PT2545081E - Compostos de glicano ligados por n - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "Compostos de Glicano Ligados por N"

Dominio da Invenção A invenção diz respeito a um composto de glicano ligado por N com a Fórmula 1, que pode opcionalmente estar fundido ou ligado a um aminoácido, péptido, proteína ou lípido. A invenção também diz respeito a anticorpos e a anti-soros contra este composto, e à sua utilização para diagnosticar uma infecção provocada por um Campylobacter patogénico. A invenção diz ainda respeito à utilização do composto a título de vacina para tratar ou evitar a infecção por um Campylobacter patogénico.

Estado da Técnica A Campylobacter jejuni e a Campylobacter coli são duas das espécies mais habitualmente isoladas de Campylobacter que provocam, infecções em seres humanos. Estes organismos provocam taxas elevadas de gastroenterite em todo o mundo, excedendo o número de casos amiúde os devidos ao conjunto de Salmonella, Shigella e E. coli enterotoxigénico (Butzler JP, Clinical Microbiology and Infection 2004) . Além disto, a infecção por C. jejuni tem sido ligada ao desenvolvimento da Síndrome de Guillain-

Barré, causa mais habitual de paralisia provocada por patogénicos desde que se eliminou a poliomielite (vejam-se revisões em: Kaida K, Glycobiology, 2009; Bereswill S & Kist M, Current Opinion in Infectious Diseases, 2003) . Têm sido reconhecidas outras espécies de Campylobacter como patogénicos emergentes na gastroenterite humana (C. upsaliensis, C. hyointestinalis) , associados a doenças inflamatórias dos intestinos em crianças, à gengivite, à periodontite e a abortos em seres humanos (C. retus, C. concisus) (Zhang LS et al. , Journal of Clinicai Microbiology, 2009) bem como causando doença venérea e infertilidade em animais domésticos (em particular no gado; C. fetus venerealis), e abortos em ovelhas (C. fetus fetus) (Butzler JP, Clinical Microbiology and Infection, 2004 e as referências ai citadas).

Desde a publicação da primeira sequência do genoma de C. jejuni em 2000 (Parkhill J., et al., Nature, 2000), têm sido descritas diversas outras sequências genómicas de Campylobacter. Ao contrário da maior parte das bactérias que foram descritas até à data, todas as Campylobacter contêm genes pgl conservados que são necessários para a glicosilação proteica ligada a N (Szymanski CM & Wren BW, Nature Reviews Microbiology 2005; Nothaft Η & Szymanski CM, Nature Reviews Microbiology, 2010) .

Nas espécies eucarióticas, as proteínas glicosiladas são componentes das matrizes extracelulares e das superfícies celulares em todos os locais. As suas espécies oligossacarídicas estão implicadas numa larga gama de acontecimentos de reconhecimento entre células e entre células e matrizes, que são vitais em processos biológicos desde o reconhecimento imunológico ao desenvolvimento do cancro. A glicosilação era antigamente considerada como restrita aos eucarióticos, no entanto com os progressos nos métodos analíticos e na sequenciação genómica, tem havido um número crescente de descrições de caminhos de glicosilação proteica tanto ligada por 0 como ligada por N, em bactérias (Nothaft H & Szymanski CM, Nature Reviews Microbiology, 2010) . Desde que se descobriu o primeiro caminho geral de glicosilação proteica em bactérias (Szymanski CM et al., Molecular Microbiology 1999), a demonstração de que os glicanos de C. jejuni estão ligados pelo N 'em bloco' (Kelly J.H., et al., Journal of Bacteriology 2006, Wacker M., et al., Science 2002, Young N.M., et al., Journal of Biological Chemistry, 2002), e que o caminho pode não apenas ser transferido funcionalmente para Escherichia coli (Wacker M., et al., Science, 2002), mas também que o enzima oligossacariltransferase (PglB) é capaz de adicionar açúcares do exterior à proteína (Feldman M., et al., PNAS 2005), resultando de um grande aumento das actividades de investigação uma melhor caracterização e exploração deste sistema. A estrutura pormenorizada do heptassacárido ligado por N único de C. jejuni foi descrita (Young N.M., et al., Journal of Biological Chemistry, 2002) . Utilizando métodos tais como RMN com rotação ao ângulo mágico com alta resolução (HR-MAS) (Szymanski C.M. .et al., Journal of Biological Chemistry, 2003), foi demonstrado que este heptassacárido é conservado na sua estrutura tanto em C. jejuni como em C. coli.

