CN101043896A - 衍生自栗子的糖酶抑制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了植物来源的糖酶抑制剂，其中所述抑制剂有效预防或缓解糖尿病，或预防肥胖，本发明还提供了含有该糖酶抑制剂的食品，饮料和药物。本发明通过采用α－淀粉酶抑制剂或α－葡糖苷酶抑制剂作为糖酶抑制剂得以实现，所述抑制剂用乙醇或含水乙醇溶液提取自栗子的涩皮。本发明还可通过将糖酶抑制剂添加至食物组合物或药物组合物作为活性成分，用于延迟糖类消化或吸收，抑制饭后血糖水平或血胰岛素水平升高，或预防肥胖得以实现。

Description

衍生自栗子的糖酶抑制剂及其应用
技术领域
本发明涉及衍生自栗子的糖酶抑制剂，尤其是α-淀粉酶或α-葡糖苷酶抑制剂。此外，本发明还涉及糖酶抑制剂的各种应用，具体而言涉及利用抑制剂的生理作用的药物组合物和食物组合物。
背景技术
现代生活方式的变化导致糖尿病流行的增加。在日本，包括潜在的糖尿病患者在内的糖尿病患者的人数估计超过15,000,000。大多数糖尿病患者患有II型糖尿病。II型糖尿病与肥胖密切相关，并且由于胰岛素抗性导致慢性高血糖症等。此外，II型糖尿病引起并发症，诸如视网膜病，肾炎，和神经紊乱。饮食和锻炼疗法是预防和治疗II型糖尿病的关键因素。在饮食方面，日常生活中控制血糖水平尤其重要。血糖水平受到食物中所含糖类(淀粉，糖原，食糖等)的影响极大。这些糖类经过消化性酶(糖酶)α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的作用而分解。α-淀粉酶为水解淀粉和糖原的α-1，4-糖苷键的内型酶。这些酶包含于动物的唾液和胰液中，并在消化道中将淀粉等转化成麦芽糖等。
诸如麦芽糖和蔗糖的二糖，经过存在于小肠粘膜的细胞膜中的α-葡糖苷酶的水解，转化为葡萄糖并被吸收。分解麦芽糖的麦芽糖酶和分解蔗糖的蔗糖酶是典型的α-葡糖苷酶。从小肠吸收的葡萄糖被携带至血液，并升高血糖水平。因此，为了抑制多余的能量供给或控制血糖水平，换言之，为了预防或治疗肥胖和糖尿病，控制诸如α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的这些酶的活性是非常重要的。
针对抑制糖酶作用的物质进行了很多研究，并已发现许多糖酶抑制剂。例子包括来自小麦、基于蛋白的物质[O’Donnell MD和McGeeneyKF.：Purification and properties of an alpha-amylase inhibitor from wheat.Biochim.Biophis.Acta，422，159-169(1976)]；提取自大豆的多糖(日本未审专利公布No.1991-290187)；提取自芋头(Colocasia esculenta)、基于蛋白的物质NSA1-I和NSA1-II(日本未审专利公布No.1991-294300)；来自月桂(Laurus nobillis L)的粗提取物(日本未审专利公布No.1992-27389)；来自番石榴叶的提取物(日本未审专利公布No.1995-59539)；利用热水获得的大叶紫薇(Laqerstroemia speciosa)提取物[Hosoyama H，Sugimoto A，Suzuki Y等：Isolation and QuantitativeAnalysis of the alpha-amylase Inhibitor in Lagerstroemia speciosa(L.)Pers.(Banaba)J.Pharm.Soc.Jpn.，123，599-605(2003)]；来自麻黄(Ephedra Herb)地上根的提取物(日本未审专利公布No.1997-2963)；来自黑米的提取物(日本未审专利公布No.2004-91462)等。而且，产自放线菌的寡糖作为衍生自微生物的糖酶抑制剂是公知的。
另外，对α-葡糖苷酶或α-淀粉酶具有抑制活性的众所周知的可商购药(抗糖尿病药)的例子包括阿卡波糖(acarbose)(Glucobay；由Bayer Yakuhin，Ltd.生产)[Jenkins DJ，Taylor RH，Nineham R.等：”Combined use of guar and acarbose in reduction of postprandialglycaemia”，Lancet 2(8149)924-927(1979)]和伏格列波糖(voglibose)(Basen；由Takeda Pharmaceutical Company Limited生产)[Yoshio Goto，Shigeaki Baba，Masakazu Nakagawa等：”Effectiveness of AO-128，anα-glucosidase inhibitor，for treating non-insulin dependent diabetesmellitus.”IGAKU NO AYUMI 160943-971(1992)]。此外，糖酶抑制剂的抗肥胖作用还公开在下列文献中：Svensson等，[Svensson B，FukuokaK，Nielsen PK等：“Proteinaceous amylase inhibitors”，Biochim.Biophys.Acta，1696，145-156(2003)]以及Udani等的[Udani J，Hardy M和MadsenDC：“Blocking carbohydrate absorption and weight loss：A clinical trialusing phase 2 brand proprietary fractionated white bean extract”，Alternative Medicine Review 9，63-69(2003)]。
