un oligopéptido, un péptido, una proteína o un lípido. En un aspecto, el oligopéptido o péptido comprenden entre 2 y 40 aminoácidos, o entre 2 y 30 aminoácidos, o entre 2 y 20 aminoácidos, o entre 2 y 10 aminóacidos.
La invención se refiere también a un método para producir un anticuerpo o un antisuero que comprende las etapas de proporcionar el compuesto de fórmula 1, inocular a un animal o a un ser humano con dicho compuesto para estimular una respuesta inmunológica contra dicho compuesto, extraer el suero de dicho animal y opcionalmente purificar dicho suero para obener el anticuerpo o el antisuero. El anticuerpo o el antisuero resultante se une a especies de Campylobacter en las que el glicano descrito en la presente es nativo, que incluyen Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis y subespecies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum y subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus.
El anticuerpo o el antisuero pueden emplearse para objetivos de diagnóstico, para detectar la presencia de dichos organismos en un animal o en un ser humano.
10
15
20
25
30
35
40
45
50
E11741801
24-04-2015
Los compuestos de la presente invención pueden emplearse en una formulación de vacuna, con o sin un adyuvante, contra Campylobacter fetus venerealis, que es una causa importante del fracaso reproductivo en ganado vacuno y para el cual la actual vacuna tienen un uso limitado, o contra otras especies de Campylobacter, en las que el glicano de fórmula 1 es nativo a dicho organismo, que incluyen las especies listadas anteriormente. Los compuestos de la presente invención tienen usos posibles en aplicaciones de modificación de glicoproteínas, terapéuticas y diagnósticas. Por tanto, la invención se refiere a una vacuna que comprende el compuesto de fórmula 1, opcionalmente conectado o enlazado a un único aminoácido, un oligopéptido, un péptido, una proteína o un lípido. El único aminoácido puede comprender asparagina.
La invención se refiere también al uso de dicha vacuna para tratar o prevenir una infección provocada por un organismo de Campylobacter, en el que el compuesto de fórmula 1 comprende un glicano nativo dentro de dicho organismo, y a un método de tratamiento que comprende dicho uso, dentro de un ser humano o un animal.
Según otro aspecto, la invención se refiere a un método para mejorar la productividad y la salud de un rebaño de animales mediante la administración a dicho rebaño de la vacuna según se describió anteriormente.
Las vacunas, los anticuerpos y los antisueros descritos en la presente también pueden emplearse para la prevención, el tratamiento y el diagnóstico en seres humanos.
Descripción de los dibujos
La figura 1 muestra la glicosilación de proteínas N-enlazadas y los oligosacáridos libres en C. jejuni.
La figura 2 es un diagrama que resume las estructuras de fOS y de N-glicanos en diversas especies de Campylobacter.
Las figuras 3A-3D muestran análisis de N-glicanos y fOS en especies de Campylobacter seleccionadas.
La figura 4A es el espectro de RMN de 1H de fOS purificado a partir de C. fetus fetus.
La figura 4B es un solapamiento de espectros de RMN de HSQC bidimensionales para C. fetus fetus y C. fetus venerealis.
La figura 5 muestra las estructuras de fOS y N-glicanos de C. jejuni, C. coli y C. upsaliensis (estructura 1), y de la fórmula 1A y la fórmula 1B de las otras especies de Campylobacter descritas en la presente.
La figura 6 muestra los perfiles de elución de la fórmula 1A y la fórmula 1B, bajo las condiciones descritas en la presente, y la confirmación de la fórmula 1A y la fórmula 1B purificadas.
La figulra 7 ilustra la conjugación de los compuestos de fórmula 1A y formula 1B purificados con BSA.
La figura 8 ilustra inmunotransferencias con antisueros generados contra cada uno de los glicoconjugados-BSA.
Las figuras 9A-F muestran los espectros de MS de glicopéptidos que comprenden compuestos de fórmula 1 como el resto glicano.
La figura 10 muestra células de Campylobacter que han sido marcadas con antisuero específico de la fórmula 1A y la fórmula 1B.
La figura 11 ilustra inmunotransferencias con antisueros generados contra la fórmula 1A, la fórmula 1B y la estructura 1.
Descripción detallada
La presente invención se refiere al compuesto de glicano A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc, en el que A es GlcNAc o Glc. El anterior compuesto incluye los dos compuestos de glicano GlcNAc-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc (en la presente la fórmula 1A) y Glc-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc (en la presente la fórmula 1B).
En las anteriores fórmulas, QuiNAc4NAc representa un significante alternativo del sacárido Bac, que constituye una abreviatura de bacilosamina (también denominada diNAcBac). El compuesto de fórmula 1 está opcionalmente conectado o enlazado a un único aminoácido, un oligopéptido, un péptido, una proteína o un lípido.
