CN101228963A - 一种含有吡咯并喹啉醌的强化食品 - Google Patents
一种含有吡咯并喹啉醌的强化食品 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种加工食品以抑制食品中微生物生长的方法以及用该方法获得的食品，所述方法包括将吡咯并喹啉醌活性物质与所述食品混合。吡咯并喹啉醌活性物质的加入可抑制食品中微生物生长，达到延长食品保存时间的目的。本发明还提供了吡咯并喹啉醌活性物质在食品加工中的用途及其制备和纯化方法。通过本发明的制备方法可高效率地制得高纯度吡咯并喹啉醌。
Description
技术领域
本发明属于食品加工领域，涉及一种抑制食品中的微生物生长、延长食品保质期的方法及制备所述食品的方法。更具体而言，本发明涉及吡咯并喹啉醌在食品加工中抑制微生物生长、延长食品保质期的用途，及其制备和纯化方法。
发明背景
日常生活中，食品腐败是一个常见问题。根据澳大利亚食品科学委员会和国际低温运输中心(Food Science Australia and the National Cold Chain Center)初步估算，因全球新鲜食品的运输和存储等环节中的腐败所导致的浪费高达二百亿美元每年(Food Magazine，2006年4月)。
微生物在食物中的生长繁殖是食品腐败的一个重要原因。最近的研究显示，引起食品腐败的微生物包括：真菌，如念珠地丝菌(Geotrichum candidum)；霉菌，如黑曲霉素(Aspergillus niger)和扩展青霉菌(Aspergillus niger)；各种酵母菌；腐败菌，如粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、嗜热芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；致病性细菌，如蜡状芽孢杆(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、海德尔堡沙门菌(Salmonella hydelberg)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)、大肠埃希菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、鲍伊德氏志贺菌(Shigella boydii)、宋内氏志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、福氏志贺菌(Shigellaflexneri)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)等；以及某些病毒，如诺罗病毒(Norovirus)和肝炎病毒。
自人类历史起源，人们就一直在寻找防止腐败、抑制致病性微生物生长的方法。保存食品的常见方法包括：干燥(如冰冻干燥)、盐浸、烟熏、发酵、冷藏、冰冻；将食品浸入果汁、糖、油、醋或者酒精中；以及在食品中添加防腐剂如亚硫酸盐、脱氢醋酸、亚硝酸盐、甲酸乙酯、丙酸、山梨酸和苯甲酸。
同时人们也在不断尝试和发明新的防腐技术。例如，1810年Nicolas Appert发明了罐装食品。1846年Lousi Pasteur的加热杀菌法为食品保存提供了另一种方法。在食品工业中这两种方法沿用至今。美国专利6955893中阐述的方法是通过抗菌素编码的溶菌酶来防止食品变质。而另一个美国专利5654020中则使用乳酸菌抑制腐败。
此外，电离辐射也是一种很流行的防止食品变质的方法。这种方法是将食品置于x-射线或放射性同位素钴-60、铯-137及高能电子束产生的γ射线的照射下。辐射可以杀死食物中的细菌、霉菌和其它害虫，减慢水果的成熟和腐败速度，同时高剂量的辐射也会导致种子不再结果。
自从2001年禁止使用甲基溴烷，辐射成为阻止腐败菌和致病微生物生长的主要方法。20世纪60年代早期，美国食品药品监督管理局(FDA)批准可以对小麦、面粉和土豆进行辐射。1990年3月FDA批准使用辐射抑制鸡肉、火鸡和家禽中的沙门氏菌和其它有害细菌的生长。1997年12月对牛肉、羊羔肉和猪肉等新鲜红肉中可能存在的致病菌使用辐射进行消毒也获得了FDA的许可。
然而，许多尚在使用的食品保存方法也有局限性。例如，对食物进行干燥、盐浸、烟熏、发酵、或浸入果汁、糖、油、醋和酒精等处理后，甚或添加化学物等方法虽然可以延长食物的保存时间，却会影响其营养价值、密度、结构和味道。冷藏和冷冻要求一直将食品保存于很低的温度中。辐射并不能适用于所有食品。因为日常食品经辐射处理，味道会发生很大变化，不易为大众所接受。由于食物只能放在较低的热度中进行处理，所以巴斯德消毒法虽然能够杀死所有的致病菌，但是仍有部分腐败生物不能被消灭。
保存食物的方法可以用食品的保存期限进行衡量。保存时间越长，食物防腐方法越好。食品的保存时间指在食品的品质受到某些因素或指标(如微生物生长等)的影响之前，该食品可以销售和消费的时间长度。通常，食品标签上标注的“在...(时间)以前使用最佳”、“截至...(时间)前使用”或“保质日期为”，上面的日期即指它们的保存时间。
延长食品的保存时间仍然是当今研究的课题。一项新的食品保存技术必须要符合一定的要求和标准。处理后的食品要保持营养价值、香味，同时也要对人体无害。人们长期使用添加防腐剂的食物后不应该出现不良反应。
消费者们很担心长期食用人工合成的食品添加剂和许多抗生素对他们的健康不利。很显然，抗生素不能作为食品添加剂，因为抗生素有很多副作用，例如产生过敏反应、导致人体正常菌群失调、长期使用还会引起抗生素耐药等。抗生素还可能有不良气味，吃起来比较苦或者颜色令人不愉快，这些原因使得它们不宜作为食品添加剂使用。而另一方面，维生素和矿物质虽然可以强化食物使之更有营养，但是它们没有抗菌功能，不能延长食物的保存时间。
所以，本领域中迫切需要寻找天然的、能够有效抗菌并有营养价值的食品添加剂。
发明内容
本发明提供一种在食品中添加有效量吡咯并喹啉醌(PPQ)或其衍生物，从而抑制食品中微生物生长同时又保持食品特性的方法。本发明还提供了制备吡咯并喹啉醌的方法以及由该方法制得的高纯度吡咯并喹啉醌，以及用于制备吡咯并喹啉醌的突变菌株。
在本发明的第一方面，提供了一种对食品进行处理的方法，所述方法包括：将吡咯并喹啉醌活性物质作为微生物生长抑制剂添加到所述食品中。所述方法可用于抑制微生物在食品中的生长和/或延长食品保质期。
在本发明的一个实施方式中，所述吡咯并喹啉醌活性物质选自：吡咯并喹啉醌、吡咯并喹啉醌的食品学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、异构体、或它们的混合物。
在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌活性物质以含有一种或多种吡咯并喹啉醌、吡咯并喹啉醌的食品学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物或异构体、它们的混合物以及食品学上可接受的载体的吡咯并喹啉醌组合物的形式存在。
在本发明的另一实施方式中，所述吡咯并喹啉醌活性物质的加入量为所述食品重量的0.001wt％至19.9wt％，优选0.01wt％至9wt％，更优选0.1wt％至5wt％。
在一个优选例中，以所述食品的重量计，所述吡咯并喹啉醌活性物质的加入量为0.0001mg/g至100mg/g，较适宜为0.001mg/g到10mg/g，更适宜0.01mg/g至2mg/g。
