CN101200490A

CN101200490A - 高纯度丹参酮ⅱa的制备方法

Info

Publication number: CN101200490A
Application number: CNA2007101722518A
Authority: CN
Inventors: 周长新; 朱志彬; 赵霞; 尹金瑶
Original assignee: SHANGHAI LANGSA MEDICINE SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI LANGSA MEDICINE SCIENCE AND TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2007-12-13
Filing date: 2007-12-13
Publication date: 2008-06-18

Abstract

本发明涉及一种高纯度丹参酮IIA的制备方法，包括：(1)将药材丹参根及根茎以醇提取，浓缩析出胶质，过滤或离心除去杂质；(2)加水，得丹参总酮沉淀，过滤干燥；(3)将丹参总酮采用正相层析，通过多功能层析系统进行分离，洗脱液浓缩，重结晶，得高纯度丹参酮IIA。该方法收率及纯度高、成本低，适合大规模生产。

Description

高纯度丹参酮ⅡA的制备方法

技术领域

本发明属丹参酮IIA的制备方法领域，特别是涉及一种高纯度丹参酮IIA的制备方法。

背景技术

丹参为唇形科鼠尾草属植物(Salviamiltiorrhiza Bunge)丹参的干燥根部及根茎，具活血化瘀，凉血消肿，清心除烦之功效。丹参酮IIA(Tanshinone IIA，Tan)结构如图1，是丹参中含量较高，是主要的药效成分之一，对心脑血管疾病、肿瘤、白血病等具有潜在的治疗作用，已引起国内外学者的重视【李瑞环，王玲.丹参酮IIA的药理研究进展.现代中西医结合杂志，2006，15(23)：3303-3305】。

然而作为主要的有效成分之一，丹参酮IIA目前常用的提取分离方法中普遍存在得率低，溶剂消耗量大，能耗大等问题，主要原因在于工艺流程过长、后处理方法繁琐，如文献报道采用一定浓度的乙醇提取获得浸膏后，用热水洗去浸膏中的水溶性成分，再通过氧化铝柱层析以苯等有机溶剂洗脱分段切割法等来分离出较纯的单体成分【王庆伟，杨频，张立伟.丹参酮的有效分离.山西大学学报(自然科学版)，1994，17(3)：294-298】。由于该方法操作复杂、步骤多，且使用的溶剂有很强的毒性，既污染环境，又危害人们的身体健康，对于长时间做此分离工作的人员有较大的伤害，难以在工业化生产中应用。也有在用乙醇提取丹参获得浸膏，再用甲醇溶解除去不溶性杂质，将甲醇溶解物采用Sephadex LH-20分离获得丹参酮IIA的报道【董蕊，郑毅男.丹参中丹参酮成分的分离与鉴定.吉林师范大学学报(自然科学版)，2004，5(2)：100-104】，但由于Sephadex LH-20材料昂贵、载样量小，因此目前多停留在实验室研究阶段。

由于丹参酮中存在丹参酮IIA、丹参酮IIB、丹参酮I、隐丹参酮等一系列化学结构极其相似的化合物，使得丹参酮IIA的纯化工作非常困难。然而随着近年来分子生物学和细胞生物学的研究进展，发现丹参酮IIA越来越广泛、突出的生物活性，如可抑制AngII所诱导的心肌细胞的凋亡和肥大【谢辉，郑智.丹参酮IIA对血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大、凋亡的影响.高血压杂志，2004，12(4)：359】、显著改善自发性高血压大鼠的左心室肥厚【柳锋，郑智，钟强.丹参酮IIA对自发性高血压大鼠左心室肥厚心肌细胞凋亡的影响.中华实用中西医杂志，2004，17(8)：1096】，对大鼠肝星状细胞氧应激所致脂质过氧化的抑制作用，在细胞水平上表现出显著的抗肝纤维化效应【杨伟峰，陈厚昌，夏笔军.丹参酮IIA对肝星状细胞增殖及分泌细胞外基质的影响.实用医学杂志，2003，19(11)：1191】以及通过改善脑线粒体能量代谢、抗氧化作用对脑缺血再灌注损伤的保护作用【胡霞敏，周密妹，胡先敏，王君.丹参酮IIA对脑缺血再灌注大鼠脑损伤的保护作用及对能量代谢的影响.中国临床药学杂志，2006，15(3)：176-179】。随着研究的深入展开，丹参酮IIA的需求会不断增加，因此迫切需要研制出一种低毒、低能耗、高纯度、高收率的丹参酮IIA的制备方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高纯度丹参酮IIA的制备方法，该方法不仅适合实验室制备高纯度丹参酮IIA样品，更适合工业化生产的要求。