Dicho lípido puede aislarse y purificarse de una fuente bacteriana, arqueobacteriana o eucariota, o puede sintetizarse químicamente. Dicho enlace del compuesto de glicano al lípido puede estar mediado por un fosfato, un conector de pirofosfato o un enlace glicosídico. Se han descrito ejemplos de lípidos (con diversas longitudes de cadena, grado de saturación y configuración) enlazados a N-glicanos (Faridmoayer et al., Journal of Biological Chemistry, 2009; Chen M.M. et al., Biochemistry, 2007). Los compuestos de N-glicanos enlazados a lípidos producidos en el hospedante nativo o en un sistema de expresión heterólogo incluyen compuestos de N-glicanos undecaprenil-fosfato-enlazados, tal como se muestra para el N-glicano de C. jejuni (Reid C.W. et al., Analytical
E11741801
24-04-2015
Chemistry, 2008, Reid C.W. et al., Analytical Chemistry, 2009) y propuesto para el N-glicano de C. lari (Schwarz F. et al., Glycobiology 2011) y conjugados de N-glicano-lípido A (demostrado para el N-glicano de C. jejuni (van Sorge
N.M. et al., Cellular Microbiology, 2009).
Se ha determinado que el anterior compuesto está sustancialmente conservado a través de múltiples especies de 5 Campylobacter.
Las figuras 3A-3D muestran N-glicanos y fOS en especies seleccionadas de Campylobacter. (A) Transferencia Western que emplea un antisuero que reconoce el heptasacárido N-enlazado de C. jejuni que ha reaccionado con reactividad cruzada con otras especies de Campylobacter (recuadros blancos) que también reaccionaron con (B) aglutinina de soja que reconoce los restos GalNAc terminales, pero que muestran poca reactividad con (C) aglutinina
10 de germen de trigo (WGA) que reconoce los restos GlcNAc terminales presentes en la fórmula 1A y la fórmula 1B. Se destacan las especies que no reaccionan con el antisuero específico de C. jejuni, pero que sí reaccionan con WGA. (D) Ejemplos de la espectrometría de masas de fracciones enriquecidas en fOS o Asn-enlazadas de (1) C. jejuni, (2) C. fetus venerealis, (3) C. concisus, (4) C. fetus fetus, y (5) C. hyointestinalis; los resultados de todas las especies analizadas mediante espectrometría de masas se resumen en la tabla 1.
15 Tabla 1
MS-MS2 (m/z)
Especies de Campylobacter
Oligosacárido libre (fOS) Glicano N-enlazado
C. jejuni
GalNAc5-Glc-Bac (1425,0) HexNAc5-Hex-Bac-Asn (1539,5)
C. coli
HexNAc5-Hex-Bac (1425,0) N/D
C. upsaliensis
HexNAc5-Hex-Bac (1425,0) N/D
C. fetus fetus
HexNAc5-Bac (1263,5) Formula 1A HexNAc4-Glc-Bac (1222,5) Fórmula 1B HexNAc5-Bac-Asn (1377,5) Formula 1A-Asn(N)-enlazado Sobre un péptido: HexNAc5-Bac-Asn Formula 1A-Asn(N)-enlazado Hex-HexNAc4-Bac-Asn Formula 1B-Asn(N)-enlazado
C. fetus venerealis
HexNAc5-Bac (1263,5) Formula 1A HexNAc4-Hex-Bac (1222,5) Fórmula 1B Sobre un péptido: HexNAc5-Bac-Asn Formula 1A-Asn(N)-enlazado Hex-HexNAc4-Bac-Asn Formula 1B-Asn(N)-enlazado
C. concisus
HexNAc5-Bac (1263,5) Formula 1A HexNAc4-Hex-Bac (1222,0) Fórmula 1B Sobre un péptido: HexNAc5-Bac-Asn Formula 1A-Asn(N)-enlazado Hex-HexNAc4-Bac-Asn Formula 1B-Asn(N)-enlazado
C. hyointestinalis
HexNAc5-Bac (1263,5) Formula 1A HexNAc4-Hex-Bac (1222,0) Fórmula 1B N/D
Tabla 1. Masas de las estructuras de fOS y de N-glicanos determinadas mediante espectroscopía de masas en cepas de Campylobacter seleccionadas. Los números indican la masa o masas de fórmula 1A y fórmula 1B, como el oligosacárido libre (fOS) o Asn-enlazado. Las masas se obtuvieron en el modo de ion positivo a partir de lisados de
20 células completas de la cepa indicada. Las estructuras de la fórmula 1A y la fórmula 1B se determinaron mediante RMN, tal como se muestra en la figura 4, la tabla 3 y la figura 5. N/D, no determinado.
Ejemplo 1: Purificación de los compuestos de fórmula 1A y 1B
Se cultivaron Campylobacter jejuni 11168, C. concisus, C. hyointestinalis, C. fetus fetus y C. fetus venerealis bajo condiciones microaerobias. Las células completas obtenidas después de una centrifugación se digirieron con un 25 gran exceso de proteinasa K a pH 8 (ajustado mediante la adición de amoniaco) a 37 ºC durante 48 horas. Los productos de la digestión o los oligosacáridos libres se separaron en una columna de Sephadex G-15 (1,5 x 60 cm) y
10
15
20
25
30
E11741801
24-04-2015
cada fracción que eluye antes del pico salino se secó y se analizó mediante RMN de 1H. Las fracciones que contenían los productos deseados se separaron mediante una cromatografía de intercambio aniónico sobre una columna Hitrap Q (tamaño 5 ml, Amersham) y los glicanos se eluyeron con un gradiente lineal de NaCl (0-1 M, 1 h) que dio como resultado el aislamiento de una mezcla de ambos compuestos de glicano (fórmula 1A y fórmula 1B). La desalación se realizó sobre Sephadex G15 antes del análisis mediante RMN.