如上所述，已提出了许多α-淀粉酶抑制剂和α-葡糖苷酶抑制剂。然而，为了将这些物质作为预防或治疗糖尿病或肥胖的有效药剂用于实际应用，除加强针对α-淀粉酶或α-葡糖苷酶的抑制活性之外，从许多观点来看，诸如体内安全性和存在的副作用，原材料稳定供给的可用性等研究也是必要的。鉴于此，已知的抑制剂不一定是令人满意的。
发明内容
本发明的目的是提供获自栗子的糖酶抑制剂，并且具体提供对α-淀粉酶或α-葡糖苷酶显示抑制活性的糖酶抑制剂。本发明的另一目的是提供对人体安全且从可被稳定供给的材料制备的糖酶抑制剂。
本发明的糖酶抑制剂可延迟消化道对糖的消化和吸收。因此可以降低饭后血糖水平的上升。此外，由于糖酶抑制剂可延迟消化道对糖的消化和吸收，所以预计具有抗肥胖作用。因此，本发明提供了利用这些糖酶抑制剂的生理作用的药物组合物和食物组合物。
为了找到新型糖酶抑制剂，本发明人利用日常生活中通常丢弃的材料进行筛选，这些材料诸如柑橘果榨汁后的残渣，aojiru榨汁后的残渣(绿叶蔬菜的汁)，各种果皮，盐卤，甲壳纲动物的几丁质和壳聚糖，种皮或鱼内脏。结果发现，来自栗子涩皮(chestnut astringent skin)的溶剂提取物具有强烈的α-淀粉酶抑制活性或α-葡糖苷酶抑制活性。此外，本发明人还发现，这些溶剂提取物可降低饭后(或食用糖类之后)正常和糖尿病大鼠和人的血糖水平升高。基于上述发现实现了本发明。换言之，本发明包括下列特征：
第1项.糖酶抑制剂，包含栗子涩皮提取物。
第2项.第1项的糖酶抑制剂，其是通过利用乙醇或含水乙醇溶液对栗子涩皮进行提取而获得的。
第3项.第2项的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有5-95vol％的乙醇。
第4项.第2项的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有10-90vol％的乙醇。
第5项.第2项的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有15-90vol％的乙醇。
第6项.第2项的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有20-90vol％的乙醇。
第7项.第2项的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有25-90vol％的乙醇。
第8项.第2项的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有50-90vol％的乙醇。
第9项.第2项的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有50-80vol％的乙醇。
第10项.第2项的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有50-75vol％的乙醇。
第11项.第1-10任一项的糖酶抑制剂，其中受抑制的糖酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶或两者。
第12项.延迟糖类消化和吸收的组合物，包含第1-11任一项的糖酶抑制剂作为活性成分。
第13项.降低饭后血糖水平升高的组合物，包含第1-11任一项的糖酶抑制剂作为活性成分。
第14项.缓解高血糖症的组合物，包含第1-11任一项的糖酶抑制剂作为活性成分。
第15项.抗肥胖组合物，包含第1-11任一项的糖酶抑制剂作为活性成分。
第16项.食物组合物，包含第1-11任一项的糖酶抑制剂。
第17项.第16项的食物组合物，其是高碳水化合物含量的饮料或食物，诸如面条，面包或糖食。
第18项.食物组合物，包含有效量的第1-11任一项的糖酶抑制剂作为活性成分用于延迟糖消化和吸收。
第19项.第18项的食物组合物，其具有延迟糖类消化和吸收的性质，并在其包装上标注该食物组合物适用于延迟糖类消化和吸收。
第20项.食物组合物，包含有效量的第1-11任一项的糖酶抑制剂作为活性成分用于降低饭后血糖或血胰岛素水平升高，或用于缓解高血糖症。
第21项.第20项的食物组合物，其具有抑制饭后血糖水平升高或缓解高血糖症的性质，并在其包装上标注该食物组合物适用于抑制饭后血糖水平升高，或适用于缓解高血糖症。
第22项.食物组合物，包含有效量的第1-11任一项的糖酶抑制剂作为活性成分用于预防肥胖。
第23项.第21项的食物组合物，其具有抗肥胖作用，并在其包装上标注该食物组合物适用于预防肥胖。
第24项.药物组合物，包含第1-11任一项的糖酶抑制剂作为活性成分。
第25项.第24项的药物组合物，其是用于预防或治疗糖尿病的药物。
第26项.第24项的药物组合物，其是抗肥胖药物。
第27项.抑制对象饭后血糖水平升高或缓解对象高血糖症的方法，包含给对象注射或施用第1-11任一项的糖酶抑制剂。
