CN101063111B - 一种提高肌酸激酶液体双试剂稳定的方法 - Google Patents
一种提高肌酸激酶液体双试剂稳定的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种提高肌酸激酶液体双试剂稳定的方法，用于临床生化诊断试剂的配制，其特点是：在该试剂溶液中含0.02～1％的去氧表面活性剂，并调整含巯基化合物的缓冲液pH为6.0～6.7(25℃)。本发明可以提高使用含巯基化合物作为激活剂的生物体液诊断试剂的稳定性，主要应用于肌酸激酶和肌酸激酶同工酶中。
Description
技术领域：
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种提高肌酸激酶液体双试剂稳定的方法。
背景技术：
肌酸激酶(Creatin Kinase，CK)是由M(肌肉)型和B(脑)型两种单体亚单位组成的二聚酶。M型和B型亚单位结合形成三种CK同工酶：BB(CK-1)、MB(CK-2)和MM(CK-3)。总CK活性主要见于骨骼肌，绝大多数为CK-MM同工酶；其他含有较高CK活性的组织，包括心肌，其中约40％为CK-MB同工酶；胃肠道和脑组织，以CK-BB同工酶为主。这些组织受损或疾病时会导致血清肌酸激酶水平升高，如肌肉萎缩症、心肌梗死、急性脑血管意外等。通过测定血清中特殊的同工酶可以改善诊断的特异性。
CK的测定方法有比色法、酶耦联法、荧光法和生物发光法等。可以测定正向反应产物，也可以测定逆向反应产物。因逆向反应的速度较快，敏感性较高，成为中国使用的主要方法。即国际临床化学联合组织(IFCC)推荐的酶偶联法测定肌酸激酶活性。
该方法的主要原理如下：
Creatine-P：磷酸肌酸；ADP：二磷酸腺苷；ATP：三磷酸腺苷；D-Glucose：右旋葡萄糖；hexokinase：己糖激酶；D-Glucose-6-P：6-酸葡萄糖；NADPH：辅酶II。Glucose-6phosphate dethyerogenase：6-磷酸葡萄糖脱氢酶。
在一定条件下血清中的肌酸激酶被含巯基化合物激活后，可以促进磷酸肌酸与ADP发生磷酸基团转移生成ATP，ATP与右旋葡萄糖在己糖激酶催化下，生成6-磷酸-葡萄糖，6-磷酸-葡萄糖在G6PD(6-磷酸葡萄糖脱氢酶)的催化下，将氢离子转移到NADP+上，生成NADPH，并在340nm下发生明显的吸光度上升变化，该吸光度的变化速度，在一定范围内与磷酸肌酸的酶催化活性成正比，可以通过计算吸光度变化速率计算出样本中肌酸激酶的含量。
由于血清中的肌酸激酶需要经过预先激活才能进行对应的测量，而使用的激活剂含巯基化合物是一种强还原剂，在溶液中极易被氧化，并且生成的二硫化合物会抑制肌酸激酶的活性(Clinical Chemistry，22(5)，650，(1976))。作为商品化的试剂，需要足够的稳定性，目前常用的稳定方法是加入一定量的乙二胺四乙酸或者其钠盐(EDTA)来提高该试剂的稳定性，但该方法尚不能满足临床检测试剂稳定性的要求。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种能使肌酸激酶液体双试剂稳定的方法。
本发明提供了一种提高肌酸激酶液体双试剂稳定的方法。该方法是在肌酸激酶液体双试剂的试剂I(含巯基化合物组份的试剂)配制时添加表面活性剂。
本发明人经过研究发现肌酸激酶液体双试剂的不稳定主要是由于含巯基化合物的不稳定引起的，含巯基化合物的不稳定则是由于缓冲液中存在的氧化性物质和溶解在溶液中的氧引起的，本发明通过添加少量表面活性剂大幅度降低溶液中的氧，同时根据双试剂的特点，降低保存含巯基化合物试剂溶液的pH，形成还原型缓冲液，而提高含巯基化合物的稳定性。
本发明中使用的表面活性剂对反应本身无影响，但可以大幅度降低水溶液中游离氧的存在，主要包括吐温80，吐温20，曲拉通x100等，含量为溶液的0.02～1％，缓冲液pH范围为6.0～6.7(25℃)。
上述试剂中表面活性剂的浓度最佳为0.08～0.3％。
上述试剂中降低的缓冲液pH范围为6.1～6.6(25℃)。
