KR20140019482A

KR20140019482A - 원핵 세포로부터의 재조합 ｎ-글리코실화 단백질

Info

Publication number: KR20140019482A
Application number: KR1020147001671A
Authority: KR
Inventors: 마르쿠스 아에비; 미하엘 코바리크; 우메시 아후자
Original assignee: 에테하 취리히
Priority date: 2005-05-11
Filing date: 2006-05-10
Publication date: 2014-02-14
Also published as: JP5356807B2; CN101360831A; KR101524636B1; US8753864B2; US9551019B2; PT1888761E; DK2311972T3; KR101408653B1; EP2853600B1; PL2311972T3; AU2006245969A1; ES2353814T3; WO2006119987A3; JP5687637B2; EP2853600A1; JP5827303B2; JP2012100678A; CA2607595A1; CA2607595C; US20140323700A1

Abstract

본 발명은 하나 이상의 도입된 N-글리코실화 최적화된 아미노산 서열(들) 을 포함하는 재조합 N-글리코실화 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 핵산, 뿐만 아니라 상응하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단백질, 핵산, 벡터 및 숙주 세포의, 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 단백질의 제조 방법을 제공한다.

Description

원핵 세포로부터의 재조합 Ｎ-글리코실화 단백질 {RECOMBINANT N-GLYCOSYLATED PROTEINS FROM PROCARYOTIC CELLS}

본 발명은 하나 이상의 도입된 N-글리코실화 최적화 아미노산 공통염기서열(들)을 포함하는 재조합 N-글리코실화 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 핵산뿐만 아니라, 상응하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 단백질, 핵산, 벡터 및 숙주 세포의, 약제의 제조를 위한 용도에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상기 단백질의 제조 방법을 제공한다.

N-연결 단백질 글리코실화는 진핵 개체의 소포체 내에서 일어나는 필수적이고 보존된 방법이다. 상기 글리코실화는 단백질 접힘, 올리고머화, 안정성, 품질 조절, 분류, 분비성 단백질 및 막 단백질의 수송에 중요하다 (Helenius, A., and Aebi, M. (2004). Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 73, 1019-1049).

단백질 글리코실화는 단백질의 항원성, 안정성 및 반감기에 큰 영향을 미친다. 또한, 글리코실화는 크로마토그래피, 예를 들어, 단백질의 글리코실화 부분과 상호작용하는 고체상에 결합된 렉틴 리간드를 사용한 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질의 정제를 도울 수 있다. 따라서, 생물학적으로 그리고 약학적으로 유용한 글리코실화 패턴을 제공하기 위해서, 진핵 세포 내에서 많은 글리코실화 단백질을 재조합적으로 제조하는 것이 확립된 실행이다.

단지 최근 몇 해 내에, 박테리아인 식품 매개 병원체인 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 가 또한 그의 단백질을 N-글리코실화시킬 수 있다고 언급되었다 (Szymanski, 등 (1999). Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni . Mol. Microbiol. 32, 1022 - 1030). 글리코실화에 필요한 머시너리는 소위 pgl 좌위에서 클러스터되는 12 개의 유전자에 의해 암호화된다. N-글리코실화를 방해하면, C. 제주니의 침범 및 병원성에 영향을 미치나, 대부분의 진핵 개체 내에서 치명적이지는 않다 (Burda P. and M. Aebi, (1999). The dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta 1426 (2) : 239 - 57). 이. 콜라이 (E. coli) 내에서 pgl 좌위 및 수용체 당단백질을 동시에 재조합적으로 발현시킴으로써 C. 제주니 단백질의 N-글리코실화를 구성하는 것이 가능하다. (Wacker 등 (2002). N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science 298, 1790 - 1793).

본 발명자의 선행 발명인 유럽 특허 출원 제 03 702 276.1 호 (유럽 특허 제 1 481 057 호) 는 (i) 지질 운반체 상에서의 올리고사카라이드의 조립을 위한 특정 글리코실트랜스퍼라제, (ii) 공통염기서열 "N-X-S/T" (여기서, X 는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산일 수 있음) 를 포함하는 재조합 표적 단백질, 및 (iii) 상기 올리고사카라이드를 표적 단백질의 공통염기서열에 공유 결합하는, C. 제주니의 올리고사카릴 트랜스퍼라제 (OTase) 를 암호화하는 핵산이 도입되는 원핵 개체를 교시한다. 상기 원핵 개체는 특정 글리코실트랜스퍼라제의 유형에 의해 정의되는 특정 구조가 있는 N-글리칸을 생성한다.

단백질 내에 공지된 N-글리코실화 공통염기서열이 존재하는 것이, C. 제주니의 올리고사카릴 트랜스퍼라제(OTase)를 포함하는 원핵 개체 내에서 재조합 표적 단백질이 N-글리코실화될 수 있게 한다 하더라도, 일부 표적 단백질의 N-글리코실화는 종종 불충분하다.

본 발명의 목적은 원핵 개체 생체 내에서 생성될 수 있는 N-글리코실화에 대한 최적화된 효율을 가진 단백질, 및 그러한 단백질의 제조 방법 및 수단을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 상기 단백질의 항원성, 안정성, 생물학적, 예방적 및/또는 치료적 활성을 변경시키기 위해, N-글리칸을 재조합 단백질에 더욱 효율적으로 도입하는 것을 목적으로 한다. 추가의 목적은 본 발명의 재조합 N-글리코실화 단백질을 그의 표면상에 효율적으로 제시하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.

제 1 측면에서, 본 발명은 하기 N-글리코실화 최적화된 아미노산 서열(들) 중 하나 이상을 포함하는 재조합 N-글리코실화 단백질을 제공한다 :

D/E-X-N-Z-S/T, (최적화된 공통염기서열)

(상기 식에서, X 및 Z 은 프롤린을 제외한 임의의 천연 아미노산이고, 여기서, 하나 이상의 상기 N-글리코실화 부분 아미노산 서열(들) 이 도입됨).

놀랍게도, 특정 부분 아미노산 서열(들) (최적화된 공통염기서열(들)) 이 단백질에 도입되는 것이, 상기 도입된 위치에서 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 바람직하게는 C. 제주니로부터 올리고사카릴 트랜스퍼라제(OST, OTase)에 의해 효율적으로 N-글리코실화되는 단백질을 초래한다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 내용에서 사용된 바와 같이, 용어 "부분 아미노산 서열(들)" 은 또한 "최적화된 공통염기서열(들)" 을 말할 것이다. 최적화된 공통염기서열은 선행 기술에서 알려진 규칙적인 공통염기서열 "N-X-S/T" 보다 훨씬 더 효율적으로 캄필로박터 종. 바람직하게는 C. 제주니로부터의 올리고사카릴 트랜스퍼라제 (OST, [MW1] OTase) 에 의해 N-글리코실화된다.

일반적으로, 용어 "재조합 N-글리코실화 단백질" 은, 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 본래 포함하지 않는 숙주 세포에서 생성된 임의의 이종 폴리- 또는 올리고펩티드를 말한다. 본 발명의 내용에서, 상기 용어는 임의의 숙주 세포, 예를 들어, 진핵 또는 원핵 숙주 세포, 바람직하게는 원핵 숙주 세포, 예를 들어, 에스케리키아 종(Escherichia ssp.), 캄필로박터 종(Campylobacter spp .), 살모넬라 종(Salmonella ssp.), 시겔라 종(Shigella ssp.), 헬리코박터 종(Helicobacter ssp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas ssp.), 바실러스 종(Bacillus ssp.), 더욱 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium) 등에서 재조합으로 생성되는 단백질을 말하며, 여기서, 상기 단백질을 암호화하는 핵산을 상기 숙주 세포에 도입하고, 암호화되는 단백질을 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 바람직하게는 C. 제주니로부터의 OTase에 의해 N-글리코실화시키고, 상기 트랜스퍼라제 효소는 상기 숙주 세포 내에서 본래 발생하거나 또는 상기 숙주 세포 내로 재조합적으로 도입된다.

아미노산에 대한 국제적으로 인용되는 한 글자 코드에 따르면, 약어 D, E, N, S 및 T 는 각각 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 세린 및 트레오닌을 말한다. 본 발명에 따른 단백질은, 최적화된 공통염기서열(들) D/E-X-N-Z-S/T 중 하나 이상이 도입되고 N-글리코실화되는 점에서, 본래의 또는 선행 단백질과 상이하다. 따라서, 본 발명의 단백질은 최적화된 공통염기서열을 또한 함유하나, 임의의 추가의 (도입된) 최적화된 공통염기서열을 포함하지 않는 자연 발생 C. 제주니 단백질과 상이하다.

최적화된 공통염기서열의 도입은 하나 이상의 아미노산의 첨가, 소실 및/또는 치환에 의해 이루어질 수 있다. 최적화된 공통염기서열을 도입하기 위한 하나 이상의 아미노산의 첨가, 소실 및/또는 치환은 고체상-지지 화학적 펩티드 합성과 같이 당업자에게 잘 알려진 화학적 합성 전략에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 더 큰 폴리펩티드에 대해서도 바람직하게는, 본 발명의 단백질이 표준 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 단백질은, 그것들이 캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니로부터의 기능성 pgl 오페론을 포함하는 임의의 원핵 숙주에서 높은 효율로 생성될 수 있다는 점에서 이점을 가지고 있다. 본 발명의 측면 및 구현예를 수행하는데 있어서, 캄필로박터 종. 로부터의 바람직한 대안적인 OTase는 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 및 캄필로박터 라리(Campylobacter lari)이다 ([Szymanski, C. M. and Wren, B. W. (2005) Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nat. Rev. Microbiol. 3 : 225 - 237] 참조). 기능성 pgl 오페론은, 상기 원핵 숙주가 캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니인 경우 자연적으로 존재할 수 있다. 그러나, 당 기술분야에서 이미 기술되고 상기 전술된 바와 같이, pgl 오페론은 세포 내로 수송되고, 상기 새로운 세포 환경에서 기능성인 채로 존재한다.

