CN101824405B - 一种肌酸激酶稀释剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种肌酸激酶稀释剂，本发明通过在稀释剂中添加多种抗干扰剂，稳定剂，并选择非离子缓冲液，配置组合抗干扰剂和稳定剂，形成保持肌酸激酶活力的稳定水溶性稀释剂。试验结果表明使用本发明稀释剂后，肌酸激酶的酶活性的稳定性得到显著的提高，以确保检测结果真实正确，有较大的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物试剂，具体涉及一种肌酸激酶稀释剂。
背景技术
血清肌酸激酶的测定用于临床诊断肌肉萎缩症、心肌梗死、急性脑血管意外等情况，有一定的参考价值。肌酸激酶(Creatin Kinase，CK)是由M(肌肉)型和B(脑)型两种单体亚单位组成的二聚酶。M型和B型亚单位结合形成三种CK同工酶：BB(脑型同工酶)(CK-1)、MB(心肌同工酶)(CK-2)和MM(肌肉型同工酶)(CK-3)。总CK活性主要见于骨骼肌，绝大多数为CK-MM同工酶；其他含有较高CK活性的组织，包括心肌，其中约40％为CK-MB同工酶；胃肠道和脑组织，以CK-BB同工酶为主。这些组织受损或疾病时会导致血清肌酸激酶水平升高，如发生肌肉萎缩症、心肌梗死、急性脑血管意外等症状时。因此，通过测定血清中特殊的同工酶可以改善诊断的特异性。
目前，临床测定时，肌酸激酶样本使用56℃灭活的正常血清进行稀释，而不能用常规的生理盐水，PBS(磷酸盐缓冲液)等溶液稀释。对于纯酶，也不能用常规的生理盐水或PBS进行稀释。但使用56℃灭活的正常血清稀释，不仅可能影响肌酸激酶活力，并且，往往会带来各种可能的生物危害。因而，为了避免上述现象，需要设计一种能保持肌酸激酶活力的稳定的水溶剂来满足测定的需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计一种比较方便的能保持肌酸激酶活力的稳定的水溶剂。
本发明提供了一种肌酸激酶稀释剂，它由下列百分比的成分组成：
Tris 3.63％～6.05％(W/V％)
HAc 0.11％～0.13％(V/V％)
EDTA·Na2 0.19％～1.86％(W/V％)
Mg(Ac)2 0.07％～0.57％(W/V％)
Proclin300 0.01％～0.1％(V/V％)
BSA 0.2％～2％(W/V％)
NaCl 0.10％～1％(W/V％)
DTT 0.00％～1.23％(W/V％)
DI(去离子水) 添加至总体积为1000ml。
DI为去离子水。
本发明人经过研究发现，肌酸激酶在生理盐水或者PBS(磷酸盐缓冲液)等体系下活力被抑制的主要原因是缺少酶稳定剂以及抗干扰剂，而在纯粹非离子溶剂中，由于对肌酸激酶活性中性的影响会导致结果明显偏高，本发明通过在稀释剂中添加多种抗干扰剂，稳定剂，并选择非离子缓冲液，配置组合抗干扰剂和稳定剂，形成能保持肌酸激酶活力的稳定水溶性稀释剂。
本发明中使用的抗干扰剂与稳定剂对肌酸激酶参与反应本身无影响，主要是保持肌酸激酶的活力，使检测结果真实正确。使用的缓冲液为TRIS-HAc(三羟甲基氨基甲烷醋酸盐)缓冲液，使用的抗干扰剂主要包括BSA(牛血清白蛋白)，EDTANa2(乙二胺四乙酸二钠盐)，使用的稳定剂主要包括Proclin300(液体生物防腐剂)，NaCl(氯化钠)，DTT(二硫苏糖醇)，Mg(Ac)2(醋酸镁)等。
上述试剂中抗干扰剂浓度分别为：BSA为0.2％～2％，EDTANa2为0.19％～1.86％，稳定剂浓度分别为：proclin300 0.01％～0.1％，NaCl为0.1％～1％，二硫苏糖醇(DTT)等强还原剂0.00％～1.23％，Mg(Ac)20.07％～0.57％。
上述试剂中抗干扰剂最佳浓度为：BSA为0.5％～1％，EDTANa20.37％～0.74％，稳定剂的最佳浓度为：proclin300 0.01％～0.03％，NaCl为0.3％～0.5％，Mg(Ac)2为0.28％～0.43％。
本发明的最佳组成为：
Tris 3.63％～6.05％ W/V％
HAc 0.11％～0.13％ V/V％
EDTA·Na2 0.37％～0.74％ W/V％
Mg(Ac)2 0.28％～0.43％ W/V％
Proclin300 0.01％～0.03％ V/V％
BSA 0.5％～1％ W/V％
NaCl 0.3％～0.5％ W/V％
DTT 0.00％～1.23％ W/V％
DI 89.06％～95.55％ W/V％。
根据溶解或者稀释肌酸激酶后，需要保持溶液稳定的天数决定添加的DTT的量，如溶解或者稀释肌酸激酶后，三天以内使用制备的溶液，可以加0.00％～0.93％DTT，如溶解或者稀释肌酸激酶后，30天以内使用制备的溶液，需要添加0.93％～1.23％的DTT。
