BR112015025288B1 - Composição de vacina para uso na vacinação de galinhas contra campylobacter - Google Patents
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Abstract
VACINA DE CAMPYLOBACTER. A presente invenção refere-se a uma composição de vacina que compreende: bactérias manipuladas para expressar pelo menos um glicano N de Campylobacter, tal como C. jejuni, por exemplo, ou um glicano N derivado do mesmo em sua superfície celular; e um ou mais de um diluente, excipiente, adjuvante ou transportador fisiologicamente aceitável. As bactérias são Escherichia coli, Salmonella ou quaisquer bactérias apropriadas que oferecem a expressão suficiente e a resposta imunogênica melhorada. A composição de vacina pode ser formulada para a administração aos animais, tais como aves domésticas, inclusive, galinhas.
Description
[001] A presente invenção se refere às vacinas de Campylobacter. Mais particularmente, a presente invenção se refere às vacinas de Campylobacter que compreendem as células de Escherichia coli que expressam o glicano de heptassacarídeo de Campylobacter jejuni derivado do caminho de N-glicosilação.
[002] A bactéria Gram-negativa de Campylobacter é a causa bacteriana mais comum de gastroenterite humana na América do Norte e em muitos países industrializados. Campylobacter é também um patógeno significativo transmitido por alimentos da pecuária, inclusive, aves domésticas, que são consideradas a serem uma fonte principal de campilobacteriose humana. Assim, o controle na própria fazenda de Campylobacter nas aves domésticas reduziria o risco da exposição humana a este patógeno e teria um impacto significativo na segurança de alimento e na saúde pública.
[003] Campylobacter é endêmico a muitos países em desenvolvimento, principalmente devido às pobres condições sanitárias e ao contato próximo humano com animais que são os reservatórios do patógeno. Um relatório de Katarzyna et al. Expert Rev. Vaccines 8: 625-645, 2009), sugere que nos Estados Unidos, as infecções de Campylobacter são a causa de 1,5 milhões (dados da Organização Mundial da Saúde) até 2,4 milhões (dados do Centros de Controle e Prevenção de Doenças) casos de doença todos os anos. Além disso, de acordo com a Organização Mundial da Saúde, aproximadamente 1% da população da Europa Ocidental é infectada anualmente por Campylobacter spp. As infecções humanas são causadas principalmente por duas espécies: C. coli e C. jejuni, que são responsáveis por mais de 95% dos casos de campilobacteriose. As manifestações clínicas de infecções de Campylobacter podem variar de casos assintomáticos até gastroenterite grave, acompanhado de diarreia mucosa, sangrenta, ou aquosa às vezes de longa duração.
[004] A publicação de Jun Lin "Novel Approaches for Campylobacter Control in Poultry" (FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE, Volume 6, Number 7, pp. 755-765, 2009), incorporada neste documento de referência, discute várias estratégias para reduzir infecções de Campylobacter nas aves domésticas. Lin sugere três estratégias gerais para controlar Campylobacter nas aves domésticas no nível de fazenda: (1) reduzir a exposição ambiental (medidas de biossegurança), (2) um aumento na resistência do anfitrião das aves domésticas para reduzir a presença de Campylobacter no intestino (por exemplo, exclusão competitiva, vacinação, e seleção de genética de anfitrião), e (3) o uso de antimicrobianas alternativas para reduzir e até eliminar Campylobacter das galinhas colonizadas (por exemplo, terapia de bacteriófago e tratamento de bacteriocina). Lin ainda declara que afora as medidas de biossegurança, as outras aproximações de intervenção não estão comercialmente disponíveis e estão ainda em desenvolvimento.
[005] A eliminação destes patógenos dos animais domésticos pode servir como um meio de reduzir a incidência da infecção nos seres humanos e impedir a propagação em animais de fazendas. A vacinação em fazendas pode também reduzir o risco da contaminação humana de comer ou de manipular os produtos animais bem como a contaminação por derramamento fecal das bactérias do estrume dos animais domésticos. O tratamento de campilobacteriose com antibióticos está tornando-se também cada vez mais desafiador como a resistência de antibiótica de Campylobacter aos antibióticos previamente eficazes está tornando-se mais comum.
[006] Glicosilação uma vez tinha sido considerada a ser especificamente um fenômeno eucariótico, mas depois foi mostrado para ser difundido nos domínios Archaea e bacterianos. Os acoplamentos bacterianos de O- e N- são formados com uma escala mais larga dos açúcares do que aqueles observados em glicoproteínas eucarióticas. Um caminho geral de glicosilação para proteínas nas bactérias foi demonstrado primeiramente em C. jejuni. (Szymanski et al. Molecular Microbiology 32: 1022-1030, 1999). A maquinaria de glicosilação de C. jejuni foi caracterizada e até mesmo foi transferida com sucesso a E. coli (Wackeret al. Science, 298: 1790-1793, 2002) e a N-glicosilação ativa das proteínas foi demonstrada (Younget al. J Biol Chem, 277: 42530-42539, 2002; Wacker et al. Science, 298: 1790-1793, 2002). O locus do gene de C. jejuni, denominado de pgl (para a glicosilação de proteína), está envolvido na glicosilação de múltiplas proteínas. Seu silenciamento mutacional resulta na perda de imunogenicidade em proteínas múltiplas, entre muitos fenótipos biológicos.
[007] A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2006/0165728 A1, agora Patente U.S. n° 7.598.354, incorporado neste documento de referência, identifica um heptassacarídeo específico e altamente imunogênico que está presente em uma pluralidade de glicoproteínas periplásmicas e expostas à superfície de C. jejuni. Este heptassacarídeo é comum pelo menos a diversas espécies de Campylobacter e cepas numerosas que são importantes como patógenos humanos e veterinários (Nothaft et al. Mol. Cell. Proteomics 11: 1203-1219, 2012). O heptassacarídeo tem a seguinte fórmula (I): GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4- GalNAc-a1,3-diNAcBac, em que diNAcBac (também denominado de di-N-acetilbacilosamina) é 2,4-diacetamido-2,4,6-trideóxi-D- glucopiranose, GalNAc é N-acetil-galactosamina e Glc é glicose. Esta fração de glicano é um componente de glicoproteínas múltiplas. Em C. jejuni o N-glicano é importante para a interação de C. jejuni com células hospedeiras. As mutações na maquinaria de glicosilação conduzem à colonização diminuída de tratos intestinais nos ratos e nas galinhas. Em C. jejuni o N-glicano é importante para a ligação e a invasão de células epiteliais humanas (Szymanski et al. Infect Immun 70: 2242-2244, 2002), a colonização dos tratos intestinais dos ratos e galinhas (Kelly et al. J Bacteriol 188: 2427-2434, 2006; Szymanski et al. Infect Immun 70: 2242-2244, 2002; Hendrixson & DiRita, Mol Microbiol 52: 471-484, 2004; Karlyshev et al. Microbiology 150: 19571964, 2004), competência natural nas cepas com sistemas de secreção do Tipo IV (Larsenet al. J Bacteriol 186: 6508-6514, 2004) e para a ligação à lectina de tipo C de macrófago humano, MGL (van Sorgeet al, Cell Microbiol11: 1768-1781, 2009). Além disso, os N- glicanos da superfície de Campylobacter se mostraram a ter papéis protetores contra proteases de intestino da galinha tendo por resultado a aptidão bacteriana aumentada (Alemka et al. Infect Immun 81: 167482, 2013).