용어 "캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니로부터의 기능성 pgl 오페론" 은 캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니의 기능성 올리고사카릴 트랜스퍼라제(OTase), 및 지질 운반체 상에서 올리고사카라이드를 조립할 수 있는 하나 이상의 특정 글리코실트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산의 클러스터를 말하고, 여기서, 상기 올리고사카라이드는 지질 운반체로부터 하나 이상의 최적화된 아미노산 서열(들): D/E-X-N-Z-S/T 를 갖는 표적 단백질에 OTase에 의해 수송될 수 있다. 본 발명의 내용에서, 용어 "캄필로박터 종(Campylobacter spp .), 바람직하게는 C. 제주니로부터의 기능성 pgl 오페론" 은 본래 단일 전사 단위로서의 오페론을 말하는 것이 아니다. 상기 용어는 단지, 하나의 숙주 세포 내에서의, 재조합 단백질의 N-글리코실화를 위한 기능성 성분의 존재를 필요로 한다. 상기 성분은 하나 이상의 개별 mRNA 로서 전사될 수 있고, 함께 또는 따로 조절될 수 있다. 예를 들어, 상기 용어는 또한, 게놈 DNA 에 위치한 기능성 성분 및 하나의 숙주 세포 내의 플라스미드(들) 를 포함한다. 효율을 목적으로, 기능성 pgl 오페론의 모든 성분은 동시에 조절 및 발현되는 것이 바람직하다.

단지 기능성 올리고사카릴 트랜스퍼라제(OTase) 가 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 바람직하게는 C. 제주니로부터 기원되어야 하고, 지질 운반체 상에서 올리고사카라이드를 조립할 수 있는 하나 이상의 특정 글리코실트랜스퍼라제는 숙주 세포로부터 기원되거나 또는 상기 숙주 세포 내로 재조합적으로 도입될 수 있다는 것을 인지하는 것이 중요하며, 유일한 기능성 제한은, 상기 글리코실트랜스퍼라제에 의해 조립되는 올리고사카라이드가 지질 운반체로부터, 하나 이상의 최적화된 공통염기서열을 갖는 표적 단백질에 OTase 에 의해 수송될 수 있다는 점이다. 따라서, 본래 특정 글리코실트랜스퍼라제를 포함하고/거나 또는 상기 숙주 내에 본래 존재하는 특정 글리코실트랜스퍼라제를 무력하게 하는 숙주 세포의 선별, 뿐만 아니라 이종 특정 글리코실트랜스퍼라제의 도입은 당업자가 본 발명의 단백질 내 최적화된 N-글리코실화 공통염기서열 부위에 결합된 N-글리칸을 다양하게 할 수 있을 것이다.

상기의 결과로서, 본 발명은 본 발명의 단백질 상에 개별 디자인의 N-글리칸-패턴을 제공한다. 따라서, 상기 단백질은 그의 N-글리칸 패턴이 생물학적, 약학적 및 정제 요구에 적합하도록 개별화될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 단백질은 상기 N-글리코실화 최적화된 아미노산 서열을 하나, 또한, 하나 초과로, 바람직하게는 2개 이상, 바람직하게는 3개 이상, 더욱 바람직하게는 5개 이상 포함할 수 있다.

본 발명의 단백질 내 하나 이상의 N-글리코실화 최적화된 아미노산 서열(들) 의 존재는 그의 항원성을 증가시키고, 그의 안정성을 증가시키고, 그의 생물학적 활성에 영향을 미치고, 그의 생물학적 반감기를 연장시키고/거나 또는 그의 정제를 단순화시키는 이점일 수 있다.

최적화된 공통염기서열은 위치(들) X 및 Z 에 프롤린을 제외한 임의의 아미노산을 포함할 수 있다. 용어 "임의의 아미노산" 은, 공통적이면서 희귀한 천연 아미노산, 뿐만 아니라, 최적화된 공통염기서열이 OTase 에 의해 N-글리코실화될 수 있게 할 합성 아미노산 유도체 및 유사체를 포함하는 것으로 의미된다. 자연 발생의 공통적이고 희귀한 아미노산은 X 및 Z 에 바람직하다. X 및 Z 은 동일 또는 상이할 수 있다.

X 및 Z 이 본 발명에 따른 단백질 내에서 각각의 최적화된 공통염기서열에 대해서 상이할 수 있음을 주목한다.

최적화된 공통염기서열에 결합된 N-글리칸은 OTase에 의한 수송을 위해 지질 운반체 상에서 올리고사카라이드를 조립할 때, 특정 글리코실트랜스퍼라제 및 그의 상호작용에 의해 결정될 것이다. 당업자는 목적하는 숙주 세포 내에 존재하는 특정 글리코실트랜스퍼라제의 유형(들) 및 양을 다양하게 함으로써, N-글리칸을 디자인할 수 있다.

N-글리칸은 본원에서 N-글리시코시드 연결을 통해 단백질 내의 아스파라긴 잔기의 ε-아미드 질소에 연결되는 다양한 조성물의 모노-, 올리고- 또는 폴리사카라이드로서 정의된다. 바람직하게는, OTase 에 의해 수송되는 N-글리칸은 그램-음성 또는 양성 박테리아의 세포질 막 내에 존재하는 운데카프레놀-피로포스페이트 지질-앵커 상에서 조립된다. 그것들은 O 항원, O 사카라이드 및 펩티도글리칸의 합성에 관여한다 ([Bugg, T. D., and Brandish, P. E. (1994). From peptidoglycan to glycoproteins : common features of lipid-linked oligosaccharide biosynthesis. FEMS Microbiol Lett 119, 255 - 262] ; [Valvano, M. A. (2003). Export of O-specific lipopolysaccharide. Front Biosci 8, S452-471]).

바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 단백질은 캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니로부터의 N-글리칸으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 N-글리칸을 포함하고, 상기 N-글리칸은 그램-음성 박테리아 내 O 폴리사카라이드 형성 O 항원에 수송되는 올리고- 및 폴리사카라이드, 또는 그램-양성 박테리아, 바람직하게는 : P. 애루기노사(P. aeruginosa) 09, 011; 이. 콜라이 07, 09, 016, 0157 및 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae) 01 로부터의 캡슐형 폴리사카라이드로부터 유도되는 N-글리칸, 및 폴리사카라이드 구조에 영향을 미치는 글리코실트랜스퍼라제 및 에피머라제를 삽입하거나 또는 삭제시킴으로써 수득되는 그의 엔지니어링된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 N-글리칸을 포함한다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 단백질은 2 가지 이상의 상이한 N-글리칸을 포함한다.

예를 들어, 동일한 단백질 상의 상이한 N-글리칸은 얼리 또는 레이트 프로모터를 사용하거나, 또는 개별의 특정 글리코실트랜스퍼라제의 프로모터 활성을 개시, 침묵, 향상 및/또는 감소시키는 인자를 도입하여, 특정 글리코실트랜스퍼라제의 발현의 시점을 조절함으로써 제조될 수 있다. 적합한 프로모터 및 그의 활성을 지배하는 인자는 당업자가 일상적으로 사용가능하고, 추가로 논의되지 않을 것이다.

본 발명의 재조합 단백질의 기원에 대해서는 제한이 없다. 바람직하게는, 상기 단백질은 포유류, 박테리아, 바이러스, 곰팡이 또는 식물 단백질로부터 유도된다. 더욱 바람직하게는, 상기 단백질은 포유류 단백질, 가장 바람직하게는 인간 단백질로부터 유도된다. 본 발명에 따른 항원성 재조합 단백질을 제조하기 위해서는, 바람직하게는 백신의 활성 성분으로서 사용되기 위해서는, 재조합 단백질을 박테리아, 바이러스 또는 곰팡이 단백질로부터 유도하는 것이 바람직하다.

추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 단백질 및/또는 N-글리칸(들) 이 치료적으로 및/또는 예방적으로 활성인 재조합 단백질을 제공한다. 하나 이상의 최적화되고 N-글리코실화된 공통염기서열의 도입은 단백질에서 치료적 및/또는 예방적 활성을 변경 또는 심지어 도입시킬 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 상기는 면역원성적으로 활성인 단백질 및/또는 N-글리칸(들) 이다. 이러한 경우, 도입된 N-글리코실화(들) 는 단백질의 생물학적 활성에 변경 효과를 가지고/거나 또는 새로운 항원 부위를 도입할 수 있고/거나, 또는 단백질을 마스크해서 분해 단계를 피하고/거나 또는 반감기를 증가시킬 수 있다.

본 발명의 재조합 단백질은 숙주 세포, 바람직하게는 박테리아, 더욱 바람직하게는 그램-음성 박테리아의 외부 막 및/또는 표면에 효율적으로 표적화될 수 있다. 표면 제시 및/또는 외부 막 위치화를 돕기 위해, 본 발명의 재조합 단백질은 추가로 상기 재조합 단백질을 박테리아, 바람직하게는 그램-음성 박테리아의 외부 막 및/또는 세포 표면에 표적화시킬 수 있는 하나 이상의 폴리펩티드 서열을 포함하는 것이 바람직하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 단백질은 상기 표적화 폴리펩티드 서열이 II 형 신호 펩티드 (Paetzel, M., Karla, A., Strynadka, N.C., and Dalbey, R. E. 2002. Signal peptidases. Chem Rev 102: 4549-4580) 또는 막 단백질 ([Wemerus, H., and Stahl, S. 2004. Biotechnological applications for surface-engineered bacteria. Biotechnol Appl Biochem 40: 209-228.[mk2]] 에서 리뷰) 로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 C. 제주니의 OmpH1, C. 제주니의 JlpA 의 신호 펩티드 또는 전장 단백질, 이. 콜라이로부터의 외부 막 단백질, 바람직하게는 OmpS, OmpC, OmpA, OprF, PhoE, LamB, Lpp'OmpA (표면 제시 기술을 위한 융합 단백질, [Francisco, JA1 Earhart, C. F., and Georgiou, G. 1992. Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 2713- 2717] 참조), 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) 로부터의 Inp 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 재조합 단백질을 암호화하는 핵산에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 핵산은 mRNA, DNA 또는 PNA 이고, 더욱 바람직하게는 mRNA 또는 DNA, 가장 바람직하게는 DNA 이다. 핵산은 상기 단백질을 암호화하는 서열, 및 또한 프로모터, 인핸서, 정지 코돈, 개시 코돈 및 조절 서열을 통해 재조합 단백질의 발현을 조절하는데 필요한 유전자와 같은 조절 서열과 같은 기타 서열 등을 포함할 수 있다. 용어 "본 발명에 따른 재조합 단백질을 암호화하는 핵산" 은 상기 코딩 서열, 및 핵산이 캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니의 기능성 pgl 오페론을 함유하는 숙주 세포에서 본 발명의 재조합 단백질을 생성할 수 있는 한, 서열 정보에 상관없이 임의의 추가의 핵산 서열을 임의로 포함하는 핵산을 말한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명은 프로모터, 바람직하게는 공지된 유도성 및 경쟁성 원핵 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터, 더욱 바람직하게는 테트라사이클린 프로모터, 아라비노스 프로모터, 살리실레이트 프로모터, lac-, trc-, 및 tac- 프로모터에 조작적으로 연결된, 단리 및 정제된 핵산을 제공한다 (Baneyx, F. (1999). Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 10, 411-421 ; Billman-Jacobe, H. (1996). Expression in bacteria other than Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol 7, 500-504). 상기 조작적으로 연결된 핵산은 예를 들어, 백신화에 사용될 수 있다.