上述稀释剂的pH范围为7.2～8..2(25℃)。
本发明稀释剂的制备属于常规生化试剂制备方法。
本发明稀释剂可用于临床诊断肌酸激酶试剂的稀释，肌酸激酶试剂品种主要包括肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)和肌酸激酶脑型同工酶(CKBB)等。
本发明稀释剂与生理盐水或PBS相比较，能较好地保持肌酸激酶的活力，维持肌酸激酶试剂的稳定性，确保检测结果真实正确，有较大的临床应用价值。
具体实施方式
下面所提及的实施例是对本发明详细说明，而不是限定本发明的范围。
实施例1
制备含下述组分的试剂(1000ml)。
Tris 4.84g
HAc 1.142ml
EDTA·Na2 0.744g
Mg(Ac)2 0.285g
Proclin300 0.2ml
BSA 0.7g
NaCl 0.3g
DTT 0.00g
DI 加至1000ml
制备过程：
使用1000ml的容量瓶，先加入800ml去离子水，依次加入4.84gTris，0.744g EDTA·Na2，0.285g Mg(Ac)2，0.3gNaCl，0.2mlproclin300，0.7gBSA，充分溶解后加入1.142ml冰醋酸，加水至1000ml，测量pH值应在7.2～8..2(25℃)。如有偏差，应使用冰醋酸或者Tris进行pH调节。
制备后将下表所列试剂使用同一血清样本作1∶1稀释，于2～8℃密封贮存3天。3天后，使用新鲜56℃灭活血清制备一份含同样成分的试样(新鲜试样)，将2～8℃密封贮存试样和新鲜试样都用标准的肌酸激酶试剂(肌酸激酶液体双试剂，复星长征现有已市售)测定(测定方法见Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem，vol 29，1991，pp，435～456)，将40ul血清样本加入800ul试剂I(肌酸激酶液体双试剂，复星长征)中，混匀后在37℃孵育5分钟，然后加入200ul试剂II(肌酸激酶液体双试剂，复星长征)，反应3分钟后连续监测2分钟内吸光度变化的速率，用辅酶II的摩尔消光系数测定肌酸激酶的活性。结果如下表。其中新鲜试剂活性为100％，贮存试剂以相对值表示。
结论：使用本发明稀释剂后，肌酸激酶的酶活性的稳定性得到显著的提高
实施例2
制备含下述组分的试剂。
Tris 4.84g
HAc 1.142ml
EDTA·Na2 0.744g
Mg(Ac)2 0.285g
Proclin300 0.2ml
BSA 0.7g
NaCl 0.3g
DTT 1.23g
DI 加至1000ml
制备后将下表所列试剂使用同一样本对倍稀释，再2～8℃密封贮存30天。30天后，使用新鲜56℃灭活血清制备一份含同样成分的试样(新鲜试样)，将2～8℃密封贮存试样和新鲜试样都用标准的肌酸激酶试剂(肌酸激酶液体双试剂，复星长征)测定(测定方法见Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem，vol 29，1991，pp，435～456)，将40ul血清样本加入800ul试剂I(肌酸激酶液体双试剂，复星长征)中，混匀后在37℃孵育5分钟，然后加入200ul试剂II(肌酸激酶液体双试剂，复星长征)，反应3分钟后连续监测2分钟内吸光度变化的速率，用辅酶II的摩尔消光系数测定肌酸激酶的活性。结果如下表。其中新鲜试剂活性为100％，贮存试剂以相对值表示。
结论：使用本发明稀释剂后，肌酸激酶的酶活性的稳定性得到显著的提高
Claims (5)
1.一种肌酸激酶稀释剂，其特征在于所述稀释剂由下列成分组成：
Tris 4.84g
HAc 1.142ml
EDTA·Na2 0.744g
Mg(Ac)2 0.285g
Proclin300 0.2ml
BSA 0.7g
NaCl 0.3g
DTT 0.00g
DI 加至1000ml
。
2.一种肌酸激酶稀释剂，其特征在于所述稀释剂由下列成分组成：
Tris 4.84g
HAc 1.142ml
EDTA·Na2 0.744g
Mg(Ac)2 0.285g
Proclin300 0.2ml
BSA 0.7g
NaCl 0.3g
DTT 1.23g
DI 加至100ml
。
3.根据权利要求1或2所述的肌酸激酶稀释剂，其特征在于所述稀释剂的pH范围为7.2～8.2，25℃。
4.根据权利要求1或2所述的肌酸激酶稀释剂，其特征在于所述肌酸激酶稀释剂用于肌酸激酶试剂的稀释。
5.根据权利要求5所述的肌酸激酶稀释剂，其特征在于所述肌酸激酶试剂为肌酸激酶、肌酸激酶同工酶或肌酸激酶脑型同工酶。
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