JPS60501489A - γ−グルタミルトランスペプチダ−ゼを測定する方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 γ−グルタミル　トランスペプチダーゼを測定する方法および組成物 本発明は生物学的液体、特に人の血清中におけるγ−グルタミル　トランスペプ チダーゼ酵素の定量およびこの検定（ａｓｓａｙ）に使用する組成物に関する。

γ−グルタミル　トランスペプチダーゼ酵素は大または動物の腎臓の如き種々の 生物学的組織に、並びに尿および血清に存在している。血清における高レベルの Ｔ−グルクミル　トランスペプチダーゼは肝臓患者の前兆であり、また極めて高 レベルでは肝臓ガン、胆管閉鎖（ｋｉｌｃｄｕｃｔ　ｏｂ９ｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ）およびポスト心筋梗塞（ｐｏｓｔｍｙｏｃａ−ｒｄｉａｌ　１ｎｆａｒｃｔｉ ｏｎ）の心臓障害に関連する。それ故、血清におけるγ−グルタミル　トランス ペプチダーゼの臨床的測定は多数の病理学的診断における日常の試験である。γ −クルタミル　トランスペプチダーゼ活性の測定にもっとも広く使用されている 方法では、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）　γ−グルタミルーｐ−二トＶコアニリ １−（ＧＧｐＮ）が使用されている。遊離（Ｉ　１ｂｅｒａｔｅｄ）反応物、ｐ −＝ドローアニリンは黄色い化合物であり、この形成割合をγ−グルタミル　ト ランスペプチダーゼ（ＧＧＰＴ）活性の測定により光学的に定める。既知の反応 ： γ−グルクミル−ｐ−二トロアニリド　＋　グリシルグリシン三−エル　ｐ−ニ トロアニリド　＋　グルタミルグリシルグリシンはスザスゼ（Ｓｚａｓｚ）氏（ 「クリニカル　ケミストリー」１５、１．２４　（１９６９）により血清中のＧ ＧＴＰ活性を測定する臨床処理に適用され、しかもスカンシナビアン　ソサエテ ィオブ　クリニカル　ケミストリーおよびクリニカルフィシオロジにおいて最も よく活用されている（　ｒｓｃａｎｄ。

Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｌａｂ、ｌｎｖ’ｅｓｔ、Ｊ　３６．　］１９（１９７６） ）。また、この方法は−γメリカン　アソシエイジョン　オブ　クリニカル　ケ ミストリーにより適用されている。

この標準処理の１つの欠点はＴ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド基質が不安定 で、かつ水溶解性に乏しいことである。処理試薬の調製において、基質を溶解す るのが困難であり、このために温水と混合し、かつ水浴または恒温器中で５０〜 ６０℃で５分間にわたり加熱する必要がある。次いで、試薬は常温で３７℃に冷 却する必要があり、沈澱を妨げるために１時間以内において３７℃で冷却する。

沈澱が生ずる場合には、試薬を５０℃に再加熱し、使用するために再び３７℃に 冷却する必要がある。この結果、仕較的にわずかな測定を行うのに十分な溶液を 、出来るだけ早く調製する必要がある。加熱によるけれとも、調製基質濃度は約 ３〜４ミリモル／βにすることができる。

ＧＧｐＮ基質の乏しい溶解性を避けるために、ロサルキイー（Ｒｏｓａｌｋｉ） およびタル０−　（Ｔａｒｌｏｗ）氏は基質を限界安定性で肛β希釈溶液に溶解 している（　ｒｃｌｉｎ、　Ｃｈｅｍ、　ｊ２０、９．ページ１１２１〜１１２ ４　（１９７４）。ＥＣｐ試薬の使用に要求される不便さを除去するために、基 質の酸性（ａｃｉｄｉｃ）およびスルホン酸（ｓｕｌｆｏｎｉｃ）誘導体を開発 しているこ古が米国特許第３．９８６．９３１および４．０８７．３３１号明細 書に記載されている。これらの基質誘導体は水溶性および価格において改良され ているが、遅い分解速度および多種試薬要件が臨床的使用を制限している。した がって、ＧＧｐＮはＧＧＴＰ検定に対する基質のｊｘ択が残る。

