CN101035809B - 抗tag-72的人源化单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种特异于肿瘤-相关糖蛋白-72(TAG-72)的人源化抗体，还涉及包含该人源化抗体的抗癌组合物，具体地，本发明涉及人源化抗体，该抗体通过突变特异于TAG-72的人源化抗体PXA/HzK的重链从而增强抗原结合亲合力，涉及用人轻链替换人源化抗体的轻链而制备的抗体，并涉及包含这些抗体的抗癌组合物。

Description

抗TAG-72的人源化单克隆抗体
技术领域
本发明涉及特异于肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)的人源化抗体和包括该人源化抗体的抗癌组合物。
背景技术
肿瘤相关糖蛋白-72(以下简称“TAG-72”)是一种粘蛋白，其是在许多人类癌瘤中表达的一种肿瘤相关抗原，所述肿瘤包括结肠癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌和卵巢癌。鼠单克隆抗体B72.3是第一个特异于TAG-72的抗体，其是1980年代Jeffrey Schlom团队在国家肿瘤协会利用人乳腺癌组织的膜组分作为免疫原研究出来的(Colcher etal.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78(5)：3199-3203)。其后，由相同的科研小组研究出了比B72.3具有更高的抗原结合亲合力的第二代抗体，例如CC49和CC83(Muraro etal.，1988 CancerRes.，48(16)：4588-4596)。
发现CC49或CC83结合到多于80％的结肠癌和约50％的乳腺癌，但很少结合到正常组织。还有，在肿瘤患者体内用131I标记的CC49或CC83成像能够检测原发性癌和转移性癌(Divgi et al.，1994，Nucl.Med.Biol.，21(1)：9-15).然而，向体内反复给药鼠单克隆抗体引起了副作用或通过在体内诱导免疫反应而降低治疗效果。为了将这些不希望的免疫反应减到最小，已经通过将互补决定区(CDR)和鼠抗体骨架区(framwork region)(FR)的一些氨基酸残基移植到人抗体上构建了人源化抗体(Owenset al，1994，J.Immunol.Methods，168(2)：149-65)。已有报道，这些人源化抗体重复给药患者时极大地降低了不希望的免疫反应(Brown et al.，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：2663)。
在一项有关抗TAG-72抗原的人源化抗体的研究中，通过移植鼠单克隆抗体CC49的CDRs到人单克隆抗体轻链和重链FRs上，同时保留了维持抗原结合位点结构所需的那些鼠骨架残基，研究出了鼠单克隆抗体CC49的人源化抗体(HuCC49)(Kashmiri et al.，Hybridoma 14：461-473，1995)。
美国专利号5,976,531描述了特异于TAG-72的Hum4VL、VH抗体，其包括轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)，其中所述的轻链可变区由源于人卡帕亚型IV幼殖体基因(Hum4 VL)编码，所述重链可变区能够与VL结合形成特异地结合到TAG-72的三维结构。
美国专利号6,495,137公开了抗TAG-72的人源化抗体或其片段，其包括CDR移植轻链，该轻链具有被移植到Hum4VL的抗TAG-72的鼠抗体轻链CDRs，其中抗TAG-72的鼠抗体选自CC49、CC83、CC46、CC92、CC30和CC11。
其它多种抗TAG-72的人源化抗体已经研究出来，然而，需要开发具有高抗原结合能力和降低在人类中产生免疫反应危险的抗TAG-72的人源化抗体。
在这方面，如本发明的发明者提交的韩国专利号0318761所述，本发明的发明者确定了与抗TAG-72的鼠抗体的CDR和FR序列很相似的人基因，并利用上述所确定的人基因制备人源化抗体的轻链和重链基因，将所获得的基因克隆入表达载体，用该表达载体转化宿主细胞，然后培养宿主细胞，这样研制出了抗TAG-72的人源化抗体：AKA/HzK。
与人源化抗体HuCC49比较，人源化抗体AKA/HzK的CDRs和FRs中的多个氨基酸被与人类相似的残基替换，这样该抗体降低了在人中的免疫原性，同时基本保持了与HuCC49抗体非常类似的抗原结合能力。尽管取得了这些发展，还是需要功能优异的、降低在人体中产生免疫反应危险和改进抗原结合能力及亲合力的抗体。
基于这些背景，为制备与TAG-72具有优异的结合能力和亲合力的抗体，本发明的发明者通过随机变异人源化抗体AKA/HzK的CDR3的重链可变区制备了人源化重链文库，然后利用文库表达细胞进行菌落转移检测以挑选出具有高抗原结合能力的突变Fab克隆。通过竞争性ELISA检测所选择克隆的抗原结合能力。结果，构建了新的与TAG-72具有增强的抗原结合能力和抗原结合亲合力的抗体，本发明的发明者进一步用人轻链替换新的人源化抗体的轻链构建人源化抗体，这样就产生了本发明。
发明概述
本发明的一个目的是提供一种抗肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)的人源化抗体，其包括(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区，其中第100-103位的一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸替换，和(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NOS：21或22的轻链可变区。
本发明的另一个发明目的是提供编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。
本发明的另一个发明目的是提供包含编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列的重组载体。
本发明的另一个发明目的是提供重组载体转化的转化体。
本发明进一步的发明目的是提供通过培养转化体制备人源化抗体的方法。
本发明进一步的发明目的是提供一种包括人源化抗体的抗癌组合物。
本发明进一步的发明目的是一种提供通过给予人源化抗体治疗或预防癌症的方法。
本发明进一步的发明目的是提供一种通过给予人源化抗体诊断癌症的方法。
附图简述
本发明上面的和其它的目的、特征和其它的优点将更加清楚地从下面结合附图的详述中理解，其中：
图1是通过随机突变氨基酸序列的第99-103位的氨基酸残基构建突变抗体的表达载体的流程示意图，该表达载体编码抗肿瘤相关糖蛋白-72的人源化抗体AKA/HzK的重链HCDR3，由SEQ ID NO：1表示；
图2是选择具有高抗原结合亲合力的突变Fab克隆的菌落转移检测示意图；
图3表示具有高抗原结合亲合力的突变克隆的重链可变区的氨基酸序列；
图4是构建用于3E8突变体表达的质粒的流程示意图，所述的3E8突变体以全IgG形式具有最高抗原结合亲合力；
图5a和5b是曲线图，其中IgG形式的3E8、3C4、3D5、NV和NI抗体与常规IgG形式的抗体AKA/HzK在抗原结合能力方面进行比较；
图6是本发明的抗体在还原和非还原条件下电泳分离的凝胶照片，其中抗体及其亚单位的分子量被确定(泳道1：还原条件；泳道2：非还原条件)；
图7是3E8/BSM22抗体的人轻链可变区和常规抗体AKA/HzK的轻链可变区的氨基酸序列比对(alignment)；
图8是构建表达全IgG形式的3E8/BSM22抗体质粒的流程图；
图9是3E8和3E8/BSM22抗体与AKA/HzK抗体在抗原结合亲合力方面比较的曲线图(○：3E8；3E8/BSM22；●：AKA/HzK)；
图10图表示AKA/HzK和3E8抗体的体内分布和肿瘤靶向能力，其中将125I-AKA/HzK(A图)和125I-3E8(B图)静脉注射进入人结肠癌的无胸腺小鼠异种移植模型并评定在小鼠体内的分解和肿瘤靶向；
图11表示3E8抗体的放射性免疫治疗效果，其通过3E8抗体对肿瘤生长的抑制效果来测定，其中在131I-3E8(●)和3E8(■)给药的小鼠中测量肿瘤倍增时间(Td；A图)和体重变化(B图)；和
图12表示3E8抗体的放射性免疫治疗效果，其通过小鼠存活率来测定，其中在131I-3E8(●)和3E8(■)给药的小鼠中测定存活率(A图)和体重变化(B图)。