Foi descrito um intermediário no caminho de glicosilação ligada pelo N em C. jejuni, nomeadamente um (oligo-) heptassacárido livre (fOS) - uma componente solúvel do espaço periplásmico de C. jejuni (Liu X., et al., Analytical Chemistry, 2006) . Este fOS tem uma estrutura idêntica à do oligossacárido ligado por N que é adicionado a proteínas (Nothaft H., et al., PNAS 2009). Sob condições de crescimento laboratoriais, a razão entre fOS e heptassacárido ligado por N a proteína é de cerca de 9:1. O fOS no C. jejuni desempenha um papel na regulação osmótica semelhante aos glicanos do periplasma de bactérias, e este caminho pode ser manipulado alterando a concentração dos osmólitos circundantes (Nothaft H., et al., PNAS 2009) . A Figura 1 mostra a glicosilação proteica ligada por Ne os oligossacáridos livres em C. jejuni. O heptassacárido ligado por undecaprenil-pirofosfato é montado no citosol por adição de açúcares activados por nucleótidos (Szymanski C.M., et al., Journal of Biological Chemistry, 2003; Szymanski C.M., et al., Trends Microbiology 2003) . O heptassacárido completo é translocado através da membrana interior e até ao periplasma pelo transportado ABC, PglK (Alaimo C., et al., EMBO Journal, 2006). O oligossacárido é transferido para o grupo amino da asparagina na sequência de consenso da proteína, D/E-Xl-N-X2-S/T, na qual XI, X2 podem ser um aminoácido qualquer excepto prolina, por PgIB (Kowarik M., et al., EMBO Journal 2006; Young N.M., et al., Journal of Biological Chemistry, 2002). Além disto, existem grandes quantidades de heptassacárido livre (fOS) em C. jejuni (Liu X., et al., Analytical Chemistry, 2006); a razão entre fOS e iV-glicano foi determinada como sendo 9:1. GlcNAc, N-acetilgalactosamina; Bacilosamina (Bac), 2,4-diacetamido-2,4,6-tridesoxiglucose; GalNAc, iV-acetilgalactosamina; Glc, Glucose (adaptado de Szymanski C.M., et al., Trends Microbiology, 2003) .

Descrição Resumida

Determinaram-se as estruturas dos iV-glicanos e dos fOS de diversas espécies de Campylobacter, todas elas possuindo glicanos ligados por N e fOS. Além disto, demonstrou-se que os iV-glicanos e os fOS dos Campylobacter podem ser divididos em dois grupos estruturais. O primeiro grupo produz uma estrutura semelhante à publicada para C. jejuni e para C. coli (Young N.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2002; Szymanski C.M. et al., Journal of Biological Chemistry, 2003) . O segundo grupo produz um glicano com uma estrutura única que é diferente da que foi determinada para C. jejuni e para C. coli e que ainda nunca havia sido descrita. As espécies Campylobacter que se estão neste grupo incluem as Campylobacter fetus venerealis (causa da doença venérea e da infertilidade no gado), Campylobacter fetus fetus (causa de abortos em ovelhas), Campylobacter concisus (associado à gengivite e à periodontite, e que foi isolado de fezes de doentes com gastroenterite), Campylobacter hyointestinalis (que tal como C. jejuni e C. coli, está associada a doença de diarreia), bem como subespécies de Campylobacter hyointestinalis.

Crê-se que também se incluam no segundo grupo, Campylobacter sputorum e subespécies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus (um patogénico emergente que se sugeriu estar envolvido na gastroenterite, Bullman S., et al., FEMS Immunology & Medical Microbiology, 2010), Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus (doença periodontal e aborto em seres humanos), Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis e Campylobacter curvus. A Figura 2 ilustra uma análise filogenética das sequências proteicas da componente chave deste caminho, a oligossacariltransferase (PglB), incluindo as espécies Campylobacter cujo genoma foi sequenciado e outros organismos relacionados, e demonstra que as Campylobacter se dividem em dois grupos. Na gama das Campylobacter as espécies que produzem a Estrutura 1 estão na caixa superior, as estirpes que produzem Fórmula IA e Fórmula 1B estão na caixa inferior (adaptado de Nothaft H & Szymanski C.M., Nature Reviews Microbiology, 2010). A Figura 3 ilustra a reactividade dos iV-glicanos com (A) um anti-soro especifico contra iV-glicanos de C. jeuni, (B) uma lectina SBA (reconhecendo os resíduos terminais GalNAc da estrutura 1) (C) reactividade de lectina WGA (reconhecendo resíduos terminais GlcNAc das Fórmulas IA e 1B com reactividade cruzada com as estruturas GalNAc) e (D) as análises de fOS baseadas em espectrometria de massa mostraram que os glicanos derivados do caminho pgl diferem, entre espécies Campylobacter.

De acordo com um aspecto, a invenção diz respeito a um novo glicano ligado por N (referido como um iV-glicano) com a Fórmula 1: A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc, em que A seja GlcNAc ou Glc. Este composto, na sua forma nativa, é comum a diversas espécies Campylobacter. Na sua forma nativa, o composto é solúvel no periplasma bem como está ligado a proteínas na membrana interior e do periplasma, e de uma forma notável a proteínas exteriores da superfície da membrana de muitas espécies Campylobacter, incluindo patogénicos. Na invenção presente, o composto com a Fórmula 1 é proporcionado sob uma forma isolada e/ou purificada. 0 composto inclui dois hexassacáridos que diferem um do outro por um açúcar terminal, que é quer Glc, quer GlcNAc. 0 primeiro dos compostos referidos é: GlcNAc-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GaINAc-QuiNAc4NAc (neste documento Fórmula IA) . 0 segundo dos compostos referidos é: Glc-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc (neste documento Fórmula 1B).