Ejemplo 2: Análisis de espectroscopía de RMN
Los experimentos de RMN sobre los glicanos obtenidos en el ejemplo 1 se realizaron en un espectrómetro Varian INOVA 500 MHz (1H) con una sonda de gradiente de 3 mm a 25 ºC con acetona como referencia interna (2,225 ppm para 1H y 31,45 ppm para 13C) utilizando las secuencias de pulso patrón DQCOSY, TOCSY (tiempo de mezclado 120 ms), ROESY (tiempo de mezclado 500 ms), HSQC y HMBC (100 ms de retraso de transferencia de intervalo largo). El tiempo AQ se mantuvo a 0,8-1 sg para las correlaciones H-H y 0,25 sg para HSQC, y los incrementos de 256 se adquirieron para t1. Los resultados se muestran en la figura 4, figura 5 (espectros de RMN y estructuras) y la tabla 2, que se corresponde con los desplazamientos químicos.
La figura 4A es el espectro de RMN de 1H de fOS purificado de C. fetus fetus. La figura 4B es un solapamiento de espectros de RMN de HSQC bidimensionales para C. fetus fetus y C. fetus venerealis, que indica que las estructuras de fOS de ambas especies son idénticas. El espectro de RMN también puede solaparse con uno obtenido para C. concisus (no se muestra). Los correspondientes desplazamientos químicos (ppm) para el oligosacárido libre purificado de C. fetus fetus (tal como se muestra en la figura 4A) se resumen en la tabla 2. Los desplazamientos químicos de carbono y protón se referencian a un patrón interno de acetona (H 2,225 ppm, C 31,07 ppm).
Los glicanos de Campylobacter que se añaden a las proteínas o que aparecen en forma libre (fOS) pueden dividirse en dos grupos estructurales. El primer grupo de especies de Campylobacter produce una estructura exclusiva de glicano que ha sido previamente determinada para C. jejuni y C. coli, y en la presente para C. upsaliensis. Las Campylobacter que pertenecen al segundo grupo consisten en Campylobacter fetus venerealis (provoca enfermedad venérea e infertilidad en ganado vacuno), Campylobacter fetus fetus (provoca abortos en ovejas), Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespecies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum y subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus.
La determinación de la estructura mediante RMN empleando oligosacáridos libres (fOS) purificados a gran escala a partir de C. fetus fetus, C. fetus venerealis, y C. concisus demuestra que este segundo grupo de Campylobacter produce una estructura diferente de la descrita originariamente para C. jejuni y C. coli (figura 4 y figura 5).
Tabla 2 5
Unidad, compuesto
Átomo 1 2 3 4 5 6 (6a) 6b
-QuiNAc4NAc -A
1H 5,14 4,07 4,00 3,80 3,97 1,14
13C
92,2 54,3 73,3 58,3 68,0 17,6
-QuiNAc4NAc -A
1H 4,73 3,78 3,81 3,80 3,54 1,17
13C
95,6 57,2 75,9 58,3 72,3 17,6
-GalNAc B
1H 5,21 4,23 3,83 4,05 3,89 37,0 3,75
13C
98,0 50,7 68,0 77,5 72,6 60,9
-GalNAc C
1H 5,00 5.02 4,28 4,14 4,08 4,37 3,59 3,64
13C
99,4 51,4 67,7 77,6 72,3 60,5
-GlcNAc D
1H 4,90 4,05 3,95 3,76 4,33 3,57 4,01
13C
99,4 54,2 80,0 69,3 71,9 65,8
-GlcNAc E
1H 4,58 3,70 3,59 3,48 3,48 3,77 3,93
13C
102,5 57,0 74,6 71,1 77,0 61,8
-GlcNAc F
1H 4,93 3,92 3,78 3,50 3,75 3,79 3,85
10
15
20
25
30
35
40
45
E11741801
24-04-2015
13C
98,1 54,9 72,3 71,2 73,1 61,7
-GalNAc C’
1H 5,00 4,28 4,14 4,10 4,37 3,59 3,64
13C
99,4 51,4 67,7 77,7 72,3 60,5
-GlcNAc D’
1H 4,97 4,16 3,97 3,75 4,34 3,57 4,01
13C
99,5 54,1 81,7 69,3 71,9 65,8
-Glc G
1H 4,53 3,29 3,51 3,42 3,48 3,74 3,91
13C
104,3 74,2 76,8 70,6 76,8 61,7
Tabla 2: Desplazamientos químicos (ppm) para los oligosacáridos libres purificados (fórmula 1A y formula 1B) procedentes de C. fetus fetus (para el espectro mostrado en la figura 4A). Los desplazamientos químicos de carbono y protón se referencian a un patrón interno de acetona (H 2,225 ppm, C 31,07 ppm). Las letras mayúsculas se refieren a los restos azúcar individuales según se resume en las figuras 4A y 5.
