CN101072797A - 抑制血管发生和肿瘤生长的多肽化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的某些实施方案提供了多肽组合物(如可与EphB4结合的抗体及其抗原结合部分)，以及抑制EphB4活性的方法。本发明的另一些实施方案则提供了治疗肿瘤或治疗血管发生相关疾病的方法和组合物。

Description

抑制血管发生和肿瘤生长的多肽化合物
相关申请
本申请要求于2004年9月23日递交的美国临时申请60/612,908、于2004年9月23日递交的美国申请10/949,720以及2004年3月12日递交的美国申请10/800,350的优先权。相关申请的完整教导全部在此处引用作为参考。
背景技术
EphB4，有时也称为肝配蛋白受体B4或肝细胞瘤跨膜激酶(HTK)，是跨膜受体蛋白-酪氨酸激酶家族中的一员。EphB4含有一个由配体结合结构域(也称为球蛋白结构域)、富半胱氨酸结构域以及一对III型纤连蛋白重复(见如图5)组成的细胞外结构域。胞浆结构域中含具有两个保守酪氨酸残基的近膜区、蛋白质酪氨酸激酶结构域、不育α基序(SAM)以及PDZ结构域结合基序。EphB4与膜结合配体肝配蛋白B2相互作用(Sakano，S.等人，Oncogene.1996 Aug 15；13(4)：813-22；Brambilla R.等人EMBO J.1995 Jul 3；14(13)：3116-26)。EphB4与Eph家族的其他成员一样，通过结合成簇的膜连接肝配蛋白配体而被活化(Davis S等人，Science.1994 Nov4；266(5186)：816-9)，提示Eph受体的活化需要表达受体的细胞与表达配体的细胞间的接触。一旦配体结合，EphB4受体形成二聚体并自磷酸化近膜区的酪氨酸残基从而达到完全活化。一般认为当表达EphB4的细胞遇到表达肝配蛋白B2的细胞时，EphB4-肝配蛋白B2的相互作用和聚合会激发两种细胞内的信号转导。
EphB4-肝配蛋白B2信号转导涉及血管发生(Wang等人.Cell.1998May 29；93(5)：741-53；Gerety等人，Mol Cell.1999 Sep；4(3)：403-14)。血管发生是从先前存在的微管结够的内皮中产生新的血管，是宿主体内实体肿瘤生长、进展和转移的关键步骤。在正常的生理性血管发生中，血管内皮与其周围基质成分间的自分泌、旁分泌以及邻分泌相互作用在空间和时间上都受到严格的调节。此外，促血管发生和血管稳定的细胞因子以及生长因子的水平和活性也保持平衡。与之相反，活跃肿瘤生长所必需的病理性血管发生持续不衰，是正常血管发生系统失调节的表现。特别是实体和造血系统类型的肿瘤，更与高水平的异常血管发生相关。
一般认为肿瘤的发生包括一系列有序而相互作用的步骤，最终导致产生具有侵袭性生长潜能的自主性克隆。这些步骤包括持续的生长和无限的自我更新。肿瘤细胞种群的一般特征在于生长信号的自供给、对生长抑制信号敏感性降低以及对凋亡的耐受。起始异常生长的遗传的或细胞发生的事件通过阻断凋亡，将细胞维持在一个延长的“就绪”状态。
本公开内容的目的在于提供可抑制血管发生和肿瘤生长的试剂和治疗手段。
发明概述
本公开内容一方面提供了抑制EphB4介导功能的多肽试剂，包括可以结合EphB4并通过特定途径影响EphB4的抗体及其抗原结合部分。正如此处所述，EphB4和肝配蛋白B2参与了多种疾病状态，包括癌症和与有害或过度血管发生相关的疾病。因此，此处公开的某些多肽试剂也可用于治疗此类疾病。此外，本公开内容涉及在多种肿瘤中EphB4和/或肝配蛋白B2常常高水平表达这一发现。因此，能够下调EphB4或肝配蛋白B2功能的多肽试剂可以通过直接作用于肿瘤细胞而影响肿瘤，也可以通过间接作用于肿瘤募集的血管发生过程而对肿瘤产生影响。在某些实施方案中，本公开内容提供了特别适于用下调EphB4或肝配蛋白B2功能的试剂治疗的肿瘤类型的鉴定。
本公开内容的某些方面提供了可与EphB4胞外部分的表位相结合而抑制EphB4活性的分离的抗体或其抗原结合部分。分离的抗体或其抗原结合部分可结合于位于图1 EphB4序列中的氨基酸16-198的表位。例如，该表位可能处在与肝配蛋白B2结合的EphB4球蛋白结构域(GD)中。分离的抗体或其抗原结合部分可结合于位于图1 EphB4序列中的氨基酸324-429或430-537的表位。例如，分离的抗体或其抗原结合部分可以结合于EphB4的第一纤连蛋白样结构域(FND1)或第二纤连蛋白样结构域(FND2)。分离的抗体或其抗原结合部分可以抑制EphB4二聚化或多聚化并可以任选地抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4自磷酸化。分离的抗体或其抗原结合部分可以抑制培养的内皮细胞形成脉管、体内组织的血管形成、植入动物角膜的组织的血管形成、植入动物体内的基质胶(matrigel)组织栓的血管形成和/或小鼠中人类肿瘤异种移植物的生长。优选的结合图1EphB4序列中氨基酸16-198的表位的抗体包括此处以No.001、No.023、No.035和No.079表示的抗体。优选的结合图1 EphB4序列中氨基酸428-537的表位的抗体包括此处以No.047、No.057、No.85H、No.098和No.138表示的抗体。
本公开内容的某些方面提供了可与EphB4胞外部分的表位相结合而刺激EphB4活性的分离的抗体或其抗原结合部分。例如此处所述的分离抗体或其抗原结合部分可结合位于图1 EphB4序列中氨基酸324-429或430-537的表位，并刺激EphB4激酶活性。该分离的抗体或其抗原结合部分可以结合EphB4的FND1或FND2。该抗体可以选自此处以No.85L、No.091、No.121和No.131表示的抗体。
本公开内容提供此处公开的任一抗体的人源化形式，以及含有至少一个来源于此处公开抗体CDR部分(特别是CDR3)的抗体及其抗原结合部分。在优选的实施方案中，抗体为与其将施用的受试者免疫相容的单克隆抗体，优选可临床施用于人体的抗体。
本公开内容的某些方面提供了能够产生此处公开抗体的杂交瘤，特别是能产生选自以下抗体的杂交瘤，所述抗体表示为No.001、No.023、No.035、No.079、No.047、No.057、No.85H、No.098、No.138、No.085L、No.091和No.131。可产生抗体No.023(位于氨基酸16-198内的表位)、抗体No.091(活化激酶的抗体；位于氨基酸324-429的表位)、抗体No.098(位于氨基酸430-537的表位)、抗体No.131(位于氨基酸324-429的表位)以及抗体No.138(位于氨基酸430-537的表位)的杂交瘤储存于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209。ATCC中产抗体No.023、No.091、No.098、No.131和No.138的杂交瘤保藏识别号分别为PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6214和PTA-6211。
因此，本公开内容的某些具体方面提供了选自具有ATCC保藏识别号PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6214和PTA-6211的杂交瘤细胞。
惊奇的是，抑制配体结合的抗体、抑制EphB4激酶活化的抗体和活化EphB4激酶活性的抗体在生物测定中都抑制EphB4介导的事件。因此，本公开内容提供了治疗癌症的方法，包括向所需患者施用有效剂量的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分可与位于EphB4胞外部分的表位结合并抑制EphB4活性或活化EphB4激酶活性。任选患者已被诊断为患有选自结肠癌、乳腺肿瘤、间皮瘤、前列腺肿瘤、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤以及白血病的癌症。可以全身或局部施用分离的抗体或其抗原结合部分。此外，本公开内容提供了抑制患者血管发生的方法，包括向所需患者施用有效剂量的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分可与位于EphB4胞外部分的表位结合并抑制EphB4活性或活化EphB4激酶活性。任选患者被诊断患有黄斑变性。
本公开内容的某些方面提供了含有此处公开的任一分离的抗体或其抗原结合部分的药物制品，以及此类抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症的药物制品中的用途。所述癌症可任选地选自结肠癌、乳腺肿瘤、间皮瘤、前列腺肿瘤、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤以及白血病。
某些方面而言，此处公开的抗体可以共价连接(或者稳定相联)于一个额外的功能性部分，例如标记或赋于所需药代动力学性质的部分。标记的实例包括那些适于用荧光检测法、正电子成像术检测法以及核磁共振检测法的标记。例如，标记可以选自荧光标记、放射活性标记以及具有特殊核磁共振信号的标记。诸如聚乙二醇(PEG)部分的部分可被固定于抗体或其抗原结合部分上，以提高其血清半衰期。
附图简述
图1显示人EphB4前体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2显示人EphB4蛋白的cDNA核苷酸序列。
图3显示B4ECv3蛋白的氨基酸序列(显示了包含未切割Eph B4前导肽的前体的预测序列)。
图4显示B4ECv3NT蛋白的氨基酸序列(显示了包含未切割Eph B4前导肽的前体的预测序列)。
图5显示针对EphB4产生的单克隆抗体以及这些抗体的表位图。EphB4胞外结构域的拓扑结构如图所示，包括球蛋白结构域(G)、富半胱氨酸结构域(C)以及两个3型纤连蛋白结构域(F1和F2)。
图6显示肝配蛋白B2多克隆抗体和EphB4多克隆抗体对肿瘤细胞生长的影响。A)H28细胞系；B)H2373细胞系；以及C)H2052细胞系。
图7显示EphB4单克隆抗体的亲和力测试结果。显示了亲和力排序(从最弱到最强)。
图8显示在bFGF存在或不存在时，利用示例性EphB4抗体(No.138)进行小鼠角膜微囊测定的结果。
图9显示EphB4抗体抑制SCC15异种移植肿瘤的生长。
图10显示EphB4抗体导致SCC15头颈部癌肿瘤类型中的凋亡、坏死和血管发生减少。
图11显示全身性施用EphB4抗体导致肿瘤消退。
发明详述
I.EphB4抗体以及其他结合多肽
本公开内容中部分提供了能够被多肽结合剂有效靶定的EphB4分子的确定部分，所述多肽结合剂如抗体、抗体的抗原结合部分以及非免疫球蛋白抗原结合支架。此处所述的EphB4多肽结合剂可用于治疗多种疾病，特别是癌症和与有害性血管发生相关的疾病。本公开内容提供了抑制一种或多种EphB4介导的功能(如肝配蛋白B2结合或EphB4激酶活性)的抗体及其抗原结合部分。此类结合剂可用于在体外或体内抑制EphB4的功能，优选用于治疗癌症和与有害性血管发生相关的疾病。本公开内容也提供了活化EphB4激酶活性(通常通过评估EphB4磷酸化状态进行测定)的抗体及其抗原结合部分。惊奇的是，在细胞水平和体内测定中此类抗体也抑制EphB4功能。因此，此类结合剂可用于在体外和体内抑制EphB4功能，并优选用于治疗癌症和与有害性血管发生相关的疾病。尽管并不指望局限于某一特定的机制，但这些抗体不仅刺激了EphB4激酶的活性，也刺激了从膜内去除EphB4，从而降低了EphB4的整体水平。
EphB4属于跨膜受体蛋白酪氨酸激酶家族。EphB4的胞外部分由配体结合结构域(也称为球蛋白结构域)、富半胱氨酸结构域以及一对III型纤连蛋白重复(见如图1)组成。胞浆结构域中含具有两个保守酪氨酸残基的近膜区、蛋白质酪氨酸激酶结构域、不育α基序(SAM)以及PDZ结构域结合基序。EphB4对膜结合配体肝配蛋白B2具有特异性(Sakano，S.等人1996；Brambilla R.等人1995)。EphB4通过结合成簇的、膜连接的肝配蛋白配体而被活化(Davis S等人1994)，提示Eph受体的活化需要表达受体的细胞与表达配体的细胞间的接触。一旦结合配体，EphB4受体形成二聚体并自磷酸化近膜区的酪氨酸残基从而达到完全活化。
此处使用的术语“EphB4”是指来自包括人在内的哺乳动物的EphB4多肽。在一个实施方案中，产生针对某一分离和/或重组的哺乳动物EphB4或其部分(如肽)，或针对表达重组哺乳动物EphB4的宿主细胞的抗体(免疫球蛋白)。在某些方面，本发明的抗体特异地结合于EphB4蛋白质的胞外结构域(此处称为EphB4可溶性多肽)。例如EphB4可溶性多肽含有球蛋白结构域，并能够与肝配蛋白B2相结合。图2提供了EphB4可溶性多肽的实例。此处使用的EphB4可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽的片段、功能性变体以及修饰的形式。