Na Fórmula 1 acima, QuiNAc4NAc representa uma designação alternativa do sacárido Bac, que constitui uma abreviatura de bacilosamina.

Num aspecto a invenção diz respeito a um composto isolado ou purificado incluindo os compostos com a Fórmula 1 relacionados ou ligados a um único aminoácido, a um oligopéptido, a um péptido, a uma proteína, ou a um lípido. Num aspecto, o oligopéptido ou péptido inclui entre 2 e 40 aminoácidos, ou entre 2 e 30 aminoácidos, ou entre 2 e 20 aminoácidos, ou entre 2 e 10 aminoácidos. A invenção diz ainda respeito a um método de produzir um anticorpo ou um anti-soro que inclua os passos de proporcionar o composto com a Fórmula 1, inocular um animal ou seres humanos com o composto referido para estimular uma reacção imunológica ao composto referido, obter soro do animal referido e opcionalmente purificar o soro referido para obter o anticorpo ou o anti-soro. O anticorpo ou o anti-soro resultantes ligam-se a espécies Campylobacter nas quais o glicano descrito neste documento seja nativo, incluindo Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis e subespécies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum e subespécies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis,

Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis e Campylobacter curvus.

Podem utilizar-se o anticorpo ou o anti-soro com objectivos de diagnóstico, para detectar a presença dos organismos referidos num animal ou num ser humano.

Podem utilizar-se os compostos da invenção presente numa formulação de vacina, com ou sem um adjuvante, contra Campylobacter fetus venerealis, que é uma causa principal das falhas na reprodução do gado e em relação ao qual a vacina actual tem uma utilidade limitada, ou contra outras espécies Campylobacter relativamente às quais o glicano com a Fórmula 1 seja nativo, incluindo as espécies listadas acima. Os compostos da invenção presente têm utilizações possíveis na engenharia proteica em glicoproteínas, com aplicações terapêuticas e de diagnóstico. A invenção diz respeito portanto a uma vacina que inclua o composto com a Fórmula 1, opcionalmente ligado a um único aminoácido, a um oligopéptido, a um péptido, a uma proteína, ou a um lípido. No aminoácido único pode incluir-se a asparagina. A invenção diz respeito ainda à utilização da vacina referida para tratar ou para evitar uma infecção provocada por um organismo Campylobacter, em que o composto com a Fórmula 1 inclua um glicano nativo do referido organismo, e a um método de tratamento que inclua a referida utilização, de um ser humano ou de um animal.

De acordo com um outro aspecto, a invenção diz respeito a um método de melhorar a produtividade e a saúde de um rebanho de animais por administração da vacina tal como se referiu ao referido rebanho.

As vacinas, anticorpos e anti-soros que se descrevem neste documento também podem ser utilizados para a prevenção, o tratamento e o diagnóstico em seres humanos.

Descrição dos desenhos A Figura 1 mostra a gicosilação de proteínas ligada por N e oligossacáridos livres em C. jejuni. A Figura 2 é uma tabela resumindo as estruturas de fOS e de iV-glicano em diversas espécies Campy1obacter.

As Figuras 3A-3D representam análises de N-glicanos e de fOS em espécies Campylobacter seleccionadas. A Figura 4A é o espectro de RMN de ΤΗ de fOS purificado de C. fetus. A Figura 4B representa a sobreposição dos espectros de RMN 2D HSQC para C. fetus fetus e para C. fetus venerealis A Figura 5 representa estruturas de fOS e de N-glcanos de C. jejuni, C. coli e C. upsaliensis (Estrutura 1) e a Fórmula IA e a Fórmula 1B das outras espécies Campylobacter descritas neste documento. A Figura 6 mostra os perfis de eluição da Fórmula IA e da Fórmula 1B, nas condições descritas neste documento, e a confirmação das Fórmula IA e Fórmula 1B purificadas. A Figura 7 ilustra a conjugação de compostos com Fórmula IA e com Fórmula 1B purificados com a BSA. A Figura 8 ilustra imunotransferências com anti-soro criado contra cada um dos glicoconjugados de BSA.

As Figuras 9A-F mostram espectros MS de glicopéptidos incluindo compostos com a Fórmula 1 a titulo de espécie glicano. A Figura 10 mostra células de Campylobacter que foram marcadas com anti-soro especifico para Fórmula IA e para Fórmula 1B. A Figura 11 ilustra imunotransferências com anti-soros criados contra Fórmula IA, Fórmula 1B e estrutura 1.

Descrição Pormenorizada A invenção presente diz respeito ao composto glicano A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc, em que A é GlcNAc ou Glc. O composto acima inclui os dois compostos glicanos GlcNAc-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc (neste documento Fórmula IA) e Glc-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAc-QuiNAc4NAc (neste documento Fórmula 1B).