Ejemplo 3: Preparación del glicano de los compuestos de fórmula 1 enlazado a un único aminoácido
Un digerido con Pronase E de extractos de células completas obtenido después de la lisis de células intactas, seguido de un espectrometría de masas, según se describe en Liu X. et al., AnalChem, 2005, y en Nothaft H. et al., Methods Mol. Biol., 2010, identificó el heptasacárido de C. jejuni (estructura 1) enlazado a un única asparagina, y la fórmula 1 enlazada a una única asparagina en C. fetus fetus (tabla 1).
Ejemplo 4: Expresión de los compuestos de fórmula 1
El operón de glicosilación de proteínas que codifica todos los genes necesarios para la producción y la transferencia de los compuestos de fórmula 1A y fórmula 1B puede cloanrse y expresarse a partir de un plásmido o plásmidos de
E. coli. Como alternativa, las glicosiltransferasas sobre un plásmido descrito por Wacker et al., Science, 2002, que contiene el operón de glicosilación de proteínas (pgl) de C. jejuni puede intercambiarse por glicosiltransferasas que producen la fórmula 1A y la fórmula 1B. La expresión de los compuestos de fórmula 1A y fórmula 1B puede realizarse en un sistema heterólogo en presencia de un péptido aceptor marcado por afinidad para la glicosilación de proteínas N-enlazadas (que ya se ha demostrado para el N-glicano de C. jejuni y para el N-glicano de C. lari; Wacker et al., Science, 2002; Schwarz et al., Glycobiology, 2011) o como una fusión de dicha proteína con una proteína de fago (Duerr et al., Glycobiology, 2010). La proteína/péptido/fago que contiene el glicano puede purificarse mediante una purificación con un marcador de afinidad, si es necesario en combinación con una cromatografía de afinidad con un agente que reconoce el glicano o lectina, para separar los péptidos glicosilados y no glicosilados.
Ejemplo 5: Purificación de la fórmula 1A y la fórmula 1B
El fOS de fórmula 1A y fórmula 1B purificado se separó mediante una cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución con detección amperométrica pulsada (HPAEC/PAD). La figura 6 muestra el perfil de elución de una columna analítica CarboPac PA200 (3 x 250 mm, CarboPac PA100 equipado con una columna de guarda: 3 x 50 mm) bajo las siguientes condiciones. caudal: 0,5 ml/min; sistema eluyente, acetato de sodio 50 mM en hidróxido de sodio 100 mM; modo de detección, amperometría pulsada, forma de onda cuádruple, electrodo de Au; la temperatura ambiente de la columan se ajustó a aproximadamente 30 ºC (figura 6A). Aproximadamente 0,5 nmoles de una mezcla de fórmula 1A y fórmula 1B (figura B), o de fórmula 1B y fórmula 1A después de una separación (figura 6C) empleando una columna semipreparativa PA 100 (9 x 250 mm) y un colector de fracciones (DIIONEX UltiMate 3000) bajo las mismas condiciones que las indicadas anteriormente, se analizaron mediante HPACE/PAD. Las fracciones que contenían la fórmula 1A o la fórmula 1B se neutralizaron con cantidades equimolares de HCl 0,2 M y se conservaron a -20 ºC. Los espectros obtenidos mediante espectrometría de masas de ionización de electropulverización (ESI-MS) de la fórmula 1A (figura 6D) y la fórmula 1B (figura 6E) purificadas después de la purificación se corresponden con las masas observadas de fórmula 1A y fórmula 1B según se indica en la tabla 1.
Ejemplo 6: Conjugación de la fórmula 1A y la fórmula 1B con BSA
Los compuestos de fórmula 1A y 1B purificados y neutralizados preparados en el ejemplo 5 se conjugaron con BSA mediante una aminación reductora (véase Gildersleeve J.C., Bioconjug. Chem., 2008). Una mezcla de albúmina de suero bovina (BSA, 2 l de una disolución 150 mg/ml, fracción V), borato de sodio (5,5 l de una disolución 400 mM, pH 8,5), sulfato de sodio (3,7 l de una disolución 3 M, 50 ºC), oligosacárido (fórmula 1A o fórmula 1B) (7,0 l de una disolución 20 mM para 15 eq.), H2O (1,4 l) y cianoborohidruro de sodio (2,2 l de una disolución 3 M) se incubó en un tubo de PCR de 200 l en un termociclador de PCR a 56 ºC durante 96 h con una tapa calentada. La reacción se diluyó con H2O hasta un volumen final de 100 l, se trasladó a un tubo de diálisis de 500 l (corte de peso molecular 10.000) y se dializó tres veces contra H2O (2,5 l).
10
15
20
25
30
35
E11741801
24-04-2015
La figura 7 muestra la conjugación de la fórmula 1A y la fórmula 1B a BSA: los glicoconjugados se separaron mediante PAGE al 12,5% (A) y se controlaron mediante una transferencia Western empleando WGA-lectina disponible en el mercado conjugada con fosfatasa alcalina (B). Carril 1, 400 mg de fracción V de BSA; carril 2, 400 ng de la fórmula 1B acoplada a la fracción V de BSA; carril 3, 400 ng de la fórmula 1B acoplada a la fracción V de BSA. A la izquierda se indican los marcadores de peso molecular (PM en KDa).