本发明的最佳实施方式
一方面，本发明涉及一种抗肿瘤相关糖蛋白-72(TAG-72)的人源化抗体，其包括(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区，其中第100-103位的氨基酸残基具有下述序列式1表示的序列，和(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO：21或22的轻链可变区。
[序列式1]
-X100-X101-X102-X103-
其中，X100是氨基酸残基亮氨酸(Leu)或色氨酸(Trp)，
X101是氨基酸残基异亮氨酸(Ile)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)或丙氨酸(Ala)，
X102是氨基酸残基蛋氨酸(Met)或谷氨酰胺(Gln)，
和X103是氨基酸残基丙氨酸(Ala)、谷氨酰胺(Gln)或甘氨酸(Gly)。
鼠源抗体在人体中导致不希望的免疫反应，因为它们在人体中被识别为抗原，并且产生针对鼠抗体的新的人抗鼠抗体(HAMAs)，这样产生不希望的免疫反应。已经进行很多尝试，通过减少人体中非人抗体的免疫原性来克服这些问题。所谓的人源化技术一般应用重组DNA技术来操作编码抗体分子多肽链的DNA序列。最初的制备人源化抗体方法是基于不可能抗体(chimeric antibody)的产生，其中人抗体的恒定区被融合到非人抗体的抗原结合域。国际专利申请号WO86/01533公开了制备不可能抗体的方法、该抗体通过仅将来源于鼠抗体的可变区连接到人抗体恒定区进行人源化。这些不可能抗体表现出比鼠抗体更低的免疫反应并具有改进的功能。然而，因为不可能抗体仍然包含鼠可变区，也就是包含非人可变区的氨基酸序列，当重复给药于人时它们能够引起HAMA反应。
为了进一步人源化不可能抗体，同时保持鼠抗体的抗原结合特异性和亲合力，进行了许多尝试，基于重组不能在人类中导致免疫反应的思想，将表现出具有抗原结合能力的鼠单克隆抗体的CDRs与人抗体的FRs进行重组。(Jones et al.，1986、Nature，4；321(6069)：522-525)。基于移植鼠抗体的CDR环到人抗体上的CDR移植制备的人源化抗体包含更少非人氨基酸序列，并且比不可能抗体具有降低的HAMA反应危险，但是可能具有较低的抗原结合亲合力。需要亲本鼠抗体的FRs以保留其亲本抗体结合到抗原的能力。在该方面，当被认为影响CDR结构的FRs的多个氨基酸残基被鼠抗体的相应残基替换时，人源化抗体的抗原结合亲合力被增强到与亲本鼠抗体相似的水平(Riechmann et al.，1988，Nature，332：323-327；Queen et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：10023-10029；Tempest et al.，1991，Biol.Technology，9：266-271；Co et al.，1991，Nature，351：501-502)。
术语“人源化抗体”，如本文所用，如上面所述，一般是指非免疫原性的或在人类中具有降低的免疫原性的抗体。人源化抗体是具有改变氨基酸序列的抗体，并且根据预期目的，抗体的氨基酸序列可能被重新组成。大量的改变是可能的，从改变抗体的一个或多个氨基酸到可变区和/或恒定区的完全重组。一般地，改变可变区以增强与抗原的结合能力和亲合力，改变恒定区以提高效应物功能，例如补体结合，和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性。
本发明的人源化抗体是通过变异本发明发明者在本发明之前构建的人源化抗体AKA/HzK的重链可变区的CDR3而获得的。本发明的人源化抗体比AKA/HzK具有改进的抗原结合能力和亲合力，其重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO：1和轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO：21。
术语“可变区”，如本文所用，是指抗体分子的一部分，其功能是与抗原特异结合并且在序列上具有多个变异。三个互补区CDR1、CDR2和CDR3位于可变区。“互补决定区(CDRs)”是参与抗原识别的环状区，CDRs序列的改变决定抗体对抗原的特异性。更具体地，在本发明中，通过CDR3的氨基酸序列改变来构建具有提高的抗原结合亲合力的抗体。以适当的方向插入在CDR之间的“骨架区(FRs)”用于保持CDR环，其包括FR1、FR2、FR3和FR4。本发明抗体重链可变区由跨位1到30位的FR1，跨位31到35位的CDR1，跨位36到49位的FR2，跨位50到66位的CDR2，跨位67到98位的FR3，跨位99到104位的CDR3，和跨位105到115位的FR4组成。本发明抗体轻链可变区由跨位1到23位的FR1，跨位24到40位的CDR1，跨位41到55位的FR2，跨位56到62的CDR2，跨位63到94位的FR3，跨位95到103位的CDR3，和跨位104到113位的FR4组成。
本发明的发明者发现当具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区的CDR3的第101位的天冬酰胺(Asn)残基被脂肪族残基替换时，本发明的人源化抗体对TAG-72具有增强的亲合力，本发明中，脂肪族残基是指异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或丙氨酸。
具体地说，本发明提供抗TAG-72的人源化抗体，其包括(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区，其中101位的天冬酰胺残基(Kabat号：97)被脂肪族残基替换，例如：异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或丙氨酸，并且100位的亮氨酸残基(Kabat号：96)被色氨酸残基替换，和/或102位的蛋氨酸残基(Kabat号：98)被谷氨酰胺残基替换，和/或103位的丙氨酸残基(Kabat号：99)被谷氨酰胺或甘氨酸残基替换，和(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区。
更加优选地，在重链可变区，101位的天冬酰胺残基被缬氨酸替换，102位的蛋氨酸残基被谷氨酰胺替换，和103位的丙氨酸残基被甘氨酸替换。这样，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体3C4，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区。还有，更加优选地，在重链可变区，101位的天冬酰胺残基被异亮氨酸替换，102位的蛋氨酸残基被谷氨酰胺替换，和103位的丙氨酸残基被甘氨酸替换。这样，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体3D5，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ IDNO：21的轻链可变区，还有，更加优选地，在重链可变区，101位的天冬酰胺残基被异亮氨酸替换，100位的亮氨酸残基被色氨酸替换，和103位的丙氨酸残基被谷氨酰胺替换。这样，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体3E8，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区。还有，更加优选地，在重链可变区，101位的天冬酰胺残基被缬氨酸替换。这样，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体NV，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区。还有，更加优选地，在重链可变区，101位的天冬酰胺残基被异亮氨酸替换。这样，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体NI，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区。