Nas Fórmulas acima, QuiNAc4NAc representa uma designação alternativa para o sacárido Bac, que constitui uma abreviatura de bacilosamina (também conhecida como diNAcBac). 0 composto com a Fórmula 1 está opcionalmente associado ou ligado a um único aminoácido, a um oligopéptido, a um péptido, a uma proteína, ou a um lípido. 0 lípido referido pode ser isolado e purificado a partir de uma fonte bacteriana, arqueai ou eucariótica, ou pode ser quimicamente sintetizado. A ligação referida entre o composto glicano e o lípido pode ser mediada por um agente de ligação fosfato, pirofosfato ou por uma ligação glicosídica. Foram descritos exemplos de lípidos (com cadeias de diversos comprimentos, vários graus de saturação e configurações) ligados a iV-glicanos (Faridmoayer. et al., Journal of Biological Chemistry, 2009; Chen Μ.M., et al., Biochemistry, 2007). Os compostos iV-glicano ligados a lípido produzidos no hospedeiro em que são nativos ou por um sistema de expressão heterólogo incluem com postos N-glicano ligados por fosfato a undecaprenilo tal como se ilustra com o N-glicano de C. jejuni (Reid C.W., et al., Analytical Chemistry, 2008, Reid C.W., et al., Analytical Chemistry, 2009) e a proposta para o iV-glicano de C. lari (Schwarz F., et al., Glycobiology 2011)) e os conjugados N-glicano-LipidA (ilustrados para o iV-glicano de C. jejuni (van Sorge N.M., et al., Cellular Microbiology, 2009)).

Determinou-se que o composto acima é substancialmente conservado através de múltiplas espécies Campy1obacter.

As Figuras 3A-3D representam iV-glicanos e fOS em espécies Campylobacter seleccionadas. (A) Transferência Western utilizando anti-soro que reconhece o heptassacárido ligado por N do C. jejuni em reacção cruzada com outras espécies Campylobacter (caixas em aberto) que também reagiam com (B) aglutinina de soja que reconhecia resíduos terminais GalNAc, mas que denota pouca reactividade com (C) aglutinina de gérmen de trigo (WGA) que reconhece resíduos terminais GlcNAc presentes na Fórmula IA e na Fórmula 1B. Realçaram-se as espécies que não reagiam com o anti-soro específico para C. jejuni, mas reagiam com o WGA. (D) Exemplos de espectrometria de massa de fracções enriquecidas em fOS ou numa forma ligada por Asn e proveniente de (1) C. jejuni (2), C. fetus venerealis, (3) C. concisus, (4) C. fetus, e (5) C. hyointestinalis; resumem-se na Tabela 1 os resultados para todas as espécies analisadas por espectrometria de massa.

Tabela 1. As massas de fOS e das estruturas de N-glicano foram determinadas por espectrometria de massa em estirpes Campylobacter seleccionadas. Os números indicam a ou as massas de Fórmula IA e de Fórmula 1B quer como oligossacáridos livres (fOS), quer ligados por Asn. Obtiveram-se as massas no modo de ião positivo a partir de lisados de células inteiras da estirpe indicada.

Determinaram-se as estruturas da Fórmula IA e da Fórmula 1B por RMN, tal como se mostra na Fig. 4, na Tabela 3 e na Fig. 5. N/D significa não determinado.

Exemplo 1 Purificação dos compostos com as Fórmulas IA e 1B

Cultivaram-se Campylobacter jejuni 11168, C. concisus, C. hyointestinalis, C. fetus fetus e C. fetus venerealis em condições microaeróbicas. Obtiveram-se células inteiras após uma centrifugação, e digeriram-se com um grande excesso de proteinase K a pH 8 (ajustado por adição de amónia) a 37°C durante 48 horas. Separaram-se os produtos da digestão ou os oligossacáridos livres numa coluna Sephadex G-15 (1,5x60 cm) e secou-se cada uma das fracções eluídas antes do pico do sal, analisando-se por RMN de 1H. Separaram-se as fracções contendo os produtos pretendidos por cromatografia de permuta aniónica numa coluna Hitrap Q (5 mL de dimensão, Amersham) eluindo-se os glicanos com um gradiente linear de NaCl - (0-1 Μ, 1 h) que deu origem ao isolamento de uma mistura de ambos os compostos glicanos (Fórmula IA e Fórmula 1B) . Retiraram-se os sais numa Sephadex G15 antes da análise por RMN.

Exemplo 2: Análise por espectroscopia de RMN

Levaram-se a cabo as experiências de RMN dos glicanos obtidos no exemplo 1 num espectrómetro Varian INOVA de 500 MHz (3Η) com uma sonda com um gradiente de 3 mm a 25°C utilizando acetona como referência interna (2,225 ppm para 3Η e 31,45 ppm para 13C) utilizando as sequências de pulsos padrão DQCOSY, TOCSY (tempo de mistura 120 ms), ROESY (tempo de mistura 500 ms) , HSQC e HMBC (atraso da transferência a longa distância de 100 ms). Manteve-se o período de AQ a 0,8-1 segundo para as correlações H-H e 0,25 segundos para o HSQC, adquiriram-se 256 incrementos para tl. Mostram-se os Resultados nas Fig. 4, Fig. 5 (espectros de RMN e estruturas) e na Tabela 2, os desvios químicos correspondentes. A Figura 4A é o espectro de 3H de fOS purificado de C. fetus fetus. A Figura 4B sobrepõe os espectros 2D de HSQC para C. fetus fetus e para C. fetus venerealis, indicando que as estruturas de fOS para ambas as espécies são idênticas. O espectro de RMN também pode ser sobreposto ao obtido para C. concisus (que não se mostra). Os desvios químicos correspondentes δ (ppm) para os oligossacáridos livres purificados de C. fetus fetus (ilustrados na Figura 4 A) estão resumidos na Tabela 2 . Os desvios químicos de carbono e de protão foram referidos a um padrão interno de acetona (δΗ 2,225 ppm, 5C 31,07 ppm).