[008] A Publicação do Pedido de Patente U.S. 2012/0100177 descreve uma cepa de Salmonella enterica que compreende pelo menos um operon de pgl de C. jejuni ou um derivado funcional disso e apresentando pelo menos um N-glicano de C. jejuni, ou derivado de glicano disso, em sua superfície celular. Esta S. enterica recombinante é admitida a hipótese de ser útil em uma vacina contra às infecções de Campylobacter, particularmente nos animais domésticos, tais como aves domésticas. Entretanto, infelizmente, as publicações subsequentes mostrarem que enquanto que a S. enterica recombinante expressa o N-glicano de Campylobacter em sua superfície, não podia colonizar galinhas sem causar a doença, não havia nenhuma resposta imune humoral detectável nas galinhas vacinadas contra o N-glicano de Campylobacter (Thommen "Campylobacter N-glycan presenting Salmonella Typhimurium: a new vaccine for broiler chickens?" Zurich Open Repository and Archive, University of Zurich, Dissertation, Vetsuisse Faculty, 2011). Além disso, não havia nenhuma redução na colonização de C. jejuni nas galinhas vacinadas ao infectar com um desafio de C. jejuni.
[009] Ainda existe uma necessidade de uma vacina eficaz para impedir e/ou tratar infecções de Campylobacter nos seres humanos e nos animais, em particulares, animais domésticos, e mais particularmente, aves domésticas.
[0010] Estas informações de fundamento são fornecidas com a finalidade de tornar conhecidas as informações acreditadas pelo depositante de ser de relevância possível à presente invenção. Nenhuma admissão é pretendida necessariamente, nem deve ser interpretado, que algumas das informações precedentes constituem o estado da técnica contra a presente invenção.
[0011] Um objetivo da presente invenção é de fornecer uma vacina contra Campylobacter. De acordo com um aspecto, é fornecida uma composição de vacina que compreende as bactérias manipuladas para expressar pelo menos um N-glicano de Campylobacter ou um derivado de glicano disso em sua superfície celular; e um ou mais de um diluente, excipiente, adjuvante ou veículo fisiologicamente aceitável. Em determinadas modalidades, a espécie Campylobacter é C. jejuni. As bactérias podem ser Escherichia coli ou Salmonella e as bactérias manipuladas expressam o heptassacarídeo de C. jejuni em sua superfície.
[0012] Em determinadas modalidades, a composição de vacina compreende E. coli vivo, manipulado, ou células E. coli vivas, atenuadas, inativas, ou manipuladas à morte. A composição pode compreender uma suspensão das bactérias manipuladas em um tampão diluente apropriado, tal como um tampão fosfato salino, e pode ser formulado para a administração oral, administração in ovo, administração parenteral (por exemplo, por injeção ou infusão), ou pulverização, por exemplo. A composição de vacina pode também ser formulada para a adição à alimentação dos animais domésticos, aos aditivos da alimentação ou à água, e para a administração às aves domésticas, tais como galinhas.
[0013] De acordo com outro aspecto, é fornecido um método de vacinar um animal contra Campylobacter, o método compreende a administração a um animal de uma composição de vacina como descrita neste documento compreendendo as bactérias manipuladas para expressar pelo menos um N-glicano de Campylobacter, tal como C. jejuni, ou um derivado de glicano disso em sua superfície celular; e um ou mais de um diluente, excipiente, adjuvante ou veículo fisiologicamente aceitável.
[0014] Sabe-se que a expressão do N-glicano em Salmonella não induz uma resposta imune protetora. Surpreendentemente, os inventores encontraram que E. coli - que é uma bactéria muito similar à salmonela, e se esperaria obter resultados similares - de fato induz certamente uma resposta imune protetora na galinha ao expressar o N-glicano.
[0015] Para uma compreensão melhor da presente invenção, bem como outros aspectos e características adicionais disso, a referência é realizada à seguinte descrição que deve ser usada em conjunto com as figuras anexas, em que:
[0016] A figura 1 mostra lisados de células tratadas com proteinase K de E. coli a partir do mutante de polimerase de E. coli.
[0017] A figura 2 mostra a estrutura do Lipídeo-A-N-glicano e um ensaio de RMN de componente de de Lipídeo A-Campylobacter N- glicano purificado.
[0018] A figura 3 mostra um ensaio de FACS com o mutante de polimerase de E. coli.
[0019] As figuras 4 A, B, C e D descrevem a vacinação e desafiam os desafios como descritos no Exemplo 2 e
[0020] As figuras 5 A e B representam respostas de anticorpos específicos (ELISA) para IgY (IgG) N-glicano de galinha.
[0021] A menos que definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado que compreendido geralmente por alguém versado na técnica a qual esta invenção pertence.
[0022] Como usado na especificação e nas reivindicações, as formas singulares de "um", "uma" e "o", "a" incluem as referências plurais a menos que o contexto ditar claramente de outra maneira.
[0023] O termo "compreende" conforme usado neste documento será compreendido para significar que a seguinte lista é não exaustiva e pode ou não pode incluir quaisquer outros artigos apropriados adicionais, por exemplo, uma ou mais características adicionais, componente(s) e/ou ingrediente(s) como apropriado.
[0024] Os termos "glicano de C. jejuni", "heptassacarídeo de C. jejuni", "heptassacarídeo de N-glicano", "N-glicano de Campylobacter", e "heptassacarídeo," são usados intercambiavelmente neste documento para consultar a uma fração de glicano que está presente em uma pluralidade de glicoproteínas expostas à superfície e oligossacarídeos livres em cepas múltiplas e espécies de Campylobacter. Este glicano, no case de C. jejuni e como exemplificado neste documento, tem a fórmula: GalNAc-a1,4-GalNAc- α1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-diNAcBac, em que diNAcBac é 2, 4-diacetamido-2,4,6-trideóxi-D-glucopiranose. Estes termos podem consultar à glicosilação por N-glicosilação ou por meio de usar açúcares derivados de N-glicosilação ou por outros caminhos. O trabalho recente pelos inventores demonstrou que o N- glicano de C. jejuni e os oligossacarídeos livres são conservados razoavelmente ao longo da espécie termofílica de Campylobacter (Nothaft et al. Mol. Cell. Proteomics 11: 1203-1219, 2012), com algumas espécies produzindo um derivado de hexassacarídeo do heptassacarídeo, faltando a ramificação de glicose. O uso de estruturas de N-glicano alternativas e oligossacarídeos livres descritos por (Nothaft et al. Mol. Cell. Proteomics 11: 1203-1219, 2012) que estão presentes na espécie não termofílica de Campylobacter, tal como aqueles descritos na Publicação PCT WO/2011/097733, são contemplados também, e incorporados neste documento de referência.
[0025] O termo "antígeno" conforme usado neste documento consulta a um produto químico ou uma espécie biológica que induz uma resposta imune em um animal ou ser humano. No sistema presentemente descrito, o antígeno compreende o heptassacarídeo de Campylobacter jejuni ou um derivado de N-glicano disso. O termo "derivado de N-glicano" conforme usado neste documento consulta aos derivados do heptassacarídeo que induzem uma resposta imune em um animal similar a ou melhor do que aquele induzido pelo heptassacarídeo próprio. O N-glicano pode ser conjugado aos veículos tais como proteínas (como descrito no Pedido PCT n° WO 2012/027850) e lipídeos (Nothaft et al. Mol. Cell. Proteomics 11: 12031219, 2012, van Sorge et al. Cell Microbiol 11: 1768-1781, 2009), por exemplo, repetições mais curtas ou mais longas do sacarídeo do heptassacarídeo em um polissacarídeo.
