CN101333560B - 嘌呤类药物敏感基因检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，属于临床检测的基因芯片技术领域，可用于平行经济地检测与嘌呤类药物敏感的相关基因。该试剂盒包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片，所述的扩增液含有扩增巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)上3个突变位点基因的引物，3个突变位点分别是238，460和719。嘌呤类药物用于治疗急性淋巴细胞白血病，本发明可用于检测对嘌呤类药物敏感的TMPT基因上述3个位点突变情况。
Description
技术领域
本发明属于临床检测的基因芯片技术领域，具体地说涉及一种嘌呤类药物敏感基因检测试剂盒。
背景技术
目前研究结果表明，治疗急性淋巴细胞白血病的巯嘌呤代谢药物——6-巯基嘌呤和6-巯代鸟嘌呤均是无内在生物活性的药物，必须通过体内一系列代谢后才能发挥药效。而人体的巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)的代谢酶在此类药物代谢和抗白血病作用中起关键作用。TPMT上含有的突变位点与人体对嘌呤类药物的敏感性有关。
目前用于检测5氟尿嘧啶单位点突变的方法主要有：测序法，这是最直接，最准确的方法，；荧光定量PCR法，和单碱基延伸法。这些方法所需要的设备仪器都价格昂贵，技术复杂，从经济上考虑不适于用作常规方法加以推广。
发明内容
为了对嘌呤类药物敏感的相关基因进行平行检测，对大量样本进行同时分析，并考虑经济推广的可行性，本发明选择TPMT的三个突变位点作为检测对象，提供一种嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片；其特征在于，所含的扩增液含有扩增巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因上3个突变位点序列的引物，3个突变位点分别是238，460和719。
所述的嘌呤类药物敏感基因检测试剂盒，其特征在于，扩增液可以包含以下一组序列的引物：
238-1：TGAAACCCTATGAACCTG
238-2：TCCAGGAATTTCGGTGT
460-1：GTTGAAGTACCAGCATG
460-2：CCTGGATTGATGGCAA
719-1：GGTTGATGCTTTTGAAGAA
719-2：CAATCTGCAAGACACATAG
所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，还可以包括扩增液B，扩增液B中包含如下一组序列的ASPE(Allele-Specific Primer Extension，即等位基因特特性引物延伸)引物：
238-G：5’-ATTTTATGCAGGTTTG
238-C：5’-ATTTTATGCAGGTTTC
460-G：5’-GGATAGAGGAG
460-A：5’-GGGATAGAGGAA
719-A：5’-TCTTTTTGAAAAGTTATA
719-G：5’-TCTTTTTGAAAAGTTATG
所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，扩增液B中包含的ASPE引物还可以是含有5’-端检测定位序列的如下序列：
238-G：5’-CAATTCATTTCATTCACAATCAATTTTATGCAGGTTTG
238-C：5’-CAATATACCAATATCATCATTTATTTTATGCAGGTTTC
460-G：5’-TCAATCATCTTTATACTTCACATGGGATAGAGGAG
460-A：5’-CTTTTTCAATCACTTTCAATATTTGGGATAGAGGAA
719-A：5’-CAATTTACTCATATACATCACTTTCTTTTTGAAAAGTTATA
719-G：5’-CTACTAATTCATTAACATTACTATCTTTTTGAAAAGTTATG
所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，扩增液B含有生物素标记的dCTP。
所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所含的基因芯片上的探针序列可以是以下一组序列：
POS-1：ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG
POS-2：GTAAATGATGATATTGGTATATTG
POS-3：ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA
POS-4：ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG
POS-5：AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG
POS-6：GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG
该试剂盒通过将嘌呤类所涉及的药物敏感基因巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因上的3个突变位点结合在一起，达到对相关基因进行平行检测的目的。另外通过将ASPE法与化学发光法相结合，检测单位点突变，优点在于：(1)结果准确，(2)通量大，(3)背景低，(4)操作简便，(5)无需大型仪器。
附图说明
图1为检测试剂盒应用流程图
图2为试剂盒中所含嘌呤类药物敏感基因检测芯片示意图
具体实施方式
下面结合附图和举例说明本发明目的的实施。
实施例子：
1.样本处理
用口腔粘膜脱落细胞作为样本来源，进行基因组DNA抽提。抽提使用博大泰克的细胞基因组抽提试剂盒。
2.芯片制备，将文献中已有标记定位探针在超平玻片上点样，探针序列如下：
POS-1：ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG
POS-2：GTAAATGATGATATTGGTATATTG
POS-3：ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA
POS-4：ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG
POS-5：AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG
POS-6：GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG
3.引物设计：
(1)设计以下引物序列组A，用以扩增TMPT基因上，与嘌呤类药物敏感相关的3个基因片断，分别含突变位点238，460和719。
238-1：TGAAACCCTATGAACCTG
238-2：TCCAGGAATTTCGGTGT
460-1：GTTGAAGTACCAGCATG
460-2：CCTGGATTGATGGCAA
719-1：GGTTGATGCTTTTGAAGAA
719-2：CAATCTGCAAGACACATAG