“免疫球蛋白”为四聚体分子。天然存在的免疫球蛋白中，每一四聚体是由两对相同的多肽链组成的，每一对中含有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的氨基端部分包含负责主要识别抗原的长约100至110或更多氨基酸的可变区。而每一条链的羧基端则存在主要负责效应器功能的恒定区。人轻链可分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α或ε，并定义抗体的同种型分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区之间通过长约12个或更多氨基酸的“J”区相连，重链中还含有一个长约10个氨基酸的“D”区。详见《FundamentalImmunology》第7章(Paul，W.编辑，第二版.Raven Press，N.Y.(1989))(此处整体引用作为参考)。每一轻/重链对的可变区形成抗体结合位点，这样完整的免疫球蛋白具有两个结合位点。免疫球蛋白可以组成更高级的结构。IgA一般为两个四聚体的二聚体。IgM一般为五个四聚体的五聚体。
免疫球蛋白链的一般结构相同，具有由三个高变区(也称为互补决定区或CDR)连接的相对保守构架区(FR)。来自每对两条链的CDR由构架区连接，使之能结合于特异的表位。从N-末端到C-末端，轻链和重链都含有结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸在每一结构域中的分配与Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987 and 1991))，或Chothia&Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987)；Chothia等人，Nature342：878-883(1989)中的定义一致。
“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分。可以通过重组DNA技术、或酶或化学裂解完整抗体来产生抗原结合部分。抗原结合部分中包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、dAb，以及至少含有足以使特异性抗原结合于多肽的部分免疫球蛋白的互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、单结构域抗体、嵌合抗体、双抗体及多肽。此处术语“抗EphB4抗体”和“EphB4抗体”可互换使用。
Fab片段是由VL、VH、CL和CH I结构域组成的单价片段；F(ab′).sub.2片段是含有两个在铰链区通过二硫键桥相连的Fab片段的二价片段；Fd片段由VH和CH1结构域组成；Fv片段由抗体的单臂VL和VH结构域组成；而dAb片段(Ward等人，Nature 341：544-546，1989)由VH结构域组成。
单链抗体(scFv)中，VL和VH区通过合成的连接子配对形成单价分子，所述连接子可使它们成为一条单独的蛋白质链(Bird等人，Science 242：423-426，1988；以及Huston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883，1988)。双抗体为二价的双特异性抗体，其中VH和VL结构域表达于同一条多肽链上，但其使用的连接子太短而不能使这两个区域之间在同一条链上配对，因此其中的结构域不得不与另一条链上的互补结构域发生配对，从而产生两个抗原结合位点(见如Holliger，P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448，1993，以及Poljak，R.J.等人，Structure 2：1121-1123，1994)。一个分子中可能以共价结合或非共价结合的形式含有一个或多个CDR。
抗体中可能含有一个或多个结合位点。如果结合位点多于一个，则这些结合位点可能彼此相同，也可能不一样。例如天然存在的免疫球蛋白中具有两个相同的结合位点，单链抗体或Fab片段中含有一个结合位点，而“双特异性”或“双功能”抗体含有两个不同的结合位点。
术语“人抗体”包括具有一个或多个来自人免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的所有抗体。在优选的实施方案中，所有的可变区和恒定区都来自人免疫球蛋白序列(完整的人抗体)。可如下通过多种途径制备这些抗体。
术语“嵌合抗体”是指含有来自一个抗体的一个或多个区域以及来自其他一个或多个抗体的一个或多个区域的抗体。在优选实施方案中，一个或多个CDR来自人抗EphB4抗体。在更优选的实施方案中，所有的CDR均来自人抗EphB4抗体。在另一优选的实施方案中，来自多于一个人抗EphB4抗体的CDR混合并匹配在一个嵌合抗体中。例如，在一个嵌合抗体中，来自第一种人抗EphB4抗体轻链的CDR1可能与来自第二种人抗EphB4抗体轻链的CDR2和CDR3结合，而重链的CDR则可能来自第三种抗EphB4抗体。此外，构架区可能来自相同的抗EphB4抗体之一、来自一个或多个不同的抗体(如人抗体或人源化抗体)。
“中和抗体”是指能够抑制EphB4与肝配蛋白B2结合的抗体，足量抗EphB4抗体可将与肝配蛋白B2结合的EphB4(可溶性)量减少至少约20％，优选至少40％，更优选60％，甚至更优选80％，或甚至更优选85％。可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法测量结合的减少，例如通过体外竞争性结合测定测量。测量结合减少的实例可见以下的实施例。
“活化EphB4激酶的抗体”是指当加入到表达EphB4的细胞、组织或有机体中时，可活化至少约20％EphB4激酶活性的抗体。在优选实施方案中，活化EphB4激酶活性的抗体可活化至少40％、更优选60％、甚至更优选80％，或甚至更优选85％的激酶活性。一般而言，通过EphB4自身的磷酸化状态(酪氨酸自磷酸化)来测量激酶活性。
此处所用的术语“标记”或“标记的”是指将另一种分子整合于抗体中。在一个实施方案中，标记为可检测的记号，例如掺入放射性标记的氨基酸，或向多肽连接具有可由标记抗生物素蛋白(例如含有荧光标记或酶活性而能被光学或比色法检测的链霉抗生物素蛋白)检测的生物素化部分。在另一实施方案中，标记或记号可为治疗性的，例如药物缀合物或毒素。可以使用本领域已知的多种标记多肽和糖蛋白的方法。多肽标记的实例包括(但不仅限于)如下：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc；111In、125I、131I)、荧光标记(例如FITC、罗丹明、镧磷光体)、酶标记(例如辣根过氧化物酶、β半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素化基团、由第二报告子识别的预确的定多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、第二抗体结合位点、金属结合结构域、表位标签)、磁性试剂(如钆螯合物)、毒素(如百日咳毒素)、  紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴乙啶、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔毛霉素、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、mitliramycin、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普奈洛尔和嘌呤霉素以及它们类似物或同系物。在一些实施方案中，标记通过不同长度的间隔臂连接以降低可能的空间位阻。
如下文实施例所示，申请人已经制造出若干针对EphB4的单克隆抗体，以及能够产生EphB4单克隆抗体的杂交瘤细胞系。这些抗体还具有其他许多方面的特征，例如它们抑制EphB4及其配体(例如肝配蛋白B2-中和抗体)间的相互作用的能力，它们抑制EphB4受体二聚化或多聚化的能力，它们诱导EphB4的酪氨酸磷酸化的能力、它们与其他Eph家族成员之间的交互反应性、它们抑制血管发生的能力以及它们抑制肿瘤生长的能力。此外，表位测图研究显示这些EphB4抗体可特异结合EphB4的一个或多个区域(例如球蛋白结构域、富半胱氨酸结构域或III型纤连蛋白结构域)。例如EphB4抗体可结合两个III型纤连蛋白结构域。
某些方面而言，本发明的抗体可以特异结合EphB4蛋白质的胞外结构域(ECD)(此处也称为可溶性EphB4多肽)。可溶性EphB4多肽可含有包含球蛋白(G)结构域(SEQ ID NO：1中的氨基酸29-197)的序列，并任选含有其他结构域，如富半胱氨酸结构域(SEQ ID NO：1中的氨基酸239-321)、第一3型纤连蛋白结构域(SEQ ID NO：1中的氨基酸324-429)及第二3型纤连蛋白结构域(SEQ ID NO：1中的氨基酸434-526)。图3-4中提供了示例性的EphB4可溶性多肽。如此处使用的，EphB4可溶性多肽包括EphB4可溶性多肽的片段、功能性变体以及修饰的形式。
本发明在某些方面提供了对EphB4或EphB4部分具有结合特异性的抗体(抗EphB4)。这些抗体的实例包括(但不仅限于)图5所示的EphB4抗体编号1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131和138。所述免疫球蛋白任选以至少约1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9M或更低的亲和力结合EphB4。任选抗体及其部分结合肝配蛋白B2的亲和力与结合含球蛋白配体结合结构域的EphB4多肽可溶性胞外部分大致相同。
此处公开的抗体优选对EphB4具有特异性，而与Eph或肝配蛋白家族的其他成员结合微小。在本发明的另一方面，抗EphB4抗体同时具有物种和分子选择性。在一个实施方案中，抗EphB4抗体结合人、cynomologous或恒河猴(rhesus)的EphB4。在优选实施方案中，抗EphB4抗体并不与小鼠、大鼠、豚鼠、狗或兔的EphB4结合。任选地，抗体能结合来自不同物种(例如人和小鼠)的多种不同的EphB4。按照说明书的这一教导，可以利用本领域公知的方法确定抗EphB4抗体的物种选择性。例如，可以使用Western印迹、FACS、ELISA或RIA确定物种的选择性。在优选实施方案中，可以利用Western印迹确定物种的选择性。在另一实施方案中，抗EphB4抗体与EphB4结合的趋势比之与来自同一物种的EphB4家族其他成员的结合趋势至少高50倍，优选高100或200倍。可以按照本说明的教导利用本领域公知的方法确定选择性。例如，可以利用Western印迹、FACS、ELISA或RIA确定选择性。在优选实施方案中，通过Western印迹确定分子的选择性。
在某些实施方案中，本发明的抗体结合EphB4的一个或多个特异性结构域。例如，抗体与一个或多个EphB4的胞外结构域(如球蛋白结构域、富半胱氨酸结构域以及第一3型纤连蛋白结构域和第二3型纤连蛋白结构域)结合。例如，EphB4抗体编号1、23、35和79结合图1序列中跨越球蛋白结构域的氨基酸16-198区域的表位。EphB4抗体编号85L、85H、91和131结合图1序列中内含第一3型纤连蛋白结构域的氨基酸324-429区域的表位。EphB4抗体编号47、57、85H、98、121和138可结合图1序列中内含第二3型纤连蛋白结构域的氨基酸430-537区域的表位。任选地，受试抗体(如EphB4抗体号85H)可结合EphB4的至少两个结构域(图5)。
抗EphB4抗体可以为IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在优选实施方案中，抗体为IgG，且属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在更优选的实施方案中，抗EphB4抗体为IgG2亚类。可以通过本领域已知的任何方法确定EphB4抗体的类别和亚类。一般而言，可以使用对某一特定类别和亚类的抗体具有特异性的抗体，来确定抗体的类别和亚类。此类抗体可以购得。可以通过ELISA、Western印迹以及其他技术确定类别和亚类。或者也可以通过对抗体重链和/或轻链中恒定区全部或部分测序，将其氨基酸序列与不同类别和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列进行比较，并确定抗体的类别和亚类。为说明所需，示例性的EphB4抗体的类别和亚类见于下表1。