米国特許第３．８７８．０４８号明細書にはＧ　Ｇ　ｐ　Ｎ基質を塩基媒質に溶 解する表面活性剤を使用することが記載されており、一旦、基質を溶解し、ｐ＋ ＋を塩酸溶液の添加により約８．２に調製して酵素反応を促進する。次いで、ρ −ニトローアニリン反応生成物の染料−カッブリンクを酸性条件下で開始させ、 次いでジアゾ化生成物を試料のＧ　ＧＴＰ活性の指示に対して光学的に測定する 。

従来の技術においては’？−−１乾燥試薬を使用している３゜この試薬は平板状 または粉末状のＧＧｐＮ基質、およびトリス−緩衝還元試薬ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆ ｅｒｅｃｌ　ｒｅｃｏｎｓｔｉＬｕｔｉｏｎｒａｇｅｎｔ）のｐ＋＋を約８．２ に調製する遊離グルタミル、ｌ−リス（ヒドロキシメチル）アミツメクンおよび こはく酸に対する通常のクリシルグリシン受容体からなる。しかしながら、かか る単一、乾燥試薬を塩基性ｐＨ溶液への還元（ｒｅｃｏ口５ｔｉｔｕｔｉｏｎ） は安定溶液を形成するために３７℃で温水に溶解する必要がある。この生成試薬 溶液は常温で約８時間にわたって安定であるが、基質の沈澱のために凍らすこと ができない。

発明の概要 本発明はＴ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド基質（ＧＧｐＮ）および水溶性の 常態固体酸（ｎｏｒｍａｌｌｙ　５ｏｌｉｃｌ　ａｃｉｄ）からなる新規な乾燥 混合物を提供する。通常、この乾燥混合物は固体または粉末常態で供給および貯 蔵することができる。固体酸は常温で、かつ加熱しないで水を用いて基質を水溶 液に溶解するのに十分な酸性を有している。生成基質溶液は冷凍下２〜１５℃の 範囲のように低い温度で、１週間のような期間にわたり沈澱に対して安定である 。

本発明における基質溶液は、クールター・エレク）　ＩＪソックインコーポレー ション製のＤＡＣＯ３”ケミカル　アナライザーに作用するのに必要とされるよ うに冷凍する場合または他の使用に適当な非冷凍の場合において、生物学的液体 中のＧ　Ｇ　Ｔ　Ｐ酵素を検定するのに用いることができる。

また、本発明は生物学的液体中のＧＧＴＰ酵素活性を測定するのに用いる新規で 、かつ改良された試薬組成物を提供することである。この組成物はＧＧｐＮ基質 および常温で水により有利に還元して（ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｃｌ）水性基 質溶液を生成できる常態固体酸からなる第１試薬、および緩衝剤及び酵素反応の グルタミル生成物を受け入れる成分からなる第２試薬を含んでいる。生物学的液 体におゆるＧＧＴＰの酵素の含有量に比例する所望酵素反応を促進する両試薬溶 液のｐ＋＋を上げるために、第２試薬を第１試薬の溶液と混合する。

発明の具体的な記載 大ざっばに云えば、本発明においては、γ−クルタミル　トランスペプチダーゼ 検定に対して満足な濃度で、常温においてＴ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド の水中での不溶解性の問題を、ＧＧｐＮ基質を他の通常の試薬成分から分離し、 ＧＧｐＮ基質を加熱することなく溶解するのに十分な酸性度の固体酸と混合する ことによって解決したことである。乾燥混合物は常温で水によく溶解し、生成基 質溶液は常温で沈澱に対して２４時間のような時間にわたって安定であり、かつ 冷凍下２〜１５℃のように低い温度で１週間のような期間にわたって安定である 。

気質溶液の冷凍安定性は研究室での一時的貯蔵を可能とし、かつ冷凍試薬貯蔵を 約１５℃で使用するクールター・エレクトロニクスの［）ＡＣＯＳ”器機の如き ケミカル　アナライザーにおける試薬の使用を可能とする。