在另一优选例中，所述食品为液态，以所述食品的总体积为基准计，吡咯并喹啉醌活性物质的浓度为0.0001mg/L至1,000mg/L，较适宜的浓度为0.001mg/L到100mg/L，更适宜的浓度为0.01mg/L至80mg/L。
在本发明的另一实施方式中，所述的食品包括食品原料、半成品或成品。
在一个优选例中，所述的吡咯并喹啉醌活性物质为液态，较佳地所述液体形式选自：溶液、乳液、或分散液，优选溶液或乳液形式。
在另一优选例中，所述的吡咯并喹啉醌活性物质为固体形式，较佳地所述固体形式选自：粉末、颗粒、或微丸，优选粉末形式。
在另一优选例中，所述吡咯并喹啉醌活性物质为天然的或重组生产的吡咯并喹啉醌。
在本发明的另一实施方式中，所述微生物选自：腐败菌、致病性细菌、真菌、酵母菌、大肠埃希菌。
在一个优选例中，所述微生物选自：白地霉、黑曲霉、青霉菌、粪产碱杆菌、脂肪嗜热芽孢杆菌、噬酸乳酸杆菌、荧光假单胞菌、蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森菌、伤寒沙门菌、海德尔堡沙门菌、肠炎沙门菌、大肠埃希氏菌O157:H7、空肠弯杆菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、宋内志贺菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌、鲍伊德氏志贺菌、霍乱弧菌。
在本发明的另一实施方式中，所述食品选自：乳制品、脂肪、油、脂肪乳、可食用冰、水果、蔬菜、海产品、坚果、种子、糖果、谷类食物或其衍生物、肉或肉产品、鱼类食品、蛋或蛋制品、调味品、豆制品、合成食品、快餐、饮料。
在一个优选例中，所述食品选自：奶牛奶、水牛奶、山羊奶、绵羊奶、黄油、食用油、奶油、松软干酪、酸奶酪、酸乳酒、意大利干酪、新鲜干酪、熟干酪、脱脂乳制的意大利干酪、冰冻果子露、果汁冰糕、水果、蔬菜、海藻、坚果、种子、硬糖、软糖、太妃糖、瑞士奶片、巧克力、咖啡糖、药属葵蜜饯、杏仁蛋白奶糖、面粉糕饼、口香糖、冰激凌、碎芝麻蜂蜜糖、谷类的根、茎、豆、豆荚、面包、家禽、野味、软体类、甲壳类、棘皮类动物、鸡蛋、蜂蜜、盐、香料、汤料、酱油、色拉、大豆蛋白、发酵的大豆食品、合成食品、果汁、冰茶、冰咖啡、可乐类饮料、姜汁啤酒、奎宁水、南瓜、无醇饮料、柠檬水、乳制品、卡布奇诺、咖啡、浓咖啡、冰冻饮料、摩卡咖啡、热巧克力、热苹果酒、温苹果酒、香茶、绿茶、珍珠奶茶、茶、草药茶、鸡尾酒、淡色啤酒、苏格兰威士忌、黑麦啤酒、黑麦威士忌、玉米啤酒、波旁威士忌、小麦啤酒、小麦威士忌、日本米酒、朝鲜麦酒、黄酒、白酒、葡萄酒、白兰地、法国科涅克白兰地、秘鲁皮斯科白兰地、苹果酒、苹果白兰地、法国苹果白兰地酒、梨子白兰地酒、浪姆酒、巴西朗姆酒、次白兰地酒、墨西哥麦斯卡尔酒、李子葡萄酒、梅子白兰地、罗马尼亚珠伊卡酒、果渣葡萄酒、格拉巴酒、葡萄渣、榨渣、蜂蜜酒、蜂蜜白兰地、马铃薯啤酒、伏特加酒、白兰地烈性酒、山芋酒或亚力酒。
在一个优选例中，所述食品为乳制品，优选奶牛奶、水牛奶、山羊奶或绵羊奶的奶加工品，更优选为奶牛奶。
在一个优选例中，以牛奶的总体积为基准计，加入吡咯并喹啉醌活性物质的量为0.0001mg/L至1,000mg/L，优选0.001mg/L到100mg/L，更优选0.01mg/L至100mg/L。
在本发明的第二方面中，提供了一种吡咯并喹啉醌活性物质的用途，其用于制备抑制微生物在食品中生长的微生物生长抑制剂。
在本发明的一个实施方式中，所述添加剂包含：a)抑制食品中微生物生长有效量的吡咯并喹啉醌活性物质；和b)食品学上可接受的载体或赋形剂。
在一个优选例中，所述吡咯并喹啉醌活性物质选自：吡咯并喹啉醌、吡咯并喹啉醌的食品学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、异构体、或它们的混合物。
在另一优选例中，所述吡咯并喹啉醌活性物质占所述食品添加剂总重量的0.001wt％至99.9wt％，优选0.01wt％至90wt％，更优选0.1wt％至80wt％。
在本发明的另一实施方式中，吡咯并喹啉醌活性物质还用于作为或制备延长食品保质时间的食品添加剂。
在本发明的第三方面中，提供了一种食品组合物，所述的组合物包括：(a)食品；和(b)作为微生物生长抑制剂的吡咯并喹啉醌活性物质。
在另一优选例中，所述的食品组合物是采用本发明的方法获得的。
在本发明的第四方面中，提供了一种制备吡咯并喹啉醌的方法，所述方法包括：i)在培养基中培养产吡咯并喹啉醌的菌株或通过诱导所述菌株突变并筛选吡咯并喹啉醌高产突变菌株，其中所述吡咯并喹啉醌高产突变菌株的吡咯并喹啉醌产量至少为诱导前菌株的1.25倍；和
ii)培养所述产吡咯并喹啉醌的菌株或吡咯并喹啉醌高产突变菌株，并收集吡咯并喹啉醌。
在本发明的一个实施方式中，所述产吡咯并喹啉醌的菌株选自：生丝微菌、嗜碱噬甲基菌或硫杆菌属。
在一个优选例中，所述菌株选自：生丝微菌ATCC No：27500、生丝微菌ATCCNo：27501、生丝微菌ATCC No：33404、嗜碱噬甲基菌ATCC BAA-297、或硫杆菌ATCC No：8093，优选在一个优选例中，所述产吡咯并喹啉醌的菌株选自：生丝微菌ATCC No：27501或硫杆菌ATCC No：8093。
在本发明的另一实施方式中，所述培养基中还进一步添加了选自下组的碳源：甲醇、乙酸钠、丙三醇或D-甘露醇，优选甲醇。
在另一个优选例中，还将以下一种或多种物质加入培养基中：酪氨酸、谷氨酸盐或吐温-80。
在另一个优选例中，以0.001‰至10‰的重量体积比将酪氨酸、谷氨酸盐和/或吐温-80添加到培养基中，优选0.05‰至5‰，更优选0.01‰至2‰，所述千分比基于培养基的总体积。
在本发明的另一实施方式中，突变的诱导是通过将菌株置于紫外灯下进行突变诱导或通过将菌株置于离子束照射下进行的。
在一个优选例中，在紫外灯下进行突变诱导的时间为使得受诱导菌液中的致死率为70％至80％，优选72％至78％，更优选75％的时间，所述致死率为紫外线照射后死亡的菌数占照射前菌液中所有活菌数的百分比。
在本发明的另一实施方式中，所述吡咯并喹啉醌高产突变菌株选自：保藏号为CCTCC M 208013的U-H103菌株、U-MT12、U-T187、E-H177、E-MT145或E-T128。
在一个优选例中，所述菌株是保藏号为CCTCC M 208013的U-H103突变菌株。
在另一优选例中，所述吡咯并喹啉醌高产突变菌株的吡咯并喹啉醌产量为诱导前菌株吡咯并喹啉醌产量的1.25倍至10倍，优选1.5倍至8倍，更优选2倍至5倍。
在另一优选例中，对所得的吡咯并喹啉醌高产突变菌株进行传代培养以获得稳定性良好的菌株，优选传代2至15次，更优选传代5至12次，最优选传代6至10次。
在另一优选例中，所述方法还包括对含有所述吡咯并喹啉醌高产突变菌株的菌液进行发酵的步骤。
在本发明的另一实施方式中，将吡咯并喹啉醌的分离采用的是阴离子交换树脂。
在一个优选例中，使所得含吡咯并喹啉醌的液体在电导400-500μs/cm，pH7.0-8.0的条件下，流过DEAE Streamline阴离子交换树脂。
在本发明的另一实施方式中，所述方法还包括对分离的吡咯并喹啉醌进行纯化的步骤。
在本发明的另一实施方式中，所述纯化步骤包括采用超滤法对分离所得含吡咯并喹啉醌液体进行超滤以去除杂质。
在一个优选例中，优选将从阴离子交换树脂上洗脱的含吡咯并喹啉醌的溶液通过超滤膜包过滤，所述超滤膜包为5-50kd的膜包，优选5-10kd，更优选为8kd。
在另一个优选例中，所述纯化步骤包括将分离所得含吡咯并喹啉醌液体的pH值降低到1-4，优选pH 2-3，更优选pH 2.5-2.8以进行酸沉淀。优选将从阴离子交换树脂上洗脱的含吡咯并喹啉醌溶液加酸调节到pH 2.75。