在某些实施方案中，含有来自不同物种的部分的单链抗体，和嵌合、人源化或灵长类化(CDR移植的)抗体，以及嵌合或CDR移植的单链抗体也包括在本发明抗体的抗原结合部分中。可以通过常规技术将这些抗体的多个部分化学性的连接在一起，也可以利用遗传工程技术将之制备成连续的蛋白质。例如，可以表达编码嵌合或人源化链的核酸来制备连续的蛋白质。见如Cabilly等人，美国专利No.4,816,567；Cabilly等人，欧洲专利No.0,125,023；Boss等人，美国专利No.4,816,397；Boss等人，欧洲专利No.0,120,694；Neuberger，M.S.等人.，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人.，欧洲专利No.0,194,276B1；Winter，美国专利No.5,225,539；以及Winter，欧洲专利No.0,239,400B1。关于灵长类抗体，也参见Newman，R.等人.，BioTechnology，10：1455-1460(1992)。关于单链抗体，见如Ladner等人.，美国专利No.4,946,778；以及Bird，R.E.等人，Science，242：423-426(1988)。
此外，也可以生产抗体的功能性片段，包括嵌合、人源化、灵长类化或单链抗体的片段。受试抗体的功能性片段保留了其来源的全长抗体中至少一项结合功能和/或调控功能。优选的功能性片段保留了相应全长抗体中的抗原结合功能(例如，对EphB4的特异性)。某些优选的功能性片段保留了抑制一种或多种EphB4特征性功能(如结合特异性、信号转导活性，和/或激活细胞反应)的能力。例如在一个实施方案中，EphB4抗体的功能性片段能够抑制EphB4与其一种或多种配体(如肝配蛋白B2)之间的相互作用，和/或抑制其一项或多项受体介导功能，如细胞迁移、细胞增殖、血管发生和/或肿瘤生长。
例如，包括(但不仅限于)Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2在内能结合EphB4受体或其部分的抗体片段，都包括在本发明中。可通过酶裂解或重组技术生产此类片段。例如，木瓜蛋白酶或胃蛋白酶裂解分别能够产生Fab或F(ab′)2片段。也可以利用其中已于天然终止位点上游引入一个或多个终止子密码的抗体基因，来产生多种截短形式的抗体。例如，可以设计编码F(ab′)2重链的嵌合基因中含有编码重链CH1结构域和铰链区的DNA序列。
人源化抗体为来自于非人物种的抗体，其中突变了构架和重链及轻链恒定区中的某些氨基酸以避免或消除在人中的免疫反应。或者也可通过将来自人抗体的恒定区与非人物种的可变区融合来产生人源化抗体。如何制备人源化抗体的实例可见于美国专利No.6,054,297、5,886,152和5,877,293。人源化抗体可含有来自不同免疫球蛋白的部分，其中任选至少有一个部分来源于人。因此，本发明涉及对EphB4(如人EphB4)具有结合特异性的人源化免疫球蛋白，所述免疫球蛋白中包括非人源(如啮齿类的)的抗原结合区，以及至少部分的人免疫球蛋白(如人构架区、人恒定区或其部分)。例如，人源化抗体可以含有具所需特异性的非人(如小鼠)来源的免疫球蛋白部分，以及来自人的免疫球蛋白序列(如嵌合免疫球蛋白)，通过常规技术(如合成)将其化学连接，或利用遗传工程技术制备连续的多肽(如可以表达编码嵌合抗体的蛋白质部分的DNA以产生连续的多肽链)。
本发明人源化免疫球蛋白的另一实例是含有一个或多个免疫球蛋白链的免疫球蛋白，所述免疫球蛋白链中具有非人源CDR(如来自非人抗体的一个或多个CDR)和来自人轻链和/或重链的构架区(如有或无构架改变的移植CDR的抗体)。在一个实施方案中，人源化免疫球蛋白能够与鼠单克隆抗体竞争结合EphB4多肽。术语人源化免疫球蛋白也包括嵌合或移植CDR的单链抗体。
本发明的某些实施方案提供了EphB4拮抗物抗体。此处所述的术语“拮抗物抗体”是指能够抑制一项或多项EphB4功能的抗体，例如抑制其结合活性(如配体结合)和信号转导活性(如EphB4的成簇或磷酸化、刺激细胞应答，如刺激细胞迁移或细胞增殖)。例如，拮抗物抗体能够抑制(减弱或防止)EphB4受体与天然配体(如肝配蛋白B2或其片段)之间的相互作用。优选的针对EphB4的拮抗物抗体能够抑制EphB4介导的功能，包括内皮细胞迁移、细胞增殖、血管发生和/或肿瘤生长。任选地，拮抗物抗体结合EphB4的胞外结构域。
本发明的其他实施方案提供了活化EphB4激酶的抗体。此类抗体可增强EphB4激酶的活性，即使在没有肝配蛋白B2时也是如此。在某些情况下，此类抗体可用于刺激EphB4。然而，申请人注意到令人惊奇的是，在大部分细胞水平和体内测定中此类抗体表现如拮抗物抗体。此类抗体似乎与两个III型纤连蛋白结构域中的至少一个相结合，特别是图1中的氨基酸324-429区域。
某些实施方案也提供抗独特型抗体。抗独特型抗体识别与另一抗体的抗原结合位点相关的抗原决定簇。可以通过免疫相同物种的动物制备针对第二抗体的抗独特型抗体，所述动物优选为与用来产生第二抗体的动物同一品系。见如美国专利No.4,699,880。在一个实施方案中，产生针对受体或其部分的抗体，而这些抗体可随后用于产生抗独特型抗体。由此产生的抗独特型抗体能够结合与受体结合的化合物(如受体功能的配体)，且可用于免疫测定中以检测或鉴定或定量此类化合物。尽管此类抗独特型抗体自身不结合受体，它也可以作为EphB4受体功能的抑制剂。这样的抗独特型抗体也可称为拮抗剂抗体。
本发明的某些方面提供了杂交瘤细胞系，以及这些杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体。本发明的细胞系除了生产单克隆抗体之外还有其他用途。例如，本发明的细胞系可融合于其他细胞(如有合适药物标记的人骨髓瘤、小鼠骨髓瘤、人-小鼠杂合骨髓瘤(heteromyeloma)或人类淋巴母细胞细胞)，以产生其他的杂交瘤，从而可促成编码单克隆抗体基因的转移。此外，该细胞系还可用作编码抗EphB4免疫球蛋白链的核酸的来源，可以分离和表达所述核酸(例如利用任何合适的技术转移到其他细胞(见如Cabilly等人，美国专利No.4,816,567；Winter，美国专利No.5,225,539)。例如，可以分离含有重排抗EphB4轻链或重链的克隆(如通过PCR)，或者可以从分离自该细胞系的mRNA制备cDNA文库，并分离编码抗EphB4免疫球蛋白链的cDNA克隆。因此，可得到抗体重链和/或轻链或其部分的编码核酸，并根据重组DNA技术用之于多种宿主细胞或体外翻译系统中产生特定的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或它们的变体(如人源化免疫球蛋白)。例如，可将编码人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白链的变体的核酸(包括cDNA)或其衍生物置于合适的原核或真核载体(如表达载体)中，并通过合适的方法(例如转化、转染、电穿孔法、感染)导入合适的宿主细胞，从而使该核酸可与一个或多个表达控制元件有效连接(如进入载体或整合入宿主细胞基因组)。为生产所需，可将宿主细胞保持在适于表达的条件下(例如存在诱导子并添加适当盐、生长因子、抗生素、营养补充物等的合适培养基)，以生产编码多肽。如有需要，可以回收和/或分离编码蛋白质(如从宿主细胞中或培养基中)。应当理解生产方法包括在转基因动物的宿主细胞中表达(见如，WO92/03918，GenPharm International，1992年3月19日公开)。
II.抗体生产方法
可以如此处所述或利用其他合适的技术制备免疫抗原，并生产多克隆和单克隆抗体。已描述了多种方法。见如Kohler等人.，Nature，256：495-497(1975)以及Eur.J.Immunol.6：511-519(1976)；Milstein等人.，Nature266：550-552(1977)；Koprowski等人.，美国专利No.4,172,124；Harlow，E.和D.Lane，1988，Antibodies：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，N.Y.)；Current Protocols In MolecularBiology，Vol.2(Supplement 27，Summer′94)，Ausubel，F. M.等人.，Eds.，(John Wiley&Sons：New York，N.Y.)，Chapter11，(1991)。一般而言，可以通过将永生细胞系(如骨髓瘤细胞系，如SP2/0)与抗体产生细胞融合而制备杂交瘤细胞。抗体产生细胞(优选脾脏或淋巴结细胞)获自利用目标抗原免疫的动物。可以利用选择性培养条件分离融合细胞(杂交瘤)，并通过有限稀释克隆。通过适当的检测(如ELISA)选择能产生具有所需特异性抗体的细胞。
也可使用其他适当的方法生产或分离具有所需特异性的抗体，包括如从文库中选择重组抗体的方法、或依赖于免疫能够生产全组人抗体的转基因动物(如小鼠)的方法。见如Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-2555(1993)；Jakobovits等人.，Nature，362：255-258(1993)；Lonberg等人.，美国专利No.5,545,806；Surani等人.，美国专利No.5,545,807。
作为说明，可以利用来自EphB4多肽的免疫原(如能够引发发抗体应答的EphB4多肽或其抗原性片段，或EphB4融合蛋白)免疫哺乳动物，如小鼠、仓鼠或兔。见如《Antibodies：A Laboratory Manual.》Harlow和Lane编辑(Cold Spring Harbor Press：1988)。使蛋白质或肽具有免疫原性的技术包括与载体缀合或其他本领域公知的技术。可以在佐剂存在时施用EphB4多肽的免疫原性部分。可以通过检测血浆或血清中的抗体效价来监测免疫的进展。可以利用标准ELISA或其他免疫测定法，利用免疫原作为抗原来评估抗体水平。在一个实施方案中，本发明抗体对EphB4蛋白的胞外部分(如SEQ ID NO：2)或其片段具有特异性。在另一实施方案中，本发明的抗体对EphB4蛋白的胞内部分或跨膜部分具有特异性。
在利用EphB4多肽的抗原性制品免疫动物后可以获得抗血清，且如有需要，可从血清中分离出多克隆抗体。为生产单克隆抗体，从经免疫的动物中收集抗体产生细胞(淋巴细胞)，并用标准体细胞融合的方法将之与永生细胞(如骨髓瘤细胞)融合，以产生杂交瘤细胞。此类技术为本领域所公知，包括如杂交瘤技术(原创于Kohler和Milstein，(1975)Nature，256：495-497)，人B细胞杂交瘤技术(Kozbar等人.，(1983)Immunology Today，4：72)，以及EBV杂交瘤技术产生人单克隆抗体(Cole等人.，(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.77-96页)。可以通过免疫化学的方法筛查杂交瘤细胞中对EphB4多肽有特异反应性抗体的产生，以及从含有此类杂交瘤细胞的培养物中分离的单克隆抗体。
在某些实施方案中，可以利用常规技术将本发明的抗体进行片段化，并通过上述所有与抗体相同的方法筛查这些片段的功效。例如，用胃蛋白酶处理抗体能够产生F(ab)2片段。可以处理所产生的F(ab)2片段还原其中的二硫键，进而产生Fab片段。
在某些实施方案中，本发明的抗体还包括抗体的由至少一个CDR区域所致的对EphB4多肽具有亲和力的双特异性、单链、以及嵌合和人源化分子。也可以应用生产单链抗体的技术(美国专利No.4,946,778)生产单链抗体。还可以用转基因小鼠或包括其他哺乳动物在内的其他生物来表达人源化抗体。产生这些抗体的方法为本领域所公知。见如Cabilly等人.，美国专利No.4,816,567；Cabilly等人.，欧洲专利No.0,125,023；Queen等人.，欧洲专利No.0,451,216；Boss等人.，美国专利No.4,816,397；Boss等人.，欧洲专利No.0,120,694；Neuberger，M.S.等人.，WO 86/01533；Neuberger，M.S.等人.，欧洲专利No.0,194,276；Winter，美国专利No.5,225,539；winter，欧洲专利No.0,239,400；Padlan，E.A.等人.，欧洲专利申请No.0,519,596 A1。也见Ladner等人.，美国专利No.4,946,778；Huston，美国专利No.5,476,786；以及Bird，R.E.等人.，Science，242：423-426(1988)).