上述抗体比常规抗体AKA/HzK极大地增强了亲合力。全抗体3C4具有1.33×10-9M的抗原结合亲合力(KD)，全抗体3D5具有2.27×10-9M的KD，和全抗体3E8具有0.65×10-9M的KD，这些KD值分别比AKA/HzK的1.45×10-8M的KD值高约11、6和22倍。全NV抗体具有1.66×10-9M的KD，和全抗体NI具有3.38×10-9M的KD，这些KD值比AKA/HzK的1.45×10-8M的KD值分别高约8和4倍。
本发明的发明者打算用人轻链替换抗体的轻链。为了选择能够替换人源化轻链并与人源化抗体重链可变区一起使用的人轻链，由人外周血淋巴细胞制备了人轻链文库(PBL)。将人轻链DNA片段插入到表现出最好效果的人源化抗体3E8的Fab的表达载体(pC3-Q-3E8)替代人源化轻链基因，然后进行菌落转移检测以选择具有强抗原结合能力的突变克隆。分离比野生3E8Fab具有更好的抗原结合能力的细胞克隆，对它们的轻链可变区进行DNA测序。DNA测序显示克隆具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区。以该方式获得的具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的人轻链可变区能够通过常规重组DNA技术替换人源化抗体的轻链可变区。
更详细地说，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体，其包括(i)具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的重链可变区，其中101位的天冬酰胺残基(Kabat号：97)被脂肪族残基替换，例如：异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或丙氨酸，和100位的亮氨酸残基(Kabat号：96)被色氨酸残基替换，和/或102位的蛋氨酸残基(Kabat号：98)被谷氨酰胺残基替换，和/或103位的丙氨酸残基(Kabat号：99)被谷氨酰胺或甘氨酸残基替换，和(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区。
优选地，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体，其包括具有氨基酸序列SEQ IDNO：2的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区。还有，优选地，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区。还有，优选地，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区。还有，优选地，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区。还有，优选地，本发明提供了抗TAG-72的人源化抗体，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区。
上面抗体比常规抗体AKA/HzK极大地增强了亲合力。在它们中，最优选人源化抗体3E8/BSM22，其包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区。全3E8/BSM22抗体具有0.45×10-9M的抗原结合亲合力(KD)，其比3E8抗体0.65×10-9M的KD高约1.5倍。在本发明中，“抗体”包括全抗体形式和抗体分子的功能片段。全抗体包括2个全长轻链和2个全长重链，其中每个轻链经二硫键连接到每个重链。术语“抗体分子的功能片段”是指保持抗原结合功能的片段，并且包括Fab，F(ab′)，F(ab′)2和Fv。在抗体片段中，Fab包含轻链和重链的可变区，轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)，并且其具有单一抗原结合位点。Fab′片段不同于Fab片段在于在重链CH1域的C端具有包含1个或多个半胱氨酸残基的铰链区。F(ab′)2片段作为Fab片段的铰链区的半胱氨酸残基间通过二硫键形成的一对Fab′片段产生。Fv是最小的抗体片段，其仅包含重链可变区和轻链可变区。产生Fv片段的重组技术在国际专利申请号WO88/10649，WO88/106630，WO88/07085，WO88/07086和WO88/09344中有记载。二硫键连接的Fv(dsFv)包括通过二硫键相互连接的重链可变区和轻链可变区。单链Fv(scFv)包括通过肽连接子相互共价连接的重链可变区和轻链可变区。
这些抗体片段可能利用蛋白水解酶获得(例如，用木瓜蛋白酶消化全抗体产生Fab片段，和胃蛋白酶处理制备F(ab′)2片段)，并且优选采用重组DNA技术制备。在本发明中，抗体优选是Fab形式或全抗体形式。
本发明的人源化抗体可以通过重组DNA技术连接所有类型的恒定区。基于恒定区氨基酸序列的差异，重链具分为5个明显的类型：伽马(γ)，谬(μ)，阿尔法(α)，德尔塔(δ)和厄普西隆(ε)，并且重链包括下面的小类：伽马1(γ1)，伽马2(γ2)，伽马3(γ3)，伽马4(γ4)，阿尔法1(α1)和阿尔法2(α2)。还有，基于恒定区氨基酸序列的差异，轻链具有2个类型：卡帕(κ)和兰巴达(λ)类型(Coleman et al.，Fundamental Immunology，2nd Ed.1989，55-73)。优选地，重链恒定区是伽马1或伽马3，和更优选地，是伽马1同种型。优选地，轻链恒定区是卡帕类。
本发明抗体的恒定区包括具有多个改变氨基酸序列的多个变体。优选地，在变体能够导致免疫反应的前提下，通过氨基酸序列的改变和修饰，免疫球蛋白恒定区变体具有改进的结构稳定性，如抗热，ph等，或具有改进的溶解性，或具有改进的生物活性，如二硫键的形成，对表达宿主的亲合力，互补结合，与Fc受体的关联和抗体依赖的细胞介导的细胞毒性。
在其它方面，本发明涉及编码重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。
编码重链可变区的核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：1，其中氨基酸序列的101位的天冬酰胺残基被脂肪族残基替换，例如，异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或丙氨酸，和100位的亮氨酸残基被色氨酸残基替换，和/或102位的蛋氨酸残基被谷氨酰胺残基替换，和/或103位的丙氨酸残基被谷氨酰胺或甘氨酸残基替换。优选地，核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：2，3，4，5或6。
更加优选地，编码氨基酸序列SEQ ID NO：2的核苷酸序列是核苷酸序列SEQ IDNO：16。更加优选地，编码氨基酸序列SEQ ID NO：3是核苷酸序列SEQ ID NO：17。更加优选地，编码氨基酸序列SEQ ID NO：4是核苷酸序列SEQ ID NO：18。更加优选地，编码氨基酸序列SEQ ID NO：5是核苷酸序列SEQ ID NO：19。更加优选地，编码氨基酸序列SEQ ID NO：6是核苷酸序列SEQ ID NO：20。
编码轻链可变区的核苷酸序列编码SEQ ID NO：22表示的轻链可变区。优选地，该核苷酸序列是SEQ ID NO：23。
将编码抗体可变区和恒定区的核苷酸序列插入重组表达载体然后表达。
在另方面，本发明涉及重组载体，其包括编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列。
优选的重组载体包括编码选自SEQ ID NOs：2-6的重链可变区的核苷酸序列和编码选自SEQ ID NOs：21和22氨基酸序列的轻链可变区的核苷酸序列。在详细的试验中，本发明提供了重组载体pC-Q-3C4，pC3-Q-3D5，pC3-Q-3E8，pC3-Q-NV，pC3-Q-NI或pC3-Q-3E8/BSM22，还有，本发明提供重组载体pdCMV-dhfr-3C4，pdCMV-dhfr-3D5，pdCMV-dhfr-3E8，pdCMV-dhfr-NV，pdCMV-dhfr-NI或pdCMV-dhfrc-3E8/BSM22。
术语“重组载体”，如本文所用的，其描述了能够在适当的宿主细胞中表达目的蛋白质的表达载体，是指基因构建体，其包括必需的调控元件，基因插入可操作地连接到该元件从而重组载体在宿主细胞中表达。