[0026] O termo "vacina" conforme usado neste documento consulta a uma composição para melhorar a imunidade nos animais ou nos seres humanos a determinados micro-organismos. As vacinas presentemente descritas podem ser usadas em uma variedade ampla de animais, como, para exemplos, aves, tais como aves domésticas, bem como mamíferos. Os micro-organismos direcionados pela vacina presentemente descrita são do gênero Campylobacter.
[0027] O termo "Campylobacter" conforme usado neste documento consulta a um gênero de bactéria que compreende qualquer e toda a espécie do gênero Campylobacter. As várias espécies de Campylobacter deste gênero incluem, mas não se limitam a, C. jejuni, C. hominis, C. rectus, C. lari, C. fetus, C. coli, C. upsaliensis, C. fetus subsp. venerealis, C. fetus subsp. fetus, C. peloridis, C. lari subsp. concheus, C. sputorum, C. gracilis, C. showae, C. lanienae, C. curvus, C. helveticus, C. hyointestinalis subsp. hyointestinalis, C. hyointestinalis subsp. lawsonii, C. mucosalis, C. sputorum bv. paraureolyticus, C. sputorum bv. fecalis, C. ureolyticus, C. insulaenigrae, C. concisus, C. subantarcticus, C. avium, C. cuniculorum, e C. volucris.
[0028] A presente aplicação fornece um glicano e fragmentos imunologicamente ativos disso, que podem ser usados como vacinas contra à infecção de Campylobacter nos seres humanos e nos animais. Tais vacinas podem ser úteis para impedir ou neutralizar infecções de Campylobacter nos animais domésticos desse modo impedindo que este patógeno entre a cadeia de alimento humana. Em determinadas modalidades, o heptassacarídeo de C. jejuni e os fragmentos disso, ligados opcionalmente a um aminoácido, oligopeptídeo, lipídeo ou outro conjugado apropriado, podem ser usados como uma vacina. Por exemplo, esta vacina pode ser usada em qualquer animal que está infectado com Campylobacters para os quais o N-glicano pode ser expresso na superfície de E. coli como uma fusão do núcleo do Lipídeo A. Composição de vacina
[0029] A presente aplicação fornece uma composição de vacina que compreende E. coli recombinante que foi manipulado para expressar pelo menos um N-glicano de Campylobacter, ou um derivado do heptassacarídeo disso, em sua superfície. O E. coli recombinante está vivo, morto e/ou atenuado.
[0030] Conforme descrito acima, o heptassacarídeo de Campylobacter é comum pelo menos a diversas espécies de Campylobacter e cepas numerosas, inclusive espécies, que são importantes como patógenos humanos e veterinários. É um componente de glicoproteínas múltiplas, inclusive, por exemplo, C. jejuni n° Cj0114, Cj0200c, Cj0289c, Cj0367c, e outros. Esta fração de glicano é também fortemente imunogênica e, portanto, este glicano (e derivados relacionados disso e glicopeptídeos que compreendem o N- glicano ou derivados disso) foi identificado como um candidato bom para o uso como um antígeno em uma vacina para a imunização contra as cepas múltiplas e espécies de Campylobacter nos mamíferos, inclusive seres humanos e animais domésticos, inclusive galinhas (Patente U.S. n° 7.598.354).
[0031] E. coli é uma bactéria Gram-negativa que tenha uma membrana externa coberta no lipopolissacarídeo (LPS), que contribui à integridade estrutural das bactérias e fornece uma barreira física para proteger as membranas. O LPS é composto de três componentes principais: Lipídeo A, o núcleo e o antígeno O. O Lipídeo A afixa o LPS à membrana externa e o antígeno O é a parte mais externa do LPS. O núcleo é um oligossacarídeo ramificado que liga o Lipídeo A e componentes de antígeno O do LPS.
[0032] A cepa de E. coli útil na preparação da presente composição de vacina é de qualquer cepa que é ou pode ser suficientemente atenuada para permitir sua administração não patológica aos seres humanos e/ou aos animais em forma viva ou morta. Outras bactérias podem ser usadas como Salmonella ou outras cepas de E. coli que podem oferecer expressão suficiente e resposta imunogênica melhorada.
[0033] O termo "operon de pgl" conforme usado neste documento consulta a qualquer agrupamento de glicosilação fisiologicamente ativo dos genes de Campylobacter capazes da glicosilação de estruturas homólogas ou heterólogas produzidas pela cepa de E. coli empregada na composição de vacina. O operon de pgl em C. jejuni codifica todas as enzimas necessárias para a síntese do heptassacarídeo de N- glicano de C. jejuni, seu transporte através da membrana interna e transferência às proteínas. O código de PglD, E, F para as enzimas envolvidas na biossíntese de di-N-acetilbacilosamina, PgIC transfere UDP- diN-acetilbacilosamina a undecaprenilfosfato e PglA, H e J adicionam os resíduos de GalNAc. A ramificação de Glc é afixado por PglI. A transferência através da membrana interna do heptassacarídeo completado ocorre através da ação de PglK e o oligossacariltransferase de PglB transfere o N-glicano à proteína e libera também o heptassacarídeo no periplasma em sua forma livre.
[0034] Um derivado funcional de um operon de pgl é um agrupamento dos genes derivados de qualquer operon de pgl de Campylobacter que tem apagamentos, mutações e/ou substituições do(s) nucleotídeo(s) ou de genes inteiros, mas ainda capaz de produzir um oligo- ou polissacarídeo que pode ser ligado às estruturas homólogas ou heterólogas produzidas pela cepa de E. coli usada na composição de vacina. Um ou mais operons de pgl ou derivados disso podem ser integrados no cromossoma da cepa de E. coli ou ele(s) pode(m) ser introduzido(s) como parte de pelo menos um plasmídeo. A integração tipicamente cromosômica é preferida porque é mais estável comparada aos vetores de plasmídeo, a perda do qual poderia ocorrer durante a propagação. Anota-se que a cepa de E. coli pode compreender mais de um operon de pgl ou derivado disso que produz um ou mais N-glicanos ou derivado(s) disso. Em determinadas modalidades, a composição de vacina compreende uma cepa de E. coli que tem mais de um tipo de operon de pgl tendo por resultado mais de uma estrutura de glicano que está sendo expressa na superfície de E. coli recombinante. Isto pode ser vantajoso para eliciar uma resposta imune mais diversa em um ser humano ou em um animal contra espécies diferentes de Campylobacter. Em uma modalidade alternativa, a composição de vacina compreende uma cepa de E. coli que tem um único tipo de operon de pgl tendo por resultado mais de uma estrutura de glicano que está sendo expressa na superfície de E. coli recombinante. Isto pode ser vantajoso para eliciar uma resposta imune específica em um ser humano ou em um animal contra uma única espécie de Campylobacter.
[0035] Opcionalmente, o nível de expressão do glicano de C. jejuni pode ser regulado pelo uso de promotores diferentes ou outros elementos reguladores a montante do operon de pgl, inclusive, mas não ser limitado a, promotores de genes de proteína ribossomal, bem como promotores dos genes de codificação da resistência ao antibiótico como bla ou promotores similares e preferivelmente fortes. Este tipo de regulamento está disponível para operons de pgl codificados por plasmídeo ou integrados cromossomicamente. Além disso, a estabilidade do plasmídeo pode opcionalmente ser realçada incluindo genes essenciais no plasmídeo ao suprimir estes genes no genoma da cepa de E. coli empregada na composição de vacina.