本发明的高纯度丹参酮IIA的制备方法，包括下列步骤：

(1)将药材丹参根及根茎以醇提取，浓缩析出胶质，过滤或离心除去杂质；

(2)加水，得丹参总酮沉淀，过滤干燥；

(3)将丹参总酮采用正相层析，通过多功能层析系统进行分离，洗脱液浓缩，重结晶，得高纯度丹参酮IIA。

所述步骤(1)中的以醇提取是用甲醇或乙醇经回流、超声或渗漉方法提取；

所述步骤(2)中的加水是加水量为1％～99％；

所述多功能层析系统是集回流、柱色谱分离、样品收集于一体的系统，其中样品洗脱采用回流方法，可根据需要选择减压回流及常压回流，温度控制在0～60℃，设备示意图见图2；

所述多功能层析系统的柱色谱分离中的色谱分离溶剂为一种低极性与一种中极性溶剂的组合，其体积比为99∶1～90∶10，其中低极性溶剂为石油醚、正己烷或环己烷中的一种，中极性溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷中的一种；

所述多功能层析系统的柱色谱分离中的色谱材料为硅胶或氧化铝；

所述步骤(3)中的浓缩是得含量90％-100％的丹参酮IIA；

所述步骤(3)中的重结晶是用乙醇反复重结晶；

所述的高纯度丹参酮IIA是含量98％～100％丹参酮IIA，该丹参酮IIA可以通过药剂学方法制成注射剂。

本发明采用的多功能层析系统主要由三部分组成：底部溶剂回流装置、恒压滴液装置、冷凝装置，为便于说明，以玻璃仪器装置图示意说明如下：

(1)溶剂回流装置

该部分既相当于加热引起回流的热源部分，又相当于柱色谱的溶剂接收装置，主要包含三部分：1A、1B、1C，其中1A为装洗脱溶剂的装置，在实验室装置中可为三颈瓶；1B为回流洗脱完后溶剂的出口；可以真空抽出，1C为溶剂加入的进口。在实验室操作中回流的热源常用水浴，在工业化生产中可以将1A制造成带夹层的提取罐，夹层通入蒸汽加热形成溶剂回流。

(2)恒压滴液装置

该部分实际上相当于一个柱色谱系统，主要包含2A、2A′、2B、2C，其中2A、2A′为两个活塞连接装置，2A相当于层析柱的开关，2A′处的活塞在回流洗脱后溶剂从1B抽出时处于关闭状态，保证真空度；2B为装填色谱材料的层析系统，可以做成球形、梨形，目的是增大体积、降低普通柱层析的高度以方便操作，该部分可以装填硅胶或氧化铝；2C为该系统装填色谱材料的侧方开的进口。

(3)冷凝装置

该部分在实验室操作时可以接一球形冷凝管(3A)，上部通过连接活塞(3B)引入真空减压操作，使1A的溶剂加热在较低温度下即可形成回流。在工业化生产中，3A设备通常为冷却塔，3B为经冷却塔接入真空系统的配套连接口。

本发明的有益效果：

(1)本发明工艺过程简单、可控，用醇溶液提取丹参药材继而通过浓缩后冷却静置，除去胶质，加入适当量的水得到丹参总酮的沉淀，大大简化了操作程序；

(2)本发明工艺过程污染小、成本低，本发明在整个工艺过程中舍弃了苯、氯仿等毒性大的溶剂，改用基本无毒的己烷、乙酸乙酯等系统，大大降低了对操作人员的危害，减少了环境污染，非常适合工业化生产；

(3)本发明分离速度快，生产周期短，采用多功能层析系统使得回流、柱色谱分离、样品收集于一体，通过重结晶，2～3天即可完成一个生产周期，因此具有很好的应用前景。

附图说明

图1是丹参酮IIA的结构式；

图2是实施例1中提取丹参总酮的流程图；

图3是本发明中的多功能层析系统；

图4是实施例1中制得的丹参酮IIA的HPLC谱图；

图5是实施例2中制得的丹参酮IIA的HPLC谱图；

图6是实施例3中制得的丹参酮IIA的HPLC谱图；

图7是实施例4中制得的丹参酮IIA的HPLC谱图；

图8是丹参酮IIA的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

1.丹参总酮的提取

取丹参药材10kg(直径约1cm)，加入8倍量95％乙醇80℃回流提取2h，过滤，药渣再加入6倍量95％乙醇回流提取2h，过滤，合并滤液，在2℃环境中静置24h，析胶，过滤，浓缩至药材的8倍量体积，缓缓加水充分搅拌使醇浓度达到约50％，充分搅拌，然后静置24h(2℃)，抽滤干燥得到真空总酮，母液再加水沉淀，静置24h(2℃)抽滤干燥总酮，总酮得率约1.05％。流程图见图3。