术语“可操作地连接”，如本文所用的，是指核酸表达控制序列和编码目标蛋白质的核苷酸序列之间的功能连接，从而允许具有一般的功能。对于一个重组载体的可操作连接可以利用该领域已知的遗传重组技术制备，位点特异性DNA切割和连接可以利用该领域一般公知的酶轻松实现。
本发明合适的表达载体包括表达调控元件，例如启动子，起始密码子，终止密码子，聚腺苷酸信号和增强子，还有用于膜定位或分泌的信号序列。起始和终止密码子一般被认为是编码免疫原性目标蛋白质的核苷酸序列的一部分，在已经给药遗传构建体的个体中是功能必需的，并且在一定位于编码序列的框架中。启动子一般是组成型的或诱导型的。可用于原核细胞中的启动子的非限制性例子包括lac，tac，T3和T7启动子。可用于真核细胞的启动子的非限制性例子包括猿病毒40(SV40)启动子，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子，人免疫缺陷病毒(HIV)启动子，例如HIV长末端重复(LTR)启动子，莫洛尼病毒(moloney virus)启动子，巨细胞病毒(CMV)启动子，epstein barr病毒(EBV)启动子，劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子，还有来自例如人p-肌动蛋白，人血红蛋白，人肌肉肌酸和人金属硫蛋白的人基因启动子。
表达载体可以包括选择标记，以允许选择包含载体的宿主细胞。编码具有选择性表型产物的基因一般用作选择标记，选择性表型例如药物抗性，营养需要，对细胞毒素试剂的抗性或表面蛋白质的表达。因为只有表达选择标记的细胞才能够在选择试剂处理的环境中存活，所以转化细胞能够被选出来。还有，可复制的表达载体可能包括复制区，起始复制的特异性核苷酸序列。还有，可以使用病毒(例如vaculovirus)或噬菌体载体，和能够整合进入宿主细胞基因组的载体，例如逆转录病毒载体。
全抗体或抗体片段可以利用在单一载体中同时表达轻链和重链的载体系统制备，或利用在2个分离的载体中表达轻链和重链的系统制备。在后面的例子中，通过共转化或目标转化将2个载体导入宿主细胞。在目标转化中，选择包含轻链(或重链)基因的载体转化的细胞，然后用包含重链(或轻链)基因的载体再次转化选出的表达轻链(或重链)的细胞，最后选择表达轻链和重链的细胞。
为构建Fab形式的抗体，向载体中插入编码人轻链可变区(VI)和恒定区(CL)，和人重链可变区(VH)和第一区恒定区(CH1)的基因。在详细的试验中，使用pComb3HSS载体。更优选的载体是pC3-Q，其中在载体的XhoI位点前方的氨基酸序列EVQL(谷氨酸-缬氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸)改变成QVQL(谷氨酰胺-缬氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸)，以保留重链的第一氨基酸残基、谷氨酰胺，和/或基因III被移除以表达可溶的Fab。该载体具有lacZ启动子和OmpA和pelB信号肽。
在优选的方面，本发明提供：pC3-Q-3C4，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：2的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区：pC3-Q-3D5，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区；pC3-Q-3E8，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区；pC3-Q-NV，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区；Pc3-Q-NI，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区；Pc3-Q-3E8/BSM22，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区，等。
为构建全抗体，使用插入了编码人轻链可变区(VL)和恒定区(CL)，和人重链可变区(VH)和所有恒定区(CH1，CH2和CH3)的基因的载体。在本发明详细的试验中，使用具有2个表达单元的pdCMV-dhfr，其是利用pCMV-dhfr构建(KCTC8671P：韩国专利申请号162021)。该载体具有2个CMV启动子，并且重链和轻链由各自的启动子表达。
在优选的方面，本发明提供：pdCMV-dhfr-3C4，其包括具有氨基酸序列SEQ IDNO：2的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区；pdCMV-dhfr-3D5，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：3的重链可变区和具有氨基酸序列SEQID NO：21的轻链可变区；pdCMV-dhfr-3E8，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区；pdCMV-dhfr-NV，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区；pdCMV-dhfr-NI，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：6的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：21的轻链可变区，pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22，包括具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的重链可变区和具有氨基酸序列SEQ ID NO：22的轻链可变区，等。
在重组载体中，表达全抗体3E8的pdCMV-dhfr-3E8载体保藏在KCTC(韩国韩国典型培养物保藏中心；52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)2001年6月21日，登记号为KCTC 1039BP。表达全抗体3E8/BSM22的pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22载体保藏在KCTC，2004年5月31日，登记号KCTC 10647BP。
在其它方面，本发明涉及重组载体转化的转化体。
适于载体的宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌，芽胞杆菌，链霉菌，假单胞菌，奇异变形杆菌或葡萄球菌。还有，用作宿主细胞的真核细胞包括较低等的真核细胞，例如真菌(曲霉)和酵母菌(例如Pichiapastoris，酿酒酵母，裂殖酵母，粗糙链孢霉)和来自较高等的真核细胞，例如昆虫细胞。宿主细胞还可能来源于植物和动物。优选的细胞包括但不限于，COS7细胞(猴子肾脏细胞)，NSO细胞，SP2/O，CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，W138，BHK(幼仓鼠肾脏)细胞，MDCK，骨髓瘤细胞，HuT 78细胞和293细胞。CHO细胞是优选的。利用Lipofectamine将本发明的pdCMV-dhfr-3E8载体转化入CHO细胞，产生转化细胞系9E8，其保藏在KCTC，2001年6月21日，登记号KCTC 1040BP。将本发明的pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22载体转化进入CHO细胞，产生转化细胞系4D12-B31，其保藏在KCTC，2004年5月31日，登记号KCTC 10646BP。
在本发明中，对宿主细胞的“转化”包括将核酸导入生物体细胞，组织或器官的任何方法，如现有技术中已知的，可以根据宿主细胞选择适当的标准技术进行。这些方法包括但不限于，电穿孔，原生质体融合，磷酸钙(CaPO4)沉淀，氯化钙(CaCl2)沉淀，碳化硅纤维激发，农杆菌介导转化，和PEG介导的、硫酸葡聚糖介导的、Lipofectamine介导的以及干燥/抑制介导的转化。
进一步地在其它方面，本发明涉及通过培养转化体制备人源化抗体的方法。
在抗体制备方法中，利用适当的培养基在适当的培养条件下培养转化体，这在本领域是已知的。本领域熟练的技术人员根据菌株很容易采取这些培养方法。