[0036] Em uma modalidade alternativa o gene de pglB do operon de pgl é inativado, significando que o oligossacariltransferase B correspondente não está expresso ou pelo menos enzimaticamente inativado. O produto do gene de pglB transfere o glicano de N a um local específico de aceitante de polipeptídeo descrito adicionalmente abaixo e libera o heptassacarídeo em sua forma livre. A inativação de transferase conduz ao N-glicano ou derivado de N-glicano que está sendo ligado exclusivamente ao núcleo do Lipídeo A do aceitante do antígeno O em E. coli e conduz à troca de GlcNAc por diN- acetilbacilosamina já que a ligase do antígeno O de E. coli reconhece somente glicanos que contêm GlcNAc no local de fixação (isto é, extremidade redutora).
[0037] Em uma modalidade relacionada o derivado de pgl é um em que um ou mais genes para a biossíntese de di-N- acetilbacilosamina, pgID, E, F, e a transferência são inativados e o gene de pglB inativado, também. Esta modalidade conduz à troca de GlcNAc para di-N-acetilbacilosamina. A modalidade de tal derivado de pgl em Salmonella resultou na apresentação celular aumentada e a transferência do heptassacarídeo modificado ao núcleo do Lipídeo A em vez dos aceitantes de polipeptídeo (vide, a Publicação do Pedido de Patente U.S. n° 012/0100177).
[0038] Pelo menos um N-glicano de C. jejuni, ou derivado de heptassacarídeo disso, pode ser qualquer N-glicano produzido por qualquer operon de pgl de Campylobacter, ou um derivado funcional disso, contanto que o glicano seja imunogênico, no sentido em que extrai uma resposta imune específica para uma espécie de Campylobacter.
[0039] Em uma modalidade específica, o glicano é o heptassacarídeo da fórmula (I) conforme descrito acima, isto é, GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4- GalNAc-a1 ,3-diNAcBac, em que diNAcBac (também denominado de di-N-acetilbacilosamina) é 2,4-diacetamido-2,4,6-trideóxi-D- glucopiranose.
[0040] A modalidade alternativa, em que um operon de pgl onde os genes para a biossíntese de di-N-acetilbacilosamina são inativados, ou na sua maior parte ou inteiramente supridos, conduz à síntese de um heptassacarídeo derivado da fórmula (II), sendo GalNAc-a1,4- GalNAc-α1,4-[Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3- GlcNAc.
[0041] Em uma determinada modalidade o(s) glicano(s) N ou derivado(s) resultando de pelo menos um operon de pgl, ou derivado disso, pode ser ligado a pelo menos um polipeptídeo de E. coli homólogo ou heterólogo que eventualmente será transferido e apresentado na superfície da célula. O polipeptídeo ligado ao N- glicano (derivado) pode ser de qualquer tipo de polipeptídeo tal como um polipeptídeo puro (somente aminoácidos) ou um polipeptídeo modificado pós-traducionalmente, por exemplo, um polipeptídeo ligado por lipídeo.
[0042] Em outra modalidade, o(s) glicano(s) ou o(s) derivado(s) disso, são purificados do anfitrião nativo em sua forma de oligossacarídeo livre e então conjugados quimicamente a um polipeptídeo ou veículo lipídico.
[0043] Em uma modalidade específica pelo menos um glicano ou derivado disso que resulta de pelo menos um operon de pgl ou derivado disso é ligado ao núcleo do Lipídeo A de E. coli ou um derivado funcionalmente equivalente disso. O núcleo do Lipídeo A de E. coli é uma estrutura de oligossacarídeo que consiste de, mas não limitado aos hexoses, heptoses e KDO (ácido 3-deóxi-D-manno- octulossônico) ligados através de duas glucosaminas às cadeias de acil que afixam a estrutura na membrana externa da bactéria. Um derivado funcionalmente equivalente do núcleo do Lipídeo A é um capaz de aceitar um ou mais glicanos ou derivados disso e de apresentá-los na superfície celular. Anota-se que neste caso o heptassacarídeo ou derivado disso não é ligado por N porque o núcleo do Lipídeo A da estrutura de E. coli não é um polipeptídeo.
[0044] Opcionalmente pelo menos um heptassacarídeo ou derivado disso toma o lugar do antígeno O nas cadeias laterais no LPS (lipopolissacarídeo). O núcleo do Lipídeo A interno e externo de E. coli remanesce inalterado enquanto que a biossíntese do antígeno O é abolido através de mutação, por exemplo, wzy e/ou outras mutações. Em determinadas modalidades, pelo menos um heptassacarídeo, um derivado disso, ou uma mistura de ambos, é expresso simultaneamente com as cadeias laterais do antígeno O no LPS tendo por resultado o LPS heterogêneo que contém o antígeno O do anfitrião e o heptassacarídeo.
[0045] Prefere-se e para os usos médicos altamente importantes que a cepa de E. coli da invenção não extraia efeitos patogênicos quando administrada a um animal ou a um ser humano na forma viva e/ou inativa. A pessoa versada na técnica está ciente de muitas maneiras de atenuar espécies de E. coli virulentas por mutação. Por exemplo, as mutações que atenuam E. coli patogênico (1) um mutante de CarAB de Escherichia coli O2 patogênico aviário é atenuado e eficaz como uma vacina oral viva contra colibacilose em perus (Kwaga et al. Infect Immun. 62: 3766- 3772, 1994); (2) mutações de Hfq aia de RNA significativamente reduzem a patogenicidade de VTEC, EAEC, e UPEC no modelo de nematoide (Bojer et al. Microbes Infect 14:10341039, 2012); (3) mutações de genes dentro do sistema de transporte de fosfato específico (Pst) atenuam cepas de E. coli(Buckles et al. Microbiology 152: 153-160, 2006; Daigle et al. Infect and Immun. 63: 4924-4927, 1995).
[0046] Em uma modalidade particular a cepa de E. coli empregada na composição de vacina é atenuada por inativação parcial ou total da expressão do antígeno O, por exemplo, por mutação no gene de wzy (tendo por resultado um mutante polimerase de antígeno O) (Baba et al. Mol. Syst. Biol. 2: 2006).
[0047] As cepas de E. coli descritas acima são altamente imunogênicas e produzem respostas imunes contra Campylobacter, tal como infecções por C. jejuni,. Além disso, uma vez que preparado, podem facilmente ser propagados e produzidos em massa. Podem ser administradas como vacinas vivas ou mortas, vacinas vivas permitindo a propagação prolongada e o estímulo imune sustentado no anfitrião bem como respostas imunes totais com ou sem adjuvantes.
[0048] Consequentemente, a presente aplicação relaciona-se também ao uso médico de cepas de E. coli vivas ou mortas manipuladas para apresentar um ou mais N-glicanos de Camplyobacter, ou derivados disso, em sua superfície, no detalhe para preparar um medicamento, preferivelmente uma vacina.
[0049] Preferivelmente, o medicamento é útil para a prevenção e/ou o tratamento de infecção por C. jejuni, e/ou colonização, preferivelmente nos animais domésticos, mais preferivelmente no gado e nas aves domésticas, e ainda mais preferivelmente nas aves domésticas tais como a galinha, o peru, o ganso e os patos.