더욱이, 본 발명의 추가의 측면은 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포의 유형은, 숙주 세포가 C. 제주니로부터의 기능성 pgl 오페론 및 본 발명의 재조합 표적 단백질(들) 을 코딩하는 하나 이상의 핵산을 갖고 있는 한 제한되지 않는다. 바람직한 숙주 세포는 원핵 숙주 세포, 더욱 바람직하게는 박테리아, 가장 바람직하게는 에스케리키아 종(Escherichia ssp.), 캄필로박터 종, 살모넬라 종(Salmonella ssp.), 시겔라 종(Shigella ssp.), 헬리코박터 종(Helicobacter ssp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas ssp.), 바실러스 종(Bacillus ssp.), 바람직하게는 에스케리키아아 콜라이(Escherichia coli), 더욱 바람직하게는 이. 콜라이 계통 Top10, W3110, CLM24, BL21 , SCM6 및 SCM7(Feldman 등, (2005). Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 3016-3021 ; Alaimo, C, Catrein, I., Morf, L., Marolda, C. L., Callewaert, N., Valvano, M. A., Feldman, M. F., Aebi, M. (2006). Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO Journal 25, 967-976) 및 S. 엔테리카(S. enterica) 계통 SL3261(살모넬라 엔테리카 sv. 티피뮤리움(Salmonella enterica sv . Typhimurium) LT2(델타) aroA, [Hoiseth, S. K., and Stocker, B.A. 1981, Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature 291 :238-239] 참조), SL3749(살모넬라 엔테리카 sv. 티피뮤리움 LT2 waaL, [Kaniuk 등, J. Biol. Chem. 279: 36470-36480] 참조) 및 SL3261 ΔwaaL로 이루어진 군으로부터 선택되는 것들이다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 숙주 세포는, 본 발명에 따른 재조합 단백질의 외부 막 및/또는 표면 제시를 표적으로 하기에 유용한 것이고, 바람직하게는 상기 숙주 세포는 하기를 갖는 재조합 그램-음성 박테리아이다 :

i) 하기를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전형

a) 지질 운반체 상에서의 올리고사카라이드의 조립을 위한 하나 이상의 천연 또는재조합 특정 글리코실트랜스퍼라제,

b) 캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니로부터의 하나 이상의 천연 또는 재조합 원핵 올리고사카릴 트랜스퍼라제(OTase),

c) 본 발명에 따른 하나 이상의 재조합 단백질, 바람직하게는 표적화 폴리펩티드를 추가로 포함하는 단백질, 및

ii) 그램-음성 박테리아 내 및/또는 외부 막에 위치하는 본 발명에 따른 재조합 N-글리코실화 단백질을 포함하는 표현형.

상기 구현예의 숙주 세포는 바람직하게는 에스케리키아 종(Escherichia ssp.), 캄필로박터 종(Campylobacter ssp.), 시겔라 종(Shigella ssp.), 헬리코박터 종(Helicobacter ssp.) 및 슈도모나스 종(Pseudomonas ssp.), 살모넬라 종(Salmonella ssp.), 바람직하게는 이. 콜라이, 더욱 바람직하게는 이. 콜라이 계통 Top10, W3110, CLM24, BL21 , SCM6 및 SCM7, 및 S. 엔테리카 계통 SL3261, SL3749 및 SL3261ΔwaaL ([Hoiseth, S. K., and Stocker, B.A. 1981. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature 291 : 238-239] 참조), SL3749 (Kaniuk, N.A., Vinogradov, E., and Whitfield, C. 2004. Investigation of the structural requirements in the lipopolysaccharide core acceptor for ligation of O antigens in the genus Salmonella: WaaL "ligase" is not the sole determinant of acceptor specificity. J Biol Chem 279: 36470-36480)로 이루어진 군으로부터 선택된다. _[ _mk4 _]

본 발명의 바람직한 단백질이 그 자체로 및/또는 도입된 N-글리코실화 부위로 인해 치료적 또는 예방적 활성을 가질 수 있기 때문에, 상기 단백질은 약제의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명을 수행하기 위한 단백질의 유형은 제한적이지 않고, 따라서, 본 발명의 단백질은 EPO, IFN-알파, TNF알파, IgG, IgM, IgA, 인터루킨, 사이토카인, HisJ (CjO734c), AcrA (CjO367c), OmpH1 (CjO982c), 디프테리아 독소(CRM 197), 콜레라 독소, P. 애루기노사(P. aeruginosa) 외단백질과 같은 C. 제주니 단백질과 같고, 거기에 최적화된 N-글리코실화 공통염기서열이 도입된 백신용 바이러스 및 박테리아성 단백질이 약제 제조용으로 유용하다 (Wyszynska, A., Raczko, A., Lis, M., and Jagusztyn-Krynicka, E. K. (2004). Oral immunization of chickens with avirulent Salmonella vaccine strain carrying C. jejuni 72Dz/92 cjaA gene elicits specific humoral immune response associated with protection against challenge with wild-type Campylobacter. Vaccine 22, 1379-1389).

또한, 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터는 또한 약제의 제조에 유용하고, 바람직하게는 유전자 치료에서의 용도에 유용하다.

더욱이, 본 발명에 따른 숙주 세포, 바람직하게는 박테리아, 바람직하게는 그램-음성 박테리아, 더욱 바람직하게는 상기-열거된 그램-음성 박테리아 중 하나의 내부 및/또는 외부 막에 위치하는 본 발명의 N-글리코실화 재조합 단백질을 포함하는 표현형을 가진 숙주 세포가 특히 약제의 제조에 유용하다.

더욱 바람직하게는, 본 발명의 단백질은 그것을 필요로 하는 개체에 치료 및/또는 예방 백신을 하기 위한 약제의 제조에 사용된다.

더욱 바람직한 구현예에서, 본 발명은 바람직하게는 유전자 치료에 의해, 그것을 필요로 하는 개체의 치료 및/또는 예방적 백신화를 위한 약제의 제조를 위해 본 발명에 따른 핵산 및/또는 벡터를 사용하는 것에 관한 것이다.

상기 N-글리코실화 재조합 단백질을 나타내는 본 발명의 숙주 세포는 특히 백신의 제조에 유용한데, 그 이유는 제시된 N-글리코실화 단백질이 숙주 세포의 표면 상에 풍부하게 존재하고, 면역세포, 특히 그의 친수성 N-글리칸에 의해 처리될 수 있기 때문이고, 또한, 숙주 세포가, 살아 있다면, 어느 정도 복제시킬 수 있고 그의 백신 효과를 증폭시킬 수 있는 보조제의 추가 효과를 가지고 있기 때문이다.

바람직하게는, 본 발명의 의학적 측면을 실행하기 위한 숙주 세포는 약화되거나 또는 살해된 숙주 세포이다.

약제, 바람직하게는 백신의 제조를 위해 본 발명의 숙주 세포를 사용하는 것의 또다른 이점은 상기 숙주 세포가 세포성 성분으로 인해 IgA 항체를 유도한다는 점이다.

바람직하게는, 상기 숙주 세포는 동물, 바람직하게는 포유류, 쥣과, 양, 말, 개, 소 또는 인간에서 IgA 항체를 유도하기 위해 본 발명에 따라 사용된다.

백신이 필요한 상기 개체는 조류, 포유류 또는 어류, 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 소, 양, 말, 개, 고양이 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류, 가장 바람직하게는 인간인 것이 바람직하다. 가금류도 또한 바람직하다.

본 발명의 추가의 측면은 본 발명에 따른 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 핵산, 하나 이상의 벡터 및/또는 하나 이상의 숙주 세포를 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 단백질 또는 숙주 세포, 바람직하게는 약화되거나 또는 살해된 숙주 세포를 포함하는 약제의 제조, 및 유전자 치료를 위한 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 약제의 제조는 당업계에 잘 알려져 있다. 최종 약학적 조성물의 제조 도식 및 그의 투여 형태 및 상세사항은 사용되는 단백질, 숙주 세포, 핵산 및/또는 벡터에 따라 다를 것이다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 보조제를 포함한다.

본 발명은 하기 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다 :

(i) 본 발명에 따른 재조합 단백질, 숙주 세포, 핵산 및/또는 재조합 단백질인/을 암호화하는/을 발현하는 재조합 벡터, 및

(ii) 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 및/또는 보조제.

적합한 부형제, 희석제 및/또는 보조제는 당업계에 잘 알려져 있다. 부형제 또는 희석제는 활성 성분을 위한 비히클 또는 매질로서 작용할 수 있는 고체, 반-고체 또는 액체 물질일 수 있다. 조성물 제조 분야의 당업자는 선택되는 제품의 특징, 치료되는 질환 또는 상태, 질환 또는 상태의 단계, 및 기타 관련 조건에 따라 적절한 투여 형태 및 방식을 쉽게 선택할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (1990)). 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제의 분율 및 성질은 선택되는 약학적 활성 화합물의 용해도 및 화학적 성질, 선택되는 투여 경로, 및 표준 약학적 실행기준에 의해 결정된다. 약학적 제제는 경구, 비경구 또는 국소 용도를 위해 채택될 수 있고, 정제, 캡슐, 좌제, 용액, 현탁액 등의 형태로 환자에 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 활성 화합물은 그 자체가 효과적인 한편, 안정성, 결정화 편리성, 증가된 용해도 등을 위해 산 부가염 또는 염기 부가염과 같은 그의 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 제형 및 투여될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면은 하기 단계를 포함하는, N-연결 글리코실화 단백질의 제조 방법에 관한 것이다 :

a) 하기를 암호화하는 핵산을 포함하는, 재조합 개체, 바람직하게는 원핵 개체를 제공함 :

i) 캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니로부터의 기능성 pgl 오페론, 및

ii) 하기 N-글리코실화 최적화된 아미노산 공통염기서열(들) 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 재조합 표적 단백질 ;

D/E-X-N-Z-S/T,

(상기 식에서, X 및 Z 은 프롤린을 제외한 임의의 천연 아미노산일 수 있고, 상기 N-글리코실화 최적화된 아미노산 공통염기서열(들) 중 하나 이상이 도입됨), 및

b) 표적 단백질(들) 의 제조 및 N-글리코실화에 적합한 방식으로 재조합 개체를 배양함.