通过培养转化体获得的抗体可以以非纯化的形式使用，或利用各种常规方法纯化后使用，这些方法可以分别或合并使用，例如透析，盐沉淀和层析法。在这些方法中，层析法更常用。层析法的例子包括离子交换层析法，分子排阻色谱法，和亲合层析法。
通过上述方法制备的抗体对抗原具有增强的亲合力。术语“亲合力”是指特异识别和结合到抗原特定区域的能力。抗体对抗原的高亲合力以及特异性在免疫反应中是关键因素。在本发明中，重链可变区被随机突变以制备人源化重链文库细胞，并且对文库细胞进行菌落转移检测以挑选具有高抗原结合能力的突变克隆。通过竞争性ELISA检测所选克隆的亲合力，其它的多种方法，例如表面等离子共振技术(SRP)可以用于测量抗体对抗原的亲合力。
术语“KD”，如本文所用，是指特定抗体-抗原相互作用的离解常数，并且已经用于测量抗体对抗原的亲合力。通过上述方法制备的本发明抗体对TAG-72抗原的结合能力比其亲本抗体AKA/HzK更好。
这样，通过上面的方法制备的具有增强亲合力的抗体可以诊断和治疗肿瘤。抗体可以以它们本身或包含在组合物中供给。
进一步地在其它方面，本发明涉及利用抗体诊断肿瘤的方法。
本发明的抗体以高亲合力结合到TAG-72上。这样，可以通过测量检测标签的信号大小的数量或性质来测定TAG-72和抗体之间的复合物形成，借此可以诊断肿瘤。能够定性或定量测量抗原-抗体复合物的形成的标签的非限制性例子包括酶，荧光物质，配位体，发光物质，微粒，氧化还原分子和放射性同位素。在本发明中，免疫组织化学显示本发明的抗体与结肠癌具有非常强的反应活性。
另外，本发明的抗体以结合成像标记的方式给药于患者，以诊断人癌或其转移。既然本发明的抗体比常规抗体具有更高的原亲合力，且是被进一步人源化的抗体，那么它们非常适于给药于患者。抗体-成像标记结合物的给药和检测以及将抗体结合到成像标记上的方法在文献中有多次描述(Goldenberg et al.，1978，New England J.Med.298，1384-1388；Goldenberg et al.，1983，J.Amer.Med.Assoc.280，630-635；Goldengerg etal.，1983，Gastroenterol.84，524-532；Siccardi et al.，1986，Cancer Res.46，4817-4822；Epenetos et al.，1985，Cancer 55，984-987；Philben et al.，1986，Cancer 57，571-576；Chiouet al.，1986，Cancer Inst.76，849-855；Colcher et al.，1983，Cancer Res.，43，736-742；Colcher，E.et al.，Laboratory Research Methods in Biology and MedicineImmunodiagnostics.New York，Alan R.Liss.pp.215-258(1983)；Keenan，A.M.et al.，1984，J.Nucl.Med.25，1197-1203；Colcher D.et al.，1987，Cancer Res.47，1185-1189；Estaban，J.M.et al.，1987，Intl.J.Cancer 39，50-59；Martin，D.T.，et al.，1984，Curr.Surg.41，193-194；Martin，E.W.Jr.et al.，1986，Hybridoma 5，S97-S108；Martin，D.T.et al.，1985，Am.J.Surg.150，672-675；Meares et al.，Anal.Biochem.1984，142，68-78；and Krejcarek etal.，1977，Biochem.and Biophys.Res.Comm.77，581-585)。剂量可以依据患者的年龄和体重变化。抗体-成像标记结合物的剂量应该是能够有效地看到或检测肿瘤位点明显于正常组织的量。
可以结合到抗体的成像标记的例子对于本领域熟练的技术人员是已知的，其包括可以利用伽马扫描设备、手握式伽马探测器或正电子发射体层摄影通过诊断成像检测的物质，和可以利用核磁共振分光计通过核磁共振成像检测的物质。
可以利用伽马扫描设备检测的物质的适当的例子包括放射性同位素例如125I，131I，123I，11In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re，188Re和99mTc。125I，123I，153Sm和99mTc是优选的，因为它们是低能的并且适于多种检测。可以利用核磁共振分光计检测的物质的一个例子是钆(Gd)。
进一步地在其它方面，本发明涉及包括抗体的抗癌组合物。
术语“抗癌”，如本文所用的，包括“预防”和“治疗”。术语“预防”是指通过给药本发明的包括抗体的组合物来抑制或延迟肿瘤形成的所有行为。术语“治疗”是指通过给药本发明的抗体使得肿瘤症状更好或有益地改变肿瘤进展的所有行为。
与常规抗体AKA/HzK相比，本发明的抗体在人结肠癌异种移植的无胸腺小鼠中保持较高的水平并且在血液中以高水平存在。当把本发明的抗体给药到具有人结肠癌异种移植的无胸腺小鼠中时，小鼠生存时间比对照小鼠更长。
可以通过本发明的组合物治疗的肿瘤包括所有类型的表达TAG-72的肿瘤。虽然TAG-72在许多人癌肿中表达，但本发明的组合物可以治疗所有类型的表达TAG-72的肿瘤。这样类型的肿瘤的例子包括结肠癌，卵巢癌，胃癌，胰腺癌和乳腺癌。
当用作治疗抗体时，本发明的抗体可以通过连接子直接或间接连接(例如，共价结合)连接到已知的治疗试剂，并且为了治疗肿瘤，以抗体-治疗结合物的形式给药到体内。
能够连接到抗体的治疗试剂的非限制性例子包括化学治疗试剂，放射性核素，免疫治疗试剂，细胞因子，趋化因子，毒素，生物试剂，酶抑制剂，和异功能抗体(heterofunctional antibody)：(1)抗体结合到放射性核素，例如131I，90Y，105Rh，47Sc，67Cu，212Bi，211At，67Ga，125I，186Re，188Re，177Lu，153Sm，123I和111In，它们描述在例如Goldengerg et al.，1981，Cancer Res.41，4354-4360中。(2)抗体结合到生物反应调解剂，例如甲氨蝶呤，阿霉素和淋巴因子，如干扰素，它们描述在例如Chabner et al.，1985，Cancer，Principles and Practice of Oncology，Philadelphia，PA，J.B.Lippincott Co.Vol.1，pp.290-328中；(3)抗体结合到毒素，例如蓖麻毒素，相思豆毒素和白喉，它们描述在例如Uhr et al.，1983，Monoclonal antibodies and Cancer，Academic Press，Inc.，pp.85-98中；(4)异功能抗体，即结合到其它抗体的抗体，这样该复合物同时结合到癌瘤和效应物(例如K细胞(杀伤细胞)，举例为T细胞)，它们描述在例如Perez et al.，1986，J.Exper.Med.163，166-178；and Lau et al.，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)82，8648-8652中；(5)其本身，也就是未结合的或非复合的抗体，它们描述在例如Herlyn et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)79，4761-4765中。
抗癌组合物包括可接受的载体并根据给药方式配制成适当的剂型。适于给药方式的药物制备是已知的，一般包括促进穿过膜传送的表面活性剂。该表面活性剂可以来源于类固醇，或者是阳离子脂质，例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)，或者是多种化合物，例如胆固醇半琥珀酸酯和磷脂酰甘油。
进一步地在其它方面，本发明涉及通过给药抗体来治疗肿瘤的方法。
本发明组合物以有效治疗肿瘤的量给药于患者。剂量可以根据因素变化而变化，因素包括肿瘤的类型，患者的年龄和体重，疾病的性状和严重程度，当前使用的治疗类型，治疗频率，和给药方式及途径，并且本领域专门工作者很容易确定该剂量。本发明组合物可以与药物或生理配料同时或相继给药，和可以与常规治疗试剂相继或者同时结合给药。本发明组合物可以单一或多次剂量给药。考虑所有的因素的情况下，以最小量给药组合物以达到最大的无副作用的效果是很重要的，这样的剂量本领域熟练的技术人员可以测定。