可以使用合成的和/或重组核酸来制备编码所需人源化链的基因(如cDNA)，从生产此类人源化免疫球蛋白。例如，可以利用PCR诱变方法来改变编码人或人源化链的DNA序列(如先前的人源化可变区的DNA模板)，以构建人源化可变区的编码核酸(如DNA)序列(见如Kamman，M.等人.，Nucl.Acids Res.，17：5404(1989))))))；Sato，K.等人.，CancerResearch，53：851-856(1993)；Daugherty，B.L等人.，Nucleic Acids Res.，19(9)：2471-2476(1991)；以及Lewis，A.P.和J.S.Crowe，Gene，101：297-302(1991))。利用这些或其他合适的方法，也可以生产变体。在一个实施方案中，可诱变克隆的可变区并可选择具有所需特异性的变体的编码序列(如从噬菌体文库中，见如Krebber等人.，美国专利No.5,514,548；Hoogenboom等人.，WO93/06213，发表于1993年4月1日)。
在某些实施方案中，进一步将抗体附着于能被检测的标记(如标记可为放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。其活性部分可以为放射活性剂，如放射活性重金属(如铁螯合物；钆或锰的放射活性螯合物；氧、氮、铁、碳或镓的正电子发射体；43K、52Fe、57Co、67Cu、67Ga、68Ga、123I、125I、131I、132I或99Tc。固定于此类部分的结合剂可用作显像剂，以诊断用有效剂量施用于哺乳动物(如人)，然后检测该显像剂的定位和累积。可以通过放射性闪烁扫描、核磁共振成像、计算机断层成像或正电子发射成像来检测显像剂的定位和累积。利用针对EphB4的抗体或其他结合多肽进行免疫闪烁扫描来检测和/或诊断癌症和脉管系统。例如标记99锝、111铟、125碘的针对EphB4标志的单克隆抗体即可用于此类显像。显然对于技术人员而言，施用的放射性同位素的量取决于所用的放射性同位素。本领域的普通技术人员即能根据某一用作活性部分的放射性核素的比活性和能量，熟练地得出所需施用的显像剂剂量。一般而言，每剂显像剂施用0.1-100毫居里，优选1-10毫居里，最常施用的剂量为2-5毫居里。因此，本发明中用作显像剂的组合物，包括缀合于含有0.1-100毫居里的放射活性部分的靶部分，在某些实施方案中优选1-10毫居里，在某些实施方案中优选2-5毫居里，在某些实施方案中更优选1-5毫居里。
在某些优选的实施方案中，本发明的抗体为单克隆抗体，而在某些实施方案中，本发明提供生产新抗体的方法。例如，一种生产能特异性结合EphB4多肽的单克隆抗体的方法包括：向小鼠施用一定剂量的免疫原性组合物(所述组合物中含可有效激活可测水平免疫应答的EphB4多肽)，从小鼠中获得产生抗体的细胞(如来自脾脏的细胞)，并将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合以获取产生抗体的杂交瘤，测试该产生抗体的杂交瘤以鉴定能产生可特异性结合EphB4多肽的单克隆抗体的杂交瘤。一旦得到，即可在细胞培养物中增殖该杂交瘤，任选在杂交瘤衍生细胞产生可与EphB4多肽特异性结合的单克隆抗体的培养条件中进行。可以从细胞培养物中纯化该单克隆抗体。
此外，用于筛查抗体以鉴定所需抗体的技术可能会影响所得抗体的性质。例如，将用于某些治疗目的的抗体应当优选能够针对特定的细胞类型。因此，为得到此类抗体，可能需要筛选出结合表达目标抗原的细胞的抗体(例如通过荧光活化的细胞分选)。与之类似，如果将用于结合溶液中的抗原，可能需要测试其溶液结合力。有多种不同的方法可用于测试抗体-抗原的相互作用，以鉴定所需的特定抗体。此类技术包括ELISA、表面等离振子共振结合测定(如Biacore结合测定，Bia-core AB，Uppsala，Sweden)、夹层测定(如顺磁珠系统，IGEN International，Inc.，Gaithersburg，Maryland)、western印迹、免疫沉淀测定和免疫组织化学。
本发明的抗体可用于多种应用，包括研究、诊断和治疗性应用。例如，它们可用于分离和/或纯化受体或其部分，也可用于研究受体结构(如构象)和功能。
III.诊断性应用
在某些方面，本发明的多种抗体可用于检测或测量EphB4受体的表达，例如在内皮细胞(如静脉内皮细胞)中，或在被转染EphB4受体基因的细胞中。因此，它们也可为诊断或研究目的，用于如细胞分选和成像(例如流式细胞术，以及荧光活化细胞分选)的应用中。
在某些实施方案中，为诊断目的可以标记或不标记抗体或抗体的抗原结合片段。一般而言，诊断测定需要检测由于抗体与EphB4结合而导致的复合物形成。可以直接标记这些抗体。可使用的多种标记包括但不仅限于放射性核素、荧光剂、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂和配体(如生物素、半抗原)。多种合适的免疫测定为技术人员所公知(见如美国专利No.3,817,827；3,850,752；3,901,654；和4,098,876)。未标记的抗体可用于如凝集测定等测定中。未标记抗体也可与另外的(一种或多种)可用于检测抗体的适当试剂组合使用，所述试剂如可与第一抗体反应的标记抗体(如第二抗体)(如对未标记免疫球蛋白具有特异性的抗独特型抗体或其他抗体)，或其他合适的试剂(如标记的A蛋白)。也可用化学基团如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基、或糖基衍生EphB4抗体。这些基团有助于改善抗体的生物学特性，例如可提高其血清半衰期或提高组织结合力。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于酶免疫测定中，其中受试抗体或第二抗体与酶缀合。当含有EphB4蛋白的生物样品与受试抗体结合时，在抗体和EphB4蛋白之间产生了结合。在一个实施方案中，含有表达EphB4蛋白质细胞(如内皮细胞)的样品与受试抗体组合，在抗体和具有EphB4蛋白作为抗体识别表位的细胞之间产生了结合。这些被结合的细胞可以从未结合试剂中分离出来，并且通过例如将样品与经酶作用后会产生颜色或其他可检测变化的酶底物相接触，来确定是否存在特异结合细胞的抗体-酶缀合物。在另一实施方案中，可以不标记受试抗体，而加入能够识别受试抗体的第二标记抗体。
在某些方面，也可以制备用于检测生物样品中是否存在EphB4蛋白的试剂盒。此类试剂盒包含可以结合EphB4蛋白或所述受体部分的抗体，以及一种或多种适于检测抗体和EphB4复合物或其部分存在的辅助试剂。本发明的抗体组合物可提供单独冻干形式或与对其他表位具特异性的其他抗体的组合冻干形式。试剂盒中可含有这些标记或未标记的抗体，以及附加成分(如缓冲液，如Tris、磷酸盐和碳酸盐；稳定剂；赋形剂；杀生物剂和/或惰性蛋白质，如牛血清白蛋白)。例如，可以提供抗体与附加成分一道的冻干混合物，也可单独提供附加成分以任使用者组合。一般而言，这些附加材料的重量小于活性抗体量的5％，根据抗体浓度通常其总量为至少约0.001％重量。当使用能够结合单克隆抗体的第二抗体时，该抗体可包含在试剂盒中，例如在独立的小瓶或容器中。如果存在，则第二抗体一般是标记的，可以通过与上述抗体制剂类似的方法配制。
与之类似，本发明也涉及检测和/或定量细胞中EphB4或其受体部分的表达，其中含有细胞或其级分(如膜级分)的组合物与可结合EphB4或其受体部分的抗体在适于抗体与之结合的条件下相接触，并监测抗体的结合。检测到抗体，即指示在抗体和EphB4或其受体部分之间形成了复合物，表明存在受体。可以通过标准方法测定抗体与细胞之间的结合，例如那些描述于实施例中的方法。该方法可用于检测EphB4在个体细胞中的表达。任选地，可通过如流式细胞术评估EphB4在内皮细胞表面的定量表达，染色强度可与疾病的易感性、进程或风险关联。
本发明也涉及检测哺乳动物对于某些疾病易感性的方法。用作说明，该方法可用于检测哺乳动物对某些疾病的易感性，所述疾病的进程取决于细胞中EphB4的量和/或该哺乳动物中EphB4阳性细胞的数目。在一个实施方案中，本发明涉及检测哺乳动物对于肿瘤的易感性。在该实施方案中，将待测样品与结合EphB4或其部分的抗体在适于所述抗体结合的条件下相接触，其中该样品含有在正常个体中表达EphB4的细胞。检测到抗体的结合和/或检测到结合量，提示该个体对肿瘤有易感性，其中受体水平越高，个体对肿瘤的易感性就越高。申请人以及其他团体已经发现EphB4的表达与肿瘤的生长和进展相关联。本发明的抗体也可用于进一步揭示个体中EphB4表达与血管发生相关性疾病之间的关系。
IV.治疗性应用
在某些实施方案中，本发明提供了抑制血管发生以及治疗血管发生相关性疾病(或紊乱)的组合物和方法。在另一些实施方案中，本发明提供了抑制或降低肿瘤生长的方法以及治疗患有癌症个体的方法。这些方法包括如上所述向个体施用治疗有效量的一种或多种EphB4抗体。这些方法特别针对于动物，尤其是针对人的治疗性和预防性治疗。
如上所述，血管发生相关性疾病包括但不仅限于血管发生依赖性肿瘤，包括如实体肿瘤、血液产生的肿瘤(如白血病)、以及肿瘤转移；良性肿瘤，如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；炎性紊乱，如免疫或非免疫性炎症；慢性关节型风湿病和银屑病；眼血管新生性疾病，如糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植物排斥反应、新生血管性青光眼、晶体后纤维组织增生；虹膜红变；Osler-Webber综合征；心肌血管发生；斑块新血管发生；毛细血管扩张症；血友病性关节；血管纤维瘤；以及伤口肉芽肿和伤口愈合；毛细血管扩张银屑硬皮病(telangiectasia psoriasis scleroderma)、化脓性肉芽肿、冠脉侧支、缺血性肢体血管发生；角膜疾病、虹膜红变、关节炎、糖尿病性新血管发生、骨折、脉管形成、造血。
应当理解本发明的方法和组合物也可用于治疗非血管发生依赖性癌症(肿瘤)。此处所用的术语“非血管发生依赖性癌症”，是指肿瘤组织中没有或有很少新生血管的癌症(肿瘤)。
具体而言，本发明的抗体可用于治疗或预防癌症(肿瘤)，包括但不仅限于，结肠癌、乳腺癌、间皮肿瘤、前列腺癌、膀胱癌、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、卡波西肉瘤以及白血病。
在此类方法的某些实施方案中，可以一起(同时)或在不同时间(顺序)施用一种或多种EphB4抗体。此外，抗体可以与另一种治疗癌症或抑制血管发生的试剂联合施用。在特定的实施方案中，本发明的受试抗体也可以与其他抗体治疗剂(单克隆或多克隆)一起使用。
在某些实施方案中，可单独使用本发明的受试抗体。或者受试抗体可与其他常规抗癌疗法联合使用，这些疗法用于治疗或预防增殖性紊乱(如肿瘤)。例如，此类方法可用于预防性癌症预防、预防手术后的癌症复发及转移，以及作为其他常规癌症疗法的辅助疗法。本发明认为通过使用一种或多种本发明的EphB4抗体，能够增强常规癌症疗法的有效性(如化学治疗、放射性治疗、光疗、免疫疗法以及手术)。
大批常规化合物具有抗肿瘤活性。这些化合物已用作药剂，在化疗中缩小实体肿瘤、防止转移和进一步生长，或减少白血病或骨髓恶性疾病中恶性细胞的数量。尽管化疗在治疗多种类型肿瘤中都很有效，许多抗肿瘤化合物会引发非期望的副作用。已知当联合两种或更多不同治疗方法时，这些治疗方法可协同作用而减少各治疗的剂量，进而减少各化合物在较高剂量时带来的有害副作用。另一些情况下，对某一治疗反应不佳的肿瘤可能会对两种或多种不同治疗的联合疗法产生反应。
当本发明的主要EphB4抗体与其他常规抗肿瘤剂联合施用时，不管是同时施用还是顺序施用，此类抗体都能够增强抗肿瘤试剂的疗效或克服对此类抗肿瘤剂的细胞耐受。这使得抗癌剂的剂量减少，从而降低了非期望副作用，或在耐受细胞中重建了抗肿瘤剂的有效性。
可用于联合抗肿瘤疗法的药物化合物包括(仅为说明)：氨苯哌酮、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、门冬酰胺酶、卡介苗、比卡鲁胺(bicalutamide)、博来霉素、布舍瑞林(buserelin)、白消安、喜树碱、卡培他滨(capecitabine)、卡铂、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、氯屈膦酸(clodronate)、秋水仙碱、环磷酰胺、去乙酰环丙氯地孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D、柔红霉素、双烯雌酚、已烯雌酚、多西他赛(docetaxel)、多柔比星、表柔比星、雌二醇、雌莫司汀(estramustine)、依托泊苷、依西美坦(exemestane)、非格司亭(filgrastim)、氟达拉滨(fludarabine)、氟氢可的松、氟尿嘧啶、氟羚甲基睾丸素、氟他胺(flutamide)、吉西他滨(gemcitabine)、染料木黄酮、戈舍瑞林(goserelin)、羟基脲、去甲氧基柔红霉素、异环磷酰胺、伊马替尼(imatinib)、干扰素、伊利替康(irinotecan)、伊立替康(ironotecan)、来曲唑、甲酰四氢叶酸、亮丙瑞林(leuprolide)、左旋咪唑、洛莫司汀(lomustine)、氮芥、甲孕酮、甲地孕酮、马法兰(苯丙酸氮芥)、巯嘌呤、巯乙磺酸钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦(mitotane)、米托蒽醌、尼鲁米特(nilutamide)、诺考达唑(nocodazole)、奥曲肽、奥沙利铂(oxaliplatin)、紫杉醇、帕米磷酸盐(pamidronate)、戊糖苷、普卡霉素、卟吩姆盐(porfimer)、甲基苄肼、雷替曲塞(raltitrexed)、美罗华(rituximab)、链脲佐菌素、苏拉明、三苯氧胺、替莫唑胺(temozolomide)、替尼泊苷、睾丸酮、硫鸟嘌呤、三胺硫磷、二氯钛烯、拓扑替康(topotecan)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维生素A酸、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。