第28项.预防或减轻肥胖的方法，包含给对象注射或施用第1-11任一项的糖酶抑制剂。
第29项.第1-11任一项的糖酶抑制剂在制备用于延迟糖类消化和吸收的组合物中的应用。
第30项.第1-11任一项的糖酶抑制剂在制备用于抑制饭后血糖水平升高的组合物中的应用。
第31项.第1-11任一项的糖酶抑制剂在制备用于缓解高血糖症的组合物中的应用。
第32项.第1-11任一项的糖酶抑制剂在制备用于抗肥胖组合物中的应用。
附图简述
图1显示栗子涩皮的100vol.％乙醇提取物(-△-)，75vol.％含水乙醇提取物(-■-)，50vol.％含水乙醇提取物(-□-)，25vol.％含水乙醇提取物(-●-)，以及水提取物(-○-)对α-淀粉酶活性(％)的影响(试验1)。
图2显示栗子涩皮的100vol.％乙醇提取物(-△-)，75vol.％含水乙醇提取物(-■-)，50vol.％含水乙醇提取物(-□-)，25vol.％含水乙醇提取物(-●-)，以及水提取物(-○-)对α-葡糖苷酶(麦芽糖酶)活性(％)的影响(试验2(2))。
图3显示栗子涩皮的100vol.％乙醇提取物(-△-)，75vol.％含水乙醇提取物(-■-)，50vol.％含水乙醇提取物(-□-)，25vol.％含水乙醇提取物(-●-)，以及水提取物(-○-)对α-葡糖苷酶(蔗糖酶)活性(％)的影响(试验2(3))。
图4显示在给正常大鼠施用栗子涩皮的75vol.％含水乙醇提取物(300mg/kg体重)和淀粉(2g/kg体重)之后，血糖水平(mg/dl)的变化(-●-)(试验3)。作为对照，还显示了仅施用淀粉(2g/kg体重)的正常大鼠的血糖水平的变化(-○-)。
图5显示在给正常大鼠施用栗子涩皮的75vol.％含水乙醇提取物(300mg/kg体重)和淀粉(2g/kg体重)之后，血胰岛素水平(ng/dl)的变化(-●-)(试验3)。作为对照，还显示仅施用淀粉(2g/kg体重)的正常大鼠的血胰岛素水平的变化(-○-)。
本发明的最佳实施方式
(1)糖酶抑制剂
本发明的糖酶抑制剂可以通过利用乙醇或含水乙醇溶液从Castanea属的栗子(Castanea crenata)的涩皮中提取而获得。
栗子的涩皮包括丹宁，没食子酸，类黄酮等，并且由于消炎作用，据信在治疗痱子和皮肤烧伤中有效。还据信通过改善血液循环和预防胆固醇沉积于血管而在预防生活方式相关疾病，诸如动脉硬化中有效。然而，没有报道表明其抑制诸如α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的糖酶的作用，也没有报道表明通过该抑制作用方式，抑制血糖水平的升高。
待提取的栗子涩皮的形式不受限制，可以是天然的，干燥的或以水浸泡的，并且栗子涩皮可被压碎或磨碎成所需的形状，诸如碎片或粉。
用于提取的溶剂为水，也可采用有机溶剂或其混合物。优选的有机溶剂为乙醇。
当水和乙醇的混合物(含水乙醇溶液)用作提取剂时，乙醇的含量不受限制，通常例如是5-95vol.％，优选10-90vol.％，更优选15-90vol.％，再优选20-90vol.％，甚至更优选25-90vol.％，进一步优选50-90vol.％，尤其优选50-80wt％，并且尤其更优选50-75vol.％。
在提取方法中可采取通用方法。对提取方法没有限制，其例子包括对(天然的，干燥的，压碎或磨碎的)栗子涩皮进行冷提取，热提取，或加热同时浸于溶剂的方法；渗滤方法等。提取温度不受特别限制，可合适地选自4-100℃，优选25-60℃的温度范围。让溶剂静置的同时，或搅拌或振荡的同时，可对栗子涩皮进行浸渍。提取时间不受特别限制，合适地选自1小时-2周。提取剂的体积也不受限制。优选的是，基于干重，采用10-30倍(重量比)的提取栗子涩皮量的溶剂反复提取2-3次。
还可利用超临界或亚临界态的溶剂进行提取(超临界提取法或亚临界提取法)。在超临界和亚临界提取法中，采用超临界或亚临界态(以溶剂的温度和压力皆超过临界值的状态，换言之，溶剂处于液态和气态之间的中间状态)的溶剂进行提取。提取剂的例子为二氧化碳，乙烯，乙烷，丙烷，水等；然而，从安全性和无毒性等的角度来看，优选二氧化碳。
提取压力和温度不受限制，只要提取剂变成超临界或亚临界，并且取决于所用提取剂加以合适选择。具体而言，提取压力选自3-70Mpa，并且例如，当二氧化碳用作提取剂时，优选的提取压力为5-40Mpa。提取温度通常选自25-200℃，优选25-100℃。然而，没有约束，可利用夹带剂以提高提取剂的溶解度。夹带剂的例子包括水，甲醇，乙醇等C1-C4低级醇；丙酮，乙腈等。当使用夹带剂时，夹带剂在提取剂中的含量通常优选为0.00001-50.0wt％，更优选0.0001-10wt％。提取时间不受限制，并合适地选自2小时到2周。
如果需要，固形物通过过滤，离心和/或其他固液分离法从得到的提取物中移出。依赖于使用方式，提取物可原样使用，或通过蒸发溶剂而部分浓缩或干燥，并且提取物可用作栗子香精或干燥的栗子香精。所得栗子涩皮提取物，优选利用乙醇或含水乙醇溶液对栗子涩皮进行提取而得到的提取物，对诸如下文实施例所述的α-淀粉酶和α-葡糖苷酶等糖酶具有抑制活性。因此，栗子涩皮提取物作为抑制α-淀粉酶和α-葡糖苷酶等糖酶的活性成分用于食物，药物，饲料，试剂等。
上述栗子香精或干燥的栗子香精可通过用栗子香精不溶于其中的溶剂洗涤而得以纯化。还可通过将栗子香精或干燥栗子香精溶解或悬浮于其他合适溶剂中而使用栗子香精或干燥栗子香精。