术语“给药”，如本文所用的，是指通过某种适当的方法将预定量的物质导入患者。只要它能够达到被需要的组织，包含本发明的抗体的组合物可以通过任何常规途径给药。给药方式可以变化，包括腹膜内，静脉内，肌肉内，皮下，真皮内，口服，外用，鼻内，肺内和直肠内给药，但是本发明并不限于这些举例的给药方式。然而，由于蛋白质口服给药时会被消化，所以对于口服给药的组合物的活性成分应该被包被或配制成制剂以防止在胃中被降解。另外，可以利用能够将活性配料传送入目标细胞的某种装置给药药物组合物。
下面更具体地描述本发明。
首先，制备本发明的特异性结合到TAG-72的抗体重链可变区。
人源化抗体AKA/HzK的重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO：1，并且包括跨位1到30位的FR1，跨位31到35位的CDR1，跨位36到49位的FR2，跨位50到66位的CDR2，跨位67到98位的FR3，跨位99到104位的CDR3，和跨位105到115位的FR4。在它们中，CDR3被突变成某些其它氨基酸，以构建新的、比亲本抗体AKA/HzK具更高抗原结合能力的抗体。
在具有氨基酸序列SEQ ID NO：1的人源化抗体AKA/HzK的重链可变区，CDR3的99位丝氨酸(Ser)残基，100位的亮氨酸(Leu)残基，101位的天冬酰胺(Asn)残基，102位的蛋氨酸(Met)残基和103位的丙氨酸(Ala)残基被随机突变。更具体地，为了获得包含突变的CDR3(图1)的DNA片段，利用人源化抗体AKA/HzK的基因表达载体pC3-Q-AKA/HzK作为模板，使用包括被突变的重链CDR3序列的序列作为引物进行PCR，所述的基因表达载体pC3-Q-AKA/HzK是通过用丙氨酸替换pC3-Q-HzCC49Fab-1-dgIII载体(韩国专利申请号：0318761)的重链可变区的97位苏氨酸残基而制备。所得DNA片断和pC3-Q-AKA/HzK载体分别用XhoI和ApaI消化后，进行纯化和连接。将连接的DNA分子转化入Electro-Ten blue E.coli感受态细胞(Stratagene，USA)。
为了构建新的对TAG-72具有增强抗原亲合力的抗体，用包含人源化重链文库的E.coli进行三次菌落转移检测(J.Immunol.Meth.272：219-233，2003)。利用结合生物素的AKA/HzK Fab，通过竞争性ELISA检测通过初次，二次和三次筛选分离的克隆，以确定它们是否具有比AKA/HzK Fab更好的抗原结合能力。对选择的克隆的抗原结合能力进行评价，结果是97位的天冬酰胺残基被非极性氨基酸，优选异亮氨酸或缬氨酸替换后的突变体具有比AKA/HzK更好的抗原结合能力。
根据上面的方法分离的突变克隆分别命名为3C4，3D5，3E8，NV和NI。突变克隆的重链可变区的DNA测序显示它们的氨基酸序列分别为SEQ ID NOs：2，3，4，5和6(图3)。
为了将Fab形式的抗体转化为全IgG形式，重链和轻链的可变区通过常规重组方法插入到全IgG形式的表达载体。首先，通过重组PCR将突变体的可变区与抗体基因的信号序列连接。将产生的DNA片段插入到人源化抗体AKA/HzK的全IgG形式的表达载体pdCMV-dhfr-AKA/HzK(韩国专利号：0318761)中的重链基因的同一限制性位点，这样构建表达全IgG形式抗体的质粒。在得到的表达质粒中，pdCMV-dhfr-3E8保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心，52，Oun dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)，2001年6月21日，登记号KCTC 1039BP。
将表达载体单独转化CHO细胞以获得转化体。传代培养DHFR-缺陷CHO细胞，应用Lipofectamine用全抗体表达载体转化该细胞，然后在包含G418的选择培养基和包含MTX的另一选择培养基进行选择。然后分离存活的细胞克隆，建立本发明突变抗体的表达载体转化的细胞系。在它们中，pdCMV-dhfr-3E8转化的转化细胞系9E8保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心，52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)2001年6月21日，登记号KCTC 1040BP。
检测转化细胞系表达的抗体的抗原结合亲合力以确定它们是否可用于诊断和治疗肿瘤。结果，通过本发明方法制备的抗体都比常规抗体AKA/HzK极大地增强了亲合力。每个抗体的抗原结合亲合力(KD)如下：AKA/HzK抗体是1.45×10-8M；全抗体3C4是1.33×10-9M；全抗体3D5是2.27×10-9M；和全抗体3E8是0.65×10-9M。当本发明的突变抗体的抗原结合亲合力与AKA/HzK比较的时候，本发明抗体的KD值是AKA/HzK(KD值为1.45×10-8M)的11，6和22倍。全抗体NV和NI的KD值分别是1.66×10-9M和3.38×10-9M，它们分别比AKA/HzK的1.45×10-8M高约8和4倍。
随后，为了构建体内给药时比3E8抗体具有针对TAG-72的优异的抗原结合能力和降低的免疫反应危险的抗体，用某种人轻链替换3E8的人源化轻链。为此，用人抗体的轻链替换SEQ ID NO：21表示的轻链可变区来构建新的抗体。
从人外周血淋巴细胞(PBL)制备人轻链文库以挑选能够替换本发明的人源化抗体轻链的人轻链。具体地，从人PBL分离总RNA，然后利用分离的总RNA作为模板选择性地合成人轻链cDNA。然后利用合成的cDNA作为模板，用人卡帕(kappa)轻链可变区的5′-特异性引物和人卡帕轻链恒定区的3′-特异性引物进行PCR来选择性地扩增人抗体轻链基因，然后用SacI和XbaI分别消化通过PCR获得的DNA片段和pC3-Q-3E8载体，然后进行纯化，连接，然后转化进入Electro-Ten blue E.coli感受态细胞。
为了构建新的对TAG-72具有增强抗原亲合力的抗体，利用包含人轻链文库的E.coli进行三次菌落转移检测。利用结合生物素的3E8 Fab，通过竞争性ELISA检测通过初次，二次和三次筛选分离的克隆，以确定它们是否具有比3E8 Fab更好的抗原结合能力。
检测所选择的克隆的抗原结合能力以分离与3E8 Fab具有相似的抗原结合能力的克隆。评价从分离克隆中纯化的Fab抗体，结果发现有一克隆比本发明的3E8 Fab具有更高的抗原结合能力。这些克隆命名为“pC3-Q-3E8/BSM22”。3E8/BSM22克隆的轻链可变区的DNA测序显示克隆具有氨基酸序列SEQ ID NO：22，其由核苷酸序列SEQ ID NO：23编码。
为了制备包含人轻链可变区的全IgG形式的人源化抗体，将具有核苷酸序列SEQID NO：23的轻链可变区基因克隆进入人源化抗体3E8的表达载体的轻链可变区基因的克隆位点，所述人源化抗体3E8的表达载体为pdCMV-dhfr-3E8。
将BsiWI限制性酶识别序列导入可变区和恒定区之间的位点，以仅克隆表达载体pdCMV-dhfr-3E8的轻链基因中的可变区基因，这样产生盒式载体(cassette vector)pdCMV-dhfrC-3E8。然后，将抗体基因信号序列与人轻链可变区序列连接，通过重组PCR将其包含在pC3-Q-3E8/BSM22载体中。利用HindIII和BsiWI限制性酶将连接的DNA亚克隆至pdCMV-dhfrC-3E8的HindIII/BsiWI位点，这样产生pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22。pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22质粒保藏在KCTC，2004年5月31日，登记号KCTC 10647BP。
将如上面利用Lipofectamine制备的本发明的表达质粒导入动物细胞，以在动物细胞中表达全IgG。
通过竞争性ELISA测量转化的动物细胞表达的抗体的抗原结合亲合力并与本发明的3E8抗体比较。发现3E8/BSM22抗体比3E8抗体具有更好的抗原结合能力(图9)。更具体地3E8/BSM22抗体具有约0.45×10-9M的KD，和3E8抗体具有0.65×10-9M的KD。发现3E8/BSM22抗体具有的抗原结合亲合力比3E8抗体高约1.5倍。