바람직하게는, 표적 단백질은 본 발명에 따른 상기 기술된 재조합 단백질 중 하나이다.

본 발명의 바람직한 방법에서, 캄필로박터 종, 바람직하게는 C. 제주니로부터의 기능성 pgl 오페론은 OTase에 의해 표적 단백질에 수송되는 지질 운반체 상의 올리고사카라이드의 조립을 위해, 하기를 암호화하는 핵산을 포함한다 :

i) 캄필로박터 종, 바람직하게는 C. 제주니로부터의 재조합 OTase,

ii) 캄필로박터 종, 바람직하게는 C. 제주니로부터의 재조합 및/또는 천연 특정 글리코실트랜스퍼라제, 및/또는

iii) 캄필로박터 종 이외의 종으로부터의 재조합 및/또는 천연 특정 글리코실트랜스퍼라제.

더욱이, 바람직한 구현예에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 본 발명에 따른 숙주 세포의 제조 방법에 관한 것이다 :

i) 그램-음성 박테리아를 제공함,

ii) 하기를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 상기 박테리아에 도입함 :

a) 지질 운반체 상에서의 올리고사카라이드의 조립을 위한 하나 이상의 재조합 특정 글리코실트랜스퍼라제, 및/또는

b) 캄필로박터 종, 바람직하게는 C. 제주니로부터의 하나 이상의 재조합 올리고사카릴 트랜스퍼라제 (OTase), 및/또는

c) 하기 N-글리코실화 최적화된 아미노산 공통염기서열(들) 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 재조합 단백질 ;

D/E-X-N-Z-S/T

(여기서, X 및 Z 은 프롤린을 제외한 임의의 천연 아미노산일 수 있고, 상기 N-글리코실화 최적화된 아미노산 공통염기서열(들) 중 하나 이상이 도입됨), 및

iii) c) 의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 하나 이상의 재조합 N-글리코실화 단백질이 그램-음성 박테리아 내부 및/또는 외부 막에 위치할 때까지 상기 박테리아를 배양함.

상기 바람직한 방법을 수행하기 위해서, 재조합 원핵 개체 또는 숙주 세포는 바람직하게는 에스케리키아 종, 캄필로박터 종, 살모넬라 종, 시겔라 종, 헬리코박터 종, 슈도모나스 종, 바실러스 종, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이, 바람직하게는 이. 콜라이 계통 Top10, W3110, CLM24, BL21, SCM6 및 SCM7, 및 S. 엔테리카 계통 SL3261 , SL3749 및 SL3261ΔwaaL로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에 따른 재조합 단백질의 제조, 단리 및/또는 정제의 또다른 바람직한 방법은 하기 단계를 포함한다 :

a) 청구항 제 15 항 또는 제 16 항에 따라 숙주 세포를 배양함,

b) 상기 재조합 그램-음성 박테리아의 외부 막을 제거함, 및

c) 상기 재조합 단백질을 회수함.

세포, 바람직하게는 원핵 세포, 더욱 바람직하게는 그램-음성 박테리아 세포의 외부 막을 제거하는 실례의 방법은 적합한 효소 처리 방법, 등장성 쇼크 세제 용해화 및 프렌치 프레스 방법이다.

가장 바람직하게는, 본 발명은, 캄필로박터 종., 바람직하게는 C. 제주니 이외의 종으로부터의 재조합 또는 천연 특정 글리코실트랜스퍼라제가 상기 숙주 세포에서 기능적으로 발현될 수 있는 박테리아, 고세균, 및/또는 진핵생물로부터 기원되는 에피머라제 및 글리코실트랜스퍼라제의 군으로부터 선택되는 방법에 관한 것이다.

도 1 은 구축물 A 내지 C 로부터 유도되는 립 (Lip) 단백질의 N-글리코실화를 예시한다(실시예 1 참조). C. 제주니로부터의 기능성 pgl 오페론을 운반하는 이. 콜라이 Top 10 세포(상기 [Wacker 등, 2002]) 및 구축물 A(레인 2), B(레인 1), 및 C(레인 3) 또는 돌연변이 D121A 가 있는 구축물 C 의 돌연변이체(레인 4) 를 암호화하는 플라스미드. 단백질을 주변 세포질 추출물로부터 발현 및 정제하였다. 정제된 단백질 분획의 SDS-PAGE 및 쿠마시 브릴리언트 블루 염색을 보여준다.
도 2 는 플라스미드로부터 상기 단백질을 발현하는 CLM24 세포(Feldman 등, (2005). Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 102, 3016-3021) 또는 Top10 세포 (패널 E 레인 1 ~ 6) 또는 SCM7 세포 (Alaimo, C, Catrein, I., Morf, L., Marolda, C. L., Callewaert, N., Valvano, M. A., Feldman, M. F., Aebi, M. (2006) Two distinct but interchangeable mechanisms for flipping of lipid-linked oligosaccharides. EMBO Journal 25, 967-976) (패널 E, 레인 7, 8) 내 C. 제주니 pgl 오페론 상기 [Wacker 등, 2002]) 에 의한 서열 특이적 N-글리코실화에 대해 분석한 상이한 단백질의 N-글리코실화 분석을 보여준다. 니트로셀룰로스막에 옮겨져서 특정 항혈청을 사용해 가시화된 SDS-PAGE 분리된 주변 세포질 추출물을 보여준다. 패널 A ~ D 에서, 상부 패널은 항 AcrA 항혈청으로 프로브된 면역블롯을 보여주고(상기 [Wacker 등, 2002] ; Nita-Lazar, M., Wacker, M., Schegg, B., Amber, S., and Aebi, M. (2005). The N-X- S/T consensus sequence is required but not sufficient for bacterial N-linked protein glycosylation. Glycobiology 15, 361 - 367), 반면, 하부 패널은 R12 항혈청으로 프로브된 면역블롯을 보여준다 (상기 [Wacker 등, 2002]). + 및 - 는 상기 세포 내에서의 기능성 또는 돌연변이 pgl 오페론의 존재를 가리킨다. 패널 A 는 pelB 신호 서열 및 헥사 히스택이 있는 용해성 야생형 AcrA (레인 1, 2), AcrA-N273Q (레인 3, 4), 및 AcrA-D121A (레인 5) 의 샘플을 함유함. 패널 B : AcrA (레인 1, 2), AcrA-T145D (레인 3), AcrA-N123Q-N273Q-T145D (레인 4, 5). 패널 C : AcrA-F115D-T145D (레인 1, 2), AcrA-N123Q-N273Q-N272D (레인 3, 4). 패널 D : AcrA-N273Q (레인 1, 2), AcrA-N273Q-F122P (레인 3, 4). 패널 E : CtxB (레인 1, 2), CtxB-W88D (레인 3, 4), CtxB-Q56/DSNIT (레인 5, 6), 및 CtxB-W88D-Q56/DSNIT.
도 3 은 OmpH1 내 복합적 글리코실화 위치의 엔지니어링을 보여준다. △waaL 계통 SCM6 을 플라스미드 pACYCpgl (전체 pgl 좌위를 암호화함) 및 야생형 OmpH1 (레인 1), OmpH1^N139S-myc (레인 2), 0mpH1 ^KGN ^→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT -myQ (레인 3), QmpH1 ^RGD ^→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT -myQ (레인 4), QmpH1 ^KGN ^→ ^NIT ^, ^RGD ^→ ^NIT -myQ (레인 5), OmpH1 ^KGN ^→NIT, ^RGD ^→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT-myc (레인 6), 또는 QmpH1 ^RGD ^→ ^NIT ^, ^V83T-myc (레인 7) 를 발현하는 플라스미드로 공동-형질전환시켰다. 세포를 호기성으로 성장시키고, 분석 전에 3 시간 동안 0.5% 아라비노스로 유도하였다. 재료 및 방법 부분에서 기술된 바와 같이 배양물의 광학 밀도를 균등하게 한 후, 전체 세포 파쇄물을 TCA 침전시켰다. 단백질을 15% SDS-PAGE 에 의해 분리하고, PVDF 막에 옮겼다. 첫번째 패널은 항-myc tag 항체로 프로브된 전체 세포 파쇄물의 면역블로팅이다. 하부 패널은 글리칸-특이적 항혈청으로 프로브된 전체 세포 파쇄물의 면역블로팅이다. 비글리코실화 및 글리코실화 OmpH1 의 위치를 우측에 지시하였다.
도 4 는 다양한 OmpH1 변이체를 발현하는 세포의 형광 현미경을 보여준다. 야생형 OmpH1 및 그의 변이체에 대한 발현 플라스미드를 함유하는 이. 콜라이 계통 CLM24 또는 SCM6의 배양물을 0.25/ml의 OD₆₀₀으로 균등화시켰다. 세포를 pH 7.4의 인산염 완충액 (PBS) 으로 2회 세정하고, 세포 현탁액 100 μl를 젤라틴화 유리 슬라이드에 적가하고, 습도조절된 챔버 내, 실온(RT)에서 30 분 동안 인큐베이션시켰다. 전체 세포 면역형광 표지에서의 모든 후속하는 단계를 습도조절된 챔버 내, 실온에서 수행하였다. 비결합 세포를 제거하고, 나머지를 PBS 함유 4% 파라포름알데하이드로 RT에서 30분 동안 고정시켰다. 중요하게는, 파라포름알데하이드는 세포에 침투하지 않고, 막에 의한 구분이 그대로 유지되게 한다. 고정된 세포를 PBS 로 2 회 세정하고, PBS 중 5% BSA 를 함유하는 블라킹 완충제에 재현탁시켰다. 블라킹 후, 세포를 항-myc 모노클로날 마우스 IgG(1 : 50, Calbiochem) 및/또는 항-글리칸 항혈청(1 : 4000) 과 함께 5% BSA 함유 PBS 100 μl 내에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 세포를 PBS 100 μl 로 각각 5 분씩 3 회 세정하고, FITC 공액 2 차 항-토끼 항체(1 : 250, Jackson lmmunoresearch Laboratories) 및/또는 Cy3 공액 항-마우스 항체(1 : 250, Jackson lmmunoresearch Laboratories) 와 함께 5% BSA 함유 PBS 100 μl 내에서 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 필요하다면, 4,6-디아미노-2-페닐인돌(DAPI)(Sigma)(0.5 μg/ml)을 2 차 항체 인큐베이션시, 첨가하여, 박테리아 DNA 를 염색하였다. 2 차 항체를 세포 PBS 로부터 헹구고, 배지를 마운팅하는 벡터쉴드(Vector Laboratories) 를 사용해 커버슬립을 슬라이드 상에서 마운팅하고, 손톱 광택제로 밀봉하였다. Axioplan2 현미경(Carl Zeiss) 을 사용하여 형광 현미경을 작동시켰다. Adobe Photoshop, 버전 CS2를 사용하여 이미지를 조합하였다. OmpH1 (패널 A), OmpH1 ^N139S(패널 B), OmpH1^C20S(패널 C), OmpH1 ^KGN→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT(패널 D), OmpH1 ^RGD ^→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT (패널 E), OmpH1 ^KGN ^→ ^NIT ^, ^RGD ^→ ^NIT(패널 F), OmpH1^V83T ^, ^KGN ^→ ^NIT(패널 G), 및 OmpH1 ^KGN ^→ ^NIT ^, ^RGD ^→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT(패널 H) 발현 SCM6 세포. 첫 번째 칼럼은 흑색 배경 상의 회색톤으로 나타낸 칼럼 2, 3, 및 4의 그림의 통합이다. 컬럼 2: DAPI 염색에서, 회색톤 중의 청색 형광, 칼럼 3: 글리칸 특이적 형광에서, 녹색 형광, 칼럼 4: 항-myc 염색에서, 적색 형광.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명하는 것이고, 어떤 식으로든 발명의 범주를 제한하려는 것은 아니다.
[실시예]
N- 글리코실화를 최적화시키기 위한 모델 단백질로서의 AcrA 의 선별
N-글리코실화를 위한 수용체 단백질 요건을 최적화시키기 위해, C. 제주니 당단백질 AcrA(CjO367c) 상에서 상세한 연구를 수행하였다. AcrA는 350개의 아미노산 잔기가 있는 주변 세포질 지단백질이다. 지질에 달라붙어 있지 않고 주변 세포질에 분비되는 것이 글리코실화에 대한 필요 조건이라고 나타나 있다(상기 [Nita-Lazar 등, 2005]). 외부수송을 위한 신호는 이.콜라이에서 발현되는 경우, 본래의 AcrA 신호 서열이거나 또는 이종 PelB 신호일 수 있다. 5개의 잠재적인 N-연결 글리코실화 세큐온(N117, N123, N147, N273, N274) 중에서, 동일한 2 개의 세큐온이 C. 제주니 및 이. 콜라이에서 사용된다(N123 및 N273(상기 [Nita-Lazar 등, 2005]). AcrA를 모델로서 선택하였는데, 그 이유는 상세한 구조 정보를 사용할 수 있는 유용한 C. 제주니의 유일한 주변 세포질 N-글리코실화이기 때문이다. 최근, AcrA 동종체인 그램-음성 박테리아 P. 애루기노사로부터의 MexA 단백질의 결정 구조가 공개되었다(Higgins 등, (2004). Structure of the periplasmic component of a bacterial drug efflux pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 101 9994-9999). 두 단백질 모두 소위 주변 세포질 배출 펌프 단백질의 구성원이다 (PEP,(Johnson, J. M. and Church, G. M. (1999). Alignment and structure prediction of divergent protein families: periplasmic and outer membrane protein of bacterial efflux pumps. J. MoI. Biol. 287, 695-715)). 신장된 분자는 3 개의 선형 배열된 하위도메인을 함유하는데 :α-나선, 역평행 꼬인-코일, 이는 리포일 도메인에 의해 염기에서 함께 고정되고, 6-가닥 β-배럴 도메인이 뒤따른다. N-말단에 있는 23 ~ 28 개의 잔기 및 C-말단에 있는 95 ~ 101 개의 잔기는 결정 내에서 구조화되어 있지 않다. MexA 및 AcrA 단백질 서열은 29.3% 가 동일하고, 50% 가 유사하다. 따라서, 2 개의 단백질은 유사하게 유사한 전체 접힘을 나타낸다.
실시예 1 글리코실화를 유도하는 1 차 펩티드 서열에 대한 설명
P. 애루기노사의 MexA 및 따라서 또한 C. 제주니의 AcrA 에서의 리포일 도메인이 이.콜라이에서 개별적으로 발현될 수 있는 콤팩트한 단백질을 형성한다고 알려져 있다([Berg, A., and de Kok, A. (1997). 2-Oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes. The central role of the lipoyl domain. Biol. Chem. 378, 617-634] 에 의해 리뷰). 수용체 펩티드 서열이 이. 콜라이 내 pgl 머시너리에 의한 N-글리코실화에 필요하다는 것을 체크하기 위해, AcrA 의 리포일 도메인을 취하였다. 상기 도메인을, 상이한 길이의 펩티드를 주변 세포질에 수송하고, 생체 내에서 pgl 머시너리에 그것들을 제시하는 분자 골격 (scaffold) 으로서 사용하였다.
따라서, 리포일 도메인(Lip)을 암호화하는 플라스미드를 구축하고, OmpA 의 신호 서열에 N-말단, 및 헥사 히스택에 C-말단 융합시켰다 (Choi, J. H., and Lee, S. Y. (2004). Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol 64, 625-635). 클로닝시켜, 아라비노스 프로모터의 조절 하에 유전자 발현시켰다. 립 도메인 경계를 위해, MexA 내 리포일 도메인 부분의 도메인 경계로서 동일한 위치에서 나타난 아미노산 위치를 선택하였다. 서열의 N-글리칸 스트레치(stretch)를 허용하는 펩티드의 능력에 대해 상이한 펩티드를 시험하기 위해, 립 도메인의 2개의 해머헤드-형 부분에 삽입하였다. 스트레치는 C. 제주니 AcrA의 N-글리코실화 부위 N 123 을 포함하는 서열로 이루어졌다. 생성 개방형 해독 프레임은 OmpA 신호 서열을 암호화하는 서열, AcrA의 N-말단 해머헤드-형 부분(D60-D95, 아미노산의 넘버링은 성숙 AcrA 폴리펩티드 서열 넘버링을 말함), AcrA의 본래의 N123 글리코실화 부위를 함유하는 상이한 스트레치(하기 참조), AcrA-Lip의 C-말단 해머헤드-형 부분 (L167-D210) 및 C-말단 히스-택으로 이루어졌다.
표준 분자 생물학 기술에 의해 플라스미드를 구축하였다. 상이한 길이의 AcrA 의 본래의 N123 글리코실화 부위를 함유하는 3 개의 스트레치를 립의 절반 2 개 사이에 삽입하여, 3 개의 상이한 ORF 를 생성하였다:
구축물 A 는 하기의 단백질 서열을 생성하는 A118-S130 을 함유함:

구축물 B 는 하기의 단백질 서열을 생성하는 F122-E138 을 함유함:

구축물 C 는 하기의 단백질 서열을 생성하는 D121-A127 을 함유함:

서열의 밑줄은 OmpA 신호 펩티드를 가리키고, 단일로 밑줄쳐진 잔기를 클로닝 리즌에 도입하거나 또는 단백질이 분해에 저항성이게 하였다. 볼드 (bold): AcrA 의 N123 에 상응하는 글리코실화 부위. 이탤릭 (italic): 헥사-히스택. 상응하는 유전자를 플라스미드 pEC415 의 골격 내에서 아라비노스 프로모터의 조절 하에 발현시켰다 (Schulz, H., Hennecke, H., and Thony-Meyer, L. (1998). Prototype of a heme chaperone essential for cytochrome c maturation. Science 281, 1197-1200).
3 개의 스트레치가 립 단백질의 글리코실화를 유도하는지 체크하기 위해, 단백질 발현 실험을 수행하였다. pACYCpgl 또는 pACYCpglmut(상기 [Wacker 등, 2002]) 을 운반하는 이. 콜라이 Top10 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 구축물 A, B 또는 C 를 암호화하는 플라스미드를 37℃에서 0.5의 OD 이하에서 암피실린 및 클로람페니콜을 함유하는 LB 배지 내에서 키웠다. 1/1000 부피를 유도하기 위해, 20% 아라비노스(w/v) 용액을 첨가하고, 세포를 추가의 2 시간 동안 배양하였다. 다음, 세포를 원심분리에 의해 수합하고, 20 mM Tris/HCl, pH 8.5, 20% 수크로스(w/v), 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 및 1 g/l(w/v) 리소자임 중에서 재현탁시키고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 스페로블라스트를 펠렛화시킨 후 주변 세포질 추출물을 수득하고, 10x 완충제 A(3 M NaCl, 0.5 M Tris/HCI, pH 8.0 및 0.1 M 이미다졸) 1/9 부피(v/v)와 희석시키고, MgSO₄ 를 첨가하여 2.5 mM 이 되게 하였다. 완충제 A 내 Amersham Pharmacia Biotech(Uppsala, Sweden)의 1 ml Ni-Sepharose 칼럼 상에서 Ni-친화성 정제를 수행하였다. 0.25 M 이미다졸을 함유하는 완충제 A 내에서 단백질을 용출시켰다.
도 1 은 Ni-정제된 주변 세포질 추출물로부터의 피크 용출 분획의 쿠마시 브릴리언트 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 보여준다. 발현 분석은, 구축물 B 가 지배적인 단일 단백질 종을 생성함을 보여주었다(도 1 , 레인 1). 구축물 A 및 C 둘 다, 지배적인 단백질 외에도, 더 느린 전기영동 이동성을 가진 제 2 단백질 밴드를 생성한다(도 1, 레인 2 및 3). 더 무거운 단백질 종이 실제로 글리코실화되었다는 것은 MALDI-TOF/TOF 에 의해 증명되었다(제시되지 않음). 구축물 B에는 없으나 A 및 C 에는 존재하는 유일한 아미노산은 글리코실화 N123 에 N-말단으로 2 위치에 있는 아스파테이트 잔기인 D121이었다. 이는, D121이 OTase에 의한 글리코실화에 중요한 역할을 한다고 기술한다. D121이 글리코실화에 필수적이라는 것을 증명하기 위해, 구축물 C 에 있는 알라닌에 돌연변이를 시켰다. 발현 분석은 유일한 1 개의 단백질 밴드를 생성하여(도 1 , 레인 4), D121 이 글리코실화에 중요하다는 것을 보여준다. 더욱이, 인공 펩티드 디스플레이 단백질이 글리코실화될 수 있다는 사실은, 짧은 펩티드의 D/E-X-N-Y-S/T 유형이 C. 제주니-유래 N-글리코실화가 일어나게 하는 모든 정보를 함유한다는 것을 보여준다.
실시예 2 실시예 1 의 증명 : AcrA - D121A 가 N123 에서 글리코실화되지 않음.
펩티드 디스플레이 연구로부터의 발견을 확인하기 위해, 아스파테이트의 알라닌으로의 돌연변이를 AcrA 단백질의 전장 용해성 버전 내 위치 121(D121A, 즉, 글리코실화된 N123 앞 2개의 잔기 위치) 에 삽입하고, 이. 콜라이 내에서 부위 N123이 여전히 글리코실화될 수 있는지 테스트하였다. 이를 테스트하기 위해, AcrA-D121A 를 발현시키고, 그의 글리코실화 상태를 분석하였다. 분석을 위해, 엔지니어링된 AcrA 를 사용하였다. 주변 세포질으로의 분비를 위한 PelB 신호 서열 (상기 [Choi and Lee, 2004]) 및 정제를 위한 C-말단 헥사 히스택을 함유한다는 점에서, 본래의 C. 제주니 유전자와 상이하였다. 이러한 AcrA 변이체가 분비되고, 지질이 고정된, 본래의 단백질로서 신호 펩티드-절단 및 글리코실화된 것을 보여준다(상기 [Nita-Lazar 등, 2005]). 하기는 용해성 AcrA 단백질의 단백질 서열이다:

밑줄 친 잔기는 PelB 신호 펩티드이고, 이탤릭체는 헥사-히스택이고, 볼드체는 N123 및 N273 에 있는 2 개의 천연 글리코실화 부위이다. pEC415 플라스미드에서 상기 단백질에 대한 ORF 를 함유하는 플라스미드를 구축하여 (Schulz 등, 1998), pAcrAper 를 제조하였다.
AcrA의 글리코실화 상태 및 그의 돌연변이체를 테스트하는 어세이는 하기와 같았다(하기 참조) :
AcrA의 발현을 그의 활성 또는 비활성 형태의 플라스미드-유래 pgl 오페론(pACYCpgl 또는 pACYCpglmut(상기 [Wacker 등, 2002]) 참조) 및 AcrA 를 암호화하는 플라스미드(pAcrAper) 를 함유하는 기하급수적으로 성장하는 이. 콜라이 CLM24(상기 [Feldman 등, 2005]) 세포 내에서 0.02% 아라비노스를 사용해 유도하였다. 유도 4시간 후, 주변 세포질 추출물을 상기 기술된 바와 같이 제조하고, 항-AcrA 항혈청 또는 R12 항혈청을 사용해 SDS-PAGE, 전기이동 및 면역검출에 의해 분석하였다. 후자는 단백질을 함유하는 C. 제주니 N-글리칸에 특이적이다(상기 [Wacker 등, 2002]).
도 2A 의 첫번째 두 개의 레인은 기능성 pgl 오페론의 부재 및 존재 시의 AcrA 를 보여준다. 부재 시에는 밴드가 단지 하나만 나타나나, 기능성 pgl 오페론이 존재하는 경우에는 3 개의 밴드가 나타난다 (도 2A, 상부 패널). 이들 밴드는 비글리코실화 AcrA (레인 1) 및 비-, 모노- 및 디글리코실화 AcrA (레인 2) 에 상응한다. 레인 2 에서 2 개의 더 무거운 단백질이 글리코실화된 단백질이라는 것을 R12 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다 (레인 2, 하부 패널). 돌연변이체 AcrA-N273Q 을 동일한 방식으로 발현시킨 경우, 단지 모노글리코실화 AcrA 만이 기능성 글리코실화 pgl 오페론의 존재 시 검출되었다 (레인 3). 비글리코실화 AcrA 는 기능성 pgl 좌위의 부재 시에 검출되었다 (레인 4). 돌연변이체 AcrA-D121A 의 분석은 단지 2 개의 밴드를 생성하였고, 그 중 하나는 레인 3 의 AcrA-N273Q 로써 관찰된 바와 같이, 글리코실화 (레인 5) 되었다. 이는, D121 이 위치 123-125 에서의 효율적인 글리코실화에 필수적이라는 것을 의미한다.
실시예 3 인공 글리코실화 위치를 AcrA 에 도입함
아스파테이트 잔기의 도입이 글리코실화 부위를 생성할 수 있는지 테스트하기 위해, 용해성 AcrA 의 위치 N117 및 N147 에서 사용되지 않은 글리코실화 위치의 -2 위치 내 잔기가 아스파테이트로 교환된 AcrA 돌연변이체를 생성하였다 (F115D, T145D). 다음, 개질된 글리코실화 부위가 실시예 2 에서 기술된 바와 동일한 어세이에 의해 글리코실화될 수 있는지 테스트하였다. 2 개의 돌연변이체를, AcrA 의 용해성 버전의 야생형 서열, 또는 2 개의 사용되는 글리코실화 부위가 소실된 이중 돌연변이체 (N123Q 및 N273Q) 에 개별적으로 삽입하였다. 4 시간 동안 유도시킨 배양물의 주변 세포질 추출물을 제조하고, SDS PAGE 에 의해 분리하고, 웨스턴 블로팅에 의해 분석하였다 (도 2B). 대조군으로서, 야생형 글리코실화 및 비글리코실화 AcrA 의 샘플을 동일한 겔 상에서 진행시켰다 (레인 1 및 2). T145D 돌연변이는 본래 사용되지 않은 글리코실화 세큐온 N147-S149 의 -2 위치에 영향을 미쳤다. 항 AcrA 항혈청을 사용한 AcrA-T145D 웨스턴 블로팅의 발현 시, 4 개의 밴드가 생성되었고, 그 중 가장 높은 밴드는 레인 2 에 있는 이중 글리코실화 단백질보다 더 느린 전기영동 이동성을 나타낸다. (도 2B 의 레인 3). R12 블롯은, 4 번째 밴드가 삼중 글리코실화 AcrA 임을 확인시켜 주었다. 항 AcrA 에 대한 낮은 세기에도 불구하고, 가장 무거운 밴드가 글리코실화 특이적 R12 항혈청이 있는 가장 센 신호를 제공하였다. 동일한 돌연변이체 AcrA-T145D 가 본래의 N-글리코실화 서열 (AcrA-N123Q-N273Q-T145D) 의 부재 시에 발현되었고, 단지 모노글리코실화 AcrA 만이 기능성 pgl 오페론의 존재 시 검출되었고 (도 2B, 레인 4), 이는 기능성 pgl 오페론의 부재 시에 상실되었다 (레인 5). 이는, 레인 4 에 있는 더 무거운 밴드가 글리코실화되었음을 나타내었다. 따라서, T145D 돌연변이를 간단히 도입함으로써, 최적화된 글리코실화 부위를 생성하였다 (DFNNS).
-2 위치에 아스파테이트 잔기를 삽입함으로써 글리코실화 부위를 도입할 수 있다는 것을 추가로 확인하기 위해, 본래 사용되지 않은 위치 N117-S119 및 N274-T276 을 변화시켜, N-글리코실화를 최적화시켰다. 이를 위해, 추가의 돌연변이체를 제조하였다 (도 2C). 상기 기술된 시스템 내에서의 AcrA-F115D-T145D 의 발현은 항 AcrA 항혈청을 사용해 검출된 5 개의 단백질 종을 제공하였다 (레인 2). 이는 동일한 AcrA 분자 상에서 일어난 4 개의 글리코실레이트에 대한 지표이다. C. 제주니 N-글리칸-특이적 R12 항혈청을 사용해 검출했을 때, 5 개의 밴드로 된 사다리를 검출하였다. 가장 낮은 엷은 밴드는 비글리코실화 AcrA 인데, 그 이유는 비글리코실화 AcrA 가 또한 글리코실화의 부재 시 존재하기 때문이고 (레인 1), 가장 높은 것은 아마도 4 배 글리코실화된 AcrA 내 5 개의 항원성 결정소로 인해 강한 신호를 제공하였다. 따라서, 2 개의 도입된 위치 (N117 및 N147 에서) 및 2 개의 본래 사용되는 위치 (N 123 및 N273) 가 사용되고, pgl 머시너리에 의해 글리코실화되었다. pgl 오페론이 있고 없는 상태에서의 AcrA-N123Q-N273Q-N272D 의 발현은, 3 번째 인공 유도된 글리코실화 부위인 N274 (DNNST) 또한 pgl 오페론에 의해 인지된다는 것을 보여주었다 (도 2C, 레인 3 및 4).
상기 실험은, C. 제주니의 OTase 에 의해 인지된 박테리아 N-글리코실화 부위가 진핵 생물의 것과 동일한 공통염기서열로 부분적으로 이루어져 있다는 사실을 확인시켜 주었으나 (N-X-S/T, X≠P), 또한, -2 위치에 있는 아스파테이트가 효율성을 증가시키는데 필요함을 확인시켜 주었다. 더욱이, 그것들은, 그러한 최적화된 공통염기서열을 재조합적으로 도입함으로써, 원하는 부위에서 단백질을 글리코실화시킬 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4 최적화된 N- 글리코실화 서열 내 위치 - 1 의 증명
박테리아 글리코실화 부위 내 -1 위치가 진핵생물 내 +1 위치와 동일한 제한점을 나타내는지 테스트하기 위해 추가의 실험을 수행하였다 (Imperiali, B., and Shannon, K. L. (1991). Differences between Asn-Xaa-Thr-containing peptides: a comparison of solution conformation and substrate behaviour with olugosaccharyl-transferase. Biochemistry 30, 4374-4380 ; Rudd, P. M., and Dwek, R. A. (1997). Glycosylation : heterogeneity and the 3D structure of proteins. Crit. Rev. Biochem. MoI. Biol. 32, 1-100). +1 에 있는 프롤린 잔기는, 글리코실화가 억제되는 방식으로 펩티드를 제한하는 것으로 생각된다. 유사한 효과가 -1 위치에서도 관찰될 수 있는지 테스트하기 위해, 두번째 본래의 부위가 녹아웃된(AcrA-N273Q-F122P) 점돌연변이 내의 첫번째 본래 사용되는 부위의 위치에, 프롤린 잔기를 도입하였다. AcrA-N273Q 의 조절 발현은 기능성 pgl 오페론의 존재 시 모노글리코실화 단백질을 보여주었다 (도 2D, 레인 1 및 2). 그러나, AcrA-N273Q-F122P 는 글리코실화되지 않았다 (도 2D, 레인 3 및 4). 이는, -2 위치의 음성 하전된 잔기 및 아스파라긴 사이의 잔기를 구성하는 경우, 프롤린이 박테리아 N-글리코실화를 억제한다는 것을 보여준다.
C. 제주니 pgl 머시너리에 의해 글리코실화되는 것으로 알려진 모든 부위의 서열 배열은, -2 위치에 있는 D 또는 E 를 포함한다는 것을 가리킨다 (상기 [Nita-Lazar 등, 2005] ; 상기 [Wacker 등, 2002] ; [Young 등, (2002). Structure of the N-linked glycan present on multiple glycoprotein in the Gram-negative bacteria, Campylobacter jejuni. J. Biol. Chem. 277, 42530-42539]). 따라서, 박테리아에 대한 글리코실화 공통염기서열이 -2 위치에서 음성적으로 하전된 아미노산에 의해 최적화될 수 있어서, D/E - X - N - Z - S/T (여기서, X & Z ≠ P) 를 생성할 수 있음이 구축되었다.
실시예 5 비-C. 제주니 단백질의 N- 글리코실화
첫번째 서열 요건 (최적화된 공통염기서열) 이 박테리아 내에서의 N-글리코실화에 충분한지 확인하기 위해, 비-C. 제주니 단백질이 상기 전략을 적용하여 글리코실화될 수 있는지 테스트하였다. 콜레라 독소 B 하위단위 (CtxB) 를 글리코실화 표적으로서 사용하였다. 실시예 1 의 C 를 통해 구축물 A 와 동일하게, N-말단 상의 OmpA 신호 서열 및 C-말단의 헥사히스택의 암호화 서열을 함유하는 방식으로, 상응하는 유전자를 비브리오 콜레라로부터 증폭시켰다. 생성 DNA 를 클로닝시켜, 실시예 1 에서 사용되는 플라스미드 내에서 구축물 A 를 대체하였다. D 에 W88 을 점돌연변이시키거나, 또는 W88 다음에 D 를 삽입하여, 최적화된 글리코실화 부위 (DNNKT) 를 생성하였다. 신호 서열 및 히스-택을 함유하는 야생형 및 W88D CtxB 단백질을C. 제주니로부터의 기능성 pgl 좌위의 존재 및 부재 하에 이. 콜라이 Top 10 및 다른 세포 유형에서 발현시켰다. Top10 세포로부터의 주변 세포질 추출물을 SDS-PAGE, 전기이동 및 CtxB 항혈청을 사용한 연속 면역블로팅에 의해 분석하는 경우, 단지 CtxB W88D 만이 pgl 좌위 배경에서 더 높고, 글리코실화된 밴드를 생성하였다 (도 2E, 레인 3 및 4 비교). 공통염기서열 (DSNIT) 을 또한, CtxB 의 G54 또는 Q56 을 대체함으로써 CtxB 의 강글리오시드 GM1 결합 활성에 기여하는 것으로 보고된 루프 중 하나에서 삽입하였다 (후자를 CtxB-Q56/DSNIT 라고 함). 도 2E 의 레인 5 및 6 은, 엔지니어링된 단백질 (예는, Top10 세포에서 발현된 Q56 대신에 펩티드 서열 DSNIT 를 함유하는 구축물임) 이 더 낮은 이동성을 초래하고, 따라서, 상기 기술된 바와 동일한 방식으로 분석된 경우, 글리코실화-부족 세포가 아닌 글리코실화 경쟁 세포에서 글리코실화 밴드를 생성하였다. 또한, 2 개의 조작, 즉, Q56 대신에 DSNIT 로 대체하는 것뿐만 아니라 W88 뒤에 D 를 삽입하는 것을 함유하는 CtxB 가 SCM7 세포 내에서 이중-글리코실화되었음을 기술하였다 (Alaimo 등, EMBO Journal 25: 967-976 (2006)) (패널 E, 레인 7 및 8). 레인 7 에서 나타낸 이중-글리코실화 단백질 CtxB 는 표준 프로토콜에 따라 겔-내 트립신화처리 후에, Ni²⁺ 친화성-정제되고, ESI-MS/MS 에 의해 분석되었다. 예상된 글리코펩티드가 검출되어, 박테리아 N-글리코실화 (나타내지 않음) 를 위해 본 발명에 따라 최적화된 공통염기서열을 돌연변이 또는 삽입함으로써, 박테리아 N-글리코실화가 또한 비-C. 제주니 단백질에 관한 것일 수 있음을 확인시켜 주었다. 본 발명을 수행하기 위한 다른 적합한 실례의 이. 콜라이 계통의 예는 W3110, CLM24, BL21 (Stratagene, La JoIIa, CA, USA), SCM6 및 SCM7 이다.
본원에 사용되는 CtxB 단백질의 아미노산 서열을 하기에 나타낸다 (재조합 OmpA 신호 서열 ; 밑줄, 헥사-히스택 ; 이탤릭체, W88 ; 볼드체) :