[0050] De acordo com um aspecto, a presente aplicação fornece uma composição de vacina que é uma composição farmacêutica, um alimento ou uma alimentação (aditivo) compreendendo E. coli manipulado, vivo ou morto, para apresentar um ou mais N-glicanos de Campylobacter, ou derivados disso, em sua superfície, e um excipiente, diluente ou veículo fisiologicamente aceitável. Opcionalmente, a composição de vacina inclui, ou é administrada com componentes adicionais, como, por exemplo, um adjuvante. Em outra alternativa, a composição de vacina descrita neste documento é formulada para a administração com outra composição de vacina.
[0051] Os adjuvantes em general compreendem as substâncias que impulsionam a resposta imune do anfitrião em uma maneira não específica. Um número de adjuvantes diferentes são conhecidos na técnica. Os exemplos de adjuvantes são adjuvante completo e incompleto de Freunds, vitamina E, polímeros não iônico do bloco e poliaminas tais como o dextransulfato, o carbopol e o pirano. Também apropriadas são as substâncias ativas na superfície, tais como Span, Tween, hexadecilamina, lisolecitina, metóxi-hexadecilglicerol e saponinas (por exemplo, Quil A®). Além disso, os peptídeos tais como muramildipeptídeos, dimetilglicina, e tuftsina, são usados frequentemente. Ao lado destes adjuvantes, complexos imune- estimulantes (ISCOMS), óleo mineral, por exemplo, Bayol® ou Markol®, óleos vegetais ou emulsões disso e Diluvac® Forte podem vantajosamente ser usados.
[0052] Opcionalmente, a vacina é misturada com um ou mais estabilizadores, por exemplo, para proteger componentes inclinados a degradação de serem degradado, para realçar a vida útil da vacina, ou para melhorar a eficiência de secagem por congelamento. Os estabilizadores úteis são, por exemplo, SPGA (Bovarnik et al. J. Bacteriology 59: 509, 1950), leite desnatado, gelatina, albumina do soro de bovídeos, carboidratos, por exemplo, sorbitol manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glicose, proteínas tais como albumina ou caseína ou produtos da degradação disso, e tampões, tais como fosfatos de metais alcalinos.
[0053] A composição de vacina pode ser na forma de, por exemplo, uma solução, suspensão, ou uma composição seca por congelamento apropriada para a reconstituição antes da administração.
[0054] A secagem por congelamento é um método eficiente para a preservação da composição de vacina. O material seco por congelamento pode ser armazenado em estado estável por muitos anos. As temperaturas de armazenamento para o material seco por congelamento possam ser acima de zero grau, sem ser prejudiciais ao material. A secagem por congelamento pode ser realizada de acordo com todos os procedimentos de secagem por congelamento conhecidos na técnica.
[0055] A presente aplicação fornece um método de imunização de um animal contra a infecção de Campylobacter. O método compreende a etapa de administrar ao animal uma composição de vacina que compreende E. coli recombinante que foi manipulado para apresentar pelo menos um N-glicano de Campylobacter, ou derivado de heptassacarídeo disso, em sua superfície, como descrita acima.
[0056] Campilobacteriose é a doença causada pela infecção com Campylobacter. Os sintomas mais comuns são diarreia, dor abdominal, febre, dor de cabeça, náusea, e/ou vômito. Tipicamente estes sintomas duram somente por aproximadamente três a seis dias. Entretanto, raramente, a infecção de Campylobacter pode causar complicações duráveis como, por exemplo, a Síndrome de Guillain- Barré (GBS), a artrite e a bacteremia. Conformemente, as vacinas descritas neste documento são úteis na imunização de animais, inclusive, seres humanos e animais domésticos, tais como a galinha que é uma causa principal das doenças transmitidas por alimentos humanas. Conformemente, a presente aplicação ainda fornece um método para impedir ou minimizar o efeito de uma doença ou distúrbio causado pela infecção de Campylobacter. Em modalidades específicas, a doença ou distúrbio causado pela infecção de Campylobacter é campilobacteriose, Síndrome de Guillain-Barré (GBS) e/ou artrite e/ou bacteremia, embora outras espécies de Campylobacter tenham sido ligadas a outras doenças tais como periodontite e abortos.
[0057] Na modalidade em que a composição de vacina é usada para vacinar animais domésticos, existem várias vias para a administração da composição que podem ser convenientes para a vacinação em massa. A administração pode ser executada através de água potável, alimento ou alimentação, pulverização/nebulização (por exemplo, às galinhas velhas do dia em caixas da entrega, ou aos animais em um ambiente abrigado, tal como uma casa de aves domésticas), colírio, transfixação e escarificação (rota cutânea na correia fotorreceptora ou pé da asa), injeção (por exemplo, intramuscular ou subcutânea), ou administração in-ovo.
[0058] Opcionalmente, animais são tratados com uma dose inicial da composição de vacina seguido por uma ou mais doses de impulsão em intervalos de tempo apropriados. Um trabalhador versado na técnica identificaria prontamente a quantidade de dose e agendamento de dosagem apropriado para uma aplicação particular. No exemplo atual, nós fazemos uma vacinação inicial em pássaros com idade de 1 semana com 8 células 1 x 10 de E. coli fixadas em formol ou vivas (ou com qualquer outra vacina glicoconjugada, isto é, o N-glicano de C. jejuni ligado a ToxC). Nós realizamos uma impulsão com a mesma quantidade de células bacterianas (ou de proteína) duas semanas depois. O desafio com Campylobacter é realizado geralmente após uma outra semana e os pássaros são eutanasiados 1 semana após o desafio (como descrito abaixo).
[0059] Para obter uma compreensão melhor da invenção descrita neste documento, o seguinte exemplo é estabelecido. Deve-se compreender que estes exemplos são para finalidades ilustrativas somente. Consequentemente, não devem limitar o âmbito desta invenção em nenhuma maneira.
[0060] Expressão e purificação da proteína de ToxC-GT glicosilada com o N-glicano de C. jejuni: A proteína de ToxC-GT glicosilada com o N-glicano de C. jejuni foi expressa em E. coli BL21 que expressa o operon de pgl de C. jejuni e purificada por cromatografia de Ni-NTA como descrito na publicação internacional do Pedido de PCT n° WO 2012/027850. A proteína foi purificada adicionalmente por cromatografia de troca de íon usando um sistema de AEKTA FPLC dotado com 2,5 ml de coluna de troca de ânion de MonoQ. A fase móvel foi de 50 mM de tampão de Tris-HCl, pH 8,0 com um gradiente de NaCl ajustado a 0-500 mM de NaCl acima de 30 volumes de coluna. As frações que contêm o glicoconjugado foram analisadas por 12,5% de SDS PAGE, passadas duas vezes com 1 g de absorvente de remoção de lipídeo (LRA, Supelco), dializadas contra PBS estéril e ajustadas a uma concentração de 0,5 mg/ml de proteína antes do uso. A concentração da proteína foi determinada usando as metodologias padrão (teste de Bradford) que usam concentrações crescentes de BSA em PBS para criar uma curva padrão.
[0061] O N-glicano de Campylobacter fundido à estrutura do núcleo de Lipídeo A de E. coli: Preparação da vacina de E. coli
[0062] As células de E. coli que expressam o heptassacarídeo de C. jejuni foram descritas previamente (Nothaft et al. Molecular and Cellular Proteomics 11: 1203-1219). As células foram cultivadas no caldo líquido (2 x caldo de YT (extrato de fermento e caldo de triptona)) a 37°C sob agitação vigorosa (220 RPM) até a fase estacionária foi alcançada. As células foram colhidas por meio de centrifugação e lavadas duas vezes com PBS estéril. A quantidade de células foi determinada por meio de chapear diluições em série de um conjunto da suspensão de célula a um OD600 de 2,0 e usado ou diretamente ou fixada em formol.