2.丹参酮IIA的分离

将上述过程得到的总酮称重，得到105g总酮，在球形色谱系统中装入3倍量的硅胶(正己烷湿法装入)，另总酮和硅胶1∶1拌样后上样，在底部烧瓶中加入适量正己烷和乙酸乙酯99∶1(体积比)混合溶剂，在真空状态下加热到55℃开始洗脱，使回流速度和液滴的速度达到平衡，提取5h后更换溶剂系统比例，以正己烷和乙酸乙酯98∶2洗脱，浓缩洗脱液，用95％乙醇反复重结晶得到高纯度的丹参酮IIA，HPLC外标法测得含量为98.2％(图4)。

实施例2

1.丹参总酮的提取

取丹参药材20kg(直径约1cm)，同实施例1工艺操作，得到丹参总酮238g，得率1.19％。

2.丹参酮IIA的分离

将上述过程得到的总酮238g，在球形色谱系统中装入5倍量的硅胶(环己烷湿法装入)，另总酮和硅胶1∶1拌样后上样，在底部烧瓶中加入适量环己烷和二氯甲烷98∶2(体积比)混合溶剂，在真空状态下加热到50℃开始洗脱，使回流速度和液滴的速度达到平衡，提取5h后更换溶剂系统比例，以环己烷和二氯甲烷95∶5洗脱，浓缩洗脱液，用95％乙醇反复重结晶得到高纯度的丹参酮IIA，HPLC外标法测得含量为99.3％(图5)。

实施例3

1.丹参总酮的提取

取丹参药材30kg(直径约1cm)，同实施例1工艺操作，得到丹参总酮366g，得率1.22％。

2.丹参酮IIA的分离

将上述过程得到的总酮366g，在梨形色谱系统中装入6倍量的硅胶(环己烷湿法装入)，另总酮和硅胶1∶1拌样后上样，在底部烧瓶中加入适量环己烷和二氯乙烷99∶1(体积比)混合溶剂，在真空状态下加热到50℃开始洗脱，使回流速度和液滴的速度达到平衡，提取5h后更换溶剂系统比例，以环己烷和二氯乙烷97∶3洗脱，浓缩洗脱液，用95％乙醇反复重结晶得到高纯度的丹参酮IIA，HPLC外标法测得含量为98.8％(图6)。

实施例4

1.丹参总酮的提取

取丹参药材50kg(直径约1cm)，同实施例1工艺操作，得到丹参总酮596g，得率1.19％。

2.丹参酮IIA的分离

将上述过程得到的总酮596g，在梨形色谱系统中装入6倍量的硅胶(石油醚(沸程30-60℃)湿法装入)，另总酮和硅胶1∶1拌样后上样，在底部烧瓶中加入适量石油醚和二氯甲烷96∶4(体积比)混合溶剂，加热到58℃开始回流洗脱，使回流速度和液滴的速度达到平衡，提取5h后更换溶剂系统比例，以石油醚和二氯甲烷90∶10洗脱，浓缩洗脱液，用95％乙醇反复重结晶得到高纯度的丹参酮IIA，HPLC外标法测得含量为98.5％(图7)。

标准曲线附图：取丹参酮IIA对照品30.0mg，精密称定，加甲醇溶解并定容至25mL，精密移取上述溶液各1.0mL，置10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度即得对照品溶液。取对照品溶液，分别进样2、4、6、8、10、20μL，以进样量(μg)为横坐标X，色谱峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线(图8)。

Claims

1.高纯度丹参酮IIA的制备方法，包括下列步骤：

(2)加水，得丹参总酮沉淀，过滤干燥；

2.根据权利要求1所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的以醇提取是用甲醇或乙醇经回流、超声或渗漉方法提取。

3.根据权利要求1所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的加水是加水量为1％～99％。

4.根据权利要求1所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述多功能层析系统是回流、柱色谱分离、样品收集于一体的系统。

5.根据权利要求4所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述多功能层析系统中样品洗脱用回流方法，温度控制在0～60℃。

6.根据权利要求4所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述多功能层析系统的柱色谱分离中的色谱分离溶剂为一种低极性与一种中极性溶剂的组合，其体积比为99∶1～90∶10，其中低极性溶剂为石油醚、正己烷或环己烷中的一种，中极性溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或二氯乙烷中的一种。

7.根据权利要求4或6所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述多功能层析系统的柱色谱分离中的色谱材料为硅胶或氧化铝。

8.根据权利要求1所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的浓缩是浓缩得含量90％-100％的丹参酮IIA。

9.根据权利要求1所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中的重结晶是用乙醇反复重结晶。

10.根据权利要求1所述的高纯度丹参酮IIA的制备方法，其特征在于：所述的高纯度丹参酮IIA是含量98％～100％丹参酮IIA。