上述栗子香精或干燥的栗子香精可采用公知的纯化方法可被高度纯化，所得纯化的物质可用作糖酶抑制剂。对纯化方法没有约束，其例子有逆流分布法，色谱等，其中测量糖酶抑制活性(例如，α-淀粉酶抑制活性和α-葡糖苷酶抑制活性)，并选择具有至少一种上述活性的级分。测量α-淀粉酶抑制活性和α-葡糖苷酶抑制活性的若干方法是公知的，此种方法皆可使用。具体而言，通过下文实施例所述的方法进行纯化。以任一纯化方法所得的纯化提取物可通过减压干燥，冷冻干燥等标准干燥方法干燥，并可用作糖酶抑制剂。
(2)糖酶抑制剂的应用
本发明的上述糖酶抑制剂由于其α-淀粉酶抑制活性或α-葡糖苷酶抑制活性，可用作如α-淀粉酶抑制剂或α-葡糖苷酶抑制剂一样的试剂(化学产品)。
本发明的糖酶抑制剂由于其α-淀粉酶抑制活性或α-葡糖苷酶抑制活性，具有延迟体内(小肠)糖类消化和吸收，以及抑制饭后血糖水平升高的性质。因此，本发明糖酶抑制剂可作为用于延迟糖类消化和吸收(消化和吸收延缓剂)，抑制饭后血糖水平升高(血糖水平升高抑制剂)，或缓解高血糖症(高血糖症改善剂)的组合物的活性成分。
(3)延迟糖类消化和吸收的组合物，抑制饭后血糖水平升高的组合物，缓解高血糖症的组合物，以及抗糖尿病组合物。
如上所述，本发明提供了延迟糖类消化和吸收的组合物，抑制饭后血糖水平升高的组合物，和缓解高血糖症的组合物。
延迟糖类消化和吸收的组合物可含有上述糖酶抑制剂，其量可有效延迟糖类在消化道中的消化和吸收。抑制饭后血糖水平升高的组合物，或缓解高血糖症的组合物可含有上述糖酶抑制剂，含量可有效抑制饭后血糖水平升高。通常，延迟糖类消化和吸收的组合物，抑制饭后血糖水平升高的组合物，或缓解高血糖症的组合物，每100重量份的总组合物中应含有0.1-100重量份的本发明糖酶抑制剂。除上述糖酶抑制剂之外，延迟糖类消化和吸收的组合物，抑制饭后血糖水平升高的组合物，或缓解高血糖症的组合物，可包含可药用载体和添加剂和/或食物中允许添加的载体和添加剂。
本发明的糖酶抑制剂可用作抗肥胖组合物的活性成分(抗肥胖剂)，预防食欲过盛引起的肥胖，这是因为糖酶抑制剂具有抑制诸如食物中所含的淀粉和糖等糖类消化的性质，并阻止它们以能量形式吸收。因此，本发明提供了包含糖酶抑制剂作为活性成分的抗肥胖组合物。组合物中糖酶抑制剂的含量可有效减轻或抑制肥胖。通常，抗肥胖组合物每100重量份的总组合物中含有0.1-100重量份的本发明糖酶抑制剂。除上述糖酶抑制剂之外，抗肥胖组合物还可包含可药用载体和/或添加剂，或食物中允许添加的载体和添加剂。
(4)食物组合物和药物组合物
作为更具体和更实际方式的例子，本发明的糖酶抑制剂可用作食物或药物组合物的活性成分，并被制成食物或药物。由于其α-淀粉酶抑制活性或α-葡糖苷酶抑制活性，本发明的这种食物或药物组合物具有延迟体内(小肠)糖类消化和吸收，抑制饭后血糖水平升高，缓解高血糖症，和/或预防肥胖的性质。
因此，本发明提供了通过含有糖酶抑制剂而具有上述效果的食物或药物组合物。这种食物或药物组合物并不限于仅对人的组合物，还包括对各种动物，尤其是其他哺乳动物的组合物。因此，食物组合物包括诸如猫，狗等宠物用的食物组合物，以及药物组合物包括除人之外动物用的药物组合物。
(4-1)食物组合物
由于本发明的食物组合物具有如上所述的延迟糖类消化和吸收，抑制饭后血糖水平升高，和/或缓解高血糖症的性质，本发明的食物组合物具有预防糖尿病和/或其发展，或预防由饭后高血糖症引起的疾病的作用。因此，本发明食物组合物可用作患有相对高血糖水平的对象(包括人对象)，或考虑其血糖水平的对象(包括人对象)的保健食品或功能性食品。这种食物组合物不受限制，只要其包含有效延迟糖类在消化道中的消化和吸收，抑制饭后血糖水平的升高，或缓解高血糖症量的糖酶抑制剂。如果需要，该组合物可含有食品中允许添加的载体和/或其他添加剂。
由于本发明的食物组合物具有延迟体内(小肠)糖类消化和吸收的作用，因此有可能以所谓的抗肥胖食品的形式提供本发明的食物组合物，即，对象不易通过食用食物而增重。该食物组合物不受限制，只要其包含有效延迟糖类在消化道中的消化和吸收量的糖酶抑制剂，并且如果需要，该组合物可含有食品中允许添加的载体和/或其他添加剂。
这种食物组合物的形式不受限制，并且如果需要，糖酶抑制剂可与食品中允许添加的载体和/或其他添加剂一起制成片剂，丸剂，胶囊，颗粒，散剂(pulvis)，粉末，锭剂，溶液(饮料)等形式的补剂(功能性食品)。
本发明的食物组合物包括通过包含糖酶抑制剂由于其α-淀粉酶抑制活性或α-葡糖苷酶抑制活性，而具有各种作用的食品(例如，指定保健用途的食品，膳食补剂，功能性食品等)。本发明涵盖的指定保健用途的食品包括通过含有糖酶抑制剂而具有延迟糖类消化和吸收，抑制饭后血糖水平升高，和/或缓解高血糖症的性质的食品，因此这种食品在其包装上带有声明可用于延迟糖类消化和吸收，抑制饭后血糖水平升高(高血糖症)，和/或缓解高血糖症的标注。对标签上的标注没有特别限定，例如，包括“适用于那些担心血糖水平的对象”，“适用于那些血糖水平相对高的对象”或“减轻糖类吸收”。
本发明涵盖的指定保健用途的食品包括含有糖酶抑制剂并具有延迟糖类消化和吸收效果的食品，因此这种食品在其包装上带有声明可用于减轻或预防肥胖(即，体重减轻)的标注。包装上的表述没有特别限定，其例子包括“适用于那些担心其体重的对象”，“适用于那些过重的对象”等。