Ejemplo 7: Inmunización de conejos con conjugados de fórmula 1A o fórmula 1B-BSA
Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda con 2 mg de cada uno de los compuestos de glicoconjugado preparados en el ejemplo 6, empleando un protocolo de inmunización (protocolo aprobado por Animal Care Committee n.º 717). Después de una inyección subcutánea inicial (en 3 sitios, se inyectaron 0,5 ml en cada sitio) de 2,0 mg de antígeno empleando adyuvante completo de Freund (en una proporción 1:1 con el antígeno), se administró una dosis de refuerzo con 2,0 mg de cada uno de los conjugados de fórmula 1A-BSA y fórmula 1B-BSA mezclados con adyuvante incompleto de Freund (en una proporción 1:1 con el antígeno) por vía subcutánea (en 3 sitios, se inyectaron 0,5 ml en cada sitio) después de 4 semanas. Después de 6 semanas se preparó el suero a partir de una muestra de sangre de 5 ml de cada animal enfriando la muestra de sangre durente 60 min sobre hielo, seguido de una centrifugacián durante 20 min a 10.000 x g. Los sueros individuales se analizaron para la producción de anticuerpos específicos de la fórmula 1A y la fórmula 1B mediante transferencia Western con lisados de células completas de Campylobacter (figura 8).
La figura 8 muestra una inmunotransferencia con un antisuero que se generó contra glicoconjugados-BSA individuales: se aplicaron 120 g de lisados de células completas de C. jejuni 11168 de tipo salvaje (carril 1), C. jejuni 11168 pgIB cepa mutante (carril 2), o C. fetus fetus (carril 3) a SDS-PAGE al 12,5%. Después de la transferencia a una membrana de PVDF, las proteínas inmovilizadas se sondaron (A) con una dilución 1:2000 de una muestra de suero obtenida a partir de un conejo que se inmunizó con el compuesto de fórmula 1B-BSA (SZR-1) y con (B) suero de un conejo inmunizado con el compuesto de fórmula 1A-BSA (SZR-3). A la izquierda se indican los marcadores de peso molecular (PM en KDa).
Ejemplo 8: Los compuestos de fórmula 1A y 1B se N-enlazan
Se cultivaron células en caldo MH bajo condiciones microaerobias, se recolectaron mediante centrifugación y se lavaron dos veces en Tris-HCl 50 mM, pH 7,2. Los sedimentos se liofilizaron y se colocaron en tubos Lobind de 1,5 ml (Eppendorf). Los sedimentos (10 mg) se resuspendieron en 1 ml de Tris-HCl enfriado en hielo (pH 7,5) en presencia de 150 unidades de benozanasa, se agitaron en vórtice para la resuspensión y se mantuvieron en hielo. Después de una sonicación (6 veces durante 30 segundos con un minuto sobre hielo entre cada una), los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación a 20.000 x g durante 30 minutos a 4 ºC. El sobrenadante se recogió en tubos LoBind (Eppendorf) y se liofilizó. El procesamiento de las muestras, el enriquecimiento en glicopéptidos y la espectrometría de masas se aplicaron como se ha descrito (Scott N.E., et al., Molecular and Cellular Proteomics, 2010). Se identificó la fórmula 1A y la fórmula 1B N-enlazadas a asparaginas localizadas en polipéptidos derivados de lisados celulares proteolíticamente digeridos en C. fetus fetus, C. fetus venerealis y C. concisus (tabla 3).
Se aislaron e identificaron glicopéptidos de Campylobacter fetus fetus, Campylobacter fetus venerealis, y Campylobacter concisus, mostrándose los resultados en la tabla 3. Las porciones de glicanos de todos comprendían el compuesto de fórmula 1A o 1B.