在另一优选例中，所述纯化步骤包括将分离所得含吡咯并喹啉醌液体的温度降低到0-10℃，优选2-8℃进行低温结晶。
在另一优选例中，所述纯化步骤包括降低pH、低温结晶与超滤法的任意组合。
在另一优选例中，经纯化后吡咯并喹啉醌的纯度至少为85％，优选至少为90％，更优选至少为95％，最优选至少为98％。
在本发明的第五方面中，提供了一种纯度至少为98％的吡咯并喹啉醌，所述吡咯并喹啉醌是用本发明的制备方法制备的。
在本发明的第六方面中，提供了一种突变菌株，所述突变菌株是通过对产吡咯并喹啉醌的菌株进行突变诱导和筛选而获得的，所述产突变菌株的吡咯并喹啉醌产量至少为诱导前菌株的1.25倍。
在一个优选例中，所述突变菌株的诱导是将产吡咯并喹啉醌的菌株置于紫外灯下进行突变诱导或通过将菌株置于离子束照射下进行的。
在一个优选例中，在紫外灯下进行突变诱导的时间为使得受诱导菌液中的致死率为70％至80％，优选72％至78％，更优选75％的时间，所述致死率为紫外线照射后死亡的菌数占照射前菌液中所有活菌数的百分比。
在另一优选例中，所述吡咯并喹啉醌高产突变菌株的吡咯并喹啉醌产量为诱导前菌株吡咯并喹啉醌产量的1.25倍至10倍，优选1.5倍至8倍，更优选2倍至5倍。
在另一优选例中，对所得的吡咯并喹啉醌高产突变菌株进行传代培养以获得稳定性良好的菌株，优选传代2至15次，更优选传代5至12次，最优选传代6至10次。
在另一优选例中，所述突变菌株选自：保藏号为CCTCC M 208013的普通生丝微菌U-H103突变菌株、U-MT12、U-T187、E-H177、E-MT145或E-T128。在另一优选例中，所述菌株是保藏号为CCTCC M 208013的U-H103突变菌株。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1所示为：不同浓度PQQ作用6小时(图1A)、8小时(图1B)和9.5小时(图1C)后，Top10大肠杆菌和氨苄抗性大肠杆菌培养物的OD600值。
图2所示为：不同浓度PQQ添加到牛奶中作用不同时间对牛奶OD600值的影响。
菌种保藏
本发明的生丝微菌(Hyphomicrobium)菌株的突变株普能生丝微菌U-H103(HyphomicrobiumvulgareU-H103)，于2008年1月17日提交并保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉，武汉大学)，保藏号为CCTCC M208013。
具体实施方式
本发明的本发明人经过多年研究，意外地发现吡咯并喹啉醌(PQQ，一种已知化合物)可以抑制导致食物腐败变质的微生物的生长，从而延长食物的保质期并保持食品特性，此外通过添加PQQ还可进一步提高食物的营养价值。本发明人还进一步研究了PQQ的制备和纯化方法，通过培养和诱导产吡咯并喹啉醌菌提高了PQQ的产量，并通过纯化等方式获得了高纯度PQQ。在此基础上，发明人完成了本发明。
相关定义
本文中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的食品组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
本文中，术语“有效量”指按本发明的方式使用时足以获得需要的效果而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的成分的量。显然，具体的“有效量”因各种因素而异，如所需添加的食品种类、食品的加工方法和程度、PQQ或其衍生物的纯度等。
本文中，术语“PQQ”指吡咯并喹啉醌或其盐或酯。
本文中，术语“PQQ活性物质”或“吡咯并喹啉醌活性物质”可互换使用，都包括吡咯并喹啉醌、PQQ的食品学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、异构体或其它衍生物形式、或它们的混合物。术语“PQQ衍生物”是指含有吡咯并喹啉醌作为主要结构或通过吡咯并喹啉醌的代谢获得的产物，只要其还具有吡咯并喹啉醌在本发明中的功效。例如食品中可接受的盐。代表性的盐包括(但并不限于)：钠盐、钾盐、锌盐等。
吡咯并喹啉醌(PQQ)的结构与已知功能
吡咯并喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)最早于1979年从细菌中分离出。它是一种无味无嗅的化合物，其分子式如下：
PQQ被认为是一种必需的B族维生素，同时它也是一种新的氧化还原反应的辅因子(Nature.2003年4月24；422(6934)：832)。辅因子是一种非蛋白类的化合物，能够与酶结合并且在酶发挥功能的时候是必需的。辅因子能够协助酶参与生化反应。不包含辅因子的酶称为主酶，主酶与相应的辅因子结合后成为完整的酶，称作全酶。
以前，只知道少数细菌(例如甲基营养菌、醋酸假单胞菌属和葡萄糖杆菌属)能够合成PQQ。现在，已经发现不少植物性和动物性食品中含有这种维生素。PQQ在某些食物中含量很高，例如：芹菜、番木瓜、奇异果、绿茶、纳豆(发酵的豆类)、豆腐和青椒。值得注意的是，在母乳中PQQ含量很高(140-180ng/mL)，大约是牛奶中含量的4到5倍(Mitchell A E等.Analytical Biochemistry1999；269：317-325)。
PQQ在许多生物体的生理活动中发挥重要的作用。必需氨基酸赖氨酸的降解就依赖于PQQ。赖氨酸在AAS合成酶(AASS)催化下被氧化为2-氨基己二酸-6半醛(2-aminoadipic 6-semialdehyde，AAS)，接着进一步在AAS脱氢酶(AASDH)的作用下被氧化为2-氨基己二酸(2-aminoadipic acid)。在这个反应中，PQQ作为AASDH的一个辅因子发挥作用。PQQ与所有的PQQ依赖的酶(醌蛋白)以非共价形式结合。许多PQQ依赖的酶结合在细胞膜上，作为这些酶的辅因子，PQQ在生化反应过程中起到电子传递的作用。PQQ大量存在于线粒体中，它是氧化亚氮合成酶和NADH-CoQ还原酶的辅因子。
在一些氧化途径中(例如：乙醇氧化、葡萄糖氧化、多元醇氧化和奎尼酸氧化)，许多关键酶依赖于辅因子PQQ的协助。PQQ依赖的酶可以分为糖和乙醇脱氢酶(包括一些乙醇脱氢酶和NAD(P)依赖的乙醇脱氢酶)、还原酶和氧化酶。迄今为止，已经发现的PQQ依赖的乙醇代谢有关的脱氢酶可分为：膜结合的乙醇脱氢酶、可溶性的乙醇脱氢酶和膜结合的循环乙醇脱氢酶；已经发现的PQQ依赖的葡萄糖氧化有关的酶有：膜结合的葡萄糖脱氢酶(m-GDH)和可溶性的葡萄糖脱氢酶(s-GDH)；多元醇氧化有关的PQQ依赖的脱氢酶有：膜结合的D-阿拉伯糖脱氢酶、膜结合的中赤藓糖醇氧化脱氢酶、膜结合的D-葡糖酸盐氧化多元醇脱氢酶、膜结合的甘油脱氢酶、膜结合的D-甘露糖脱氢酶、膜结合的核糖醇脱氢酶、膜结合的D-山梨糖醇脱氢酶和膜结合的L-山梨醛脱氢酶；在奎尼酸氧化过程中，PQQ依赖的脱氢酶包括膜结合的奎尼酸脱氢酶(QDH)。此外，一些醛脱氢酶也是PQQ依赖的。
PQQ在哺乳动物的生长发育过程中起着非常重要的作用。动物通过饮食获取每日所需的PQQ。用缺乏PQQ的饮食喂养小鼠会导致新生幼仔生长受影响并且出现多种异常体征，成年小鼠表现为适应性减退、免疫反应受损、生殖力减弱、皮肤变脆并且容易发生出血和憩室炎。一旦在这些小鼠的饮食中恢复添加PQQ，上述的症状就消失了。
PQQ的多种功能通过动物实验观察到。纯化的PQQ作为一种抗氧化剂能够保护肝脏免受CCl4或酒精损伤。纯化的PQQ减少鸡胚发育过程中糖皮质激素诱导的白内障形成，可能是通过恢复谷胱甘肽水平从而降低对皮质激素的反应性来发挥作用。PQQ直接氧化受体的NMDA氧化还原位点，保护细胞免受NMDA毒性影响，从而防止脑部缺血缺氧，避免动物模型发生严重的休克。同样，PQQ可以保护心脏防止心肌缺血及心肌梗死。