(2)设计以下ASPE引物序列组B，用以扩增含突变位点的序列，同时引进用于基因检测定位的标记序列，以便与芯片上相应的定位探针杂交，从而获得检测结果。
238-G：5’-CAATTCATTTCATTCACAATCAATTTTATGCAGGTTTG
238-C：5’-CAATATACCAATATCATCATTTATTTTATGCAGGTTTC
460-G：5’-TCAATCATCTTTATACTTCACATGGGATAGAGGAG
460-A：5’-CTTTTTCAATCACTTTCAATATTTGGGATAGAGGAA
719-A：5’-CAATTTACTCATATACATCACTTTCTTTTTGAAAAGTTATA
719-G：5’-CTACTAATTCATTAACATTACTATCTTTTTGAAAAGTTATG
4.PCR扩增待测片断并引入生物素标记。用引物序列组A扩增含待测突变位点的序列，用ASPE引物序列组B扩增含突变位点的序列，扩增时加入含生物素标记的dCTP，同此引入对样本产物检测所需的生物素标记。
5.杂交检测
按以下步骤对得到的相应样本产物进行杂交检测：
(1)将扩增得到的标记产物与杂交液(5×SSC，0.2％SDS)以1:6的比例混合，加入反应区域，50ul。
(2)42℃保温保湿反应60分钟。
(3)用洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，振动。
(4)加入HRP标记的亲和素反应液，50ul。
(5)在42℃反应15-20min。
(6)用洗液(2×SSC，0.1％SDS)洗涤4-6次，每次2分钟，晃动。
(7)加检测液20ul/孔，使检测液均匀分布于反应区域。
(8)CCD检测，视发光信号强度曝光30-60秒。
6.结果判定：
依据不同指标的CutOff值，参考标准品梯度曲线，判定样本的阴阳性。
与此同时，用常规方法对测试的样本进行常规检测。结果表明，用本发明的试剂盒得出的测试结果与常规方法相同。
序列表
238-1：TGAAACCCTATGAACCTG
238-2：TCCAGGAATTTCGGTGT
460-1：GTTGAAGTACCAGCATG
460-2：CCTGGATTGATGGCAA
719-1：GGTTGATGCTTTTGAAGAA
719-2：CAATCTGCAAGACACATAG
238-G：5’-ATTTTATGCAGGTTTG
238-C：5’-ATTTTATGCAGGTTTC
460-G：5’-GGATAGAGGAG
460-A：5’-GGGATAGAGGAA
719-A：5’-TCTTTTTGAAAAGTTATA
719-G：5’-TCTTTTTGAAAAGTTATG
238-G：5’-CAATTCATTTCATTCACAATCAATTTTATGCAGGTTTG
238-C：5’-CAATATACCAATATCATCATTTATTTTATGCAGGTTTC
460-G：5’-TCAATCATCTTTATACTTCACATGGGATAGAGGAG
460-A：5’-CTTTTTCAATCACTTTCAATATTTGGGATAGAGGAA
719-A：5’-CAATTTACTCATATACATCACTTTCTTTTTGAAAAGTTATA
719-G：5’-CTACTAATTCATTAACATTACTATCTTTTTGAAAAGTTATG
POS-1：ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG
POS-2：GTAAATGATGATATTGGTATATTG
POS-3：ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA
POS-4：ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG
POS-5：AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG
POS-6：GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG
Claims (5)
1.一种嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，包括抽提液、杂交缓冲液、洗液、扩增液、Taq酶、基因芯片，其特征在于：所含的扩增液含有扩增巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)基因上3个突变位点序列的引物，3个突变位点分别是238，460和719；所述的扩增液包含以下一组序列的引物：
238-1：TGAAACCCTATGAACCTG
238-2：TCCAGGAATTTCGGTGT
460-1：GTTGAAGTACCAGCATG
460-2：CCTGGATTGATGGCAA
719-1：GGTTGATGCTTTTGAAGAA
719-2：CAATCTGCAAGACACATAG。
2.根据权利要求1所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于：还包括扩增液B，扩增液B包含如下一组序列的ASPE（Allele-Specific Primer Extension，即等位基因特异性引物延伸）引物：
238-G：5’- ATTTTATGCAGGTTTG
238-C：5’-ATTTTATGCAGGTTTC
460-G：5’-GGATAGAGGAG
460-A：5’-GGGATAGAGGAA
719-A：5’-TCTTTTTGAAAAGTTATA
719-G：5’-TCTTTTTGAAAAGTTATG。
3.根据权利要求2所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于：所述的扩增液B中包含的ASPE引物还是含有5’-端检测定位序列的如下序列：
238-G：5’- CAATTCATTTCATTCACAATCAATTTTATGCAGGTTTG
238-C：5’-CAATATACCAATATCATCATTTATTTTATGCAGGTTTC
460-G：5’-TCAATCATCTTTATACTTCACATGGGATAGAGGAG
460-A：5’-CTTTTTCAATCACTTTCAATATTTGGGATAGAGGAA
719-A：5’-CAATTTACTCATATACATCACTTTCTTTTTGAAAAGTTATA
719-G：5’-CTACTAATTCATTAACATTACTATCTTTTTGAAAAGTTATG。
4.根据权利要求2或3所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于：所述的扩增液B含有生物素标记的dCTP。
5.根据权利要求3所述的嘌呤类药物敏感基因芯片检测试剂盒，其特征在于，所含的基因芯片上的探针序列是以下一组序列：
POS-1: ATTGATTGTGAATGAAATGAATTG
POS-2: GTAAATGATGATATTGGTATATTG
POS-3: ATTGTGAAGTATAAAGATGATTGA
POS-4: ATGAATTGAAAGTGATTGAAAAAG
POS-5: AAAGTGATGTATATGAGTAAATTG
POS-6: GTAGTAATGTTAATGAATTAGTAG。
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