本发明应用于临床诊断的试剂品种主要包括肌酸激酶(CK)，肌酸激酶同工酶(CKMB)。
具体实施方法：
下面所提及的实施例是对本发明详细说明，而不是限定本发明的范围。
实施例1
制备含下述组分的试剂。
试剂I：
咪唑-醋酸盐缓冲液pH＝6.6 115mM
乙二胺四乙酸二钠盐 2.3mM
醋酸镁 11.5mM
N-乙酰半胱氨酸 23mM
腺苷二磷酸 2.3mM
腺苷一磷酸 5.8mM
五磷酸二腺苷 11.5uM
葡萄糖 23mM
辅酶II 2.3mM
己糖激酶 3.45KU/L
六磷酸葡萄糖脱氢酶 2.3KU/L
试剂II
磷酸肌酸 345mM
按常规方法制备后立即将下表所列表面活性剂按所示浓度加入试剂I中，再2～8℃贮存9个月。9个月后，制备-份含上述同样成分的试剂(新鲜试剂)，将贮存的和新鲜的试剂都用于在标准血清中的肌酸激酶的活性测定(测定方法见Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem，vol 29，1991，pp，435～456)，将50ul标准血清加入2.25ml试剂I中，混匀后在37℃孵育5分钟，然后加入试剂II，反应3分钟后连续监测2分钟内吸光度变化的速率，用辅酶II的摩尔消光系数测定肌酸激酶的活性。结果如下表。其中新鲜试剂活性为100％，贮存试剂以相对值表示。
上述结果表明通过添加少量的表面活性剂可以大幅度降低含巯基化合物被氧化的速度，同时适当的调节保存含巯基化合物的缓冲液pH值，可以有效的提高肌酸激酶液体双试剂的稳定性。
实施例2
制备含下述组分的试剂。
试剂I：
咪唑-醋酸盐缓冲液pH＝6.4 90mM
乙二胺四乙酸二钠盐 2.3mM
醋酸镁 11.5mM
N-乙酰半胱氨酸 23mM
腺苷二磷酸 2.3mM
腺苷一磷酸 5.8mM
五磷酸二腺苷 11.5uM
葡萄糖 23mM
辅酶II 2.3mM
己糖激酶 3.45KU/L
六磷酸葡萄糖脱氢酶 2.3KU/L
试剂II
磷酸肌酸 345mM
咪唑 150mM
制备后立即将下表所列表面活性剂按所示浓度加入试剂I中，再2～8℃贮存9个月。9个月后，制备一份含同样成分的试剂(新鲜试剂)，将贮存的和新鲜的试剂都用于在标准血清中的肌酸激酶的活性测定(测定方法见Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem，vol29，1991，pp，435～456)，将50ul标准血清加入2.25ml试剂I中，混匀后在37℃孵育5分钟，然后加入试剂II，反应3分钟后连续监测2分钟内吸光度变化的速率，用辅酶II的摩尔消光系数测定肌酸激酶的活性。结果如下表。其中新鲜试剂活性为100％，贮存试剂以相对值表示。
Claims (3)
1.一种提高肌酸激酶液体双试剂稳定的方法，其特征在于该方法为：在配制肌酸激酶液体双试剂时，将表面活性剂加入试剂I中，所述试剂I的组成为：
咪唑-醋酸盐缓冲液pH＝6.6 115mM
乙二胺四乙酸二钠盐 2.3mM
醋酸镁 11.5mM
N-乙酰半胱氨酸 23mM
腺苷二磷酸 2.3mM
腺苷一磷酸 5.8mM
五磷酸二腺苷 11.5uM
葡萄糖 23mM
辅酶II 2.3mM
己糖激酶 3.45KU/L
六磷酸葡萄糖脱氢酶 2.3KU/L；
所述试剂中表面活性剂的浓度为0.02％～1％。
2.一种提高肌酸激酶液体双试剂稳定的方法，其特征在于该方法为：在配制肌酸激酶液体双试剂时，将表面活性剂加入试剂I中，所述试剂I的组成为：
咪唑-醋酸盐缓冲液pH＝6.4 90mM
乙二胺四乙酸二钠盐 2.3mM
醋酸镁 11.5mM
N-乙酰半胱氨酸 23mM
腺苷二磷酸 2.3mM
腺苷一磷酸 5.8mM
五磷酸二腺苷 11.5uM
葡萄糖 23mM
辅酶II 2.3mM
己糖激酶 3.45KU/L
六磷酸葡萄糖脱氢酶 2.3KU/L；
所述试剂中表面活性剂的浓度为0.02％～1％。
3.根据权利要求1或2所述的一种提高肌酸激酶液体双试剂稳定的方法，其特征在于其中所述的表面活性剂为吐温80，吐温20或曲拉通x100。
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