这种食品的例子包括基于牛奶的饮料，乳杆菌饮料，含果汁饮料，软饮料，充了碳酸气的饮料，果汁，蔬菜汁，含蔬菜和果汁饮料，酒精饮料，粉状饮料，咖啡，红茶，绿茶，大麦茶等饮料；牛乳布丁，牛奶布丁，soufflé布丁，含果汁布丁等布丁；果子冻，巴乐斯(bavarois)，酸奶等甜点；冰淇淋，牛奶冻，lact-ice，牛奶冰淇淋，含果汁冰淇淋，软冰淇淋，棒冰，冰糕，冰甜食等甜冷食；口香糖，泡泡糖等(条状口香糖，糖衣颗粒口香糖等)；巧克力，诸如斑纹巧克力等包衣巧克力，以及草莓巧克力，蓝莓巧克力，甜瓜巧克力等加香巧克力；硬糖(包括夹心糖，黄油球(butterballs)，糖球(marbles)等)，软糖(包括饴糖，牛轧糖，胶质糖，圆形软糖等)，糖球(drops)，太妃糖等卡拉梅尔糖(caramel)；蛋糕，硬饼干，曲奇饼，okaki(米饼)，senbei(米饼)等烘烤甜食(这些称为甜食)；面包，肉煮的清汤，浓汤等汤；味噌，酱油，调味品，调味蕃茄酱，沙司，香松(furikake)(在米上喷洒用调味粉)等佐料；草莓酱，蓝莓酱，柑橘酱，苹果酱，杏酱，蜜饯等酱；红葡萄酒等果基酒；樱桃，杏，苹果，草莓，桃的蜜饯等加工水果；火腿，香肠，烤肉等加工肉；鱼火腿，鱼香肠，碎鱼块(糊化鱼肉)，kamaboko(鱼泥块)，chikuwa(鱼饼蒸泥)，hanpen(捣碎鱼饼)，satsumaage(油炸鱼酱)，datemaki(带有鱼酱的甜煎蛋卷)，鲸鱼熏肉等“鱼”饼；udon(稠蛋白小麦面条)，hiyamugi(稀udon)，somen(细白小麦面条)，荞麦面条，中国面条，意大利面条，通心面，bifun(米面条)，harusame(细马铃薯淀粉面条)，馄饨等面条；以及各种加工食品。优选的例子有饮料，高碳水化合物含量的食品，诸如面条，面包和糖食。
糖酶抑制剂在上述食物组合物中的含量和糖酶抑制剂摄取的量不受限制，并可合适地选自大的范围，这取决于食物组合物的种类，靶功能和效果及其他条件。摄取量随着食物组合物的类型而变化；然而，体重为60kg的个人每次摄取糖酶抑制剂的量(例如，以干重计，基于栗子涩皮的干重)可合适地选自约10-200,000mg/(60kg体重)。
(4-2)药物组合物
本发明的药物组合物包含糖酶抑制剂作为活性成分，由于其通过延迟体内(小肠)糖类消化和吸收而抑制饭后血糖水平升高(高血糖症)，可有效用作抗糖尿病药。
抗糖尿病药广义上涵盖那些预防或改善糖尿病的药物。具体而言，本发明的抗糖尿病药，由于其抑制饭后血糖水平升高的效果，包括那些可预防潜在患有糖尿病发作的对象(包括人和其他动物)糖尿病发作的药。此外，本发明的糖尿病药涵盖那些具有缓解对象(包括人和其他动物)高血糖症病况作用的药。本发明的抗糖尿病药还涵盖那些通过抑制或缓解血糖水平(降低高血糖症病况的血糖水平)而具有预防或缓解高血糖症相关疾病，诸如糖尿病并发症作用的药。注意的是，本发明靶向的糖尿病优选为胰岛素依赖性II型糖尿病。
糖尿病并发症为直接或间接由糖尿病引起的全身性或局部疾病。该病具体的例子有糖尿病性酸中毒，糖尿病性黄瘤，糖尿病性肌萎缩，糖尿病性酮症，糖尿病性昏迷，糖尿病性胃紊乱，糖尿病性坏疽，糖尿病性溃疡，糖尿病性腹泻，糖尿病性微血管病，糖尿病性子宫硬化症，糖尿病性心肌症，糖尿病性神经病，糖尿病性肾病，糖尿病性水泡，糖尿病性白内障，糖尿病性皮炎，糖尿病性硬化病，糖尿病性视网膜病，糖尿病性坏死脂代谢障碍(diabetic necrobiosis lipoidica)，糖尿病性血液流动障碍等。
上述糖酶抑制剂本身可用作抗糖尿病药(药物组合物)。然而，优选的是，糖酶抑制剂可用作包含糖酶抑制剂，连同可药用载体和/或添加剂的抗糖尿病药(药物组合物)，其中糖酶抑制剂的量可有效用于抑制血糖水平升高。
本发明的药物组合物包含糖酶抑制剂作为活性成分，由于其延迟体内(小肠)糖类消化和吸收而可有效用作抗肥胖药。上述糖酶抑制剂本身就可用作抗肥胖药(药物组合物)；然而，优选的是，糖酶抑制剂与可药用载体和/或添加剂一起用作抗肥胖药(药物组合物)，该药含有有效预防肥胖量的糖酶抑制剂。
药物组合物的给药形式(药物剂型)取决于给药途径可合适地加以选择。药物组合物一般可分成下列组别：口服给药的药，经鼻给药的药物，阴道给药的药物，栓剂，舌下片剂，非口服给药的药(注射剂或滴剂)等。在本发明中，优选的是，组合物口服给药。遵循下列标准方法，本发明组合物可成形或制备成固体药物制剂，诸如片剂，丸剂，散剂，粉末，颗粒，锭剂，胶囊等；或液体药物制剂，诸如溶液，悬浮液，乳液，糖浆，酏剂等。
在制造这些药物制剂中，取决于给药形式，可采用通用载体，诸如赋形剂，稀释剂，粘合剂，润湿剂，崩解剂，崩解抑制剂，吸收加速剂，润滑剂，增溶剂，缓冲剂，乳化剂，悬浮剂等。添加剂的例子包括那些通常随给药形式所用的添加剂，诸如稳定剂，防腐剂，缓冲剂，等渗剂(isotonizing agent)，螯合剂，pH控制剂，表面活性剂，着色剂，香精，调味剂，甜味剂等。
糖酶抑制剂在本发明药物组合物中的含量依赖于药物制剂的形式，不可无条件地限定，但选择的范围一般使得糖酶抑制剂在终药物制剂中的含量为0.001-100wt％，优选为0.01-80wt％。
药物组合物的给药量不受限制，可合适地选自宽的范围，这取决于目标治疗效果，给药方法，治疗期，对象的性别或/和年龄等。给药量，例如，给体重为60kg的人施用的糖酶抑制剂的剂量，随给药途径的不同而不同并可合适地选自约10-200,000mg/(60kg体重)的范围。
实施例