Os glicanos de campylobacter que estão quer adicionados a uma proteína que aparecem sob uma forma livre (fOS) podem ser divididos em dois grupos estruturais. 0 primeiro grupo de espécies Campylobacter produz um glicano com uma estrutura única que havia sido previamente determinada para C. jejuni e para C. coli bem como neste documento para C. upsaliensis. Os Campylobacter que pertencem ao segundo grupo são Campylobacter fetus venerealis (causando doença venérea e infertilidade no gado), Campylobacter fetus fetus (provocando abortos em ovelhas), Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespécies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum e subespécies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis e Campylobacter curvus. A determinação estrutural por RMN utilizando oligossacáridos livres purificados em larga escala (fOS) de C. fetus fetus, C. fetus venerealis, e de C. concisus demonstrou que este segundo grupo de Campylobacter produzia uma estrutura diferente da que originalmente fora descrita para C. jejuni e para C. coli (Figura 4 e Figura 5).

Tabela 2: Desvios químicos δ (ppm) para os oligossacáridos livres purificados (Fórmula IA e Fórmula IB) de C. fetus fetus (correspondendo ao espectro representado na Figura 4A). Os desvios químicos de carbono e de protão são apresentados em relação aos de um padrão interno de acetona (δΗ 2,225 ppm, 5C 31,07 ppm). As letras maiúsculas referem os resíduos de açúcar únicos tal como delineados nas Figuras 4A e 5.

Exemplo 3: Preparação dos compostos glicano com a Fórmula 1 ligados a um único aminoácido.

Uma digestão com Pronase E de extractos de células inteiras obtidos após uma lise de células intactas, seguindo-se uma espectrometria de massa tal como descrita por Liu X., et al., AnalChem, 2005 e por Nothaft H. et al., Methods Mol. Biol., 2010 identificaram o heptassacárido de C. jejuni (estrutura 1) ligado a uma única asparagina e a Fórmula IA ligada a uma única asparagina, do C. fetus fetus (Tabela 1).

Exemplo 4: Expressão dos compostos com a Fórmula 1 O operão de glicosilação proteica codificando todos os genes necessários para a produção e transferência dos compostos Fórmula IA e Fórmula 1B pode ser clonado e expresso a partir de um ou mais plasmideos de E. coli. Em alternativa, podem trocar-se as glicosiltransferases num plasmideo descrito por Wacker, et al., Science 2002 que contém o operão de glicosilação proteica de C. jejuni (pgl), por glicosiltransferases produzindo Fórmula IA e Fórmula IB. A expressão dos compostos Fórmula IA e Fórmula 1B pode ser conseguida num sistema heterólogo na presença de um péptido aceitador marcado por afinidade para a glicosilação proteica ligada por N (já demonstrada para o iV-glicano de C. jejuni e para o iV-glicano de C. lari, Wacker, et al., Science 2002, Schwarz, et al., Glycobiology 2011) ou como uma fusão de uma tal proteína com uma proteína de fago (Duerr, et al. , Glycobiology, 2010) . Pode purificar-se a proteína/péptido/fago contendo o glicano por purificação de marcação da afinidade, caso seja necessário em combinação com cromatografia de afinidade com lectina ou um agente reconhecendo ou glicano, para separar os péptidos glicosilados dos não glicosilados.

Exemplo 5: Purificação de Fórmula IA e de Fórmula 1B

Separaram-se os fOS Fórmula IA e Fórmula 1B purificados por cromatografia de permuta aniónica de alta eficiência, com uma detecção amperométrica pulsada (HPAEC/PAD) . A Figura 6 mostra o perfil de eluição de uma Coluna Analítica CarboPac® PA200 (3 x 250 mm CarboPac PA100 equipada com uma Coluna de Protecção: 3 x 50 mm), nas seguintes condições: caudal: 0,5 mL/minuto; sistema eluente, acetato de sódio 50 mM em hidróxido de sódio 100 mM; modo de detecção, amperometria pulsada, forma de onda quádrupla, eléctrodo em Au; ajustou-se a temperatura da coluna ambiente a ~30°C (fig. 6A). Analisaram-se por HPAEC/PAD 0,5 nmoles de quer uma mistura de Fórmula IA com Fórmula IB (Fig. B), quer Fórmula 1B e Fórmula IA depois de separados (Fig. 6C), utilizando uma coluna semi-preparativa PA 100 (9 x 250 mm) e um colector de fracções (DIONEX UltiMate 3000), nas mesmas condições que se delinearam acima. Neutralizaram-se as fracções contendo quer Fórmula Ia, quer Fórmula 1B, com quantidades equimolares de HC1 0,2 M, e armazenaram-se a -20°C. Os espectros obtidos por espectrometria de massa com ionização por electroaspersão (ESI-MS) de Fórmula IA purificado (Fig. 6D) e de Fórmula 1B (Fig. 6E) , após uma purificação, correspondem às massas observadas para Fórmula IA e para Fórmula 1B que se delineiam na Tabela 1.