[0063] As células de uma cultura de E. coli durante a noite que expressam o local de pgl de C. jejuni foram colhidas por centrifugação e lavadas duas vezes com tampão de PBS estéril como descrito em Nothaft et al. Mol. Cell. Proteomics 11: 1203-1219, 2012. Em seguida, 1 ml de células, ajustadas a um OD600 com PBS estéril a 1,0 foram centrifugadas e ressuspensas em 100 μl de tampão da amostra de Laemmli de 1 dobra e aquecidas por 10 minutos a 95°C. A proteinase K foi adicionada a uma concentração final de 200 μg/ml e a amostra foi incubada a 60°C por 1 h seguido de uma incubação de 5 minutos em gelo e centrifugação por 15 minutos. AS alíquotas do sobrenadante foram separadas pelo padrão de 12,5% de SDS-PAGE. O heptassacarídeo fundido ao núcleo do Lipídeo A foi visualizado por Western Blotting como descrito (Nothaft et al. Molecular and Cellular Proteomics 11: 1203-1219) usando o antisoro específico hR6 do N- glicano de Campylobacter jejuni como preliminar e o anti-coelho conjugado com fosfatase alcalina como um anticorpo secundário (figura 1). A pista 1 mostra lisados de células tratadas de proteinase K do mutante de polimerase do antígeno O de E. coli que expressam o operon de glicosilação de proteína de C. jejuni com um gene de pglB inativo (mut de pglB de pACYC184). A formação da fusão de N-glicano do Lipídeo A é marcada por uma seta. A pista 2 mostra lisados de células tratadas de proteinase K do controle de vetor vazio do mutante de polimerase do antígeno O de E. coli (pACYC184). Os marcadores do peso molecular (MW em kilodalton, kDA) são indicados na esquerda. As faixas mais elevadas do peso molecular são componentes de E. coli que são cruz-reativas em ambas as preparações.
[0064] A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) do componente de N-glicano do Lipídeo A purificado. Os glicolipídeos foram preparados de oito litros de um OD600 = 1,0 cultura mutante de polimerase do antígeno O de E. coli que expressa o operon de glicosilação de proteína de C. jejuni com um gene inativo de pglB (mut de pglBde pACYC184). O LPS foi extraído por água fenol, dializado, tratado com AcOH para precipitar ácidos nucleicos, dializado, seco, hidrolizado com 2% de AcOH, e separado em um Biogel P6. As frações foram analisadas por RMN. Frações que contiveram sinais de N-glicano de C. jejuni foram combinadas e separadas em uma coluna de Hitrap de troca de ânion usando um gradiente de NaCl. As frações foram analisadas por RMN. Frações que contêm sinais de N-glicano de C. jejuni foram dessalgadas por cromatografia de Sephadex G-15. As conexões foram confirmadas por espectroscopia efeito nuclear de Overhauser (NOESY) e espectroscopia de correlação de ligação múltipla heteronuclear (HMBC). Os deslocamentos químicos de N- glicano de C. jejuni específicos podiam ser observados, todas as ligações de 1-4 dos componentes de N-glicano de C. jejuni geraram NOE de 1:4 e 1:6 transglicosídicos e as atribuições estavam no bom acordo com dados previamente publicados (figura 2 e tabela 1, e Nothaftet al. Molecular and Cellular Proteomics 11: 1203-1219, 2012). O derivado do N-glicano de C. jejuni com um GlcNAc em vez do diNAcBac como açúcar da extremidade redutora (figura 2) foi fixado através de O-7 do L-glicero -D-mano -heptose do núcleo do Lipídeo A. Todos os sinais de Hep (L) foram encontrados pela análise do montão principal das correlações e das atribuições para a parte do núcleo do Lipídeo A de E. coli estavam no acordo com dados publicados (Muller- Loennies et al. Journal of Biological Chemistry 278:,34090-34101, 2003, e Tabela 1). Tabela 1: Deslocamentos químicos
[0065] Análise da classificação de célula ativada de fluorescência (FACS). Primeiramente, 1 ml de OD600 = 1,0 de células de E. coli foram peletizadas por centrifugação e ressuspensas em 1 ml de solução de bloqueamento (PBS, 5% de leite desnatado). As células foram sondadas com antissoro hR6 de N-glicano específico de C. jejuni e antissoro de anti-coelho conjugado de Alexa Fluor-546 e analisado por FACS. Os dados de FACS foram processados com o software de FACS Diva. A marcação com DAPI foi usada para identificar e bloquear para células intatas. A análise de uma população de células 2 x 10 4 mostrou um aumento significativo na fluorescência para células de E. coli que expressam o N-glicano de C. jejuni comparado a células de controle de vetor vazio de E. coli (pACYC184) que confirmam que o N-glicano de C. jejuni é apresentado na superfície celular (figura 3). A aparência e geometria de pico mostra que cada célula de E. coli apresentou uma quantidade comparável do N-glicano de C. jejuni em sua superfície.
[0066] A exposição das galinhas às injeções do glicoconjugado de ToxC-GT (figura 4D) ou doses orais de cepas mortas (figura 4A) bem como vivas (figura 4B e C) do E. coli modificado descrito no exemplo 1, resultou em diminuições significativas no índice cecal de Campylobacter em galinhas desafiadas. Três ensaios de vacinação de galinha foram realizados usando E. coli que expressa o heptassacarídeo de C. jejuni para demonstrar imunidade aumentada dos pintinhos a Campylobacter. Os resultados destes ensaios são mostrados nas figuras 4A, B e C.
[0067] No primeiro ensaio de vacinação de galinha, um desafio foi realizado com três grupos de pintinhos. O grupo de controle PBS conteve quatro galinhas enquanto que os grupos 2 e 3 cada um conteve oito galinhas. As condições para os grupos 1 e 2 são mostradas na tabela 2. O grupo 3 tratado por gavagem oral com a superfície de células de E. coli mortas expressando heptassacarídeo de N-glicano de C. jejuni nos dias 7 e 21. Os pássaros foram desafiados subsequentemente como a seguir: O grupo 1 (controle negativo) foi tratado por gavagem oral com 300 μl PBS; os grupos 2 e 3 foram tratados por gavagem oral com 300 μl PBS que contêm 102 C. jejuni de 81-176 células. No dia 35, as galinhas foram eutanasiadas e os níveis da colonização foram determinados por meio de chapear diluições de série dos índices cecais de cada pássaro no ágar seletivo de Karmali. As unidades formantes de colônia (cfu) foram determinadas após a incubação das placas por 48 horas sob condições de microaeróbia. Os resultados são mostrados graficamente na figura 4A, com os níveis da colonização mostrados como cfu por grama de índice cecal. As barras horizontais representam o número médio para cada grupo. Especificamente, os resultados mostram que a vacina à base de N-glicano reduz a colonização de Campylobacter nas galinhas. Nenhuma unidade formante de colônia foi detectada em placas do grupo 1 (controle de PBS) visto que os pássaros do grupo 2 foram colonizados com uma média de aproximadamente 1010 de células de campylobacter por grama de índice cecal. A colonização foi reduzida no grupo 3 por aproximadamente 4 registros.