生物学的液体中のＧＧＴＰの検定に用いる本発明における第２試薬はグリシルグ リシンまたは当量のグルタミル受容体およびトリス塩基、すなわち、トリス（ヒ ドロキシメチル）アミノメタンの如き緩衝剤を含んでおり、ＧＧＴＰ活性の検定 において酵素反応溶液を約７．６〜８．４、好ましくは７．８〜８．２の適当な ｐ＋＋範囲に維持する酸性基質溶液および緩衝クリシルグリシン溶液を塩水希釈 剤（ｓａｌｉｎｅ　ｄｉｌｕｅｎｔ）と混合して、約４０５−４２０ナノメータ （ｎｍ）の範囲の波長を用いて光学吸光度を測定するこよにより添加生物学的試 料中のＧ、　Ｇ　Ｔ　Ｐ活性を比色的に監視する最適なパラメータを有する溶液 を生成する。

ＧＧｐＮ基質の常温（２０〜２５℃）での水溶液における安定化には、ＧＧＴＰ 活性を測定する酵素転換に使用するのに適当な約３〜１５ミリモル／１．の範囲 のＧＧｐＮ濃度を安定化するために、乾燥試薬に一般に３．０以下のＰＫＡで示 される高い酸性度の固体酸を含有させることが必要となる。

ＧＧｐＮ基質は両性化合物であり、ＧＧＴＰ活性を検定する普通手順に用いる塩 基性溶液で加熱した場合に安定な塩を形成する。本発明において、３．０以下の ｐＫＡを有する固体酸性ＧＧｐＮ基質を水に標準常態の常温で溶解することがで きる。それ故、ｃｃｐＮ基質および固体酸の乾燥混合物は冷凍下、約４℃で２年 間またはこれ以上の極めて長い貯蔵寿命を有する乾燥粉末試薬きして有利に供給 及び研究所において貯蔵することができ、還元気質試薬溶液を常温で加熱するこ となく水により調製することができる。次いで、試薬溶液は冷凍下、好ましくは ２〜１５ｔのように低い温度範囲で沈澱することなく一時的に貯蔵することがで きる。

ＧＧｐＮ基質を含む乾燥混合物に対して適当な固体酸は高い酸性度および水性イ オン化で特徴づけられ、この結果３．０以下の低いＰＫＡ値を有している。ｐＫ Ａは２５℃における標準水性電離定数ＫＡの対数の負の値である：次の表には、 本発明においてＧＧｐＮ基質を安定化するのに適当である代表的な固体酸を示し ており、またこれらの酸の相当する標準ｐＫＡ値を示している。

固体酸　酸性度−１１ＫＡ スルフアミン酸　０，９９ しゅう酸　１．２７ マレイン酸　１．９４ カコジル酸　１．５６ クロルフタル酸　１．６０ マロン酸　２．８６ 乾燥基質混合物使用する適当な固体酸の特徴づけにおいて、酸の化学的同一性は 定めないで酸性度を定め、有機および無機酸をＧＧＴＰの検定に対する酵素反応 に悪影響しないように使用することができる。このために、ｐＫＡＯ１９９のス ルファミノ酸の如き固体無機酸及びｐＬ　］。

６０のクロルフタル酸の如き固体有機酸は常温でＧＧｐＮを水に溶解することが できる。ｐＫＡｌ、５６のカコジル酸の如きモノカルボン酸およびｐＫＡｌ、２ ７．１．９４および２．８６のそれぞれを有するジカルボン酸であるしゅう酸、 マレイン酸きおよびマロン酸の如きポリカルボン酸は固体酸として用いることが できる。カコジル酸およびしゆう酸はその毒性のために好ましくなく、マレイン 酸は吸湿性で、かつ粉末のようにケーキングを形成する傾向がある。スルファミ ノ酸は、ＧＧｐＮを常温で水に比較的に高濃度、例えば１０〜２０ミリモル／ｌ の範囲で溶解するためにＧＧｐＮ基質を含む乾燥混合物に対して好ましい固体酸 である。乾燥混合物におけるスルファミン酸対ＧＧｐＮの適当なモル比は、１０ 〜１５ミリモル／ｌの範囲、好ましくは１３ミリモル／Ａの最適な水性基質濃度 の場合に、２〜８：１の範囲、好ましくは約５〜６：１の範囲にすることができ 、次いで緩衝溶液で最初の酵素反応溶液に好ましくは５〜９ミリモル／βに希釈 することができる。　基質溶液は、ＧＧｐＮを固体酸と脱イオン化水に常温で溶 解して１．２〜２．２の範囲のｐＨを有する水溶液を生成することにより調製す ることができる。乾燥混合物を溶解するのに加熱する必要がなく、基質溶液を使 用でき、また２〜１５℃の温度で沈澱することなく冷凍下で貯蔵することができ る。