Exemplo 6: Conjugação de Fórmula IA e de Fórmula IB com BSA

Conjugaram-se compostos Fórmula IA e 1B purificados e neutralizados preparados no Exemplo 5 com BSA por aminação redutora (veja-se Gildersleeve JC., Bioconjug. Chem. 2008). Incubou-se uma mistura de albumina de soro de bovino (BSA; 2 pL de uma solução a 150 mg/mL; fracção V) , borato de sódio (5,5 pL de uma solução 400 mM, pH 8,5), sulfato de sódio (3,7 pL de uma solução 3 M, 50°C), oligossacárido (Fórmula IA ou Formula 1B) (7,0 pL de uma solução 20 mM para 15 eq.), H20 (1,4 pL) e cianoborohidreto de sódio (2,2 pL de uma solução 3 M), num tubo para PCR de 200 pL, num aparelho de ciclização térmica para PCR a 56°C durante 96 h, com uma tampa também aquecida. Diluiu-se a mistura reaccional com H20 a um volume final de 100 pL, transferiu-se para um tubo de diálise de 500 pL (MWCO 10.000) e dialisou-se por três vezes contra H20 (2,5 L) . A Figura 7 mostra a conjugação de Fórmula IA e de Fórmula 1B com BSA: Separaram-se os glicoconjugados por PAGE a 12,5 % (A) e monitorizaram-se por transferência

Western utilizando lectina WGA comercialmente disponível conjugada com fosfatase alcalina (B) . Faixa 1, 400 ng de fracção C de BSA; faixa 2, 400 ng de Fórmula 1B acoplado a fracção V de BSA; faixa 3, 400 ng de Fórmula 1B acoplado a fracção V de BSA. Indicam-se do lado esquerdo os marcadores de massas moleculares (MM em KDa).

Exemplo 7: Imunização de coelhos com conjugados

de Fórmula IA ou de Fórmula 1B com BSA

Imunizaram-se coelhos New Zealand White com 2 mg de cada um dos compostos glico-conjugados preparados no Exemplo 6, utilizando um protocolo de imunização de 6 semanas (protocolo N- 7171 aprovado pelo Animal Care Committee) . Depois de uma injecção subcutânea inicial (em 3 locais, injectaram-se 0,5 mL em cada local) de 2,0 mg de antigénio, utilizando adjuvante completo de Freund (a uma razão de 1:1 com o antigénio), uma dose de reforço de 2,0 mg de cada um dos conjugados Fórmula 1A-BSA e Fórmula 1B-BSA misturados com o adjuvante incompleto de Freund (a uma razão de 1:1 com o antigénio) por via subcutânea (em 3 locais, injectaram-se 0,5 mL em cada local) passadas 4 semanas. Ao fim de 6 semanas preparou-se soro de uma amostra de 5 mL de sangue de cada animal arrefecendo a amostra de sangue durante 60 minutos sobre gelo e centrifugou-se durante 20 minutos a 10.000 x g. Analisaram-se os soros individuais para determinar a produção de anticorpos específicos da Fórmula IA e da Fórmula 1B por

Transferência Western com lisados de células inteiras de Campylobacter (Figura 8) . A Figura 8 mostra uma imunotransferência com anti-soro que havia sido criado contra os glicoconjugados com BSA: aplicaram-se 120 pg de lisados de células inteiras quer de C. jejuni 11168 de tipo selvagem (faixa 1), de C. jejuni 11168, estirpe mutante pglB (faixa 2) ou ainda de C. fetus (faixa 3) a uma SDS-PAGE a 12,5 %. Depois de uma transferência para uma membrana em PVDF, sondaram-se as proteínas imobilizadas (A) com uma diluição a 1:2.000 de uma amostra de soro obtido de um coelho que havia sido imunizado com o composto de BSA-Fórmula IB (SZR-1) e (B) com o soro obtido de um coelho que havia sido imunizado com o composto de BSA-Fórmula IA (SZR-3). Indicam-se do lado esquerdo os marcadores de massas moleculares(MM em KDa).

Exemplo 8: Os compostos Fórmula IA e 1B estão ligados por N.