실시예 6 인공 N- 글리코실화 부위의, C. 제주니 외부 막 단백질인 OmpH1 로의 도입
박테리아 내 N-글리코실화의 잠재적인 적용은 박테리아 숙주 세포의 표면 상의 글리칸의 디스플레이어서, 표현형을 유전형에 연결하여, 특이적인 유전적 돌연변이를 선별한다. N-글리칸이 외부 막 단백질 상에 존재할 수 있다는 것을 언급하기 위해, OmpH1 단백질을, 그것이 본 발명에 따른 복합적 최적화된 보존 위치를 함유하도록 엔지니어링하였다. 알려진 결정 구조로부터 추론되는 바와 같이 단백질의 루프 영역 내로 위치를 엔지니어링하였다 (Muller, A., Thomas, G. H., Horler, R., Brannigan, J.A., Blagova, E., Levdikov, V.M., Fogg, M.J., Wilson, K.S., and Wilkinson, A.J. 2005. An ATP-binding cassette-type cysteine transporter in Campylobacter jejuni inferred from the structure of an extracytoplasmic solute receptor protein. Mol. Microbiol. 57: 143-155). 이전의 실험은, 최상의 글리코실화 세큐온은 돌연변이 V83T, K59N-G60I-N61T, R190N-G191I-D192T 및 H263D-F264S-G265N-D266I-D267T 에 의해 생성된다는 것을 보여주었다. 표면 제시를 위해, 가장 N-글리칸-특이적인 샘플을 구축하기 위해, 상기 도입된 위치의 상이한 조합을 평가하는 것이 바람직하였다. 상기 조합은 플라스미드 구축물을 암호화하는 야생형 0mpH1 에서 생성되었고, AcrA 에 대해 기술된 바와 유사한 방식으로 테스트되었다. 도 3 은, 기존의 야생형 세큐온 외에도, 복합적 글리코실화 세큐온을 가지고 있는 다양한 0mpH1 변이체의 분석을 보여준다. 0mpH1 변이체는 3 가지 (레인 3, 4, 5 및 7) 및 4 가지 글리코실화 세큐온 (레인 6) 으로 생성되었다. 단지 1 가지의 글리코실화 세큐온만이 있는 야생형 OmpH1 및 글리코실화에 중요한 아스파라긴이 없는 돌연변이체가 또한 실험에 포함되었다. 본원에서 테스트된 모든 변이체는 높은 수준의 글리코실화 효율을 나타낼 뿐만 아니라, 모든 글리코실화 세큐온이 사용되었다. 결과는, 캄필로박터 N-글리칸 특이적 면역혈청으로 확인되었다 (도 3 하부 패널).
하기는, 이탤릭체로 된 myc 태그가 있는 캄필로박터 제주니 (계통 81-176) 의 OmpH1 단백질의 단백질 서열이다 :

단백질 내의 본래의 글리코실화 부위는 볼드체로 나타나 있고, 신호 서열은 밑줄이 쳐져 있다.
실시예 7 : 이. 콜라이 세포의 외부 막 상의 0 mpH1 상에의, C. 제주니의 N-글리칸의 표면 제시
복합적 글리코실화 0mpH1 변이체가 박테리아 세포 표면 상에 제시될 수 있는지에 대한 질문에 답하기 위해, 다양한 0mpH1 변이체를 발현하는 박테리아 CLM24 또는 SCM6 (SCM7 ΔwaaL 임) 세포 상에서 면역형광법을 수행하였다. 야생형 OmpH1 및 글리코실화에 중요한 아스파라긴이 결여된 돌연변이체를 본 실험에 포함하였다. 또한, C20S 돌연변이체를 구축하여, 단백질이 주변 세포질에 단백질이 유지되도록 하여, 본 실험에서 대조군으로서 작용하게 하였다. 파라포름알데하이드로 처리된 세포 상에서 면역염색을 수행하였다. 파라포름알데하이드는 세포 구조를 파괴하거나 구분화하지 않으면서, 세포를 고정시킨다. FITC 및 Cy3 에 공액된 상응하는 2 차 항체와 함께 c-Myc- 및 N-글리칸-특이적 면역혈청을 사용하여, 각각 박테리아 세포 표면 상에서 단백질 (적색 형광) 및 N-글리칸 (녹색) 을 검출하였다. 추가로, 4,6-디아미노-2-페닐인돌 (DAPI, 청색) 을 적용하여 염색하여, 박테리아 세포 및 세포 찌꺼기 사이에서 박테리아 DNA 가 명백하게 구분되게 하였다. 야생형 0mpH1 을 발현하는 세포가 염색되는 경우, 단백질 뿐만 아니라, N-글리칸에 특이적인 면역형광이 검출되었다 (도 4 A). 중요한 아스파라긴 N139S 가 결여된 돌연변이체가 항-Myc- 및 N-글리칸-특이적 면역혈청 둘 다로 염색되는 경우, 글리칸 특이적 신호를 제외하고 단지 단백질 신호만이 수득되었고 (패널 4 B), 이는 N-글리칸-특이적인 면역 혈청의 특이성을 지시한다. 단백질이 C20S 돌연변이체 내에서와 같이 주변 세포질 내에서 유지되는 경우, 단백질 특이성이 없는 적색 면역형광이 검출되었으며, 이는 항체가 세포 내에서 분산될 수 없고, 임의의 표면 현상을 검출하기에 충분히 경쟁적이라는 것을 지시한다 (패널 4 C). 다음, 글리코실화가 상이한 복합적 0mpH1 변이체를 발현하는 세포를 염색하였다 : OmpH1 ^KGN ^→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT (패널 4 D), OmpH1 ^RGD ^→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT (패널 4 E), 0mpH1 ^KGN ^→ ^NIT ^, ^RGD ^→ ^NIT (패널 4 F), OmpH1^V83T ^, ^KGN ^→NIT (패널 4 G) 및 0mpH1 ^KGN ^→ ^NIT ^, ^RGD ^→ ^NIT ^, ^HFGDD ^→ ^DSNIT (패널 4 H). 모든 0mpH1 변이체는 이중-염색되었고, 이는 박테리아 포면 상의 글리코실화 단백질의 존재를 지시한다. 도 4 는 회색톤으로 나타내고, 첫번째 칼럼은 동일한 열의 다른 그림의 통합 사진이다.