Tabla 3: Compuestos de fórmula 1A y 1B que contienen glicopéptidos
Glicopéptidos identificados de Campylobacter fetus fetus
n.º de registro (Uniprot)
Nombre de la proteína Secuencia del péptido Área de la glicoforma HexNAc4-Hex-Bac (fórmula 1B) Área de la glicoforma HexNAc5-Bac (fórmula 1A) Proporción (HexNAc5-Bac (fórmula 1A)/ HexNAc4-Hex-Bac (fórmula 1B)
A0RM44_C AMFF
proteína de dominio PDZ 109NSTEMGHIK118 9915111 25419948 2.563758288
A0RN17_C AMFF
proteína de la familia del citocromo c putativa 47YAKDENVSINVYK59 8804978 25437438 2.888983709
A0RN17_C AMFF
proteína de la familia del citocromo c putativa 50DENVSINVYK59 1509926 7656723 5.070925992
A0RM98_C AMFF
proteína accesoria de citocromo c oxidasa CcoG 374VHEYYFDVNDTR386 19342158 5383759 0.278343244
A0RP44_CA MFF
proteína de homeostasis de cobre CutF 855DDNETFYFK94 373909 1910579 5.10974328
A0RRM2_C AMFF
proteína de la familia del canal de iones mecanosensible 47NASLGHDLDSLK58 4565871 14763004 3.233337955
A0RP42_CA MFF
hidroxilamina oxidasa 283MSGIGDLNTTHNVSVR299 14116580 44662532 3.16383515
A0RM84_C AMFF
mureína transglicosilasa lítica soluble 155FLNDNNITSSFIPHLSSNWQFK177 310080 638344 2.058642931
A0RN61_C AMFF
proteína no caracterizada putativa 68FGLGDDNNETTK79 3488453 20563891 5.894845366
Glicopéptidos identificados de Campylobacter fetus venerealis
n.º de registro (GenBank)
Nombre de la proteína Secuencia del péptido Área de la glicoforma HexNAc4-Hex-Bac (fórmula 1B) Área de la glicoforma HexNAc5-Bac (fórmula 1A) Proporción (HexNAc5-Bac (fórmula 1A)/ HexNAc4-Hex-Bac (fórmula 1B)
ACLG01000 782.1; Cóntigo782 de C. fetus
proteína de dominio 109NSTEMGHIK118 2200609 1611018 0.732078257
venerealis Azul-94
PDZ
desconocido
desconocido
DTNQTFTK 4891730 7235352 1.479098806
desconocido
desconocido
NFHDTNK 4045072 2602866 0.643465926
Glicopéptidos identificados de Campylobacter concisus
n.º de registro (GenBank)
Nombre de la proteína Secuencia del péptido Área de la glicoforma HexNAc4-Hex-Bac (fórmula 1B) Área de la glicoforma HexNAc5-Bac (fórmula 1A) Proporción (HexNAc5-Bac (fórmula 1A)/ HexNAc4-Hex-Bac (fórmula 1B)
desconocido
desconocido
(NF)HDTNK 4261136 16308843 3.827346276
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
E11741801
24-04-2015
Lista de proteínas identificadas como N-enlazadas con fórmula 1A y fórmula 1B. Se determinaron las áreas de los picos individuales para la fórmula 1A y la fórmula 1B mediante espectrometría de masas de control de reacciones múltiples (MRM).
Las figuras 9A-F muestran los espectros de MS que demuestran que los compuestos de fórmula 1A y fórmula 1B están N-enlazados (al mismo péptido), como sigue:
9A) Espectro de MS (barrido de ion precursor) de péptidos enriquecidos en HILIC-LC tras una digestión tríptica; (B) Cuantificación de las áreas relativas de los picos de los correspondientes iones; (C) MS/MS de la porción de carbohidrato; (D) MS/MS de la porción de péptido del ion m/z 968,44545; 9E) MS/MS de la porción de carbohidrato, y 9F) MS/MS de la porción de péptido del ion m/z 982,12069.
Ejemplo 9: La fórmula 1A y 1B se presentan sobre la superficie de células de Campylobacter
Se cultivaron células de C. fetus fetus, C. fetus venerealis, C. concisus, C. hyointestinais, y C. jejuni sobre placas MH durante 18-24 horas bajo condiciones microaerobias. Las células se recolectaron de la placa con 2 ml de caldo MH, se enfriaron sobre hielo durante 10 min, se centrifugaron durante 5 min a 6.000 x g. Las células se mantuvieron sobre hielo durante todas las demás etapas de marcaje y lavado empleando disoluciones preenfriadas (4 ºC). Las células se lavaron dos veces con 2 ml de tampón de lavado (fosfato de potasio 50 mM, NaCl 100 mM). Para evitar la unión no específica, las células de bloquearon con leche desnatada al 1% en tampón de lavado durante 30 min. El anticuerpo primario (dilución 1:1.000 en tampón de lavado con leche desnatada al 0,5%) se aplicó durante 30 min. Las células se lavaron 3 veces con 2 ml de tampón de lavado. El anticuerpo secundario marcado de modo fluorescente (anti-conejo-IgG-Alexa-Fluor546, diluico 1:100 en tampón de lavado con leche desnatada al 0,5%) se aplicó durante 30 minutos y las células se lavaron 4 veces en tampón de lavado. El marcaje de la superficie celular se controló empleando un microscopio Leica DMRXA Upright equipado con una cámara digital Optronics MacroFire (LM-MFC-CD). Cada fotografía se tomó bajo idénticos ajustes del software. C. jejuni que produce la estructura 1 sirvió como control negativo.
La figura 10 muestra las imágenes de microscopía fluorescente de células completas de C. fetus fetus, C. fetus venerealis, C. concisus, C. hyointestinais, y C. jejuni (control negativo) sondadas con 10 A, SZR-1 (anti-fórmula 1B)
o 10B, SZR-3 (anti-fórmula 1A) como antisuero primario, y un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia.
La figura 11 muestra inmunotransferencias con el antisuero que se generó contra la fórmula 1A o la fórmula 1B y el antisuero que se dirige al N-glicano de C. jejuni (estructura 1, hR6 ha sido descrito por Schwarz et al., Nature Chemical Biology , 2010). Se aplicaron 90 g de C. fetus fetus (carril 1), C. fetus venerealis (carril 2), C. concisus (carril 3), C. hyointestinalis (carril 4) y C. jejuni 11168 (carril 5) a SDS-PAGE al 12,5%. Después de la transferencia a una membrana de PVDF, las proteínas inmovilizadas se sondaron (A) con una dilución 1:500 de una muestra de suero obtenida a partir de un conejo que se inmunizó con el compuesto de fórmula 1B-BSA (SZR-1), con (B) una dilución 1:500 de suero de un conejo inmunizado con el compuesto de fórmula 1A-BSA (SZR-3), o (C) con 1:5.000 de un antisuero específico contra el N-glicano de C. jejuni (hR6). A la izquierda se indican los marcadores de peso molecular (PM en KDa).