[0068] No segundo ensaio de vacinação de galinha, um desafio foi realizado com três grupos de pintainhos. Os grupos 1 e 2 contiveram 6 galinhas, o grupo 3 conteve 8 galinhas. As condições para os grupos 1 e 2 são mostradas na tabela 2. O grupo 3 tratado por gavagem oral com células de E. coli vivas expressando o heptassacarídeo de N- glicano de C. jejuni nos dias 7 e 21. As concentrações de desafio e os níveis da colonização foram determinados como descritos no primeiro ensaio. Os resultados são mostrados graficamente na figura 4B, com os níveis da colonização mostrados como cfu por grama de índice cecal. As barras horizontais representam o número médio para cada grupo. Os resultados mostram que a vacina à base de N-glicano reduz a colonização de Campylobacter nas galinhas. Nenhuma unidade formante de colônia foi detectada em placas do grupo 1 (controle de PBS) visto que os pássaros do grupo 2 foram colonizados com uma média de aproximadamente 1010 de células de campylobacter por grama de índice cecal. A colonização não era detectável em alguns dos pássaros no grupo 3.
[0069] No terceiro ensaio mostrado na figura 4C, um desafio foi realizado com 4 grupos de pintainhos. O grupo 1 conteve 6 galinhas, os grupos 2, 3 e 4 contiveram 8 galinhas. As condições para os grupos 1 e 2 são mostradas na tabela 2. Os grupos 3 e 4 foram tratados por gavagem oral no dia 7 e no dia 21. Os pássaros do grupo 3 receberam E. coli vivo que não expressa o N-glicano na superfície enquanto que os pássaros do grupo 4 receberam células de E. coli vivas que expressam o heptassacarídeo de N-glicano de C. jejuni em suas superfícies. Os resultados são mostrados graficamente na figura 4C, com os níveis da colonização mostrados como cfu por grama de índice cecal. As barras horizontais representam o número médio para cada grupo. Os resultados mostram que a vacina à base de N-glicano repetidamente reduz a colonização de Campylobacter nas galinhas e que as células de E. coli que não expressam o N-glicano não têm um efeito probiótico já que os níveis da colonização de Campylobacter após o desafio eram similares aos pássaros do grupo 2.
[0070] No quarto ensaio mostrado na figura 4D, um desafio foi realizado com seis grupos de pintainhos, cada grupo contém oito galinhas. As condições de cada grupo são mostradas na Tabela 2. Tabela 2: Grupos de desafio
[0071] Semelhante aos ensaios precedentes, no dia 1, pincelamentos cloacais foram executados em 10% dos pássaros (5 selecionados aleatoriamente) e chapeados no ágar seletivo de Karmali para confirmar que os pássaros não foram colonizados com C. jejuni. Nenhuma colônia de Campylobacter foi observada após 48 horas de incubação sob condições de microaeróbia a 37°C.
[0072] Semelhante aos ensaios precedentes, no dia 7, até 50 μl de sangue (pré-sangramento) foi coletado de cada pássaro. Os soros foram preparados como a seguir: Após ter mantido as amostras de sangue a 37°C por 1 hora seguido de centrifugação (5 minutos, 18,000xg, 4°C) que os sobrenadantes (soros) foram transferidos a um tubo fresco e glicerol foi adicionado a uma concentração final de 10%. Os soros estiveram armazenados a -20°C até o uso posterior. O tratamento antimicrobiano subsequente foi executado como a seguir: O grupo 1 (controle de PBS) e 2 (controle de colonização) receberam 300 μl de PBS com Freunds completo no dia 7 e a mesma quantidade mas com adjuvante incompleto de Freunds no dia 21 (150 μl PBS + 150 μl de adjuvante) injetado em dois locais no peito com 150 μl da formulação de vacina (sem o glicoconjugado) pelo local. O grupo 3 não recebeu nenhum antígeno no dia 7 mas recebeu uma dose de ToxC- GT glicosilado com o N-glicano de C. jejuni (100 μg de proteína em 150 μl PBS + 150 μl de adjuvante completo de Freunds) no dia 21; O grupo 4 recebeu uma dose de ToxC-GT glicosilado com o N-glicano de C. jejuni no adjuvante completo de Freunds no dia 7 e nenhum antígeno no dia 21. O grupo 5 recebeu 2 doses (no dia 7 com o Freunds completo e no dia 21 com o Freunds incompleto como o adjuvante) de 100 μg de ToxC-GT com o N-glicano de C. jejuni injetado na perna (150 μl da formulação de vacina em cada perna) e o grupo 6 foi tratado por gavagem oral com 2 doses (no dia 7 e no dia 21) com 300 μl PBS que contêm 108 de células de E. coli vivas que expressam o N-glicano de C. jejuni em sua superfície.
[0073] Semelhante aos ensaios precedentes, no dia 28, 100 μl de sangue foi extraído de cada pássaro (sangramento de teste) dos grupos 1-6 e os soros foram preparados e armazenados como descrito acima. Os pássaros foram desafiados subsequentemente como a seguir: O grupo 1 (controle negativo) foi tratado por gavagem oral com 300 μl PBS; os grupos 2-6 foram tratados por gavagem oral com 300 μl PBS que contêm 102 C. jejuni de 81-176 células. No dia 34, as galinhas foram eutanasiadas, o sangue (sangramento final) foi tomado através de punção cardíaca e os soros foram preparados e armazenados como descrito acima. Os níveis da colonização foram determinados por meio de chapear diluições de série do índice cecal de cada pássaro no ágar seletivo de Karmali. As unidades formantes de colônia (cfu) foram determinadas após a incubação das placas por 48 horas sob condições de microaeróbia.
[0074] Os resultados são mostrados graficamente na figura 4D, com os níveis da colonização mostrados como cfu por grama de índice cecal. As barras horizontais representam o número médio para cada grupo. Especificamente, os resultados mostram outra vez que as vacinas à base de N-glicano reduzem a colonização de Campylobacter na galinha e que as vacinas que compreendem células de E. coli vivas que expressam o N-glicano de C. jejuni em sua superfície funcionam melhor do que as vacinas de glicoproteína nas galinhas (vide abaixo).
[0075] Nenhuma unidade formante de colônia foi detectada em placas do grupo 1 (controle de PBS) visto que os pássaros do grupo 2 foram colonizados com uma média de aproximadamente 1010 de células de campylobacter por grama de índice cecal. A colonização foi reduzida no grupo 3, no grupo 4 e no grupo 5 com um cfu médio de 2,2 * 104, 6,8 *105 e 5,5 * 104 por grama de índice cecal, respectivamente.
[0076] A colonização no grupo 6 foi quase abolida com uma média de 100 cfu por grama de índice cecal. Além disso, 5 em cada 8 pássaros não mostraram nenhum sinal de colonização de C. jejuni de todo. Isto indicou claramente que o tratamento com a vacina de N- glicano de C. jejuni à base de proteína resultou na colonização reduzida após o desafio com o Campylobacter independente no momento da injeção e do local de aplicação da vacina e essa vacinação oral com células de E. coli vivas que expressaram o heptassacarídeo em sua superfície quase completamente aboliu a colonização de Campylobacter. Além disso, a auto-limitação da cepa de vacina de E. coli foi demonstrada já que nenhum E. coli foi observado em índices cecais deste grupo quando chapeado em LB Kan-Cm seletivo. A eliminação da cepa de vacina de E. coli vivo das galinhas foi observada em todos os ensaios.