<110> Eidgenoessische Technische Hochschule Zuerich <120> Recombinant N-glycosylated proteins from procaryotic cells <130> 50008PCT <160> 6 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip with N123 glycosylation site of AcrA and hexa His tag <400> 1 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Asp Val Ile Ile Lys Pro Gln Val Ser Gly Val 20 25 30 Ile Val Asn Lys Leu Phe Lys Ala Gly Asp Lys Val Lys Lys Gly Gln 35 40 45 Thr Leu Phe Ile Ile Glu Gln Asp Gln Ala Ser Lys Asp Phe Asn Arg 50 55 60 Ser Lys Ala Leu Phe Ser Gln Leu Asp His Thr Glu Ile Lys Ala Pro 65 70 75 80 Phe Asp Gly Thr Ile Gly Asp Ala Leu Val Asn Ile Gly Asp Tyr Val 85 90 95 Ser Ala Ser Thr Thr Glu Leu Val Arg Val Thr Asn Leu Asn Pro Ile 100 105 110 Tyr Ala Asp Gly Ser His His His His His His 115 120 <210> 2 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip with N123 glycosylation site of AcrA and hexa His tag <400> 2 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Asp Val Ile Ile Lys Pro Gln Val Ser Gly Val 20 25 30 Ile Val Asn Lys Leu Phe Lys Ala Gly Asp Lys Val Lys Lys Gly Gln 35 40 45 Thr Leu Phe Ile Ile Glu Gln Asp Gln Phe Asn Arg Ser Lys Ala Leu 50 55 60 Phe Ser Gln Ser Ala Ile Ser Gln Lys Glu Leu Asp His Thr Glu Ile 65 70 75 80 Lys Ala Pro Phe Asp Gly Thr Ile Gly Asp Ala Leu Val Asn Ile Gly 85 90 95 Asp Tyr Val Ser Ala Ser Thr Thr Glu Leu Val Arg Val Thr Asn Leu 100 105 110 Asn Pro Ile Tyr Ala Asp Gly Ser His His His His His His 115 120 125 <210> 3 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lip with N123 glycosylation site of AcrA and hexa His tag <400> 3 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 1 5 10 15 Thr Val Ala Gln Ala Asp Val Ile Ile Lys Pro Gln Val Ser Gly Val 20 25 30 Ile Val Asn Lys Leu Phe Lys Ala Gly Asp Lys Val Lys Lys Gly Gln 35 40 45 Thr Leu Phe Ile Ile Glu Gln Asp Gln Asp Phe Asn Arg Ser Lys Ala 50 55 60 Leu Asp His Thr Glu Ile Lys Ala Pro Phe Asp Gly Thr Ile Gly Asp 65 70 75 80 Ala Leu Val Asn Ile Gly Asp Tyr Val Ser Ala Ser Thr Thr Glu Leu 85 90 95 Val Arg Val Thr Asn Leu Asn Pro Ile Tyr Ala Asp Gly Ser His His 100 105 110 His His His His 115 <210> 4 <211> 379 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AcrA protein with PelB signal sequence and hexa His tag <400> 4 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met His Met Ser Lys Glu Glu Ala Pro Lys 20 25 30 Ile Gln Met Pro Pro Gln Pro Val Thr Thr Met Ser Ala Lys Ser Glu 35 40 45 Asp Leu Pro Leu Ser Phe Thr Tyr Pro Ala Lys Leu Val Ser Asp Tyr 50 55 60 Asp Val Ile Ile Lys Pro Gln Val Ser Gly Val Ile Val Asn Lys Leu 65 70 75 80 Phe Lys Ala Gly Asp Lys Val Lys Lys Gly Gln Thr Leu Phe Ile Ile 85 90 95 Glu Gln Asp Lys Phe Lys Ala Ser Val Asp Ser Ala Tyr Gly Gln Ala 100 105 110 Leu Met Ala Lys Ala Thr Phe Glu Asn Ala Ser Lys Asp Phe Asn Arg 115 120 125 Ser Lys Ala Leu Phe Ser Lys Ser Ala Ile Ser Gln Lys Glu Tyr Asp 130 135 140 Ser Ser Leu Ala Thr Phe Asn Asn Ser Lys Ala Ser Leu Ala Ser Ala 145 150 155 160 Arg Ala Gln Leu Ala Asn Ala Arg Ile Asp Leu Asp His Thr Glu Ile 165 170 175 Lys Ala Pro Phe Asp Gly Thr Ile Gly Asp Ala Leu Val Asn Ile Gly 180 185 190 Asp Tyr Val Ser Ala Ser Thr Thr Glu Leu Val Arg Val Thr Asn Leu 195 200 205 Asn Pro Ile Tyr Ala Asp Phe Phe Ile Ser Asp Thr Asp Lys Leu Asn 210 215 220 Leu Val Arg Asn Thr Gln Ser Gly Lys Trp Asp Leu Asp Ser Ile His 225 230 235 240 Ala Asn Leu Asn Leu Asn Gly Glu Thr Val Gln Gly Lys Leu Tyr Phe 245 250 255 Ile Asp Ser Val Ile Asp Ala Asn Ser Gly Thr Val Lys Ala Lys Ala 260 265 270 Val Phe Asp Asn Asn Asn Ser Thr Leu Leu Pro Gly Ala Phe Ala Thr 275 280 285 Ile Thr Ser Glu Gly Phe Ile Gln Lys Asn Gly Phe Lys Val Pro Gln 290 295 300 Ile Gly Val Lys Gln Asp Gln Asn Asp Val Tyr Val Leu Leu Val Lys 305 310 315 320 Asn Gly Lys Val Glu Lys Ser Ser Val His Ile Ser Tyr Gln Asn Asn 325 330 335 Glu Tyr Ala Ile 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OmpH1 with myc tag <400> 6 Met Lys Lys Ile Leu Leu Ser Val Leu Thr Thr Phe Val Ala Val Val 1 5 10 15 Leu Ala Ala Cys Gly Gly Asn Ser Asp Ser Lys Thr Leu Asn Ser Leu 20 25 30 Asp Lys Ile Lys Gln Asn Gly Val Val Arg Ile Gly Val Phe Gly Asp 35 40 45 Lys Pro Pro Phe Gly Tyr Val Asp Glu Lys Gly Asn Asn Gln Gly Tyr 50 55 60 Asp Ile Ala Leu Ala Lys Arg Ile Ala Lys Glu Leu Phe Gly Asp Glu 65 70 75 80 Asn Lys Val Gln Phe Val Leu Val Glu Ala Ala Asn Arg Val Glu Phe 85 90 95 Leu Lys Ser Asn Lys Val Asp Ile Ile Leu Ala Asn Phe Thr Gln Thr 100 105 110 Pro Glu Arg Ala Glu Gln Val Asp Phe Cys Leu Pro Tyr Met Lys Val 115 120 125 Ala Leu Gly Val Ala Val Pro Lys Asp Ser Asn Ile Thr Ser Val Glu 130 135 140 Asp Leu Lys Asp Lys Thr Leu Leu Leu Asn Lys Gly Thr Thr Ala Asp 145 150 155 160 Ala Tyr Phe Thr Gln Asp Tyr Pro Asn Ile Lys Thr Leu Lys Tyr Asp 165 170 175 Gln Asn Thr Glu Thr Phe Ala Ala Leu Met Asp Lys Arg Gly Asp Ala 180 185 190 Leu Ser His Asp Asn Thr Leu Leu Phe Ala Trp Val Lys Asp His Pro 195 200 205 Asp Phe Lys Met Gly Ile Lys Glu Leu Gly Asn Lys Asp Val Ile Ala 210 215 220 Pro Ala Val Lys Lys Gly Asp Lys Glu Leu Lys Glu Phe Ile Asp Asn 225 230 235 240 Leu Ile Ile Lys Leu Gly Gln Glu Gln Phe Phe His Lys Ala Tyr Asp 245 250 255 Glu Thr Leu Lys Ala His Phe Gly Asp Asp Val Lys Ala Asp Asp Val 260 265 270 Val Ile Glu Gly Gly Lys Ile Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 275 280 285 Asp Leu 290

Claims

단백질을 개질하는 방법으로서, 상기 단백질을 엔코딩하는 핵산에 D/E - X - N - Z - S/T (여기서, X 및 Z 은 프롤린을 제외한 임의의 천연 아미노산일 수 있음)의 염기서열을 포함하는 하나 이상의 아미노산 공통염기서열을 엔코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 개질된 단백질이 캄필로박터 종(Campylobacter spp.)의 올리고사카릴 트랜스퍼라제에 의하여 효율적으로 N-글리코실화될 수 있는 방법.
제2항에 있어서, 상기 캄필로박터 종이 C. 제주니(C.jejuni)인 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 핵산을 도입하는 단계가 상기 단백질을 엔코딩하는 하나 이상의 핵산의 첨가, 소실 및/또는 치환에 의해 이루어지는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이 2개 이상, 3개 이상 또는 5개 이상의 상기 아미노산 공통염기서열을 포함하도록 개질된 방법.
제5항에 있어서, 상기 단백질이 P. 애루기노사(P. aeruginosa) 외부단백질인 방법.
제6항에 있어서, 상기 P. 애루기노사가 P. 애루기노사 O11인 방법.
제5항에 있어서, 상기 단백질이 디프테리아 독소(CRM197)인 방법.
제5항에 있어서, 상기 단백질이 콜레라 독소인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질이, N-글리코실화 연결에 의하여 하나 이상의 도입된 아미노산 공통염기서열 각각에 연결된 글리칸을 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 글리칸이 그램-음성 박테리아의 올리고- 또는 폴리사카라이드를 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 올리고- 또는 폴리사카라이드가 시겔라 종(Shigella spp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas ssp.) 또는 E. 콜라이(Escherichia coli)의 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 시겔라 종이 시겔라 디센테리애(Shigella dysenteriae) 01인 방법.
제12항에 있어서, 상기 슈도모나스 종이 P. 애루기노사인 방법.
제14항에 있어서, 상기 P. 애루기노사가 P. 애루기노사 O11인 방법.
제10항에 있어서, 상기 글리칸이 그램-양성 박테리아의 올리고- 또는 폴리사카라이드를 포함하는 방법.