Los compuestos de glicano (fórmula 1B y fórmula 1B) pueden unirse a diversos vehículos de glicano (péptidos, lípidos). Los compuestos resultantes pueden emplearse para estimular una respuesta inmunológica contra la respectiva estructura que será protectora contra la infección con especies bacterianas que presentan la fórmula 1A y la fórmula 1B.
Los antisueros/anticuerpos generados pueden emplearse (por ejemplo, cuando se inmovilizan sobre una superficie) como diagnóstico para detectar, por ejemplo, C. fetus venerealis o C. fetus fetus en ganado infectado (en especial ganado vacuno infectado con C. fetus venerealis) o para detectar cepas de Campylobacter patógenas humanas (por ejemplo, C. concisus, C. hyointestinalis, C. ureolyticus). Dichos antisueros/anticuerpos pueden emplearse para detectar compuestos en cualquier secreción o fluido corporal. Por ejemplo, el semen de toro puede ensayarse con anticuerpos que reconozcan el glicano de fórmula 1 para detectar una infección por Campylobacter fetus venerealis que pueda estar presente en el animal.
Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse para inmunizar animales, en particular, ganado, frente a
C. fetus venerealis, C. fetus fetus y otras especies de Campylobacter en las que el glicano descrito en la presente es nativo al organismo. La inmunización puede tomar la forma de tratar o prevenir una enfermedad en animales individuales o en todo un rebaño para mejorar la productividad y la salud del rebaño.
En la medida en que la especie de Campylobacter en la cual el glicano de fórmula 1 es nativo al organismo, los compuestos descritos en la presente pueden utilizarse de una manera similar a lo anterior para preparar vacunas para tratar o prevenir una infección por dichos organismos dentro de seres humanos. Así mismo, puede obtenerse una función diagnóstica similar en seres humanos, empleando los anticuerpos o los antisueros generados contra dichos compuestos. De modo similar, los compuestos pueden ser dirigidos por otros productos terapéuticos, tales como bacteriófagos o sus proteínas de unión al receptor.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1.-Un compuesto aislado o purificado que comprende A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc QuiNAc4NAc, en el que A es Glc-NAc o Glc.
  2. 2.-El compuesto de la reivindicación 1 conectado o enlazado a un único aminoácido, un oligopéptido, un péptido, una proteína o un lípido.
  3. 3.-El compuesto de la reivindicación 2, en el que dicho único aminoácido es asparagina.
  4. 4.-Una vacuna que comprende el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  5. 5.-La vacuna de la reivindicación 4, que comprende además un adyuvante.
  6. 6.-La vacuna de las reivindicaciones 4 o 5 para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección provocada por un organismo de Campylobacter, en la que el compuesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 comprende un glicano nativo dentro de dicho organismo.
  7. 7.-La vacuna de la reivindicación 6, en la que dicho organismo es Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespecies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum, subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus.
  8. 8.-La vacuna de la reivindicación 4 o 5 para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección provocada por un organismo de Campylobacter, en la que el compuesto de la reivindicación 1 es nativo a dicho organismo.
  9. 9.-La vacuna de la reivindicación 8, en la que dicho organismo es Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespecies de Campylobacter hyointestinaltis, Campylobacter sputorum, subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus.
  10. 10.-La vacuna de las reivindicaciones 4 o 5 para su uso para mejorar la productividad y la salud de un rebaño de animales o la salud de un ser humano.
  11. 11.-Un anticuerpo o un antisuero eficaz contra un organismo de Campylobacter, en el que el compuesto de la reivindicación 1 es nativo a dicho organismo, y dicho anticuerpo o antisuero comprende un anticuerpo o un antisuero específico para el compuesto de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
  12. 12.-El anticuerpo o el antisuero de la reivindicación 11, en el que dicho organismo es Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespecies de Campylobacter hyointestinaltis, Campylobacter sputorum, subespecies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis y Campylobacter curvus.
  13. 13.-Un método para diagnosticar la presencia de una infección en un animal o un ser humano provocada por un organismo de Campylobacter, en el que el compuesto de la reivindicación 1 es nativo a dicho organismo, poniendo en contacto una muestra procedente del animal o del ser humano con el anticuerpo o el antisuero de la reivindicación 11 o 12.
  14. 14.-El método de la reivindicación 13, en el que el organismo es Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, o Campylobacter ureolyticus.