下列实施例和试验旨在进一步详细说明本发明，并不限制本发明的范围。在实施例和试验中，“％”表示“％w/w”，除非另有说明。
制备实施例1栗子涩皮提取物(提取剂中的乙醇浓度为100vol.％)
100ml的100vol.％乙醇添加至50g的栗子涩皮中，接着35℃下搅拌15小时。该混合物以3000g离心15分钟，所得上清液在旋转蒸发器中浓缩并冻干，得到1.59g的栗子涩皮的乙醇提取物(冻干产物)。
制备实施例2栗子涩皮提取物(提取剂中的乙醇浓度为75vol.％)
采用75vol.％的含水乙醇溶液而非100vol.％乙醇作为提取剂，将50g的栗子涩皮以制备实施例1相同的步骤进行处理，由此得到2.45g栗子涩皮的含水乙醇提取物(冻干产物)。
制备实施例3栗子涩皮提取物(提取剂中的乙醇浓度为50vol.％)
采用50vol.％的含水乙醇溶液而非100vol.％乙醇作为提取剂，将50g的栗子涩皮以制备实施例1相同的步骤进行处理，由此得到2.70g栗子涩皮的含水乙醇提取物(冻干产物)。
制备实施例4栗子涩皮提取物(提取剂中的乙醇浓度为25vol.％)
采用25vol.％的含水乙醇溶液而非100vol.％乙醇作为提取剂，将50g的栗子涩皮以制备实施例1相同的步骤进行处理，由此得到2.59g栗子涩皮的含水乙醇提取物(冻干产物)。
制备实施例5栗子涩皮提取物(提取剂中的乙醇浓度为0vol.％)
采用水而非100vol.％乙醇作为提取剂，将50g的栗子涩皮以制备实施例1相同的步骤进行处理，由此得到1.85g栗子涩皮的水提取物(冻干产物)。
对比制备例番石榴叶的热水提取物
干燥的番石榴叶磨成粉，以制备番石榴粉。2L的水添加至100g的番石榴叶粉中，接着100℃下搅拌1小时。该混合物以3000g离心15分钟，所得上清液在旋转蒸发器中浓缩并冻干，得到17.6g番石榴叶的热水提取物。
试验1α-淀粉酶抑制活性测试
(1)测试制备实施例1-5的栗子涩皮提取物和(对比制备例)番石榴叶的热水提取物对α-淀粉酶的抑制活性。上述提取物在该测试中分别溶于200mM磷酸缓冲液(pH7.0)至终浓度2.7，5.5，22，55和110μg/ml。
具体而言，将1.0ml缓冲液(200mM磷酸缓冲液，pH7.0)，0.5ml 1％氯化钠水溶液，2.5ml 0.25％淀粉水溶液的200mM磷酸缓冲液，pH7.0和0.5ml上述浓度之一的测试抑制剂之一混合在一起，以50μl的量(约1.6U；1U定义为每3分钟在20℃和pH6.8下从淀粉释放1mg麦芽糖所需的量)添加猪胰腺α-淀粉酶(Sigma)，接着在37℃下反应30分钟。随后，向反应混合物中加入0.5ml 8％氢氧化钠水溶液，再加入0.5ml二硝基水杨酸试剂[其制备方法为混合50ml酒石酸钾钠溶液(30g/50ml的纯化水)和20ml 3，5-二硝基水杨酸溶液(1g/20ml 8％氢氧化钠水溶液)，并以纯化水稀释该混合物至100ml]。所得混合物在100℃下加热5分钟，然后冷却，并在540nm测量其吸光度。测量的吸光度称作B。作为空白测试，利用50μl纯化水替代50μl猪胰腺α-淀粉酶重复上述步骤，并在540nm测量其吸光度。该测量的吸光度称作D。此外，利用0.5ml纯化水替代0.5ml测试抑制剂重复上述步骤，并在540nm测量吸光度。该测量的吸光度称作A。此外，利用0.55ml纯化水替代0.5ml测试抑制剂和50μlα-淀粉酶重复上述步骤，并在540nm测量吸光度。该测量的吸光度称作C。
各反应的α-淀粉酶活性(％)通过下列公式从吸光度A，B，C和D中计算出来：
α-淀粉酶活性(％)＝{(B-D)/(A-C)}×100
图1示出各反应系统的α-淀粉酶活性(％)，以用作测试抑制剂的各提取物的浓度(μg/ml)为横坐标制图。图1揭示，栗子涩皮的100vol.％乙醇提取物(-△-)，75vol.％含水乙醇提取物(-■-)，50vol.％含水乙醇提取物(-□-)，25vol.％含水乙醇提取物(-●-)，以及水提取物(-○-)全部以浓度依赖方式抑制α-淀粉酶活性，表明这些提取物具有α-淀粉酶抑制活性。
这些提取物的50％抑制浓度从抑制活性计算而来。表1显示上述(1)中测量的栗子涩皮提取物(制备实施例1-5)和番石榴叶的热水提取物(对比制备实施例)的结果和50％抑制浓度。番石榴叶的热水提取物已知具有α-淀粉酶抑制活性(例如，参见日本未审专利公报No.1995-59539)。
<表1>
提取物对α-淀粉酶的50％抑制浓度
  制备实施例   栗子涩皮提取物   50％抑制浓度
  1   100vol.％乙醇   5.1μg/ml
  2   75vol.％含水乙醇   4.4μg/ml
  3   50vol.％含水乙醇   6.5μg/ml
  4   25vol.％含水乙醇   7.3μg/ml
  5   水   21.0μg/ml
  对比例   番石榴叶提取物   25.0μg/ml
从这些结果一目了然，其中栗子涩皮提取物对α-淀粉酶具有较低的50％抑制浓度，为番石榴叶热水提取物的约1/3到约1/5，这表明它们具有极高的α-淀粉酶抑制活性。
试验2α-葡糖苷酶抑制活性测试
测试栗子涩皮提取物(制备实施例1-5)和番石榴叶的热水提取物(对比制备例)对α-葡糖苷酶(麦芽糖酶和蔗糖酶)的抑制活性。上述提取物在该测试中分别溶于80mM磷酸缓冲液(pH7.0)至终浓度0.13，0.25，0.5和1.0mg/ml。
(1)制备α-葡糖苷酶溶液