最近的研究工作主要集中在将PQQ开发为一种在食物中补充的维生素和医疗用药。PQQ适用于预防及治疗阿尔茨海默病、骨质疏松、脂肪肝和酒精中毒，还可用于治疗重金属中毒、增加儿童及成人血清锌水平同时降低铅含量从而预防神经疾病。
例如，美国专利申请20030229114揭示了可以使用PQQ来预防和治疗亚硝酸盐引起的急慢性神经损伤。美国专利申请20050267143提出使用PQQ来预防和治疗心肌氧化应激，因为PQQ可以调节自由基损伤。美国专利5,460,819和中国专利00119473.9提出使用PQQ治疗重金属中毒。中国专利03141434.6提出使用PQQ达到增锌降铅的目的。中国专利02111549.4提出使用PQQ治疗酒精中毒并且可以预防和治疗酒精性脂肪肝。
吡咯并喹啉醌(PQQ)或其衍生物在食品保存中的用途
PQQ普遍存在于多种生物体内以及它在许多生化途径中的重要功能提示它的功能应不止是一种维生素或药物，其应用远远超过用于动物的营养作用。
发明人长期深入的研究出乎意料地发现PQQ或其衍生物对微生物，尤其是某些导致食物腐败变质的微生物的生长具有抑制作用(这部分结果将通过实施例和附图进行更为具体的说明)。由此，提出了一种在食品中添加有效剂量PQQ或一种含有有效剂量的PQQ衍生物的化合物，强化食品营养同时又保持食品品质的方法。
具体而言，发明人经研究发现PQQ能抑制食物中微生物的生长，虽然不限于理论，但其机理可能是通过破坏微生物的遗传物质脱氧核糖核酸和核糖核酸(DNA和RNA)，从而抑制食物中微生物的复制。PQQ的抑制作用还包括阻断微生物的呼吸作用等正常代谢，从而干扰食物生产过程中微生物的生活周期。Yusuke Hiraku等人的研究工作揭示了低剂量的PQQ(10μM PQQ，相当于3.3mg/L)可能导致DNA胸腺嘧啶和胞核嘧啶结合位点的断裂。
此外，PQQ导致DNA的破坏依赖于NADH和Cu(II)的存在。可能的解释是NADH依赖的PQQ氧化还原循环产生了超氧化物和过氧化氢，这些生成物介导了铜依赖的DNA损害(NADH-mediated DNA damage induced by a newcoenzyme，pyrroloquinoline quinone，in the presence of copper(II)ion，“二价铜离子存在下由一种新的辅酶--吡咯并喹啉醌诱导的NADH-介导的DNA损伤”FEBSLetters，第393卷，No.2，1996年9月16日，pp.317-320(4))。同样的，在NADH和Cu(II)的存在下，低剂量PQQ(500μM PQQ，相当于165mg/L)产生超氧化物和过氧化氢可能阻断细菌的电子传递链，从而影响包括细菌呼吸作用在内的正常的细菌代谢。
在本发明的实施方式中，可被PQQ抑制的微生物包括真菌、霉菌、多种酵母菌、腐败和致病的细菌以及某些病毒，比如白地霉(Geotrichum candidum)等真菌；黑曲霉(Aspergillus niger)和青霉菌(Penicillium expansum)等霉菌；粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)、脂肪嗜热芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、噬酸乳酸杆菌(Lactobacillus acidophilus)和荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)等腐败菌；蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、耶尔森氏菌属如小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)、沙门氏菌属如伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、海德尔堡沙门菌(Salmonella hydelberg)、肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)；大肠埃希氏菌(如Escherichia coli O157：H7)、空肠弯杆菌(Campylobacter jejuni)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌(Shigelladysenteriae)、福氏志贺菌(Shigella flexneri)、鲍伊德氏志贺菌(Shigella boydii)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)等致病性细菌。诺罗病毒(Norovirus)和肝炎病毒等特定病毒。
因此，可通过添加PQQ达到强化食品的效果，该方法具有以下优点：(1)PQQ可以抑制食品中微生物的生长，从而延长食品的贮存期限；(2)PQQ是一种天然物质，存在于动植物食品中，因此它对人体无害；(3)PQQ作为一种维生素，对消费者的健康有利；(4)PQQ是一种无味的化合物，在食品中添加PQQ不会改变食品的风味和特性。
添加PQQ活性物质的食品
本发明提供了一种将PQQ活性物质添加入食物中来制造一种保持有食品特性并且含有有效剂量PQQ活性物质的强化食品，达到抑制食品中微生物生长及保存食品的目的。
用于本发明的PQQ活性物质可以是天然的或非天然的。较佳地，所述的吡咯并喹啉醌是人工合成的或发酵产生的，也可通过市售途径获得。较佳地，所述PQQ活性物质为纯化的PQQ，其纯度至少为85％，优选至少为90％，更优选至少为95％，最优选至少为98％。
以PQQ作为PQQ活性物质的代表例，可用PQQ处理的食品包括固体食物和各种饮料。本发明的一个实施方式是用纯化的PQQ处理各种食品，包括但不限于：乳制品、脂肪、油、脂肪乳、可食用冰包括冰冻果子露和果汁冰糕、水果、蔬菜、海产品、坚果、种子、各种糖果、谷类食物、以及谷类产品衍生物、面包、肉和肉产品、鱼类食品、蛋和蛋制品、各种调味品如蜂蜜、盐、香料、汤、沙拉、沙司；蛋白质食品包括豆制品、合成食品、快餐；各种饮料包括但不限于：可乐、冰茶、啤酒、白酒、红酒、咖啡等。
PQQ尤其适合处理牛奶等乳制品。直到今天，乳制品仅应用巴氏灭菌法来杀菌。由于腐败菌的残存，灭菌后的牛奶只有较短的保存期限。纯化的PQQ可以抑制牛奶中多种微生物从而延长牛奶的保质期。任何种类的奶都可以用PQQ处理。牛奶尤其适合用PQQ处理，使其更类似于人奶，因为人类的奶含高浓度的PQQ。因此，含PQQ的牛奶可以作为一种健康和保健饮料。
同样地，其它食品和饮料也可以用纯化的PQQ处理来抑制微生物生长、延长保质期。可以用PQQ处理的乳制品包括但不限于：黄油、奶油、松软干酪、酸奶酪、酸乳酒等。
可以在上述食品的制造加工前将有效量的PQQ加入原料中，也可以在制造加工过程中将PQQ加入半成品中，或在食品加工完成后将PQQ加入待储存的食品中，也可根据需要在加工的不同步骤中分步加入PQQ。优选在食品加工完成后加入有效量的PQQ。PQQ可以粉末、溶液、分散液、乳液等形式加入。
本发明的另一个具体实施方式提供了一种生产含有PQQ的强化食品的方法。PQQ或者含有有效剂量的PQQ衍生物的化合物能够被水溶或乳化。在一个优选实施方式中，可将水溶或乳化后的PQQ加入食品中，或者以固体形式将PQQ活性物质加入待加工的食品中，例如粉末、颗粒、微丸等形式。
通常，以所述食品的重量计，所述PQQ活性物质的加入量为0.0001mg/g至100mg/g，较适宜为0.001mg/g到10mg/g，更适宜0.01mg/g至2mg/g。