    12
ES11741801.2T 2010-02-11 2011-02-11 Compuestos de glicano N-enlazado Active ES2535543T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30341110P 2010-02-11 2010-02-11
US303411P 2010-02-11
PCT/CA2011/050084 WO2011097733A1 (en) 2010-02-11 2011-02-11 Free hexasaccharide isolated from several campylobacter species

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2535543T3 true ES2535543T3 (es) 2015-05-12

Family

ID=44367098

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES11741801.2T Active ES2535543T3 (es) 2010-02-11 2011-02-11 Compuestos de glicano N-enlazado

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9221898B2 (es)
EP (1) EP2545081B1 (es)
JP (1) JP5925699B2 (es)
AU (1) AU2011214871A1 (es)
CA (1) CA2789505C (es)
ES (1) ES2535543T3 (es)
PT (1) PT2545081E (es)
WO (1) WO2011097733A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011062615A1 (en) * 2009-11-19 2011-05-26 Glycovaxyn Ag Biosynthetic system that produces immunogenic polysaccharides in prokaryotic cells
WO2014142468A1 (en) * 2013-03-13 2014-09-18 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of providing copy image and ultrasound apparatus therefor
BR112015025288B1 (pt) 2013-04-05 2023-02-23 The Governors Of The University Of Alberta Composição de vacina para uso na vacinação de galinhas contra campylobacter
US20240083364A1 (en) 2019-10-11 2024-03-14 Nissan Motor Co., Ltd. Article storage structure for vehicle
WO2022256920A1 (en) * 2021-06-07 2022-12-15 The University Of British Columbia Acholetin biopolymers and methods for enzymatic synthesis

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8422651D0 (en) 1984-09-07 1984-10-10 Technology Licence Co Ltd Monoclonal antibodies
AU2003254665C1 (en) * 2002-08-01 2010-08-19 National Research Council Of Canada Campylobacter glycans and glycopeptides
EP2853600B1 (en) 2005-05-11 2018-09-19 ETH Zürich Recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells
KR101589554B1 (ko) 2008-01-03 2016-02-01 코넬 리서치 파운데이션 인코포레이티드 원핵생물에서의 글리코실화 단백질 발현
EP3427749A1 (en) 2008-02-20 2019-01-16 GlaxoSmithKline Biologicals SA Bioconjugates made from recombinant n-glycosylated proteins from procaryotic cells
AU2011298697B2 (en) * 2010-09-03 2016-01-28 The Governors Of The University Of Alberta Peptide containing multiple N-linked glycosylation sequons

Also Published As

Publication number Publication date
US20130295099A2 (en) 2013-11-07
EP2545081A4 (en) 2013-10-02
CA2789505A1 (en) 2011-08-18
JP5925699B2 (ja) 2016-05-25
EP2545081A1 (en) 2013-01-16
WO2011097733A1 (en) 2011-08-18
CA2789505C (en) 2017-12-05
AU2011214871A1 (en) 2012-09-06
PT2545081E (pt) 2015-05-18
US20140170150A2 (en) 2014-06-19
US20130034556A1 (en) 2013-02-07
EP2545081B1 (en) 2015-01-28
JP2013519737A (ja) 2013-05-30
US9221898B2 (en) 2015-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7598354B2 (en) Campylobacter glycans and glycopeptides
Nothaft et al. Diversity in the protein N-glycosylation pathways within the Campylobacter genus
ES2535543T3 (es) Compuestos de glicano N-enlazado
JP2022533883A (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲート、その製造方法およびその使用方法
US20140194346A1 (en) Pasteurellaceae vaccines
JP2022525773A (ja) 大腸菌ｏ抗原多糖のバイオコンジュゲートを製造する方法、その組成物およびその使用方法
Kurniyati et al. A novel glycan modifies the flagellar filament proteins of the oral bacterium T reponema denticola
JPH09500092A (ja) Ｂ群れんさ球菌の多くの菌株に対する免疫を与える細胞表面タンパク質であるタンパク質Ｒｉｂ、そのタンパク質の精製方法、薬剤キットおよび医薬組成物
AU2012292430B2 (en) Oligosaccharides and oligosaccharide-protein conjugates derived from Clostridium difficile polysaccaride PS-I, methods of synthesis and uses thereof, in particular as vaccines and diagnostic tools
JP2001517091A (ja) Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉについての抗原性組成物および検出方法
Wu et al. Proteomic identification of immunodominant membrane-related antigens in Campylobacter jejuni associated with sheep abortion
US20160326222A1 (en) Clostridium difficile vaccine
JP2022513458A (ja) Ｏ－結合型グリコシル化のための修飾キャリアタンパク質
ES2525122T3 (es) Antígeno de Enterococcus faecalis y/o Enterococcus faecium
JP6230991B2 (ja) エンテロコッカス・フェシウムクローナルコンプレックス１７に由来するラムノ多糖及びその使用
CN103667200A (zh) 一种诱导短寿抗体反应的血吸虫抗原和检测该抗体反应的血吸虫病诊断试剂盒及检测方法
AU2022203465B2 (en) Antigenic tripeptides derived from Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis S-type strains, derivatives and uses thereof
Huang et al. Proteomics integrated with Escherichia coli vector‐based vaccines and antigen microarrays reveals the immunogenicity of a surface sialidase‐like protein of Propionibacterium acnes
Roloff Padilha et al. ErpY-like protein, a promising antigen to leptospirosis control: characterization of antigenic and immunogenic potential.
CN110290804A (zh) 克雷伯氏肺炎杆菌的荚膜多糖疫苗
CA2890580A1 (en) Clostridium difficile vaccine