Cultivaram-se células em caldo MH sob condições microaeróbicas, colheram-se por centrifugação e lavaram-se por duas vezes com Tris-HCl 50 mM, pH 7,2. Liofilizaram-se as pastilhas e colocaram-se em tubos de Lobind de 1,5 mL (Eppendorf). Voltaram a suspender-se as pastilhas (10 mg) em 1 mL de Tris-HCl (pH 7,5) gelado, na presença de 150 unidades de Benozanase, agitaram-se em vórtex para voltar a suspender e mantiveram-se sobre gelo. Depois de se sonicarem (6 vezes 30 segundos, 1 minuto sobre gelo entre elas) removeram-se os destroços celulares por centrifugação a 20.000 x g durante 30 minutos a 4°C. Recolheram-se os sobrenadantes em tubos de LoBind (Eppendorf) e liofilizaram-se. Aplicaram-se o processamento das amostras, o enriquecimento em glicopéptidos e a espectrometria de massa tal como descrito (Scott N.E., et al., Molecular and Cellular Proteomics, 2010). Indentificaram-se Fórmula IA e Fórmula 1B ligados por N a asparaginas localizados nos polipéptidos derivados de Usados celulares digeridos proteoliticamente para C. fetus fetus, para C. fetus venerealis e para C. concisus (Tabela 3).

Isolaram-se e identificaram-se os glicopéptidos de Campylobacter fetus fetus, Campylobacter fetus venerealis, e Campylobacter concisus estando os resultados listados na Tabela 3. As suas porções glicano de todos eles incluíam o composto com Fórmula IA ou 1B.

Tabela 3: Glicopéptidos contendo compostos Fórmula IA e

Fórmula 1B

Listagem das proteínas identificadas como estando ligadas por N a Fórmula IA e a Fórmula 1B. As áreas de pico único para Fórmula IA e para Fórmula 1B foram determinadas por espectrometria de massa de monitorização de múltiplas reacções (MRM).

As Figuras 9A-F representam espectros de MS mostrando que tanto os compostos Fórmula IA como Fórmula 1B estão ligados por N (ao mesmo péptido), como se segue: 9A) Espectro de MS (varrimento de ião precursor) de péptidos enriquecidos com HILIC-LC digeridos com tripsina; (B) Quantificação das áreas relativas de picos dos iões correspondentes; (C) MS/MS da porção hidrato de carbono, (D) MS/MS da porção peptídica do ião com m/z 968,44545; 9E) MS/MS da porção hidrato de carbono, e 9F) MS/MS da porção peptídica do ião com m/z 982,12069.

Exemplo 9: Fórmula IA e 1B são apresentados à superfície das células de Campylobacter.

Cultivaram-se células de C. fetus fetus, C. fetus venerealis, C. concisus, C. hyointestinalis, e de C. jejuni em placas MH durante 18-24 horas em condições microaeróbicas. Colheram-se as células da placa usando 2 mL de caldo MH, arrefeceu-se sobre gelo durante 10 minutos, centrifugou-se durante 5 minutos a 6.000 x g. Mantiveram-se as células sobre gelo durante os restantes passos de marcação e lavagem, recorrendo a soluções previamente arrefecidas (4°C). Lavaram-se as células por duas vezes com 2 mL de tampão de lavagem (fosfato de potássio 50 mM, 100 mM em NaCl) . Para se evitar a ligação não especifica bloquearam-se as células com Leite Magro a 1 % em tampão de lavagem durante 30 minutos. Aplicou-se o anticorpo primário (a uma diluição de 1:1.000 em tampão de lavagem contendo 0,5 % de Magro) durante 30 minutos. Lavaram-se as células por 3 vezes com 2 mL de tampão de lavagem. Aplicou-se o anticorpo secundário marcado por fluorescência (IgG Alexa-Flour546 anti coelho, diluído a 1:100 em tampão de lavagem contendo 0,5 % de Leite Magro) durante 30 minutos e lavaram-se as células por 4 vezes com tampão de lavagem. Monitorizou-se a marcação da superfície das células utilizando um Microscópio Leica DMRXA Upright equipado com uma câmara digital Optronics MacroFire (LM-MFCCD). Tiraram- se as várias fotografias sob as mesmas condições de programa. Recorreu-se a C. jejuni que produz Estrutura 1 como controlo negativo. A Figura 10 mostra imagens de microscopia fluorescente de células inteiras de C. fetus fetus, C. fetus venerealis, C. concisus, C. hyointestinalis, e C. jejuni (controlo negativo) sondados com 10A, SZR-1 (anti-Fórmula IB) ou com 10B, SZR-3 (anti-Fórmula IA) a titulo de anti-soro primário e com um anticorpo secundário marcado por fluorescência. A Figura 11 mostra imunotransferências com anti-soro criado contra Fórmula IA ou contra Fórmula 1B ou com um anti-soro que alveja o N-glicano de C. jejuni (estrutura 1, hR6 foi descrito por Schwarz, et ai., Nature Chemical Biology, 2010) . Aplicaram-se 90 pg de C. fetus fetus (faixa 1) , C. fetus venerealis (faixa 2) , C. concisus (faixa 3) , C. hyointestinalis (faixa 4) e C. jejuni 11168 (faixa 5) sobre uma SDS-PAGE a 12,5 %. Depois de uma transferência para uma membrana de PVDF sondaram-se as proteínas imobilizadas com (A) uma diluição a 1:500 de uma amostra de soro obtida de um coelho que havia sido imunizado com o composto BSA-Fórmula IB (SZR-1), e com (B) uma diluição a 1:500 de um soro de um coelho imunizado com um composto BSA-Fórmula IA (SZR-3) ou ainda (C) com uma diluição a 1:5.000 de um anti-soro específico para o iV-glicano de C. jejuni (hR6). Indicam-se do lado esquerdo os marcadores de massas moleculares (MM em KDa).