在另一优选例中，所述食品为液态，以所述食品的总体积为基准计，吡咯并喹啉醌活性物质的浓度为0.0001mg/L至1,000mg/L，较适宜的浓度为0.001mg/L到100mg/L，更适宜的浓度为0.01mg/L至80mg/L。
例如，可将PQQ活性物质以0.0001mg/L至1,000mg/L的浓度加入牛奶中，优选0.001mg/L到100mg/L，更优选0.01mg/L至100mg/L。
本领域技术人员也可根据具体需要对PQQ活性物前的加入量、加入时间或加入方式等进行适当的调整，以获得最佳的效果。
PQQ的制备和纯化
本发明的另一方面提供了一种制备和纯化PQQ的方法。该方法总体上包括：培养产PQQ的菌株；诱导所述菌株突变并筛选PQQ高产突变菌株；培养菌株并收集细菌培养物；分离、纯化及重结晶PQQ。
A.菌株的培养及诱变
在生产制备PQQ的过程可使用适于固体或液体微生物培养基，例如液体培养基用于摇瓶培养，固体培养基用于培养皿细菌培养，扩大生产发酵可采用液体培养基进行培养。优选向所述培养基中加入PQQ合成前体(主要为酪氨酸和谷氨酰胺)和/或吐温80以增加PQQ的产量。此外，还可向培养基中加入额外的碳源，例如甲醇、醋酸钠、甘油和D-甘露醇以增加PQQ的产量，其中，甲醇是最适合的碳源。
可选用产PQQ的菌株来进行生产，也可对所述产PQQ的菌株进行诱变并筛选PQQ高产突变株来进行生产。
可用于本发明方法中的产PQQ的菌株可选自生丝微菌属(Hyphomicrobium)菌株、噬甲基菌属(Methylophaga)菌株和硫杆菌属(Thiobacillus)菌株。其中优选生丝微菌ATCC No：27500、生丝微菌ATCC No：27501、生丝微菌ATCC No：33404、嗜碱噬甲基菌(Methylophaga alcaliphila)ATCC BAA-297、或硫杆菌ATCC No：8093，尤为优选生丝微菌ATCC No：27501或硫杆菌ATCC No：8093。
可采用紫外光照射诱变或离子束诱变等方法从上述产PQQ的菌株通过诱变产生PQQ高产突变菌株。本发明实施例部分具体描述了采用紫外光照射诱变菌株的方法，其中使用了倒板方法(Pour plate method，混合细菌的方法)和集落形成单位(colony forming units，CFU)来检测培养的结果。本领域技术人员也可根据需要，在现有技术基础上对这些方法和条件进行改变。
紫外光照射损害微生物的遗传物质，诱导突变株的产生。当一个分子暴露于紫外光照射下，吸收一定量的紫外光，分子被激活，它的一些电子跃迁至较高的能量水平，引起分子的突变。DNA(脱氧核糖核酸)分子能够吸收大量紫外光，因此很容易在紫外光照射下发生突变，改变其分子结构。分子结构的改变包括DNA链断裂，DNA分子内和分子间交叉结合，核酸和蛋白质之间交叉结合，形成水合嘧啶和嘧啶二聚体。嘧啶二聚体的形成的一个主要原因就是细菌DNA分子结构改变和遗传突变。因此，通过紫外光诱变可得到合成大量PQQ的菌株。
用紫外光照射后，会造成培养微生物的死亡，常以“致死率”来表示，即为紫外光诱导的细菌死亡数与液体培养基中细菌总数的比值。由于不同菌株在不同生长期对紫外光照射的敏感度不同，因此致死率也不同。经研究表明如果照射后致死率过低(低于70％)，则细菌突变的结果不能令人满意，PQQ产量高的菌株很难获得。而致死率过高(高于80％)，则PQQ产量高的菌株也难以获得，因为液体培养基中的细菌量大量下降，许多突变株难以存活。因此，需选用相对适中的致死率用于菌株的筛选。优选采用导致70％-80％致死率，更优选72％-78％致死率，最优选75％致死率(即紫外照射后75％的细菌死亡)的照射时间来进行紫外光照射。
由上述根据致死率进行的诱变方法获得两百株突变株，然后将其置于黑暗环境液体培养基中培养，检测每株菌的PQQ产量。选择其中产量较高的10株，并在摇瓶中将其传10代，得到本发明稳定的PQQ高产突变菌株。
另一种优选的诱变方法为离子束诱变，所用离子束为氮离子束。优选采用能量水平为能量为10keV-20keV，最优选20keV的离子束照射菌株，可将所述菌株涂布于培养皿中。
离子束暴露损伤微生物的遗传物质，产生突变株。特别是，暴露于离子束的细菌发生突变，例如染色体畸变、DNA分子中四种碱基损伤和断裂，引起遗传物质损伤，大量突变株产生以筛选出PQQ产量高的细菌。离子束诱变筛选的具体方法在实施例中有详细描述。
离子束诱变后的到100株突变株，将其于液体培养基中培养，检测每株菌的PQQ产量。选择其中产量较高的10株，并在摇瓶中将其传6代。因此得到稳定地PQQ产量高的突变菌株。
通过紫外和离子束照射的到的突变菌株有U-H103、U-MT12、U-T187、E-H177、E-MT145和E-T128，优选于2008年1月17日提交并保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号为CCTCC M 208013的U-H103突变菌株，其为生丝微菌菌株的突变株。
这些突变菌株与它们的原始菌株在细胞形态和集落形态上均不相同。突变的生丝微菌菌株为杆形、革兰阴性菌。它们形成白色集落，在固体培养基上较老的菌落呈浅褐色和黄色。在液体培养基中混浊，易附着于培养瓶壁上。U-H103(CCTCC M 208013)和E-H177是从生丝微菌菌株突变而来，它们的集落比生丝微菌菌株更大，微黄色，微干。嗜碱噬甲基菌突变株为杆形、革兰阴性菌。它们形成黄色集落，在固体培养基上略干。在液体培养基中它们明显混浊并易沉淀。U-MT12和E-MT145是从嗜碱噬甲基菌菌株突变而来，它们的集落比嗜碱噬甲基菌菌株更大。硫杆菌突变株为短杆形、革兰阴性菌。它们在固体培养基形成无色潮湿集落。在液体培养基中它们易形成膜。U-T187和E-T128是从硫杆菌菌株突变而来，它们的集落微黄微干。由此产生的突变株能稳定地产生大量PQQ。该方法适用于大量生产PQQ。
所述PQQ高产突变菌株的PQQ产量为诱导前产PQQ菌株产量的1.25倍至10倍，优选1.5倍至8倍，更优选2倍至5倍。
B.PQQ的纯化
本发明还提供了对PQQ进行进一步纯化的方法。优选在培养微生物和生产PQQ之后，分离纯化结晶PQQ。本发明包含了过滤、离心、过DEAE色谱层析柱、酸沉淀和结晶等步骤，从而得到纯化结晶PQQ。
通过离心得到微生物培养物的含有PQQ的液体，所述液体需储存在4-10摄氏度条件下。记录得到的发酵液上清量，细菌浓度(OD600)和PQQ产量。收集的发酵液通过大量高速离心获得上清。可通过过滤等方法减少液体中的微生物碎片和大分子量物质，例如采用1.2μM的滤膜过滤。
在本发明的一个实施方式中，采用DEAE离子交换柱去除大量杂质。该处理在18-25℃，优选20-22℃条件下，在pH值6.0-9.0，优选7.0-8.0下，使用平衡液预处理的DEAE离子交换柱来进行。经过离心过滤处理好的上清4.5-5.0L用蒸馏水调节到电导400-500μs/cm，pH 7.0-8.0。把配好的液体上到DEAE柱，流速控制在25ml/min。上清上完后，用洗液A和B洗，流速控制在25ml/min，直到洗涤液使PQQ条带下移到1/4柱的地方。在DEAE柱洗涤好之后，用洗脱液洗脱。同时可以观测到棕红色PQQ的条带往下移动。下移到底部时，收集流出的液体并记录液体的体积。收集完毕后，测量液体中PQQ的含量，计算DEAE柱的效率。洗脱完毕后，用洗液再生柱子，流速控制在25ml/min。