根据Anal.Biochem 7：18-25，1964制备α-葡糖苷酶溶液。具体而言，从大鼠切除小肠，以生理盐水洗涤，并外翻。以载玻片刮取空肠粘膜细胞，置于含有80mM磷酸缓冲液(pH7.0)的Teflon均质器中，并在冰上均质。从4只大鼠获得的空肠粘膜细胞使用40ml磷酸缓冲液。均质细胞离心(1000g，10分钟，4℃)，并将上清液用作α-葡糖苷酶溶液。
(2)测量麦芽糖酶抑制活性
(2-1)将50μl上述(1)制备的α-葡糖苷酶溶液加至400μl 50mM麦芽糖的磷酸缓冲液(底物溶液)和50μl测试抑制剂之一的混合物中，所得混合物37℃下保持30分钟。随后，该反应在沸水浴中终止2分钟，再冰冷反应混合物。反应混合物中释放的葡萄糖通过葡萄糖测量试剂盒(葡萄糖C-II Test Wako，Wako Pure Chemical Ind.Ltd.)测量。葡萄糖的测量值称为B。作为空白测试，利用50μl纯化水替代50μl α-葡糖苷酶溶液重复上述步骤，并测量葡萄糖释放量。葡萄糖的该测量值称为D。此外，利用50μl纯化水替代50μl测试抑制剂重复上述步骤，并测量葡萄糖释放量。葡萄糖的该测量值称为A。进一步，利用100μl纯化水替代50μl测试抑制剂和50μl α-葡糖苷酶溶液重复上述步骤，并测量葡萄糖释放量。葡萄糖的该测量值称为C。
各反应系统的麦芽糖酶活性(％)通过下列公式从葡萄糖值A，B，C和D中计算而来：
麦芽糖酶活性(％)＝{(B-D)/(A-C)}×100
(2-2)图2示出各反应的麦芽糖酶活性(％)，以用作测试抑制剂的各提取物[栗子涩皮提取物(制备实施例1-5)]的浓度(mg/ml)为横坐标制图。图2揭示，栗子涩皮的100vol.％乙醇提取物(-△-)，75vol.％含水乙醇提取物(-■-)，50vol.％含水乙醇提取物(-□-)，25vol.％含水乙醇提取物(-●-)，以及水提取物(-○-)全部以浓度依赖方式抑制麦芽糖酶活性，表明这些提取物具有α-葡糖苷酶(麦芽糖酶)抑制活性。
(2-3)表2显示栗子涩皮提取物(制备实施例1-5)和番石榴叶的热水提取物(对比制备实施例)对麦芽糖酶活性的50％抑制浓度。番石榴叶的热水提取物已知具有α-葡糖苷酶(麦芽糖酶)抑制活性(例如，参见“Food Science & Business”，Nikkei Biotechnology & Business单行本，pp.108-111，2003)。
<表2>
提取物对麦芽糖酶的50％抑制浓度
  制备实施例   栗子涩皮提取物   50％抑制浓度
  1   100vol.％乙醇   0.44mg/ml
  2   75vol.％含水乙醇   0.46mg/ml
  3   50vol.％含水乙醇   0.47mg/ml
  4   25vol.％含水乙醇   0.67mg/ml
  5   水   0.99mg/ml
  对比例   番石榴叶提取物   0.56mg/ml
表2揭示出，栗子涩皮提取物对α-葡糖苷酶(麦芽糖酶)的抑制活性等同于或更胜于番石榴叶热水提取物。
(3)测量蔗糖抑制活性
(3-1)利用400μl 50mM蔗糖的磷酸缓冲液替代400μl 50mM麦芽糖的磷酸缓冲液作为底物溶液，重复上述(2-1)的步骤，并测量反应混合物中释放的葡萄糖的量。
各反应的蔗糖酶活性(％)通过下列公式从葡萄糖值A，B，C和D中计算而来：
蔗糖酶活性(％)＝{(B-D)/(A-C)}×100
(3-2)图3示出各反应的蔗糖酶活性(％)，以用作测试抑制剂的各提取物[栗子涩皮提取物(制备实施例1-5)]的浓度为横坐标制图。图3揭示，栗子涩皮的100vol.％乙醇提取物(-△-)，75vol.％含水乙醇提取物(-■-)，50vol.％含水乙醇提取物(-□-)，以及25vol.％含水乙醇提取物(-●-)全部以浓度依赖方式抑制蔗糖酶活性，表明这些提取物具有α-葡糖苷酶(蔗糖酶)抑制活性。
(3-3)表3了显示栗子涩皮提取物(制备实施例1-5)和番石榴叶的热水提取物(对比制备实施例)对蔗糖酶活性的50％抑制浓度。番石榴叶的热水提取物已知具有α-葡糖苷酶(蔗糖酶)抑制活性(例如，参见“Food Science & Business”，Nikkei Biotechnology & Business单行本，pp.108-111，2003)。
<表3>
提取物对蔗糖酶的50％抑制浓度
  制备实施例   栗子涩皮提取物   50％抑制浓度
  1   100vol.％乙醇   0.69mg/ml
  2   75vol.％含水乙醇   0.65mg/ml
  3   50vol.％含水乙醇   0.83mg/ml
  4   25vol.％含水乙醇   0.86mg/ml
  5   水   1mg/ml
  对比例   番石榴叶提取物   0.43mg/ml
表3揭示出，栗子涩皮提取物对α-葡糖苷酶(蔗糖酶)的抑制活性等同于或逊色于番石榴叶热水提取物。
试验3正常大鼠的碳水化合物耐受性测试