好ましい組成物では、ｃｃｐＮおよび固体酸の乾燥混合物には、更に乾燥混合物 から生成する水性基質試薬に付加安定性を与えうる塩化す）　ＩＪウムを含有す る。乾燥混合物において、固体酸およびＧＧｐＮ基質の適当なモル比は生物学的 液体におけるＧＧＴＰ酵素を検定するために２〜２０：１の範囲、好ましくは５ 〜１５：］の範囲にすることができる。

好ましい検定手順において、検定てべきＧＧＴＰ酵素を含む液体試料を標準塩水 （ｎｏｒｍａｌ　５ａｌｉｎｅ）で希釈し、この希釈物をグルタミル受容体成分 を含有する緩衝溶液に添加する。しかる後、生成溶液を酸性基質溶液と混合して ＧＧＴＰ酵素の最適活性に対して好ましくは７．６〜８．４の範囲の反応溶液の 最終ｐＨにする。緩衝試薬における好ましい緩衝剤は１−リス（ヒドロキシメチ ル）アミノメタンである。他の適当な緩衝剤、例えばトリス（ヒドロキシメチル ）アミノメタン塩酸塩、アンメジオール（Ａｍｍｅｄｉｏｌ）塩酸塩（２−アミ 八２−メチルプ［１）でン−１，３−ジオール塩酸塩）およびりん酸塩緩衝剤を 用いることができる。

緩衝試薬に含有する好ましいグルタミル受容体はグリシルグリシンである。他の 適当なグルタミル受容体としてはアスパラギン、メチオニン、Ｌ−フェニルアラ ニンおよびヒドロキシルアミンを包含する。

表２は水性基質溶液についての好ましい組成の成分および溶液！当たりの割合を 示している。また表３は水性緩衝溶液についての好ましい組成の成分および溶液 β当たりの割合を示している。

ＮａＣ１２２１３ミリモル ０ 成分　割合 クリシルグリシン　６００ミリモル 約７．８の好ましいｐ＋＋における緩衝反応溶液をＧＧＴＰ酵素の最適活性に対 して３７℃の好ましい温度で保温する。

反応の進行は、ＤＡＣＯ３”自動アナライザーにおいて用いる如き分光光度計で ４２０ｎｍの好ましい波長で吸光度を測定することにより監視する。４２０ｎｍ での吸光度変化は酵素反応中に遊離するｐ−ニトロアニリンの量に相当し、ＧＧ ＴＰ酵素の活性を示す。ｐ−ニトロアニリンの濃度はの吸光度から得られる標準 曲線と比較して定めることができる。３７℃における吸光度からＧＧＴＰ濃度へ の直接転換は次式により定めることができる。

ｕ／Ｌ＝ＯＤ／分Ｘ　５１２５ 」二記式中、 １」／１、は」二連する検定条件で１ミクロンモル／分の割合でＧＧｐＮのｐ− ニトロアニリンへの転化を促進する酵素活性の量きして規定する国際単位で示す ＧＧＴＰの指示活性を示す。

ＯＤは光学密度における変化を示ず。および５１２５は４２０ｎｍにおける吸光 係数、反応溶液の容量および１．ｃｍの光路を含むファクターである。上記手順 の動的範囲はＧＧＴＰの１，３００ｕ／βまでの指示直線性を生ずる。