在本发明的另一实施方式中，通过酸沉淀和/或结晶得到纯化的PQQ。PQQ的等电点是pH 2.75。在20-25度，pH 7.0的水溶液中，PQQ的容量大约是1-2mg/ml。PQQ的溶解度随着温度和pH的下降而逐渐减少。在pH 2.75时，大部分的PQQ会沉淀下来。并且随着温度下降到2-8度时，溶液中98％的PQQ会结晶，但有一些杂质也会同时结晶出来。因此酸沉淀和低温结晶被用于PQQ的纯化。
在本发明的一个具体实施例中，调节含PQQ溶液的pH值到2-3，优选2.75(优选使用2N HCl)。然后把调好pH的溶液放在2-8度冰箱，直至完全结晶。通过低温高速离心洗涤并收集沉淀的PQQ结晶，可重复该步骤数次以得到纯的PQQ。检测PQQ样品的浓度和纯度，并将PQQ保存于-80℃。可进一步通过冷冻干燥获得棕红色的PQQ粉末。使用如上的方法，可以得到85％以上纯度的PQQ。
在另一实施方式中，为了去除杂质得到纯的PQQ，使用超滤方法优化PQQ纯化技术。优选使用了MiliporeTM的5K/8K/10K/30K/50K的超滤膜包和系统来处理含PQQ的液体，然后再进行等电点沉淀。采用该技术，可使PQQ纯度达到98％以上。也可用使用超滤法(优选使用8kd膜包)处理上DEAE柱后的洗脱液以明显去除蛋白质，将PQQ纯度提高到98％以上。使用超滤法(优选8kd膜包)处理在上DEAE柱之前的发酵液，同样也可以提高PQQ纯度到98％以上。
可以单用或联合使用上述的纯化方法，优选使用降低pH、低温结晶与超滤法的组合。经纯化后吡咯并喹啉醌的纯度至少为85％，优选至少为90％，更优选至少为95％，最优选至少为98％。
本发明的优点
1.通过在食品中添加PQQ的方法，抑制了食品中微生物的生长，延长了食品的保质时间，并且还保持了食品原有风味和增强了食品的营养价值；
2.提供了PQQ的制备和纯化方法，为工业化生产PQQ提供了步骤简便、成本低廉、且所得PQQ纯度高的方法。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1.PQQ对食物中常见微生物生长的抑制作用
本实施例的目的是为了证明PQQ对食物中常见微生物生长的抑制作用。
在本实施例中，选择Top10大肠杆菌和氨苄抗性(Ampr)大肠杆菌作为细菌样本。将这些细菌分别在加入不同浓度PQQ的LB培养基中于试管中培养。LB培养基配制方法如下：将10g细菌用胰蛋白胨(Bacto-tryptone)、5g酵母提取物和10g NaCl加入800ml蒸馏水，用NaOH将溶液pH值调至7.5，然后将总体积定容至1L，随后高压灭菌。
PQQ浓度范围为0至100mg/升LB培养基。以1×105个/管的浓度将细菌接入试管中，根据下述实验设计在37摄氏度摇床上振摇指定时间。众所周知，氨苄青霉素对于具有氨苄抗性的大肠杆菌没有作用，但对于其它细菌的生长具有抑制作用。因此，氨苄实验的数据关注于氨苄抗性大肠杆菌的生长。而对于Top10大肠杆菌来说，其它细菌也可能在培养基中生长。
表1和图1显示了Top10大肠杆菌和氨苄抗性大肠杆菌培养6、8和9.5小时后OD600的值。OD600是在600nm波长条件下检测液体培养基中浓度的指标。该数值与细菌浓度有关。数值越高表示培养基中细菌的量越大，本实施例中OD600表明了液体培养基中细菌的量，是检测微生物生长的标准方法。OD600值由分光光度计测得，使用纯培养基作为空白对照。培养基中大肠杆菌OD600值与细菌浓度的换算关系是1OD＝3.8×108个大肠杆菌。
表1.PQQ处理后的OD600测量值
| PQQ(mg/L) | 6小时 | 8小时 | 9.5小时 | |||
| Top10 | Ampr | Top10 | Ampr | Top10 | Ampr | |
| 0 | 0.294 | 0.145 | 0.433 | 0.331 | 0.451 | 0.421 |
| 0.1 | 0.303 | 0.143 | 0.416 | 0.331 | 0.451 | 0.401 |
| 1 | 0.293 | 0.145 | 0.445 | 0.335 | 0.452 | 0.408 |
| 25 | 0.251 | 0.087 | 0.433 | 0.268 | 0.472 | 0.356 |
| 50 | 0.208 | 0.052 | 0.413 | 0.169 | 0.457 | 0.298 |
| 75 | 0.165 | 0.04 | 0.386 | 0.122 | 0.446 | 0.239 |
| 100 | 0.163 | 0.03 | 0.378 | 0.088 | 0.431 | 0.192 |
| Amp/kana | 0.007 | 0.006 | 0.01 | 0 | 0.013 | 0.006 |
图1和表1显示了随着PQQ浓度的增加，大肠杆菌和氨苄抗性大肠杆菌的浓度呈下降的趋势。该实验证明了大肠杆菌的生长受到PQQ的抑制，也显示了PQQ抑制细菌生长主要在生长期而不是平台期。
实施例2.PQQ对食物中细菌生长的抑制作用
本实施例的目的是证明PQQ抑制细菌生长从而延长食物保质期的作用。
将PQQ加入未经巴氏消毒的牛奶，样品PQQ按照终浓度0、0.1、1和10mg/L配制。然后置于37摄氏度摇床振摇，于3、6、9小时收集样品保存于4摄氏度。第二天，将液体LB培养基加入收集样品中，在置于摇床振摇24小时，检测其OD600值。
图2显示了OD600值。数据清楚地显示，混合6小时和9小时后，随着PQQ浓度的增加，细菌量降低，表明PQQ抑制了牛奶中细菌的生长，由此可延长其保质期。
获得高纯度的PQQ涉及两个重要方面：1.选择合适的PQQ高产细菌；2.用一种新的方法纯化和结晶PQQ。以下实施例3-6的目的是提供了一种大规模生产、纯化和结晶PQQ的方法。该方法以低投入、高通量的微生物发酵法生产PQQ。
实施例3.微生物的培养和PQQ的合成
1.液体培养基的配制
在1L去离子水中加入：3g(NH4)2SO4、1.4g KH2PO4、3g Na2HPO4、0.1gMgSO4、8g甲醇、100μg Fe和1ml微量元素母液，搅拌均匀，配成液体培养基，储存于2-4℃。
微量元素母液的配制如下：在1L去离子水中加入0.1g ZnSO4·7H2O、0.1gCaCl2·2H2O、0.01g NaCl、0.005g CuSO4·5H2O、0.005g MnSO4·3H2O、0.001gH3BO3和0.05g KI，搅拌均匀，配成微量元素母液，储存于2-4℃
2.固体培养基的配制
将2％琼脂加入到液体培养基中，所述液体培养基如下配制：在1L去离子水中加入3g(NH4)2SO4、1.4g KH2PO4、3g Na2HPO4、0.1g MgSO4、100μg Fe，和1ml微量元素母液。搅拌均匀后，灭菌处理(121℃，20min)。待培养基冷却到50℃左右，再加入0.8％的甲醇，待培养基凝固后，储存于2-4℃。
3.细菌培养的具体方法
将生丝微菌菌株、嗜碱噬甲基菌菌株和硫杆菌菌株用作PQQ的生产菌株。
将1ml上述菌株的菌液接种到100ml液体培养基中，在30℃下，120rpm/min，培养24小时后，制成细菌悬液。取1ml菌液，采用混菌法稀释，进行菌落计数。混均法如下：吸取0.5ml培养液放入4.5mL PBS中即为10-1稀释液，如此重复，可依次制成10-3～10-8的稀释液。
然后进行菌落计数。菌落计数方法(在无菌状态下进行)：去10-8、10-7、10-6三管稀释液各1mL，分别接人相应标号的培养皿中，每个稀释度接三个培养皿；然后取冷却至50℃的牛肉膏琼脂培养基，分别倒入以上培养皿中(装量以铺满皿底高1.5～2mm为宜)，迅速轻轻摇动培养皿，使菌液与培养基充分混匀，但不沾湿皿的边缘，待琼脂凝固即成细菌平板。培养48h后计数每板的菌落数，选取菌落数在30-300之间的平板，计算同一稀释度三平板的菌落平均数，乘以该稀释倍数即为总菌数.