称重150g的雄性Wister大鼠(Japan Clea Inc.)预先进食1周，然后将那些称重为180g-230g的大鼠进行下列碳水化合物耐受性测试(每组n＝8)。具体而言，大鼠禁食12小时，将制备实施例2制备的75vol.％含水乙醇的栗子涩皮提取物(300g/kg体重-●-)和淀粉(2g/kg体重)经胃管同时给药至大鼠。给药后0，20，40，60，90，120和180分钟，从尾管采集血液样品，利用Glucocard(DIAmeter-α，ARKRAY，INC)测量样品中的血糖水平(mg/dl)，以检查血糖水平的变化。利用Morinaga胰岛素试剂盒(Morinaga Co.Ltd.)测量样品中的血胰岛素水平(ng/ml)检验血胰岛素水平的变化。作为对照测试，大鼠禁食12小时，仅经胃管给予淀粉(2g/kg体重)而无栗子涩皮提取物，并在上述同样条件下同时间点测量血糖水平(mg/dl)和血胰岛素水平(-○-)。图4和5显示了这些结果。图4的纵坐标代表测试物质给药前后血糖水平(mg/dl)的增加。图5的纵坐标代表给药测试物质前后血胰岛素水平(ng/dl)的增加。
在对照大鼠中，血糖水平和血胰岛素水平直至给药后60分钟快速增加，而在给予栗子涩皮提取物的大鼠中，血糖水平和血胰岛素水平的增加被显著抑制，这依赖于给药的栗子涩皮提取物的浓度。
假设这是由于栗子涩皮提取物抑制体内α-淀粉酶和α-葡糖苷酶的活性，从而减慢糖酵解，抑制碳水化合物吸收，以及降低饭后血糖的增量。饭后血糖过多的衰减和平缓，其结果减少了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
实施例1面条
面条制备自500g中等强度面粉，30g盐，500mg由制备实施例2，3或4中获得的栗子涩皮含水乙醇提取物，以及200g水。
实施例2汉堡包
汉堡包制备自22.5g牛肉末，20.0g猪肉末，20.0g洋葱，7.5g面包屑，23g水，2g盐，1g糖，1g香料，2g纯油菜籽油，和1g由制备实施例2，3或4中获得的栗子涩皮含水乙醇提取物。
实施例3软饮料
热水(1000ml)添加至10g红茶叶以获得提取物。将100g蜂蜜，50g柠檬汁和1g由制备实施例2，3或4中获得的栗子涩皮含水乙醇提取物添加至提取物中，从而获得软饮料。
工业实用性
具有本发明糖酶抑制活性的物质(糖酶抑制剂)对α-淀粉酶或α-葡糖苷酶具有优异的抑制活性。在这些物质中，衍生自栗子涩皮的糖酶抑制剂基于多年的膳食经验，对活体显然是安全的。
因此，本发明的糖酶抑制剂通过抑制糖类在消化道内的消化和吸收而可有效用于减轻或预防肥胖。此外，本发明的糖酶抑制剂可延迟糖类消化和吸收，并抑制饭后血糖水平升高，由此可有效用于缓解糖尿病性高血糖症病，以及预防由高血糖症引起的糖尿病患者紊乱的发展。
而且，包含本发明糖酶抑制剂的食物组合物通过抑制食物中所含淀粉和糖的消化并阻止它们转化为能量，预计可预防由食欲过盛引起的肥胖相关疾病的发展。此外，由于本发明食物组合物通过延迟糖类消化和吸收，可抑制饭后血糖水平的升高，本发明的食物组合物预计具有预防或缓解糖尿病的效果。例如，通过将本发明的糖酶抑制剂与含有大量淀粉的食物混合，可为那些血糖水平高，或那些想减肥的个体提供食物。
近年来，去皮栗子的生产持续增长，从而留下大量栗子皮作为工业废物有待处理。根据本发明，这种栗子种皮(涩皮)可有效加以利用。尤其是，烘烤栗子和香草糖汁栗子所含的栗子涩皮是可食用的，因此没有理由怀疑其在活体中的安全性问题。

Claims (18)

1.包含栗子涩皮提取物的糖酶抑制剂，所述栗子涩皮提取物是通过利用乙醇或含水乙醇溶液对栗子的涩皮进行提取而获得的。
2.权利要求1的糖酶抑制剂，其中含水乙醇溶液含有5-95vol％的乙醇。
3.权利要求1的糖酶抑制剂，其中受抑制的糖酶为α-淀粉酶，α-葡糖苷酶或两者。
4.食物组合物，包含权利要求1的糖酶抑制剂。
5.权利要求4的食物组合物，其是高碳水化合物含量的饮料或食品。
6.权利要求4的食物组合物，其中糖酶抑制剂是通过利用乙醇或含水乙醇溶液对将栗子的涩皮进行提取而获得的。
7.权利要求4的食物组合物，其包含有效量的权利要求1的糖酶抑制剂作为活性成分用于延迟糖类消化和吸收。
8.权利要求7的食物组合物，其具有延迟糖类消化和吸收的性质，并在其包装上标注该食物组合物适用于延迟糖类消化和吸收。
9.权利要求4的食物组合物，其包含有效量的权利要求1的糖酶抑制剂作为活性成分用于降低饭后血糖或血胰岛素的升高。
10.权利要求9的食物组合物，其具有抑制饭后血糖水平升高或缓解高血糖症的性质，并在其包装上标注该食物组合物适用于抑制饭后血糖水平升高，或适用于缓解高血糖症。
11.权利要求4的食物组合物，其包含有效预防肥胖量的权利要求1的糖酶抑制剂作为活性成分。
12.权利要求11的食物组合物，其具有抗肥胖作用，并在其包装上标注该食物组合物适用于预防肥胖。
13.药物组合物，包含权利要求1的糖酶抑制剂作为活性成分，连同可药用载体和/或添加剂。
14.权利要求13的药物组合物，其是用于预防或治疗糖尿病的药物。
15.权利要求13的药物组合物，其是抗肥胖药物。
16.抑制对象饭后血糖水平升高或缓解对象高血糖症的方法，包含给对象注射或施用权利要求1的糖酶抑制剂。
17.预防或减轻肥胖的方法，包含给对象注射或施用权利要求1的糖酶抑制剂。
18.权利要求1的糖酶抑制剂在制备用于延迟糖的消化和吸收的组合物，用于抑制饭后血糖水平升高的组合物，用于缓解高血糖症的组合物，或抗肥胖组合物中的应用。
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PB01 Publication
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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