次に、本発明における試薬および手順についての例を説明するが、しかしこれに より特許請求の範囲を制限するものではない。常温は２４℃にした。

２５０ｍβの蒸留水に１８．７３ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン および２７．２５ｇのクリシルクリシンを常温で攪拌しながら添加し、３分間以 内で完全に溶解してｐｌ＋８．２０の溶液を得た。

基質試薬 ６２５ｍβの蒸留水に４．５５１ｇのスルファミン酸および２．１．７３ｇのγ −グルタミルーｐ−ニトロアニリドを常温で攪拌しながら添加した。生成溶液は 澄んでいた。

酵素反応 ０．８ｍＡの緩衝溶液に０．４ｍｌの塩水（水に０．９％Ｉ／ｊ／Ｖ塩化ナトリ ウム含有）および０．０８ｍβの血清試料を添加した。次いで、この試料混合物 に２．０ｍβの基質溶液を添加し、ｐＨ７，８で生成反応溶液を３７℃で保温し た。反応の進行を４２０ｎｍの波長で監視した。

例２ ＤＡＣＯ３”アナライザーにおける血清検定を次のようにして行った。

４０ｕ　、ｉｌ！の塩水に例１からの緩衝溶液８０υ１．および血〆ｈ試料８　 ｕＡを添加した。この混合物に例１からの基質溶液２００ｕｌを添加した。緩衝 溶液および基質溶液を１５℃で冷凍し、この混合反応溶液を３７℃で保温した。

反応を４２０ｎｍで監視し、酵素濃度をＧＧＴＰ活性に対する次に示す関係式を 用いて計算した： ｕ／Ｌ＝ＯＤ／分Ｘ５１２５ ８０ｍｌの蒸留水に１０．８０ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタノー ルおよび８．７２ｇのグリシルグリシンを常温で攪拌しながら添加し、３分間以 内で完全に溶解してｐＨ８，１の溶液を得た。

基質試薬 ２００ｍｊ２（７１）蒸留水ニ３００ｇノしゅう酸および０．０７０ｇ＜７）　 ｒ　−グルタミル−ｐ−トロアニリドを常温で攪拌しながら添加した。生成溶液 は加熱することなく５分間以内で澄み、１．３８のｐ＋＋を有していた。

酵素反応 ０．８ｍβの緩衝溶液に０，４ｍβの塩水（水に０，９％Ｉ／Ｉ／Ｖ塩化す）　 ＩＪウム含有）および０．０８ｍβの血清試料を添加した。次いで、この試料混 合物に２．０ｍＡの基質溶液を添加し、ｒ、ｌ＋７．８で生成反応溶液を３７℃ で保温した。反応の進行を４２０ｎｍの波長で監視した。

８０ｍ７１！の蒸留水に］４．１２ｇのトリス（ヒドロキシメチル）１８１％昭 ＧＯ−５０１４８９（５） アミノメタンおよび８．７２ｇのグリシルグリシンを常温で攪拌しながら添加し 、３分間以内で完全に溶解してＰＨ８，１の溶液を得た。

基質試薬 ２００ｍｊ７の蒸留水に４３．０ｇのマレイン酸および０．０７０ｇのγ−グル タミルーｐ−ニトロアニリドを常温で攪拌しながら添加した。生成溶液は加熱す ることなく５分間以内で澄み、１．４７のｐＨを有していた。

酵素反応 ０．８ｍＡの緩衝溶液に０，４ｎ＋ｊ！の塩水（水にＯ−９％Ｗ／Ｖ塩化ナトリ ウム含°有）および０．０８ｎ＋１の血清試料を添加した。次いで、この試料混 合物に２．０ＬＩＩｌの基質溶液を添加し、ｐＨ７，７で生成反応溶液を３７℃ で保温した。反応の進行を４２０ｎｍの波長で監視した。

８　ｍｌの蒸留水に２．８６ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよ び０．８７２ｇのクリシルグリシンを常温で攪拌しながら添加し、３分間以内で 完全に溶解してｐｔ１８゜７の溶液を得た。