从培养好的原始菌液中取5ml到装有45ml PBS缓冲液的培养皿中，制成细菌悬液。
PBS的配制方法如下：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24gKH2PO4溶解于800ml去离子水中，用HCl将溶液的pH调到7.4，再加入去离子水至终体积为1L。
4.采用紫外诱变法诱变细菌及PQQ高产突变菌株的筛选
接着，用紫外(UV)诱变的方法对细菌悬液进行诱变，最终得到致死率为75％所对应的菌种诱变时间。选取致死率为75％所对应样品进行筛选。
紫外诱变的方法描述如下：从培养好的原始菌液中取5ml入到装有45mlPBS缓冲液的培养皿中。将制备好的菌悬液培养皿置于磁力搅拌器上，与紫外灯管保持30cm的距离。开启紫外灯，打开培养皿并开启磁力搅拌器，使细胞尽可能均匀地吸收紫外光。在紫外线的照射过程中，间隔取样，每次取样1ml，在冰箱内保存1～2h。以上操作在无光的条件下进行。对取出的样品进行菌落计数(方法同前)，并计算致死率；
致死率＝(诱变前总菌数-诱变后活菌数)/诱变前总菌数×100％，
最终得到致死率为75％所对应的菌种诱变时间。选取致死率为75％所对应样品进行以下筛选。
紫外诱变后PQQ高产突变菌株的筛选方法如下：将200株诱变后的菌株同时接入到液体培养基中，30℃，200rpm/min条件下培养7天。计算PQQ的产量，挑选PQQ产量高的10株菌进行传代实验，经10代传代培养及摇瓶培养，得到稳定性良好的株菌。
由紫外诱变生丝微菌菌株、methylophage thalassica菌株和硫杆菌菌株分别得到PQQ高产突变菌株U-H103(CCTCC M 208013)、U-MT12和U-T187。
5.采用离子束诱变法诱变细菌及PQQ高产突变菌株的筛选
离子束诱变细菌的方法如下，将涂布细菌的培养皿置于微环境靶室的水冷靶台上，微环境靶室预抽至100Pa，打开隔离阀。待主真空室的真空度达1023Pa时开始离子注入。选用氮离子，能量为20keV，脉冲式注入，脉冲宽度5s，间隔55s。注入总剂量为0.52x1015个离子/cm2。达到总注入剂量后停机取出培养皿，以1mL无菌水洗脱，稀释成各浓度的悬液，分别涂布于平板培养基上，30℃培养7天，用于单菌落的挑选。
离子束诱变后PQQ高产突变菌株的筛选方法如下：将100株诱变后的菌株同时接入到液体培养基中，30℃，200rpm/min条件下培养7天。计算PQQ的产量，挑选PQQ产量高的10株菌进行传代实验，经6代传代培养及摇瓶培养，得到稳定性良好的株菌。
由离子束诱变生丝微菌菌株、methylophage thalassica菌株和硫杆菌菌株分别得到PQQ高产突变菌株E-H177、E-MT145和E-T128。
6.PQQ高产菌株的PQQ产量
将不同的菌株在液体培养基中培养，最终计算PQQ的产量。
在装料量为50ml的250ml摇瓶里分别培养：生丝微菌ATCC No：27501、ATCC No：27500、ATCC No：33404、U-H103(CCTCC M 208013)、E-H177、嗜碱噬甲基菌ATCC BAA-297、U-MT12、E-MT145、硫杆菌ATCC No：8093、U-T187、或E-T128，pH＝7，200rpm/min。7天后测OD600和PQQ产量。结果见表2：
表2.产PQQ菌株的OD600值和PQQ产量
| 菌株 | OD600 | PQQ(μg/ml) |
| 生丝微菌ATCC No：27501 | 1.9 | 4.3 |
| 生丝微菌ATCC No：27500 | 1.5 | 4.5 |
| 生丝微菌ATCC No：33404 | 1.7 | 4.2 |
| U-H103 CCTCC M 208013 | 2.3 | 6.3 |
| E-H177 | 3.1 | 8.2 |
| 嗜碱噬甲基菌ATCC BAA-297 | 1.4 | 3.2 |
| U-MT12 | 1.9 | 5.6 |
| E-MT145 | 2.2 | 6.4 |
| 硫杆菌ATCC No：8093 | 1.9 | 5.3 |
| U-T187 | 2.4 | 6.7 |
| E-T128 | 3.2 | 9.3 |
以上结果显示，经诱变和筛选所得突变菌株可获得较高的PQQ产量。
实施例4.生产PQQ细菌的优化培养基的选择
为了进一步提高PQQ产量，进行前体试验、碳源试验、吐温试验来优化培养基，寻找适合于PQQ合成的培养基条件。试验结果如表3～5所示。
1.前体试验
前体试验设计如下：PQQ的两个主要前体为酪氨酸(Tyr)和谷氨酰胺(Gln)，因此，可以在发酵培养的过程中加入该前体，以提高PQQ合成的产率。
本试验中，将硫杆菌菌株在装料量为50ml的250ml摇瓶中培养7天，培养条件为30℃，pH＝7，200rpm/min，并加入不同浓度(W/V：重量与体积比)的酪氨酸和谷氨酰胺，测量对于菌体密度OD600和PQQ产量的影响。前体实验的结果如表3所示：
表3.添加PQQ合成前体对OD600值和PQQ产量的影响
| PQQ合成前体的种类和加入量(W/V) | OD600 | PQQ(μg/ml) |
| Tyr(1‰) | 0.9 | 2.3 |
| Tyr(0.1‰) | 2.2 | 7.8 |
| Tyr(0.01‰) | 1.8 | 6.1 |
| Gln(1‰) | 1.1 | 2.1 |
| Gln(0.1‰) | 2.3 | 7.4 |
| Gln(0.01‰) | 1.7 | 5.8 |
| Tyr(1‰)+Gln(1‰) | 0.8 | 1.8 |
| Tyr(0.1‰)+Gln(0.1‰) | 2.6 | 11.2 |
| Tyr(0.01‰)+Gln(0.01‰) | 1.8 | 5.9 |
前体试验结果表明：添加前体酪氨酸0.1‰(W/V)和谷氨酰胺0.1‰(W/V)能够明显促进细菌的生长并提高PQQ的产量。
2.碳源试验
碳源试验设计如下：按照表4所示方法培养细菌菌株生丝微菌、嗜碱噬甲基菌、硫杆菌：培养在装料量为50ml的250ml摇瓶中培养7天，培养条件为30℃，pH＝7，200rpm/min，并添加不同的碳源：甲醇、乙醇、乙醛、乙酸钠、D-葡萄糖、甘油、D-果糖、D-甘露醇、乳糖、蔗糖或者D-半乳糖(培养基中碳元素的终浓度均为3g/L)。表4记录不同菌株在不同碳源培养下的PQQ产量：
表4.不同碳源对于PQQ产量的影响
表中数字为不同菌株在不同碳源下培养后的PQQ产量；
PQQ的单位为μg/ml； -*表示PQQ＜1μg/ml
上述结果显示，以上菌株在多种碳源下均可产生PQQ，例如甲醇、乙酸钠、甘油和D-甘露醇，其中以甲醇的作用最明显。
3.吐温试验
吐温80作为一种表面活性剂，是耐热的水溶性脂肪酸的酯类物质，可降低细菌菌体与培养基接触面之间的表面张力，能刺激多种酶排出体外，能影响微生物细胞的膜通透性，促进营养物质进入细胞和代谢产物排出体外。
吐温试验设计如下：按照表5的方法，将细菌菌株生丝微菌、嗜碱噬甲基菌、硫杆菌培养在装料量为50ml的250ml摇瓶中培养7天，培养条件为30℃，pH＝7，200rpm/min，并添加不同浓度的吐温(V/V：体积/体积)。表5记录不同菌株在不同浓度的吐温培养下的PQQ产量。
表5.吐温80对于PQQ产量的影响
吐温试验的结果表明，添加吐温80能够提高PQQ的产量，特别是1‰(V/V)的吐温80。
实施例5.PQQ的大规模生产
PQQ的大规模生产过程如以下实验1到实验6所示。本实验提供了简便、低耗的大规模生产PQQ的方法。
实验1
将菌株生丝微菌ATCC No：27501置于50L发酵罐中进行培养，装料量为30L，培养基参照实施例3第一部分。在50L发酵罐内的7天发酵过程中维持以下基本参数：温度＝30℃，pH＝7(通过流加氨水控制)，发酵罐中甲醇浓度保持在8‰左右(w/w)。7天后PQQ的产量为103μg/ml。
实验2
将菌株嗜碱噬甲基菌株ATCC BAA-297置于50L的发酵罐中进行培养，装料量为30L，培养基为参照实施例3第一部分。在50L发酵罐内的7天发酵过程中维持以下基本参数：温度＝30℃，pH＝7(通过流加氨水控制)，发酵罐中甲醇浓度保持在8‰左右(w/w)。7天后PQQ的产量为87μg/ml。
实验3
菌株硫杆菌ATCC No：8093在50L的发酵罐中进行培养，装料量为30L，培养基为参照实施例2第一部分。在50L发酵罐内的7天发酵过程中维持以下基本参数：温度＝30℃，pH＝7(通过流加氨水控制)，发酵罐中甲醇浓度保持在8‰左右(w/w)。7天后PQQ的产量为133μg/ml。
实验4
与实验1同样的菌株在同样的培养基条件下，同时加入酪氨酸(0.1‰W/V)、谷氨酰胺(0.1‰W/V)和吐温80(1‰V/V)。PQQ的产量为163μg/ml。
实验5
与实验2同样的菌株在同样的培养基条件下，同时加入酪氨酸(0.1‰W/V)、谷氨酰胺(0.1‰W/V)和吐温80(1‰V/V)。PQQ的产量为143μg/ml。
实验6
与实验3同样的菌株在同样的培养基条件下，同时加入酪氨酸(0.1‰W/V)、谷氨酰胺(0.1‰W/V)和吐温80(1‰V/V)。PQQ的产量为250μg/ml。
实施例6.PQQ的纯化
PQQ纯化的主要过程包括：过滤、离心、DEAE柱分离、超滤、酸沉淀和离心结晶。
1.上清液的制备
采用实施例5所述方法获得发酵液。发酵液储存于4-10摄氏度，测量发酵液的OD600和PQQ含量。
将发酵液置于大容量高速离心机(HITACHI CR22ETM)中，8000rpm，10摄氏度，离心15分钟，收集上清。然后用1.2μm的滤膜过滤上清，进一步除去细胞碎片和大分子固体。
2.DEAF柱分离
PQQ的等电点是pH 2.75。柱分离是在以下条件中进行的：温度控制在20～22摄氏度，pH控制在7.0～8.0之间。下面是一个简要的例子：