[0077] Os testes de ELISA foram executados para analisar a resposta imune de N-glicano específico, especificamente a resposta de anticorpo específico de N-glicano da galinha IgY (IgG). O oligossacarídeo livre (fOS) de C. jejuni foi preparado como descrito (Dwivedi et al. Biopolymers, 99: 772-7830, 2013) e acoplado a BSA por animação redutiva como descrito (Nothaft et al. Mol. Cell. Proteomics 11: 1203-1219, 2012). A formação do conjugado de glicano BSA-Cj-N foi confirmada por Western Blotting usando o antissoro R1-4. Após ter ajustado a concentração a 1 mg/ml com PBS, o glicoconjuado foi armazenado a 4°C até o uso posterior. Em seguida, placas de Maxisorb de 96 poços foram revestidas com 500 ng do conjugado de glicano de BSA-Cj-N durante a noite (18 horas) a 4°C. Após a remoção do antígeno não ligado, a placa foi obstruída por 1 hora a temperatura ambiente com 100 μl de PBS-T, 5% de leite desnatado com agitação. Após ter descartado a solução de obstrução, 100 μl das soluções de anticorpo foram adicionados e incubados por 1 hora como descrito acima. As soluções de anticorpo foram compreendidas de antissoro específico de N-glicano diluído 1:3000 em PBS-T, 1% de leite desnatado ou soro de galinha (preparado do 2° sangramento (isto é, no dia 28) dos ensaios de vacinação) e diluído 1:50 em PBS-T, 1% de leite desnatado. As placas foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente como descrito e cada poço foi lavado 3 vezes por 5 minutos com 100 μl de PBS-T. Após uma adição de 100 μl da solução secundária de anticorpo (ou anti-coelho-AP (1:500) para o controle de R1-4, ou anti galinha IgY (1:500) para as amostras experimentais e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente, a solução secundária de anticorpo foram descartadas e os poços foram lavados 4 vezes 5 minutos com 100 μl de PBS-T. Após a última etapa de lavagem, a solução de lavagem restante foi removida completamente de cada poço e a placa foi desenvolvida usando PNPP como um substrato. Imunorreatividade em cada soro foi determinada após o escaneamento da placa em OD405 em um leitor de placa.
[0078] Os anticorpos específicos de glicano de N de C. jejuni estavam presentes (figura 5A) nos soros preparados do sangue extraído no dia 28 antes do desafio com Campylobacter dos pássaros vacinados com 1 dose de ToxC-GT com o N-glicanoo dia 21 (peito, IM) (grupo 3 da amostra), 2 doses de ToxC-GT com o N-glicanoo dia 7 & 21 (peito, IM) (grupo 4 da amostra), 2 doses de ToxC-GT com o N- glicanoo dia 7 & 21 (perna) (grupo 5 da amostra), e 2 doses de E. coli morto (grupo 6 da amostra). A resposta de anticorpo (expressa como OD405) foi mais elevada no grupo 6 da amostra e na maioria das galinhas deste grupo da amostra não mostrou nenhuma colonização. A resposta de anticorpo nos grupos de controle positivos e negativos da colonização (a amostra dos grupos 1 e 2) estava abaixo do limite da detecção. As barras horizontais representam o número médio para cada grupo.
[0079] Os anticorpos específicos de N-glicano de C. jejuni estavam presentes (figura 5A) nos soros preparados do sangue extraído no dia 28 antes do desafio com Campylobacter dos pássaros vacinados com E. coli vivo que apresenta o N-glicano na superfície (grupo 4 da amostra). Isto corresponde ao ensaio de vacina #3 mostrado na figura 4C. As respostas do anticorpo (expressas como OD405) nos pássaros vacinado com E. coli vivo nenhum glicano (grupo 3 da amostra) e os grupos de controle positivos e negativos da colonização (grupos 1 e 2 da amostra) estavam abaixo do limite da detecção. As barras horizontais representam o número médio para cada grupo.
[0080] O seguinte foi observado:
[0081] a alimentação aos pintainhos de células de E. coli mortas que expressam o heptassacarídeo de C. jejuni seguido do desafio com C. jejuni causou uma redução de aproximadamente 4 registros na colonização de C. jejuni do intestino da galinha (figura 4A); e
[0082] a alimentação aos pintainhos de células de E. coli vivas que expressam o heptassacarídeo de C. jejuni seguido do desafio com C. jejuni causou uma redução maior do que 7 registros na colonização de C. jejuni do intestino da galinha (figuras 4B, C e D).
[0083] É evidente que as vacinas que compreendem células de E. coli vivas ou mortas que expressam o heptassacarídeo de C. jejuni são capazes significativamente de aumentar a imunidade dos pintainhos para desafiar depois por C. jejuni.
[0084] A fim de demonstrar que a gota na colonização de C. jejuni é resultado da vacinação com E. coli vivo que expressa o heptassacarídeo de C. jejuni e não a um efeito probiótico devido à exposição de células de E. coli vivas, os índices cecais dos pássaros que foram vacinados com as cepas de E. coli vivas foram chapeadas também em meios seletivos de E. coli como mencionado acima. Nenhuma colônia de E. coli foi detectada nas galinhas vacinadas com E. coli vivo que indica que E. coli era liberado antes da terminação do ensaio.
[0085] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são indicativos do nível da habilidade daqueles versados na técnica a qual esta invenção pertence e são incorporadas neste documento por referência à mesma extensão como se cada publicação, patente, ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporado por referência.
[0086] A invenção sendo descrita assim, será óbvio que a mesma pode ser variada em muitas maneiras. Tais variações não devem ser consideradas como uma fuga do espírito e do âmbito da invenção, e todas as modificações como seriam óbvias a uma pessoa versada na técnica são destinadas a serem incluídas dentro do âmbito das seguintes reivindicações.
[0087] As modalidades da invenção em que uma propriedade ou um privilégio exclusivo é reivindicado são definidos como a seguir.
Claims (12)
1. Composição de vacina para uso na vacinação de galinhas contra Campylobacter, caracterizada pelo fato de que compreende: bactérias manipuladas para expressar pelo menos um N- glicano de Campylobacter em sua superfície celular; e um ou mais de um diluente, excipiente, adjuvante ou veículo fisiologicamente aceitável, em que as bactérias são Escherichia coli, em que o glicano é um heptassacarídeo de fórmula (I), GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-[Glc- β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-diNAcBac em que diNAcBac é 2,4-diacetamido-2,4,6-trideoxi-D-glucopiranose, ou heptassacarídeo derivado da fórmula (II), GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4- [Glc-β-1,3]GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,4-GalNAc-α1,3-GlcNAc, ou derivado de hexassacarídeo de Fórmula (I) ou (II) sem uma ramificação de glicose; e em que as bactérias manipuladas são manipuladas para inativar oligossacariltransferase B e expressam o N-glicano em sua superfície celular como uma fusão de núcleo de Lipídeo A.
2. Composição de vacina, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que Campylobacter é C. jejuni.
3. Composição de vacina, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende E. coli manipulada viva, ou E. coli manipulada, viva, atenuada.
4. Composição de vacina, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende células de E. coli manipuladas inativas ou mortas.
5. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende uma suspensão das bactérias manipuladas em um tampão diluente apropriado, tal como tampão fosfato salino.
6. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante, estabilizador ou conservante.
7. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que é formulada para a administração oral.
8. Composição de vacina, de acordo com reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que é formulada para ser pulverizada ou para a adição à alimentação animal, ao aditivo da alimentação ou à água.
9. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é formulada para a administração às aves domésticas, preferencialmente galinhas.
10. Composição de vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9, caracterizada pelo fato de que as bactérias manipuladas expressam o N-glicano de C. jejuni em sua superfície.
11. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é administrada por meio de pulverização ou em uma composição farmacêutica, alimento, aditivo de alimentação, ou água potável.
12. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é formulada para a administração por administração oral.
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