将如上描述制备的本发明的表达质粒pdCMV-dhfrc-3E8/BSM22转染进入dhfr-缺陷的细胞，然后在包含G418的选择培养基和包含MTX的另一选择培养基上选择。然后分离存活的细胞克隆，这样建立被本发明的pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22表达载体所转化的细胞系4D12-B31。转化细胞系保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心；52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)，2004年5月31日，登记号KCTC 10646BP。
从上面的结果明显看出，本发明的新抗体是具有优异的抗原结合亲合力和降低的免疫反应危险的人源化抗体，并且在诊断和治疗肿瘤中是有用的。
为更好地理解本发明可以通过下面的解释性例子获得，但是它们并不构成对本发明的限制。
实施例1：制备AKA人源化重链CDR3文库
如下制备比人源化抗体AKA具有增强的抗原结合亲合力的新的人源化抗体。首先，AKA抗体的人源化重链HCDR3的氨基酸序列SEQ ID NO：1中的99位丝氨酸(Ser)残基，100位的亮氨酸(Leu)残基，101位的天冬酰胺(Asn)残基，102位的蛋氨酸(Met)残基和103位的丙氨酸(Ala)残基被随机突变。
更具体地，以人源化抗体AKA的基因表达载体pC3-Q-AKA/HzK(韩国专利申请号318761)为模板，分别以SEQ ID NOs：7和8表示的一对VH135和HCDR3BACK为引物，和分别以SEQ ID NOs：9和10表示的另一对HCDR3FORWARD和LHS11为引物进行PCR。利用Taq DNA聚合酶进行PCR，条件包括在95℃预变性3分钟和25个“在95℃变性50秒，55℃退火50秒和在72℃延长1分钟”的循环。利用引物VH135和HCDR3BACK进行PCR获得的296 bp DNA片段和利用引物HCDR3FORWARD和LHS11进行PCR获得的180bp的另一DNA片段，将它们退火，然后利用VH135和LHS11引物进行重组PCR，这样产生458bp的DNA片段。利用Taq DNA聚合酶进行重组PCR，条件包括95℃预变性3分钟和25个“95℃变性50秒，在55℃退火50秒和72℃延长1分钟”的循环。分别用XhoI和ApaI消化通过重组PCR获得的DNA片段和pC3-Q-AKA/HzK载体，然后纯化。这两个消化的DNA片段在16℃过夜连接，然后在70℃孵育10分钟以灭活连接酶。然后，添加20μl的糖原和20μl的3M醋酸钠，在添加乙醇，然后放置在-20℃过夜沉淀DNA。沉淀的DNA用70％乙醇洗涤，干燥，然后在20μl的蒸馏水中悬浮。这样获得的连接DNA通过电穿孔转化进入Electro-Ten blue E.coli感受态细胞。更具体地，Electro-ten blue细胞在500ml的2×YT在37℃下搅动孵育直到培养物的OD(最佳密度)值达到约0.5-0.7，然后放置在冰上30分钟。在4℃以4000rpm离心细胞15分钟。丢弃悬浮液之后，将沉淀的细胞悬浮在500ml的10％甘油中。。在4℃以5000rpm离心细胞悬浮液15分钟。丢弃悬浮液之后，将沉淀的细胞悬浮在250ml的10％甘油中，然后再次在4℃以5000rpm离心15分钟。丢弃悬浮液之后，将所沉淀的细胞悬浮在20ml的10％甘油中，然后再次在4℃以4000rpm离心15分钟。丢弃悬浮液之后，将细胞团粒悬浮在1-2ml的10％甘油中，这样产生感受态细胞。300μl的感受态细胞等分入1.5ml试管，然后存储在-70℃。
实施例2：选择具有优异的抗原结合能力的突变克隆
为了发现新的特异性结合到TAG-72的人源化抗体，通过菌落转移检测筛选实施例1制备的文库细胞(Radosevic et al，.J.Immunol.Methods，2003，272(1-2)，219-233)(FIG.2)。
首先，将硝化纤维素膜放置到2×YTA板上，然后将1×106的细胞涂抹到膜上过夜培养。该膜称作标准膜(master membrane)。
在过夜培养期间，用于发现细胞具有强抗原结合能力的捕获膜用10μg/ml的TAG-72阳性BSM(牛颌下粘蛋白，类型-I-S，西格马)涂覆，37℃在PBS(磷酸盐缓冲液)保持6小时。用PBS洗涤膜两次并在5％脱脂牛奶37℃下孵育2小时。移除脱脂牛奶之后，用补充了100μg/ml的氨比西林和1mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)的2×YT培养基弄湿该膜。将捕获膜放置到100μg/ml的氨比西林和1mM IPTG补充的2×YT板之后，将涂抹了文库细胞的标准膜放置到捕获膜之上，在室温下孵育16-24小时。
用包含0.05％Tween 20的PBS(PBST)的洗涤捕获膜5次，然后在PBS中的脱脂牛奶中37℃下孵育6小时。为了选择结合到BSM抗原的克隆，37℃下将捕获膜在结合辣根过氧物酶的抗人F(ab’)2抗体的1∶1000稀释液中孵育1小时。用PBST洗涤捕获膜约5次以除去未结合的抗体分子，然后利用ECL方法研究以评价细胞的抗原结合能力。
在标准膜的相同位置收集确定对TAG-72具有结合亲合力的细胞，然后在37℃下于2×YTA中孵育直到培养物的OD值达到约0.7。根据相同的方法利用培养物进行菌落转移检测。然后通过初次、二次和三次的筛选物进行竞争性ELISA，以确定获得的Fab克隆对TAG-72是否具有比野生AKA/HzK Fab更高的结合亲合力。
对于在竞争性ELISA中的使用，在第三次筛选中获得的E.coli Fab克隆在37℃下搅动孵育。当培养物的OD值达到0.5-1.0，在30℃用1mM的IPTG过夜处理细胞以诱导Fab表达。收集培养物悬浮液。为了确定Fab抗体是否具有比野生AKA/HzK Fab具有优异的抗原结合能力，用1μg的BSM涂覆ELISA板的每个孔过夜，用2％BSA封闭，并用TBS-T洗涤三次。将25μl的结合生物素的野生AKA/HzK Fab抗体(1mg/ml)的1∶2000的稀释液和25μl的每个获得的Fab抗体加入到一个孔中。将板在37℃孵育1小时，然后用TBS-T洗涤除去未结合抗原的抗体分子。为测量结合到TAG-72的生物素化的AKA/HzK Fab相关量，将能够结合生物素的抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶的1∶1000的稀释液50μl加入到每个孔中，随后在37℃孵育30分钟。用TBS-T洗涤板三次以除去未结合的抗生蛋白链菌素-碱性磷酸酶，然后用50μl的对硝基苯磷酸酯溶液显色至少20分钟，在405-450nm下测量吸光度。在这里，作为阳性对照，所使用的AKA/HzK Fab的浓度为5μg/ml和10μg/ml；作为阴性对照，只使用2％BSA。作为竞争性ELISA的结果，在下面的实施例3中选择和测定比作为标准的AKA/HzK表现出较低ELISA值的突变克隆的抗原结合能力。
实施例3：评价突变克隆的抗原结合能力
为了确定选自实施例2的每个克隆的Fab的抗原结合能力，在37℃搅动培养突变克隆。当培养物的OD值达到0.5-1.0时，用1mM IPTG在30℃过夜处理细胞以诱导Fab表达。收集细胞并利用TES缓冲液(0.2 M Tris-HCl，pH 8.0，0.5mM EDTA，0.5M蔗糖)进行渗压休克以获得的溶解了突变Fab抗体的周质提取液。
为了研究突变Fab的抗原结合特异性和能力，用1μg的BSM和1μg的BSA涂覆ELISA板的每个孔过夜，用2％BSA封闭和用TBS-T洗涤四次。将周质提取液中的Fab抗体加入到每个孔中，将板在37℃孵育1小时然后用TBS-T缓冲液洗涤除去未结合抗原的抗体分子。然后在稀释在TBS-T中的二抗即抗人F(ab’)IgG HRP中孵育所述的板。OPD/H2O2底物被加入到每个孔中显色，然后在492nm测量吸光度。
分离比野生AKA/HzK Fab具有显著的增强的抗原结合能力的克隆。利用T7Sequenase V2.0DNA测序试剂盒(Amersham)测定每个突变克隆的HCDR3全长核苷酸序列。发现测定的核苷酸序列分别编码氨基酸序列SEQ ID NOs：2，3，4，5和6(参见图3)。获得的Fab突变体分别命名为3C4，3D5，3E8，NV和NI。和表达载体分别命名为pC3-Q-3C4，pC3-Q-3D5，pC3-Q-3E8，pC3-Q-NV和pC3-Q-NI。