可以根据其作用机制，将这些化学治疗的抗肿瘤化合物分为以下类别，例如：抗代谢/抗癌试剂，如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、卡培他滨、吉西他滨以及阿糖胞苷)和嘌呤类似物、叶酸拮抗剂及相关抑制剂(巯嘌呤、硫鸟嘌呤、戊糖苷和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨)；抗增殖/抗有丝分裂试剂，包括天然产物，如长春花生物碱类(长春碱、长春新碱和长春瑞滨)；微管破坏剂，如紫杉碱(紫杉醇、紫杉萜)、长春新碱、长春碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维本(navelbine)；鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)；DNA破坏试剂(放线菌素、安吖啶、蒽环霉素(anthracycline)、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺cytoxan、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲嘧胺奥沙利铂、异环磷酰胺、马法兰(苯丙酸氮芥)、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝脲、普卡霉素、甲基苄肼、紫杉醇、紫杉特尔、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酸胺和依托泊苷(VP16))；抗生素如放线菌素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、去甲氧基柔红霉素、蒽环霉素、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光辉霉素)和丝裂霉素；酶(L-天门冬氨酸酶，可系统代谢L-天门冬氨酸并除去不能合成自身L-天门冬氨酸的细胞中的L-天门冬氨酸)；抗血小板制剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂如氮芥(氮芥、环磷酰胺及其类似物、马法兰、苯丁酸氮芥)、次乙亚胺和甲基三聚氰胺(六甲嘧胺和噻替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝脲(卡莫司汀(BCNU)及其类似物、链脲佐菌素)、trazenes-darcarbazinine(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢剂如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位复合物(顺铂、卡铂)、甲基苄肼、羟基脲、米托坦、氨苯哌酮；激素、激素类似物(雌激素、三苯氧胺、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳化酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(肝素、合成肝素盐以及其他凝血酶抑制剂)；纤维溶解剂(如组织血纤维蛋白溶酶原激活物、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、咪唑硫嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管发生化合物(TNP-470、染料木黄酮)以及生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导物(维A酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(阿霉素、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素D、eniposide、表阿霉素、依托泊苷、去甲氧基柔红霉素和米托蒽醌、拓扑替康、伊利替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、强的松和强的松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能失调诱导剂和级联反应激活剂；以及染色质断裂剂。
在某些实施方案中，可用于联合抗血管发生疗法的药物化合物包括：(1)“生血管分子”释放抑制剂，如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)；(2)血管发生分子中和剂，如抗βbFGF抗体；以及(3)内皮细胞对血管发生刺激的应答抑制剂，包括胶原酶抑制剂、基膜更新抑制剂、血管张力类固醇、来自真菌的血管发生抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、关节炎药物(如D-青霉胺和硫代苹果酸金)、维生素D3类似物、α干扰素等等。其他提及的血管发生抑制剂，参见Blood等人.，Bioch.Biophys.Acta.，1032：89-118(1990)，Moses等人.，Science，248：1408-1410(1990)，Ingber等人.，Lab.Invest.，59：44-51(1988)，以及美国专利No.5,092,885、5,112,946、5,192,744、5,202,352和6573256。此外，还有很多种化合物可用于抑制血管发生，例如肽或阻断VEGF介导血管发生途径的试剂、内皮素蛋白质或衍生物、血管张力素的赖氨酸结合片段、黑色素或促黑色素化合物、血纤维蛋白溶酶原片段(如血纤维蛋白溶酶原的Kringles 1-3)、肌钙蛋白亚基、玻连蛋白αvβ3拮抗剂、来自皂化蛋白B的肽、抗生素或类似物(如四环素或新霉素)、含地诺孕素组合物、含耦联于肽的MetAP-2抑制核的化合物、化合物EM-138、查耳酮及其类似物，以及naaladase抑制剂。见如美国专利No.6,395,718、6,462,075、6,465,431、6,475,784、6,482,802、6,482,810、6,500,431、6,500,924、6,518,298、6,521,439、6,525,019、6,538,103、6,544,758、6,544,947、6,548,477、6,559,126以及6,569,845。
根据联合治疗的性质，当施用其他治疗时和/或施用其他治疗后，仍可继续施用本发明的抗体。可以单剂或多剂形式施用本发明抗体。在某些情况下，于常规疗法之前的至少若干天开始施用抗体；而另一些情况下，则在施用常规疗法前即刻或同时开始施用抗体。
V.药物组合物和施用模式
在某些实施方案中，本发明的受试抗体与可药用载体一起配制。可以单独施用此类抗体或作为药物制剂(组合物)的成分之一施用。这些化合物可以任何便于施用的方式配制，以在人或兽医药物中使用。组合物中也可含有润湿剂、乳化剂以及润滑剂(例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁)，还可含有着色剂、释放剂、包被剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂以及抗氧化剂。
受试抗体的制剂形式包括适于经口、膳食、局部、胃肠外(如经静脉、经动脉、肌内、皮下注射)、吸入(如经气管、经鼻或口吸入、经鼻滴入)、经直肠和/或经阴道施用形式。其他适于施用的方法中也可含有可再装料或可生物降解的装置以及缓释聚合装置。本发明的药物组合物也可以作为联合治疗的一部分与其他试剂共同施用(在同一制剂中或在独立制剂中)。
制剂可以方便地为单剂形式，并可通过任何制药领域公知的方法来制备。可与载体材料结合以产生单剂形式的活性成分量，取决于即将治疗的宿主和具体的施用方式。一般而言，可与载体材料结合以产生单剂形式的活性成分的量为能够产生治疗效果的化合物量。
在某些实施方案中，制备这些制剂或组合物的方法包括，与另一类型的抗肿瘤或抗血管发生剂和载体以及任选一种或多种辅助成分相组合。一般而言，可以利用液相载体或精细分割的固相载体或两者来制备制剂，其后如有必要进行产品成型。
用于经口施用的制剂形式可以为：胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用可口基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、粉剂、颗粒剂，或者为水或非水液体中的溶液或悬液剂、或为水包油或油包水乳液剂、或为酏剂或糖浆剂、或为软锭剂(使用惰性基质，如凝胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口液等，其中每种剂型中均含有预定量的一种或两种受试抗体作为活性成分。
在经口施用的固体剂型中(胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸剂、粉剂、颗粒剂等)，可将一种或多种本发明的受试抗体与一种或多种可药用载体混合，所述载体如柠檬酸钠、或磷酸二钙，和/或以下任一种：(1)填充剂或增量剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、凝胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)分解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐，以及碳酸钠；(5)溶液延迟试剂，如石蜡；(6)吸收增速剂，如季铵化合物；(7)润湿剂，例如十六醇和单硬脂酸甘油酯；(8)吸收剂，例如高岭土和班脱粘土；(9)润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷硫酸钠及其混合物；以及(10)着色剂。对于胶囊、片剂和丸剂而言，药物组合物还可含有缓冲剂。也可以乳糖或奶糖，以及高分子量聚乙二醇等为赋形剂，使用相似类型的固体组合物作为软及硬填充凝胶胶囊的填充剂。
经口施用的液体剂型包括可药用的乳化剂、微乳化剂、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。除了活性成分以外，液体剂型还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、醋酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇以及山梨糖的脂肪酸酯，及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物也可含有佐剂，如润湿剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂以及防腐剂。
悬浮液中除了活性化合物之外，可含有悬浮剂，如乙氧基异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和山梨酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、斑脱土、琼脂和黄芪胶及其混合物。
本发明方法可以局部施用于皮肤或粘膜(如子宫颈和阴道粘膜)。这使得直接向肿瘤输送的机会最大，而诱发副作用的机会最小。局部制剂还可含有很多种已知有效的皮肤或角质层穿透增强剂中的一种或多种。此类增强剂的实例为2-吡咯烷酮、N-甲基-2-吡咯烷酮、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、丙二醇、甲醇或异丙醇、二甲基亚砜和月桂氮卓酮。还可含有使制剂可用于化妆品的其他试剂。此类试剂的实例为脂肪、蜡、油、染料、芳香剂、防腐剂、稳定剂以及表面活性试剂。也可含有本领域已知的角质离解剂。实例为水杨酸和硫磺。
局部或经皮施用的剂型包括粉剂、喷雾剂、膏剂、糊剂、霜剂、洗液、凝胶、溶液、贴剂以及吸入剂。可以在无菌条件下将受试抗体与可药用载体以及任何可能需要的防腐剂、缓冲液或推进剂混合。膏剂、糊剂、霜剂及凝胶中除抗体外还可含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡质、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅树脂、斑脱土、硅酸、滑石和氧化锌，或其混合物。
粉剂和喷雾剂中除了抗体外还可含有赋形剂，如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙以及聚酰胺粉剂，或这些物质的混合物。此外，喷雾剂中还常规含有推进剂，例如含氯氟烃和挥发性非取代烃，如丁烷和丙烷。
适于胃肠外施用的药物组合物可能含有一种或多种抗体组合一种或多种可药用的无菌等张水性或非性水溶液、分散液、悬浮液或乳化液，或者在临近使用前可以重建为无菌注射溶液或分散体系的无菌粉剂，其中可含有抗氧化剂、缓冲物、抑菌剂、使制剂与欲施用的受者血液等张力的溶质，或悬浮剂或增稠剂。可用于本发明药物组合物的合适水性或非水性载体包括，水、乙醇、多羟基化合物(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适当混合物、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯(如油酸乙酯)。通过如使用包被材料(如卵磷脂)、保持分散体系中的所需颗粒大小以及使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
这些组合物中也可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过加入多种抗细菌和抗真菌剂来阻止微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸酯(phenol sorbic acid)等。组合物中也可以含有等张剂，如糖、氯化钠等。此外，通过加入可延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝及凝胶)，能够延长可注射药物剂型的吸收。
通过在可生物降解的聚合物(如聚交酯-聚乙醇酸交酯)中形成一种或多种抗体的微胶囊基质，来制备可注射的贮存剂型。根据药物与聚合物之间的比例以及所用具体聚合物的性质，可以控制药物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括，聚(正酯类)(poly(orthoesters))和聚(酐)。也可将药物包于与机体组织相容的脂质体或微乳状液中，从而制备贮存的可注射制剂。
用于阴道内或直肠施用的制剂可以为栓剂，其可通过将一种或多种本发明的化合物与一种或多种合适的非刺激性赋形剂或载体混合制备，所述赋形剂或载体包括如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐，且所述赋形剂或载体在室温下为固体，而在体温下为液体，因此会溶解在直肠或阴道腔内而释放出活性化合物。
实施例
至此已经对本发明做了一般性描述，参照以下实施例可以更好地理解本发明，所述实施例在此处仅为说明本发明的某些方面及实施方案，而不在于限制本发明。
实施例1  肝配蛋白B2和FphB4多克隆抗体对肿瘤细胞生长的影响
从Santa CruzBiotech(Santa Cruz，CA)购得两种EphB4多克隆抗体(H-200和N-19)。H-200抗体(也称为sc-5536)具有相应于人EphB4胞外结构域中氨基酸201-400的表位区域，而N-19抗体(也称为sc-7285)具有人EphB4胞外结构域N-末端内的表位区域。此外，从R&D Systems(Minneapolis，MN)购得肝配蛋白B2多克隆。
从ATCC(Manassas，VA)获取三种间皮瘤细胞系(H28、H2052和H2373)，用于测试这些EphB4和肝配蛋白B2多克隆抗体的抗肿瘤活性。将这些细胞(约5,000细胞/孔)置于48孔平板中，并在第二天用不同浓度的各种抗体处理。在第4天进行细胞存活测定(MTT)。EphB4和肝配蛋白B2多克隆抗体对肿瘤细胞生长的影响见图6。
实施例2.EphB4单克隆抗体对血管发生和肿瘤生长的影响
A.EphB4抗体的产生和功能性分析
在小鼠体内产生针对EphB4胞外结构域(ECD)的抗EphB4单克隆抗体。将EphB4 ECD(见如图5)克隆入表达载体(例如pGEX)中，以产生EphB4 ECD融合蛋白(如GST-ECD)。通过亲和层析法纯化表达于大肠杆菌BL21内的EphB4 ECD融合蛋白。在GST融合蛋白的情况下，用凝血酶裂解GST结构域。利用A蛋白层析法从杂交瘤上清液中纯化单克隆抗体。
这些单克隆抗体包括EphB4抗体号1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131和138(图5)。抗体作图研究显示了这些抗体各自的表位结构域(图5)。分析每一EphB4抗体的结合亲和力并显示于图7。
进行进一步的实验以分析这些抗体的功能活性，包括它们与其结合配偶体(如肝配蛋白B2)的竞争能力、活化EphB4酪氨酸磷酸化的能力、抑制HUAEC中体外脉管形成的能力、通过基质胶栓测定其抑制体内血管发生的能力、激活SCC15肿瘤细胞凋亡或坏死的能力，以及抑制SCC15异种移植物生长的能力。结果总结于下表1。
表1.EphB4抗体活性概述
抗体编号    活化EphB4酪氨酸磷酸化   抑制EphB4/肝配蛋白B2相互作用 抑制HUAEC中体外脉管形成 抑制体内血管发生(基质胶栓测定) 刺激SCC15肿瘤细胞凋亡或坏死 抑制SCC15异种移植物生长 抗体亚类
 1     -     +     +     Nd     N     Nd  IgG2b
 23     -     +     +     +     A，N     -  IgG2b
 35     -     +     +     Nd     A，N     -  IgG2b
 47     -     -     +     -     Nd     +  IgG3
 57     -     -     -     -     Nd     +  IgG3
 79     -     +     -     Nd     A，N     -  IgG1
 85L     +     -     -     -     Nd     -  IgG2b
 85H     -     -     -     Nd     Nd     Nd  IgG2b