Podem ligar-se os compostos glicano (Fórmula IA e Fórmula 1B) a diversos transportadores de glicanos (péptidos, lípidos). Podem utilizar-se os compostos resultantes para estimular uma resposta imunológica contra a estrutura respectiva, que será protectora contra espécies bacterianas que apresentem respectivamente Fórmula IA e Fórmula 1B.

Podem utilizar-se os anti-soros e anticorpos gerados (quando por exemplo imobilizados sobre uma superfície) como diagnósticos para a detecção de, por exemplo, C. fetus venerealis ou de C. fetus fetus em animais domésticos infectados (em particular com o C. fetus venerealis em gado) ou para detectar estirpes patogénicas de Campylobacter em seres humanos (por exemplo C. concisus, C. hyointestinalis, C. ureolyticus). Os referidos anti-soros e anticorpos podem ser utilizados para detectar compostos em qualquer fluido ou secreção do corpo. Por exemplo, é possível testar sémen de touro com anticorpos que reconheciam o glicano com a Fórmula 1 para se detectar uma infecção por Campylobacter fetus venerealis que possa estar presente no animal.

Os compostos da invenção presente podem ser utilizados para imunizar animais, em especial animais domésticos, contra C. fetus venerealis, C. fetus fetus, e outras espécies Campylobacter quando o glicano descrito neste documento for nativo desse organismo. A imunização pode assumir a forma de se tratar ou de se evitar uma doença em animais individuais ou num rebanho, como base para uma melhor produtividade e saúde do rebanho.

Tanto quanto às espécies Campylobacter nas quais o glicano com a Fórmula 1 seja nativo, podem utilizar-se os compostos descritos neste documento de um modo semelhante aos acima, para se prepararem vacinas para tratar ou para evitar infecções devidas a estes organismos, em seres humanos. De igual modo, pode obter-se para seres humanos uma função de diagnóstico semelhante utilizando os anticorpos ou os anti-soros criados contra esses compostos. De uma forma semelhante, podem alvejar-se os compostos recorrendo a outras terapêuticas tais como bacteriófagos ou as suas proteínas de ligação a receptores.

Lisboa, 20 de Abril de 2015.

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto isolado ou purificado que inclua A-GlcNAc[GlcNAc]-GalNAc-GalNAcQuiNAc4NAc, em que A seja GlcNAc ou Glc.
2. 2. 0 composto da reivindicação 1, associado ou ligado a um único aminoácido, a um oligopéptido, a um péptido, a uma proteína, ou a um lípido.
3. 3. 0 composto da reivindicação 2, em que o referido único aminoácido seja asparagina.
4. 4. Uma vacina que inclua o composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. 5. A vacina da reivindicação 4, incluindo também um adjuvante.
6. 6. A vacina das reivindicações 4 ou 5, para utilização no tratamento ou na prevenção de uma infecção provocada por um organismo Campylobacter, em que o composto da reivindicação 1 ou da reivindicação 2 inclua um glicano nativo dentro do organismo referido.
7. 7. A vacina da reivindicação 6, em que o organismo referido seja Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespécies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum, subespécies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis e Campylobacter curvus.
8. 8. A vacina da reivindicação 4 ou da 5, para utilização no tratamento ou na prevenção de uma infecção provocada por um organismo Campylobacter, em que o composto da reivindicação 1 seja nativo em relação ao referido organismo.
9. 9. A vacina da reivindicação 8, em que o organismo referido seja Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespécies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum, subespécies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis e Campylobacter curvus.
10. 10. A vacina das reivindicações 4 ou 5, para utilização na melhoria da produtividade e da saúde de urn rebanho animal ou da saúde de um ser humano.
11. 11. Um anticorpo ou um anti-soro eficaz contra um organismo Campylobacter, em que o composto da reivindicação 1 seja nativo em relação ao organismo referido, incluindo o referido anticorpo ou anti-soro um anticorpo ou anti-soro especifico em relação ao composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
12. 12. 0 anticorpo ou anti-soro da reivindicação 11, em que o organismo referido seja Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, subespécies de Campylobacter hyointestinalis, Campylobacter sputorum, subespécies de Campylobacter sputorum, Campylobacter lanienae, Campylobacter ureolyticus, Campylobacter hominis, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Campylobacter showae, Campylobacter mucosalis e Campylobacter curvus.
13. 13. Um método de diagnosticar a presença de uma infecção num animal ou num ser humano, provocada por um organismo Campylobacter, em que o composto da reivindicação 1 seja nativo em relação ao organismo referido, através de se proporcionar o contacto entre uma amostra proveniente do animal ou do ser humano e o anticorpo ou anti-soro da reivindicação 11 ou da 12.
14. 14. 0 método da reivindicação 13, em que o organismo seja Campylobacter fetus venerealis, Campylobacter fetus fetus, Campylobacter concisus, Campylobacter hyointestinalis, ou Campylobacter ureolyticus. Lisboa, 20 de Abril de 2015.