基質試薬 ２０ｍＡの蒸留水に８００ｍｇのマロン酸および７０．０ｍｇのＴ−グルタミル −ｐ−ニトロアニリドを常温で攪拌しながら添加した。生成溶液は加熱すること なく５分間以内で澄み、１．５５のｐＨを有していた。

４ 化ナトリウム含有）および０．０８ｍ、＆の血清試料を添加した。次いで、この 試料混合物に２．０ｍ　１２の基質溶液を添加し、ｐＨ７，５３で生成反応溶液 を３７℃で保温した。反応の進行を４２０ｎｍの波長で監視した。

固体酸を安定剤として用いて調製した場合、基質試薬は次の利点を有する： ］、　基質濃度を３７℃で使用に最適にするこＬができる。

２、　基質を、加熱の如き使用者によって任意の不便な操作を用いることなく、 極めて速やかに溶解することができる。

３、　試薬がＨＣｐｉたは有機液体の如き特定溶剤を必要と４、　試薬を沈澱さ せることなく冷凍するこＬができる。

図面の簡単な説明 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　生物学的液体中のγ−グルタミル　トランスペプチダーゼ酵素活性を測定 する診断用組成物において、Ａ、　γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド：およ びＢ、　水性基質試薬を調製するために前記組成物を水に常温で溶解するのに充 分な酸性度を有する水溶性の状態固体酸 からなることを特徴とするγ−グルタミル　トランスペプチダーゼ酵素活性を測 定する診断用組成物。 ２、　前記酸は、前記組成物を水を用いて２０〜２５℃の範囲の常温で２〜１５ ミリモル／ｌの範囲のγ−グルタミルーｐ−ニトロアニリド濃度で水溶液に溶解 することができる請求の範囲第１項記載の組成物。 ３、　前記酸は、前記溶液を２〜１５℃の範囲の冷凍温度で沈澱させることなく 維持できる請求の範囲第２項記載の組成物。 ４、　前記酸は３．０以下のｐＬを有する請求の範囲第１項記載の組成物。 ５、　前記酸はスルファミノ酸、しゅう酸、マレイン酸およびマロン酸からなる 群から選択する少なくとも１成分を含む請求の範囲第１項記載の組成物。 ６、　前記酸はスルファミノ酸を含む請求の範囲第１項記載の組成物。 ７、　生物学的液体中のγ−グルタミル　トランスペプチダーゼ酵素活性を測定 する２−試薬検定システムにおいて、γ−グルタミルーｐ−ニトロアニリドおよ び常温で水に溶解して安定な水性基質溶液を得る３、０以下のｐＫＡを有する水 溶性の状態固体酸からなる第１試薬およびグルタミル受容体および緩衝剤からな る第２試薬を含み、前記液体中のγ−グルタミル　トラン°スペプチダーゼの含 有量に比例する酵素反応を促進する前記両試薬混合物のｐ＋＋を上げるため前記 第２試薬を前記第１試薬の溶液に混合することを特徴とするＴ−グルタミル　ト ランスペプチダーゼ酵素活性を測定する２−試薬検定システム。 ８、　前記第１試薬は次に示す相対割合の成分：スルフアミノ酸　２〜８ミリモ ル を含む組成からなる請求の範囲第７項記載の検定システム。 １７ ９、　前記第１試薬は溶液ｌ当りで示す次の割合の成分：成分　割合 スルファミノ酸７５　ミリモル りで示す次の割合の成分： 成分　割合 １０、生物学的液体中のγ−クルタミル　トランスペプチダーゼ酵素活性を測定 する方法において、Ａ、７−−−クルタミルーｐ−ニトロアニリドおよび水溶性 の状態固体酸を水に常温で溶解して１．２〜２．２の範囲のｐｎを有する水溶液 を生成し： Ｂ、前記溶液のｐ＋＋を上げて塩基状態にし：およびＣ４酵素活性を監視するた めに、前記塩基溶液を前記γ−グルタミル　トランスペプチダー卆酵素を含有す る前記生物学的液体と反応させる ことを特徴とするγ−グルタミル　１−ランスペプチダーゼ酵素活性を測定する 方法。