 91     +     -     -     Nd     -     Nd  IgG2a
 98     -     -     +     +     Nd     Nd  IgG2a
 121     + -     -     Nd   Nd     - IgG1
 131     + -     +     Nd   Nd     + IgG1
 138     - -     +     +   A，N     + IgG2b
Nd＝未确定(无数据提供)
--＝无明显效果
+＝效果明显
A＝凋亡
N＝坏死
A，N＝同时发生凋亡和坏死
在小鼠角膜微囊测定中进一步分析这些抗体对血管发生的影响。例如，图8显示EphB4抗体138可显著抑制血管发生。
图9中显示可说明表1总结的EphB4抗体抗肿瘤活性的代表性实验。向BaLbC裸鼠皮下注射2.5×106活肿瘤细胞(SCC15，一种头颈部鳞状细胞癌细胞系)。通过皮下注射2.5-5×106与基质胶和生长因子预混合好的细胞和抗体以诱导出肿瘤异种移植物，在nu/nu小鼠中诱导出肿瘤。于注射14天后剖开小鼠。SCC15为头颈部鳞状细胞癌细胞系，B16为黑素瘤细胞系，而MCF-7为乳腺癌细胞系。将肿瘤对这些处理的应答与接受PBS注射的对照处理小鼠进行比较。每天观察动物中的肿瘤生长，并利用测径器每两天测量一次皮下肿瘤。相对于对照，抗体#1和#23显示了SCC 15肿瘤大小的显著消退，尤其是不加生长因子时更为突出，指示EphB4抗体抑制了体内SCC15细胞的肿瘤生长。
图10显示了另一个代表性实验，以说明表1总结的EphB4抗体的抗肿瘤和抗血管发生活性。通过CD-31免疫组织化学方法评估血管发生。用CD-31染色经处理和未处理小鼠的肿瘤组织切片。通过免疫组织化学TUNNEL评估凋亡，并通过BrdU测定评估增殖。手术取出后，立即将肿瘤切成2mm连续切片并使用标准方法包埋进石蜡。将石蜡包埋的组织切成5μm切片，除去石蜡并将组织再水合。于抗原回收(retreival)溶液中用微波照射再水合组织。用PBS洗涤切片，并在完全避光的潮湿小室内加入TUNNEL反应混合物(末端脱氧核苷酸转移酶和荧光素标记的核苷酸溶液)和BrdU。然后去除TUNNEL和BrdU反应混合物，洗涤切片，并加入缀合辣根过氧化物酶的抗荧光素抗体。经孵育和洗涤后，加入3，3′-二氨基联苯胺。也可用Masson三色、苏木精和伊红染片进行形态学观察。Masson三色染色可观察到坏死和纤维化。肿瘤从肿瘤/皮肤、肌肉边界获取血供。随着肿瘤的生长，其内部区域养分耗竭。从而导致坏死(细胞死亡)，优选发生于肿瘤中心。细胞死亡后，成纤维组织取代了(肿瘤)组织。在20倍放大下观察切片得到数字图像。施用各种抗体的SCC肿瘤呈现出不同的形态。抗体#1中坏死和纤维化增强，而凋亡则无。抗体#23中凋亡、坏死和纤维化增强，而血管浸润有所减少。抗体#35中坏死和纤维化增强，凋亡稍有增强，而血管浸润有所减少。抗体#79凋亡、坏死和纤维化均有大幅度增强。抗体#91在凋亡上没有变化，但增殖增强。而抗体#138中凋亡、坏死和纤维化增强，增殖及血管浸润减少。用对照PBS处理的肿瘤中肿瘤细胞密度高、血管发生反应强烈。而用EphB4抗体处理的肿瘤则表现出肿瘤细胞密度的降低和存活肿瘤细胞区内肿瘤血管发生的显著抑制，以及肿瘤坏死和凋亡。这些结果显示，EphB4抗体诱发了头颈癌肿瘤类型SCC15中的凋亡、坏死和血管发生减少。
图11显示了可说明表1总结的EphB4抗体的抗肿瘤活性的另一代表性实验。在第4天、肿瘤建立后开始，每隔一天用EphB4单克隆抗体或等量的PBS作为对照处理，并持续14天。通过IP或SC进行全身性施用，并且无显著差异。所有的实验都是在双盲方式下进行，以消除研究者的偏见。两周处理结束后处死小鼠。死后立即收获肿瘤，并固定和处理以进行免疫组织化学。每kg体重施用40mg EphB4抗体。EphB4抗体处理小鼠相对于对照处理小鼠显著抑制了人SCC肿瘤的生长(p＜0.05)。EphB4抗体处理小鼠相对于对照处理小鼠显著抑制了肿瘤的重量(p＜0.05)。这些结果表明，对异种移植物全身性施用抗体导致了SCC15肿瘤异种移植物中的肿瘤消退。
实施例3.材料和方法
1)免疫组织化学
将福尔马林固定的组织切片去石蜡包埋，并于--70℃在10％山羊血清中孵育10分钟，然后与EphB4单克隆抗体在4℃下孵育过夜。使用同种型特异的兔IgG作为对照。利用Vector Laboratories的抗生物素蛋白-生物素试剂盒揭示对这些受体的免疫反应活性。通过二氨基联苯胺(Sigma)细胞化学反应揭示过氧化物酶活性。然后用0.12％亚甲基蓝或H&E对切片复染色。对于冰冻切片而言，OCT包埋的组织切成5μm切片，并在磷酸盐缓冲的4％多聚甲醛中固定。在PBS中洗涤切片3×5分钟，并在室温下0.3％H2O2PBS中孵育10分钟封闭内源性过氧化物酶。在室温下将切片与Eph4(C-16)抗体(1∶50)孵育1小时，然后在PBS中洗涤三次，并与驴抗山羊第二抗体(Santa Cruz Biotech.)室温下共同孵育1小时。在PBS中洗涤三次后，室温下在DAB底物溶液(Vector Laboratories，Inc.BurlingameCA)中孵育10分钟，定位过氧化物酶活性。将切片用苏木精复染色20秒，脱水并封固。染色的阴性对照是以正常山羊血清代替第一抗体。
2)Western印迹
除非另有说明，利用细胞裂解缓冲液(GeneHunter，BasgvukkeTN)加以蛋白酶抑制剂混合物(Pierce，Rockford IL)，制备全细胞裂解物。利用DC反应系统(Bio-Rad，Hercules CA)测定总蛋白质。一般而言，将20μg全细胞裂解物在4-20％Tris-甘氨酸梯度凝胶上电泳。将样品电转移至PVDF膜上，且在含有5％脱脂乳的TBST缓冲液(0.5mM Tris-HCl、45mM NaCl、0.05％Tween-20，pH 7.4)中封闭非特异性结合。先以第一抗体为探针处理膜过夜，用RestoreTM Western印迹剥离缓冲液(Pierce，Rockford IL)剥离膜，再用β肌动蛋白为探针处理，以确认蛋白质的等量上样和转移。使用SuperSignal West Femto最大灵敏度底物(Pierce)检测信号。
3)酪氨酸激酶磷酸化分析
生长在60mm盘中的细胞为乏血清(加入RPMI 1640的1％FBS，24小时)，或是培养于正常条件下(10％FBS)的，然后用或不用1μg/ml小鼠肝配蛋白B2/Fc处理10分钟以活化EphB4受体。将纯细胞裂解物与EphB4单克隆抗体于4℃下孵育过夜。加入含100μlG蛋白-琼脂糖凝胶的20mM磷酸钠(pH 7.0)，于4℃下孵育过夜，以免疫沉淀抗原-抗体复合物。利用1∶1000稀释的磷酸化酪氨酸(pTyr)特异性抗体(Upstate，clone4G10)进行Western印迹，然后与1∶5000稀释的G蛋白-HRP(Bio-Rad)孵育，来分析免疫沉淀物。用EphB4特异性单克隆抗体探针杂交完全相同的膜，以监测免疫沉淀的效率。
4)细胞培养
从Cambrex (BioWhittaker)获取正常HUVEC，并保持在EBM2培养基中，其中含有0.1mg/ml内皮生长添加剂(牛脑粗提取物)、青霉素(50U/ml)、链霉素(50U/ml)、2mmol/l谷氨酸盐以及0.1mg/ml肝素钠。冷冻保存传代1-3次的细胞等分试样。对于所有实验，使用传代4次或以下的HUVEC，从汇合的盘中收集。
从ATCC(Manassas，VA)处获取NCI H28和NCI H2373间皮瘤细胞系。将细胞保持在含有10％热灭活的胎牛血清(FBS；Life Technologies，Gaithersburg，MD)和抗生素的RPMI 1640培养基中。原代细胞来自于间皮瘤患者的胸膜渗出液。
5)内皮细胞脉管形成测定
将基质胶(10mg/ml，60μl；Collaborative Lab，Cat.No.35423)置于冰冻96孔平板的每一孔内。将平板留置室温15分钟，然后在37℃下孵育30分钟使基质胶发生聚合。同时，在EGM-2(Clonetic，Cat.No.CC3162)中制备浓度为2×105细胞/ml的人脐带静脉内皮细胞。将细胞(500μl)与测试EphB4抗体混合，以一试两份将200μl该悬浮液置于聚合基质胶上。经24小时孵育后，利用Bioquant图像分析系统对每一浓度采集3幅照片。测量形成脉管的长度和连接的数目，以次评估相对于未处理对照样品的蛋白质加成效应(IC50)。
6)细胞迁移测定
利用改良的Boyden盒，穿孔滤膜嵌入24孔平板，直径6.5mm、孔径8μm、10μm厚的基质胶包被聚碳酸酯膜(BD Biosciences)，来评估HVVEC对VEGF的趋化性。将含于200μlEBM中的HUVEC细胞悬浮液(2×105 cells/ml)接种于上层隔室内，而向下层隔室腔内同时加入测试EphB4抗体及刺激物(VEGF或bFGF)，并研究其响应含或不含100nM-1μM测试混合物的10-20ng/ml VEGF作用而发生的跨聚碳酸酯滤膜迁移。在37℃孵育4-24小时后，用拭子刮下滤膜的上表面，并用Diff Quick固定染色滤膜。在200×放大倍数下计数10个随机视野，结果用每视野平均个数表示。从刺激对照和蛋白质处理样品值中减去阴性未刺激对照值，将所得数据标示为平均迁移细胞±S.D.。从标示的数据中计算IC50。
7)生长抑制测定
将HUVEC(1.5×103细胞)置于96孔平板中的100μl EBM-2(Clonetic，Cat.No.CC3162)中。24小时后(第0天)，向每孔内的EBM-2培养基加入所需浓度的测试EphB4抗体。在第0天，用含0.5％结晶紫的20％甲醇染色一块板10分钟，水洗后空气中干燥。其他平板在37℃下孵育72小时。72小时后用含0.5％结晶紫的20％甲醇染色，并水洗后空气中干燥。用1∶1的乙醇：0.1M柠檬酸钠溶液洗脱染色(包括第0天的板)，并用ELISA读取仪(Dynatech Laboratories)于540nm下测量其吸光度。从72小时板值中减去第0天的吸光度，数据标示为对照增殖(用对照处理的细胞)的百分比。从标示的数据中计算IC50值。
8)鼠基质胶栓血管发生测定
测定血管从皮下组织向含有基质胶栓的测试样品的生长，作为小鼠体内血管发生的测定。基质胶在体温下可迅速形成固体凝胶，从而捕获因子，使其缓慢释放并延长其暴露于周围组织的时间。将4℃下液体形式的基质胶(8.13mg/ml，0.5ml)与内皮细胞生长添加剂(ECGS)、或测试EphB4抗体加ECGS混合，或者基质胶仅与赋形剂混合(含0.25％BSA的PBS)。沿腹膜中线向雌性nu/nu小鼠(6周大)的腹部皮下组织中注射基质胶(0.5ml)。每组中有3只小鼠。根据惯例和NIH纲要饲养这些动物。在第6天，处死小鼠并回收栓剂，处理以进行组织学分析。一般而言，移去表面皮肤，并保留腹膜内层作为支撑割下凝胶，用含10％缓冲福尔马林的PBS固定，并包埋于石蜡内。切成3μm切片，并用H&E或Masson三色染色，在光学显微镜下检查。
9)小鼠角膜微囊测定
根据Kenyon等人，1996的详述进行小鼠角膜微囊测定。简言之，制备含有90ng bFGF(R&D)或180ng VEGF(R&D Systems，Minneapolis，MN，U.S.A.)、以及40μg蔗糖硫酸铝(Sigma)的hydron小丸(聚羟乙基异丁烯酸[polyHEMA]，Interferon Sciences，New Brunswick，NJ，U.S.A.)。利用手术显微镜，在麻醉动物上用手术刀片(Bard-Parker no.15)做平行于外直肌走行的基质线性角膜切开术。用改良的yon Graefe刀(2″30mm)剖开基质内微囊。植入单个小球，并移向颞侧角膜缘(对于bFGF小球，范围为0±7±1±0mm，而VEGF小球为0±5mm)。由于该模型中VEGF的血管发生刺激作用相对较弱，有必要使每一生长因子小球处于不同位置。然后向手术眼敷上抗生素软膏(红霉素)，以防止感染并减少表面刺激。测量随后从角膜缘血管网延伸至小球及邻近新生血管的圆周区的血管应答。此处显示的数据和临床照片获自小球植入后的第6天，也即显示发生最大血管发生应答的一天。
10)体外侵袭测定
将用“基质胶”基质包被的9mm细胞培养嵌入物(孔径8μm；BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)置于24孔平板上。将HUVEC细胞以每孔5×103细胞的密度接种在嵌入培养基的上层，并在测试EphB4抗体存在时用无血清的EBM培养24小时。在不含EphB4抗体的相同培养基中培养对照组。然后向嵌入培养基下层中填入0.5ml人SCC15细胞系和条件培养基作为化学引诱剂。孵育细胞24小时，然后用棉花刮取上层中的残留细胞，穿入下层的细胞以5％戊二醛固定并以Diff Quick染色。利用光学显微镜计数穿过基质胶培养基及每个8μm孔嵌入培养基的细胞总数，定为侵袭指数(细胞数/面积)。
11)小鼠中的SCC15肿瘤生长
以5×106的细胞密度向无胸腺Balb/c裸鼠皮下注射呈对数级增长的SCC15头颈部鳞状细胞癌细胞系；其中在存在或不存在人bFGF的情况下含或不含测试EphB4抗体，且含有基质胶(BD Bioscience)合成基膜(1∶1v/v)，并于两周内检查肿瘤。移植后测试EphB4抗体组的肿瘤体积(含或不含生长因子)比对照组小三倍。组间体重无差异。除去石蜡、再水合并封闭内源性过氧化物酶活性后，用蛋白酶K渗透10分钟，随后进行切除肿瘤横切片，及TUNEL-阳性凋亡或坏死的免疫组织化学检查、CD34免疫染色和BrdU增殖率测定。也进行血管密度的定量评估。同时每周两次局部肿瘤内递送或经静脉递送测试EphB4抗体。
向30只无胸腺裸鼠BALB/c(nu/nu)中每只注射1×106 B16黑素瘤细胞，其中含有混入0.1ml基质胶的0.1ml PBS，或注射重悬浮于200μl无血清DMEM培养基内的1.5×106 SCC15细胞；于第0天在小鼠的右肩区域注入皮下。从第1天开始，经静脉或肿瘤周围皮下注射测试EphB4抗体，起始剂量为4μg/mg，每周及接种后2周时注射2μg/mg(10μg/g，50μg/kg/天)。于第14天处死小鼠。对照组小鼠每天接受PBS 50μl。
12)裸鼠中肿瘤形成
所有动物的处理都遵循由实验动物管理委员会(institutional animalcare committees)通过的条款进行。将癌细胞(5×106)皮下接种于裸鼠的背部皮肤。当肿瘤生长到约100mm3大小时(通常需要12天)，每日腹膜内或皮下注射测试EphB4抗体一次，并监测肿瘤生成2周。根据公式a2×b计算肿瘤的体积，其中a和b分别为最小和最大直径。使用学生t检验比较肿瘤体积，P＜0.05视为差异显著。
13)微血管密度的定量
用4％甲醛固定肿瘤，石蜡包埋，切成5μm切片，并用苏木精伊红染色。利用基于计算机的图像分析工具对血管密度进行半定量(每张切片5个视野，来自每组3只小鼠)。
引用参考
此处提及的所有出版物及专利均在此处以其整体引用作为参考，就如同每一单个出版物和专利被单独引用作为参考一样。
尽管已经探讨了本发明的具体实施方案，上述说明是说明性而不是限制性的。在回顾该详述及以下权利要求书后，对于本领域技术人员而言显而易见的是，可以对本发明进行多种改变。本发明的全部范围如权利要求书所确定，包括其完整范围内的等同物、说明书以及此类改变。

Claims (59)

1.分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分可结合EphB4胞外部分的表位相并抑制EphB4活性。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分结合位于图1的EphB4序列中氨基酸16-198的表位。
3.权利要求2的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制EphB4与肝配蛋白B2胞外部分的结合。
4.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分结合位于图1的EphB4序列中氨基酸324-429或430-537的表位。
5.权利要求4的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制EphB4二聚体或多聚体的形成。
6.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分结合EphB4的第一纤连蛋白样结构域(FND1)。