步骤1.DEAE柱的准备和预处理
DEAE树脂购自Amersham Bioscience。400ml的树脂预装到Φ5.0cm，高度30cm的玻璃柱中。用3倍体积的蒸馏水清洗，流速控制在25ml/min。
步骤2.平衡DEAE柱
平衡液A：0.1M Tris，pH 8.00，2L
平衡液B：20mM Tris，pH 8.00，5L
用5倍体积的平衡液A处理，流速控制在25ml/min。再用10倍体积的平衡液B处理，流速控制在25ml/min。直到流出液与平衡液B有相同的电导和pH值。
步骤3.DEAE柱上样
经过离心过滤处理好的上清4.5-5.0 L用蒸馏水调节到电导400-500s/cm，pH7.0-8.0。把配好的液体上到DEAE柱，流速控制在25ml/min。
步骤4.DEAE柱洗涤
洗涤液A：20mM Tris，pH 8.00，1L
洗涤液B：20mM Tris，0.2M NaCl，pH 8.00，3L
用1～2倍体积的A液洗，流速控制在25ml/min，然后再用5～7倍体积的B液洗，流速控制在25ml/min，直到洗涤液使PQQ条带下移到1/4柱的地方。
步骤5.PQQ的洗脱
洗脱液：20mM Tris，0.65M NaCl，pH 8.00，2L
在DEAE柱洗涤好之后，用洗脱液洗脱。同时可以观测到棕红色pqq的条带往下移动。下移到底部时，收集流出的液体并记录液体的体积。收集完毕后，测量液体中PQQ的含量。
步骤6.DEAE柱的再生
在PQQ洗脱完毕后，DEAE柱由下列的方法再生：
用5倍体积的洗涤液(20mM Tris，1.5M NaCl，pH8.00)处理，流速控制在25ml/min。
用5倍体积的蒸馏水处理，流速控制在25ml/min。
用5倍体积的0.2M HCl处理，流速控制在25ml/min。
用5倍体积的蒸馏水处理，流速控制在25ml/min。
用5倍体积的0.5M NaOH处理，流速控制在25ml/min。
用5倍体积的蒸馏水处理，流速控制在25ml/min。
步骤7.DEAE柱的保存
用5倍体积的20％的乙醇处理，流速控制在25ml/min。
3.酸沉淀和PQQ的结晶
PQQ的等电点是pH2.75。在20-25度，pH7.0的水溶液中，PQQ的容量大约是1-2mg/ml.PQQ的溶解度随着温度和pH的下降而逐渐减少。在pH 2.75时，大部分的PQQ会沉淀下来。并且随着温度下降到2-8摄氏度时，98％的PQQ会结晶。因此酸沉淀和低温结晶被用于PQQ的纯化。具体操作如下：
步骤1.用酸调节含PQQ溶液的pH值
用2N HCl调节含PQQ溶液的PH值到2.75，搅拌10min。
步骤2.低温结晶PQQ
把调好pH的溶液放在2-8摄氏度冰箱，放置5-7天直至完全结晶。
4)收集PQQ
下面用到的所有物质预先用pH 2.75 HCl处理，保存于2-8摄氏度。
步骤1.收集PQQ
把含有结晶PQQ的液体用大容量高速离心机以10000rpm，4摄氏度离心20min，收集沉淀。
步骤2.洗涤PQQ
用预冷的pH 2.75 HCl洗涤，10000rpm，4度离心20min，收集沉淀。洗涤3次后，收集最终沉淀，测量PQQ的质量和纯度，产品放于-80摄氏度保存。
步骤3.冷冻干燥PQQ
冷冻干燥完毕后，可以获得棕红色的PQQ粉末。
5)使用超滤技术提高PQQ纯度
使用如上的方法，可以得到85％以上纯度的PQQ。然而使用下面的技术，纯度达到98％以上。
分析上述方法得出的PQQ，我们发现还有大约14％的杂质，其中包括一些氯化钠、水以及未知的成分。
为了提高PQQ的纯度，进一步使用了MiliporeTM的5K/8K/10K/30K/50K的超滤膜包和系统来处理含PQQ的液体，然后再进行等电点沉淀。为了测量在不同条件下洗涤出的溶液成分，用测量蛋白质的经典的Lowry法测量。测量结果如下：
表6.超滤膜包过滤前后的PQQ浓度(单位：g/l)
| 超滤膜包种类 | 过滤前PQQ浓度 | 过滤后PQQ浓度 | 过滤前蛋白质浓度 | 过滤后蛋白质浓度 |
| 5K | 1.32 | 1.12 | 1.84 | 0.11 |
| 8K | 1.32 | 1.24 | 0.84 | 0.13 |
| 10K | 1.32 | 1.26 | 0.84 | 0.37 |
| 30K | 1.32 | 1.27 | 0.84 | 0.42 |
| 50K | 1.32 | 1.29 | 0.84 | 0.45 |
结果显示，使用8K膜包处理上DEAE柱后的洗脱液能够明显去除蛋白质，将PQQ纯度提高到98％以上。
使用8K膜包处理在上DEAE柱之前的发酵液，同样也可以将PQQ纯度提高到98％以上。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种对食品进行处理的方法，其特征在于，所述方法包括：将吡咯并喹啉醌活性物质作为微生物生长抑制剂添加到所述食品中。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吡咯并喹啉醌活性物质选自：吡咯并喹啉醌、吡咯并喹啉醌的食品学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、异构体、或它们的混合物。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述吡咯并喹啉醌活性物质的加入量为所述食品重量的0.001wt％至19.9wt％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的食品包括食品原料、半成品或成品。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物选自：腐败菌、致病性细菌、真菌、酵母菌、大肠埃希菌。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述食品选自：乳制品、脂肪、油、脂肪乳、可食用冰、水果、蔬菜、海产品、坚果、种子、糖果、谷类食物或其衍生物、肉或肉产品、鱼类食品、蛋或蛋制品、调味品、豆制品、合成食品、快餐、饮料。
7.一种吡咯并喹啉醌活性物质的用途，其特征在于，用于制备抑制微生物在食品中生长的微生物生长抑制剂。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述添加剂包含：
a)抑制食品中微生物生长有效量的吡咯并喹啉醌活性物质；和
b)食品学上可接受的载体或赋形剂。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，吡咯并喹啉醌活性物质还用于作为或制备延长食品保质时间的食品添加剂。
10.一种食品组合物，其特征在于，所述的组合物包括：
(a)食品；和
(b)作为微生物生长抑制剂的吡咯并喹啉醌活性物质。
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Date of cancellation: 20221215 Granted publication date: 20110928 Pledgee: Shandong Zhucheng rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: ZHUCHENG HAOTIAN PHARM Co.,Ltd. Registration number: Y2021980015486 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A fortified food containing pyrroloquinoline quinone Effective date of registration: 20221216 Granted publication date: 20110928 Pledgee: Shandong Zhucheng rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: ZHUCHENG HAOTIAN PHARM Co.,Ltd. Registration number: Y2022980027969 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Date of cancellation: 20231127 Granted publication date: 20110928 Pledgee: Shandong Zhucheng rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: ZHUCHENG HAOTIAN PHARM Co.,Ltd. Registration number: Y2022980027969 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: A fortified food containing pyrroloquinoline quinone Effective date of registration: 20231204 Granted publication date: 20110928 Pledgee: Shandong Zhucheng rural commercial bank Limited by Share Ltd. Pledgor: ZHUCHENG HAOTIAN PHARM Co.,Ltd. Registration number: Y2023980069152 |
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