7.权利要求3的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分结合EphB4的第二纤连蛋白样结构域(FND2)。
8.权利要求1的分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制肝配蛋白B2刺激的EphB4自磷酸化。
9.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制培养的内皮细胞形成脉管。
10.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制体内组织的血管形成。
11.权利要求10的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制植入动物角膜的组织的血管形成。
12.权利要求10的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制植入动物体内的基质胶组织栓的血管形成。
13.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分减少小鼠中人肿瘤异种移植物的生长。
14.权利要求2的分离的抗体，其中所述抗体选自此处以No.001、No.023、No.035和No.079表示的抗体。
15.权利要求2的分离的抗体，其中所述抗体为选自此处以No.001、No.023、No.035和No.079表示抗体的人源化形式。
1 6.权利要求2的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分含有至少一个选自此处以No.001、No.023、No.035和No.079表示抗体的CDR部分。
17.权利要求4的分离的抗体，其中所述抗体选自此处以No.047、No.057、No.85H、No.098和No.138表示的抗体。
18.权利要求4的分离的抗体，其中所述抗体为选自此处以No.001、No.023、No.035和No.079表示抗体的人源化形式。
19.权利要求4的分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分含有至少一个选自此处以No.001、No.023、No.035和No.079表示抗体的CDR部分。
20.权利要求1的抗体，其中抗体为单克隆抗体。
21.权利要求20的抗体，其中的单克隆抗体可临床施用于人。
22.产生权利要求1抗体的杂交瘤。
23.可产生此处以No.001、No.023、No.035、No.079、No.047、No.057、No.85H、No.098和No.138表示的抗体的杂交瘤。
24.治疗癌症的方法，包括向所需患者施用有效量的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4胞外部分的表位并抑制EphB4活性。
25.权利要求24的方法，其中的患者被诊断为患有选自结肠癌、乳腺肿瘤、间皮瘤、前列腺肿瘤、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤和白血病的癌症。
26.权利要求24的方法，其中全身性施用分离的抗体或其抗原结合部分。
27.权利要求24的方法，其中局部施用分离的抗体或其抗原结合部分。
28.抑制患者血管发生的方法，包括向所需患者施用有效量的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4胞外部分的表位并抑制EphB4活性。
29.权利要求28的方法，其中患者被诊断为黄斑变性。
30.含有权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分的药物制品。
31.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合部分在制造治疗癌症的药物制品中的用途。
32.权利要求31的用途，其中癌症选自结肠癌、乳腺肿瘤、间皮瘤、前列腺肿瘤、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤和白血病。
33.分离的抗体或其抗原结合部分，其结合图1 EphB4序列中氨基酸324-429或430-537的表位并刺激EphB4激酶活性。
34.权利要求33的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体结合EphB4的第一纤连蛋白样结构域(FND1)。
35.权利要求34的分离的抗体，其中所述抗体结合EphB4的第二纤连蛋白样结构域(FND2)。
36.权利要求33的分离的抗体，其中所述抗体选自此处以No.85L、No.091、No.121和No.131表示的抗体。
37.权利要求33的分离的抗体，其中所述抗体为选自此处以No.85L、No.091、No.121和No.131表示抗体的人源化形式。
38.权利要求33的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分含有至少一个选自此处以No.85L、No.091、No.121和No.131表示抗体的CDR部分。
39.权利要求33的抗体，其中的单克隆抗体可临床施用于人。
40.产生权利要求33的抗体的杂交瘤。
41.可产生以No.001、No.023、No.035、No.079、No.047、No.057、No.85H、No.098和No.138表示的抗体的杂交瘤。
42.治疗癌症的方法，包括向所需患者施用有效量的分离的抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4胞外部分的表位并刺激EphB4激酶活性。
43.权利要求42的方法，其中的患者被诊断为患有选自结肠癌、乳腺肿瘤、间皮瘤、前列腺肿瘤、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤和白血病的癌症。
44.权利要求42的方法，其中全身性施用分离的抗体或其抗原结合部分。
45.如权利要求42的方法，其中局部施用分离的抗体或其抗原结合部分。
46.抑制患者血管发生的方法，包括向所需患者施用有效剂量的分离抗体或其抗原结合部分，所述抗体或其抗原结合部分结合位于EphB4胞外部分的表位相结合并刺激EphB4激酶活性。
47.权利要求46的方法，其中患者被诊断为黄斑变性。
48.含有权利要求33的分离的抗体或其抗原结合部分的药物制品。
49.权利要求33的分离的抗体或其抗原结合部分在制造治疗癌症的药物制品中的用途。
50.权利要求49的用途，其中癌症选自结肠癌、乳腺肿瘤、间皮瘤、前列腺肿瘤、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤和白血病。
51.可特异结合EphB4胞外部分表位的抗体，其中该抗体选自编号为1、23、35、47、57、79、85L、85H、91、98、121、131和138的抗体。
52.权利要求1或权利要求33的分离的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分共价连接于额外的功能部分。
53.权利要求52的分离的抗体或其抗原结合部分，其中额外的功能部分为标记。
54.权利要求53的分离的抗体或其抗原结合部分，其中的标记为适于用选自荧光检测法、正电子成像术检测法以及核磁共振检测法的方法检测的标记。
55.权利要求53的分离的抗体或其抗原结合部分，其中的标记选自荧光标记、放射活性标记以及具有特征性核磁共振信号的标记。
56.权利要求52的分离的抗体或其抗原结合部分，其中的额外的功能部分能够提高抗体或其抗原结合部分的血清半衰期。
57.权利要求56的分离的抗体或其抗原结合部分，其中额外的功能部分包括聚乙二醇(PEG)部分。
58.权利要求1或权利要求33的分离抗体，其中所述分离的抗体由具有选自ATCC保藏识别号PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6211和PTA-6214的宿主细胞表达。
59.具有选自ATCC保藏识别号PTA-6208、PTA-6209、PTA-6210、PTA-6211和PTA-6214的宿主细胞。
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AU (1) AU2005224081B2 (zh)
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NZ (1) NZ549787A (zh)
WO (1) WO2005090406A2 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6887674B1 (en) 1998-04-13 2005-05-03 California Institute Of Technology Artery- and vein-specific proteins and uses therefor
US7381410B2 (en) 2003-03-12 2008-06-03 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
WO2004080425A2 (en) 2003-03-12 2004-09-23 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
KR20120123619A (ko) 2004-03-12 2012-11-08 바스진 테라퓨틱스, 인크. 혈관형성 및 종양 성장을 억제하기 위한 폴리펩티드 화합물
EP2275445A3 (en) 2004-03-12 2012-02-29 Vasgene Therapeutics, Inc. Antibodies binding to ephb4 for inhibiting angiogenesis and tumor growth
JP5219513B2 (ja) * 2004-09-23 2013-06-26 バスジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド 血管形成及び腫瘍増殖阻害用ポリペプチド化合物
US8444973B2 (en) 2005-02-15 2013-05-21 Duke University Anti-CD19 antibodies and uses in B cell disorders
TWI391402B (zh) * 2006-01-05 2013-04-01 Genentech Inc 抗ｅｐｈｂ４抗體及使用該抗體之方法
BRPI0706840A2 (pt) * 2006-01-05 2011-04-05 Genentech Inc anticorpos anti- ephb4 isolado polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção de um anticorpo anti ephb4, método para produção de um imunoconjugado anti ephb4, método para a detecção de ephb4, método para diagnosticar um distúrbio composição, método para inibir a angiogênese, método para tratar um cáncer, tumor e/ou distúrbio da proliferação celular e uso de um anticorpo
DK2061510T3 (en) * 2006-08-31 2016-09-05 A C N 135 493 391 Pty Ltd As Trustee For Conca Unit Trust Treatment and / or prevention of Barrett's esophagus using anti-EphB4 antibody-containing compositions
JP3970311B1 (ja) * 2006-09-01 2007-09-05 アキュメンバイオファーマ株式会社 新生血管阻害剤，ＤＮＡ合成阻害剤，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害剤及び医療用キット
US20110009323A1 (en) * 2007-06-15 2011-01-13 Vasgene Therapeutics, Inc. Non-immunoglobulin antigen binding scaffolds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
EP2020419A1 (en) * 2007-07-31 2009-02-04 Bayer Schering Pharma Aktiengesellschaft Anti ephB4 antibody fragments
BRPI0815399A2 (pt) 2007-08-13 2019-09-24 Vasgene Therapeutics Inc tratamento de câncer usando anticorpos humanizados que se ligam ephb4

Family Cites Families (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3225539A (en) 1962-06-20 1965-12-28 George C Coverston Explosion inertia turbine engine
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3817827A (en) 1972-03-30 1974-06-18 Scott Paper Co Soft absorbent fibrous webs containing elastomeric bonding material and formed by creping and embossing
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4172124A (en) 1978-04-28 1979-10-23 The Wistar Institute Method of producing tumor antibodies
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5092885A (en) 1987-02-12 1992-03-03 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Peptides with laminin activity
ATE120761T1 (de) 1987-05-21 1995-04-15 Creative Biomolecules Inc Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung.
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
US5192744A (en) 1990-01-12 1993-03-09 Northwestern University Method of inhibiting angiogenesis of tumors
JPH04218000A (ja) 1990-02-13 1992-08-07 Kirin Amgen Inc 修飾ポリペプチド
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
DE69114782T2 (de) 1990-08-08 1996-04-18 Takeda Chemical Industries Ltd Intravaskulär embolisierendes Mittel mit Gehalt an einem die Angiogenesis hemmenden Stoff.
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
AU1411992A (en) 1991-01-15 1992-08-27 Robert A Bok A composition containing a tetracycline and use for inhibiting angiogenesis
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2111006C (en) 1991-06-21 2008-04-08 Andrew D. Boyd A novel receptor-type tyrosine kinase and use thereof
AU665025B2 (en) 1991-09-23 1995-12-14 Cambridge Antibody Technology Limited Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US6331302B1 (en) 1992-01-22 2001-12-18 Genentech, Inc. Protein tyrosine kinase agonist antibodies
JPH07504813A (ja) 1992-01-22 1995-06-01 ニユー・イングランド・デイーコネス・ホスピタル 新規蛋白質チロシンキナーゼ類
US5635177A (en) * 1992-01-22 1997-06-03 Genentech, Inc. Protein tyrosine kinase agonist antibodies
DE69233803D1 (de) 1992-10-28 2011-03-31 Genentech Inc Verwendung von vaskulären Endothelwachstumsfaktor-Antagonisten
US5824303A (en) 1992-11-13 1998-10-20 Amgen Inc. Eck receptor ligands
CA2149333C (en) 1992-11-13 2002-01-22 Timothy D. Bartley Eck receptor ligands
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
US5512591A (en) 1993-02-18 1996-04-30 President And Fellows Of Harvard College Treatments for diseases characterized by neovascularization
ES2152753B1 (es) 1993-03-29 2001-09-01 Ct Investig Energeticas Ciemat Animales transgenicos para la determinacion de agentes que estimulan o reprimen la hiperproliferacion epidermica y el crecimiento del pelo
US6303769B1 (en) 1994-07-08 2001-10-16 Immunex Corporation Lerk-5 dna
US5624899A (en) 1994-07-20 1997-04-29 Genentech Inc. Method for using Htk ligand
WO1996003043A1 (en) 1994-07-26 1996-02-08 Rutgers, The State University Of New Jersey Human brain specific kinase
US5795734A (en) 1994-09-19 1998-08-18 President And Fellows Of Harvard College EPH receptor ligands, and uses related thereto
AU716924B2 (en) 1994-10-27 2000-03-09 Genentech Inc. AL-1 neurotrophic factor, a ligand for an EPH related tyrosine kinase receptor
US6057124A (en) 1995-01-27 2000-05-02 Amgen Inc. Nucleic acids encoding ligands for HEK4 receptors
WO1996026958A2 (en) 1995-02-27 1996-09-06 President And Fellows Of Harvard College Eph RECEPTOR LIGAND ELF-2
GB9508538D0 (en) 1995-04-27 1995-06-14 Zeneca Ltd Quinazoline derivatives
JPH11514976A (ja) 1995-09-08 1999-12-21 ジェネンテク・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ−関連タンパク質
AU717277B2 (en) 1995-10-23 2000-03-23 Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
US5837534A (en) 1995-11-14 1998-11-17 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Smooth muscle 22α promoter, gene transfer vectors containing the same, and method of use of the same to target gene expression in arterial smooth muscle cells
AUPN727795A0 (en) 1995-12-22 1996-01-18 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The A novel receptor-type tyrosine kinase and use thereof
EE9800154A (et) 1995-12-29 1998-12-15 Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc. Herpesviirusevastaste omadustega fenüültiasoolderivaadid
US6465431B1 (en) 1999-11-17 2002-10-15 Boston Life Sciences, Inc. Pharmaceutical compositions comprising troponin subunits, fragments and homologs thereof and methods of their use to inhibit angiogenesis
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
PT951295E (pt) 1996-05-31 2010-07-29 Scripps Research Inst COMPOSIÎES PARA UTILIZAÆO NA INIBIÆO DE ANGIOGéNESE MEDIADA POR ALFA-V-BETA3
CA2259157A1 (en) 1996-07-05 1998-01-15 Mount Sinai Hospital Corporation Oligomerized receptors which affect pathways regulated by transmembrane ligands for elk-related receptor tyrosine kinases
US6321439B1 (en) 1997-01-21 2001-11-27 Siemens Westinghouse Power Corporation Method for assembly of a stator in the field
UA73073C2 (uk) 1997-04-03 2005-06-15 Уайт Холдінгз Корпорейшн Заміщені 3-ціанохіноліни, спосіб їх одержання та фармацевтична композиція
BRPI9809387B8 (pt) 1997-04-07 2021-05-25 Genentech Inc anticorpo humanizado anti-fator de crescimento endotelial vascular humano e composição que o compreende
WO1998045708A1 (en) 1997-04-08 1998-10-15 Sugen, Inc. Study and treatment of diseases related to specific cellular functions of receptor protein tyrosine kinases
US6440954B1 (en) 1997-04-18 2002-08-27 President And Fellows Of Harvard College Inhibition of vascular smooth muscle cell proliferation
WO1999008696A1 (en) 1997-08-19 1999-02-25 Vanderbilt University METHODS FOR DETERMINING CELL RESPONSES THROUGH EphB RECEPTORS
JP2001518318A (ja) 1997-10-02 2001-10-16 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｌｅｒｋ−２媒介細胞接着の調節
US6475784B1 (en) 1997-11-14 2002-11-05 Valentis, Inc. Inhibition of angiogenesis by delivery of nucleic acids encoding anti-angiogenic polypeptides
EP1048673A4 (en) 1997-12-26 2002-10-25 Mochida Pharm Co Ltd INHIBITOR OF NEO VASCULARIZATION, WHICH CONTAINS DIENOGEST AS AN ACTIVE ACTIVE SUBSTANCE
DE69921102T2 (de) 1998-03-05 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Verfahren zur verbesserung der serum-halbwertszeit von biologisch aktiven molekülen
US6887674B1 (en) 1998-04-13 2005-05-03 California Institute Of Technology Artery- and vein-specific proteins and uses therefor
US6864227B1 (en) 1998-04-13 2005-03-08 California Institute Of Technology Artery-and vein-specific proteins and uses therefor
US6482802B1 (en) 1998-05-11 2002-11-19 Endowment For Research In Human Biology, Inc. Use of neomycin for treating angiogenesis-related diseases
US6413513B1 (en) 1998-05-22 2002-07-02 Entremed, Inc. Compositions and methods for inhibiting endothelial cell proliferation and regulating angiogenesis using cancer markers
US6395718B1 (en) 1998-07-06 2002-05-28 Guilford Pharmaceuticals Inc. Pharmaceutical compositions and methods of inhibiting angiogenesis using naaladase inhibitors
JP2002530273A (ja) 1998-07-13 2002-09-17 パーカシュ エス． ギル， 脈管形成および腫瘍増殖の新規インヒビター
AU751283B2 (en) 1998-07-14 2002-08-08 Bristol-Myers Squibb Company Lysine binding fragments of angiostatin
AU775289B2 (en) 1998-08-21 2004-07-29 Children's Medical Center Corporation Use of melanin for inhibition of angiogenesis and macular degeneration
AU8788998A (en) 1998-10-02 2000-04-06 Universite Paris 7 Vascular specific regulatory elements contained in the desmin 5' flanking region
AUPP674898A0 (en) 1998-10-27 1998-11-19 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The A method of treatment
DK1135153T3 (da) 1998-11-20 2005-08-15 Genentech Inc Anvendelser af EPH-receptorantagonister og -agonister til behandling af vaskulære forstyrrelser
US6373256B1 (en) 1999-01-08 2002-04-16 Fairchild Semiconductor Corporation Programmable low battery detector
US6462075B1 (en) 1999-12-23 2002-10-08 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Chalcone and its analogs as agents for the inhibition of angiogensis and related disease states
WO2001049743A2 (en) 2000-01-06 2001-07-12 The Hospital For Sick Children Methods of modulation of the immune system
CA2404528A1 (en) 2000-03-31 2001-10-04 Institut Pasteur Peptides blocking vascular endothelial growth factor (vegf)-mediated angiogenesis, polynucleotides encoding said peptides and methods of use thereof
AU2001257174A1 (en) 2000-04-21 2001-11-07 Amgen Inc. Integrin/adhesion antagonists
US6318298B1 (en) 2000-05-05 2001-11-20 Dan Nonay Automatic, on-demand, self-adjusting brushing system for use with large animals, such as cows
JP2004505620A (ja) 2000-08-03 2004-02-26 ザ　ユニバーシティ　オブ　ユタ　リサーチ　ファウンデーション 動静脈特性の操作
WO2002026827A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Novartis Ag Extracellular polypeptides of eph b receptors and ephrin b ligands and the corresponding nucleic acid molecules
US6548477B1 (en) 2000-11-01 2003-04-15 Praecis Pharmaceuticals Inc. Therapeutic agents and methods of use thereof for the modulation of angiogenesis
IL156009A0 (en) 2000-11-20 2003-12-23 California Inst Of Techn Artery smooth muscle and vein smooth muscle specific proteins and uses therefor
WO2002058538A2 (en) 2001-01-26 2002-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of imaging and targeting vasculature
WO2002061055A2 (en) 2001-01-31 2002-08-08 Mount Sinai Hospital Methods for regulating the kinase domain of ephb2
WO2002079382A2 (en) 2001-03-30 2002-10-10 President And Fellows Of Harvard College B-ephrin regulation of g-protein coupled chemoattraction; compositions and methods of use
WO2002102972A2 (en) 2001-06-20 2002-12-27 Prochon Biotech Ltd. Antibodies that block receptor protein tyrosine kinase activation, methods of screening for and uses thereof
AU2002318371B2 (en) 2001-06-20 2006-06-15 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CA2452578A1 (en) 2001-07-03 2003-01-16 The Hospital For Sick Children Ephrin and eph receptor mediated immune modulation
US20060241027A1 (en) 2002-02-07 2006-10-26 Hans-Peter Hauser Hiv inhibiting proteins
EP1575509B1 (en) 2002-05-10 2011-10-26 Purdue Research Foundation Epha2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof
AU2003243228B2 (en) 2002-05-10 2009-03-26 Medimmune, Llc EphA2 monoclonal antibodies and methods of use thereof
US20040110150A1 (en) 2002-12-10 2004-06-10 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of Ephrin-B2 expression
AU2003254641A1 (en) 2002-08-28 2004-03-19 Maxygen Aps Interferon beta-like molecules for treatment of cancer
AU2002951409A0 (en) * 2002-09-16 2002-09-26 North Western Adelaide Health Services Methods for regulating cancer
AU2003260169B9 (en) * 2002-09-16 2011-06-09 The Queen Elizabeth Hospital Research Foundation Inc. Methods for regulating cancer
WO2004080425A2 (en) 2003-03-12 2004-09-23 Vasgene Therapeutics, Inc. Polypeptide compounds for inhibiting angiogenesis and tumor growth
NZ567952A (en) 2003-03-24 2009-12-24 Sequoia Pharmaceuticals Inc Long acting biologically active conjugates
EP1617864A4 (en) 2003-04-11 2006-06-21 Medimmune Inc EPHA2 AND NON-NEOPLASTIC HYPERPROLIFERATIVE CELL TROUBLESHOOTING
AU2004230539A1 (en) 2003-04-11 2004-10-28 Medimmune, Llc EphA2, hypoproliferative cell disorders and epithelial and endothelial reconstitution
AU2004291026A1 (en) 2003-06-06 2005-06-02 Medimmune, Llc Use of EphA4 and modulator of EphA4 for diagnosis, treatment and prevention of cancer
US7576052B2 (en) 2003-10-17 2009-08-18 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for modulating adipocyte function
CA2546763A1 (en) 2003-11-20 2005-06-09 Medimmune, Inc. Epha2 agonistic monoclonal antibodies and methods of use thereof
EP2275445A3 (en) 2004-03-12 2012-02-29 Vasgene Therapeutics, Inc. Antibodies binding to ephb4 for inhibiting angiogenesis and tumor growth
JP5219513B2 (ja) 2004-09-23 2013-06-26 バスジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド 血管形成及び腫瘍増殖阻害用ポリペプチド化合物

Also Published As

Publication number Publication date
US20080131436A1 (en) 2008-06-05
CN101072797B (zh) 2012-05-09
JP2008500964A (ja) 2008-01-17
WO2005090406A3 (en) 2006-12-28
EP2287194B1 (en) 2016-10-26
EP1730196A2 (en) 2006-12-13
JP4960859B2 (ja) 2012-06-27
AU2005224081A1 (en) 2005-09-29
EP1730196B1 (en) 2010-12-22
NZ549787A (en) 2010-05-28
EP2275445A3 (en) 2012-02-29
EP2287194A3 (en) 2012-02-29
AU2005224081B2 (en) 2011-06-30
WO2005090406A2 (en) 2005-09-29
EP2275445A2 (en) 2011-01-19
US7977463B2 (en) 2011-07-12
CA2559554A1 (en) 2005-09-29
EP2287194A2 (en) 2011-02-23

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