实施例4：构建表达全IgG的人源化克隆的表达质粒
为了利用Fab突变体3E8制备全IgG形式抗体，通过重组PCR连接抗体基因的信号序列、Fab突变体的可变区和人抗体的恒定区(图4)。
具体地，为合成抗体基因的信号序列，以全IgG形式的人源化抗体AKA/HzK的表达载体pdCMV-dhfr-AKA/HzK作为模板，分别用SEQ ID NOs：11和12表示的引物对LHS39和LHS43进行PCR。结果获得的96bp的DNA片段。
另外，为合成Fab突变体重链可变区基因的5’区，以pC-Q-3C4，pC3-Q-3D5，pC3-Q-3E8，pC3-Q-NV和pC3-Q-NI载体作为模板，分别用SEQ ID NOs：13和14表示的引物对LHS44和Type C Back进行PCR，结果，获得的306bp的DNA片段。还有，为合成重链可变区基因的3’区，以pC-Q-3C4，pC3-Q-3D5，pC3-Q-3E8，pC3-Q-NV和pC3-Q-NI载体作为模板，分别用SEQ ID NOs：15和10表示的作为正向引物的Type C Forward和作为反向引物的LHS11进行PCR。利用DNA聚合酶进行PCR，条件包括在95℃预变性3分钟和25个“在94℃变性循环50秒，在55℃退火50秒和在72℃延长1分钟”的循环。结果，获得的159bp的DNA片段。其后利用三个DNA片段(96bp，306bp和159bp)作为模板，分别用SEQ ID NOs：10和11表示的LHS11和LHS39引物，连接三个DNA片段，这样产生531bp的DNA片段。用EcoRI和ApaI消化上述连接的DNA的每个末端，并插入到携带编码常规人源化抗体AKA/HzK基因的动物表达载体pdCMV-dhfr-AKA/HzK的EcoRI/ApaI位点。产生的表达质粒命名为pdCMV-dhfr-3C4，pdCMV-dhfr-3D5，pdCMV-dhfr-3E8，pdCMV-dhfr-NV和pdCMV-dhfr-NI，在它们中，pdCMV-dhfr-3E8质粒保藏在KCTC(遗传资源中心，KRIBB，Korea)，登记号KCTC 1039BP。
实施例5：测量人源化抗体的抗原结合亲合力
为了测定上面的制备的抗体的抗原结合能力和抗原结合亲合力，将如上面实施例4制备的本发明的表达质粒导入动物细胞以在动物细胞中产生全IgG抗体。
首先，在37℃的5％CO2培育箱中，将COS7细胞在添加了10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(GIBCO)上传代培养。将细胞以1×106细胞/ml的密度放置到100-mm培养皿上，在37℃培养过夜，并用OPTI-MEM I培养基(GIBCO)洗涤三次。5μg的实施例4制备的抗体表达载体pdCMV-dhfr-3C4，pdCMV-dhfr-3D5，pdCMV-dhfr-3E8，pdCMV-dhfr-NV和pdCMV-dhfr-NI分别用500μl的OPTI-MEM I稀释。25μl的Lipofectamine(GIBCO)也用500μl的OPTI-MEM I稀释。在15ml的试管中混合稀释的表达载体和稀释的Lipofectamine，然后在室温下保持多于15分钟以形成DNA-Lipofectamine复合物。将5ml的OPTI-MEM I添加至DNA-Lipofectamine混合物，然后将其应用到上述洗涤的COS7细胞。在37℃的5％CO2培育箱中培养细胞48小时以表达本发明的3C4，3D5，3E8，NV和NI抗体。
通过ELISA测量从细胞的培养物上清夜获得的3C4，3D5，3E8，NV和NI抗体的抗原结合能力和抗原结合亲合力。首先，将250ng的BSM放置进入免疫板的每个孔，然后在4℃孵育免疫板过夜以允许抗原接触板的底部。然后用2％BSA封闭免疫板并用TBS-T洗涤四次。将包含表达全IgG突变体的COS7细胞的培养物上清夜在PBS中稀释，然后以相同浓度加入到板的每个孔内。将板在37℃孵育30分钟，然后用TBS-T洗涤除去未结合抗原的抗体分子。一抗与二抗、抗人IgG(Fc特异的)-HRP反应，然后在TBS-T中稀释到1∶5000。OPD/H2O2基质被加入到每个孔以显色，然后在492nm测量吸光度。
为了对比3E8抗体与AKA/HzK的抗原结合亲合力，实施竞争性ELISA检测。多种浓度的竞争抗原与3C4，3D5，3E8，NV，NI或AKA/HzK抗体的第二大浓度混合，然后在37℃反应3小时。将反应混合物加入到ELISA板的每个孔中，板的孔内预涂了250ng的TAG-72抗原。反应30分钟之后，将板在抗人IgG(Fc特异的)-HRP中孵育，然后测量显色的等级。
每个抗体的抗原结合亲合力(KD)为：AKA/HzK抗体是1.45×10-8M，3C4是1.33×10-9M，3D5是2.27×10-9M，3E8是0.65×10-9M，NV是166×10-9M，和NI是3.38×10-9M。这些结果显示突变抗体分别比AKA/HzK的1.45×10-8M(图5a，5b)的KD值的抗原结合亲合力增强约11，6，22，8和4倍。
实施例6：3E8抗体-表达细胞系的建立
建立用3E8抗体的表达载体pdCMV-dhfr-3E8转化的CHO细胞系以生产3E8抗体。
首先，在37℃的5％CO2培育箱中，将DHFR-minus CHO细胞系，DG44(ATCCCRL 9096)在包含10％FBS的DMEM培养基(GIBCO)上传代培养。将细胞以1×106细胞/ml的密度放置到100-mm培养皿上，在37℃培养过夜，并用OPTI-MEMI培养基(GIBCO)洗涤三次。将分别为5μg的实施例4制备的抗体表达载体pdCMV-dhfr-3E8稀释于500μl的OPTI-MEM I，25μl的Lipofectamine(GIBCO)也用500μl的OPTI-MEM I稀释。在15ml的试管中混合稀释的表达载体和稀释的Lipofectamine，然后在室温下保持多于15分钟以形成DNA-Lipofectamine复合物。将5ml的OPTI-MEM I添加至DNA-Lipofectamine混合物，然后将其应用到上述所洗涤的DG44细胞。在37℃的5％CO2培育箱中培养细胞6小时，然后添加3ml包含20％小牛血清的DMEM/F12培养基，接着在相同条件下进一步培养48小时。分离突变抗体表达载体转化的细胞，然后以1×104细胞/ml的密度悬浮在选择培养基中，该培养基通过加入10％透析的FBS和550g/ml的G418到不包含核苷酸的MEM-α培养基而制备，然后将其等分进入96-孔板。培养多于一个星期之后，通过ELISA检测形成的克隆的抗体产品以选择表达高浓度抗体的克隆。
如下进行ELISA。将100ng的抗人IgG放置进入免疫板的每个孔，然后在4℃孵育免疫板过夜。然后用2％BSA封闭免疫板并用TBS-T洗涤四次。在PBS中稀释培养物上清夜，然后将其加入到板的每个孔中。将板在37℃孵育1小时然后用TBS-T洗涤除去未结合到抗体的抗体分子。一抗与二抗、抗人IgG(Fc特异的)-HRP反应，然后在TBS-T中稀释到1∶5000。将OPD/H2O2底物加入到每个孔以显色，然后在492nm测量吸光度。
选择的分泌高浓度3E8抗体的克隆培养在包含20nM MTX的培养基中2个星期，然后培养在包含80nM MTX的选择培养基中。表达高浓度3E8抗体的克隆命名为“9E8细胞系”，其保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心；52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)，2001年6月21日，登记号KCTC 1040BP。
实施例7：纯化全IgG突变体并评价它们的抗原结合亲合力
实施例6中制备的9E8细胞系培养在无血清的培养基CHO-S-SFMII(Gibco)中。培养物上清夜通过蛋白质G-琼脂糖4B柱(Pharmacia)。用0.1M甘氨酸(pH7.0)洗脱结合到柱上的抗体，用1.0M Tris(pH9.0)中和，然后在PBS(pH7.0)中透析。在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳纯化的3E8抗体。
如图6所示，当抗体在还原条件下在SDS-PAGE上分离时，检测到了55kDa和25kDa的2个蛋白质条带。已知它们分别是该分子的重链和轻链(参见泳道1)。这些结果显示本发明的9E8细胞系产生四聚体形式的全抗体。
另外，当根据实施例5相同的方法测量纯化的3E8抗体的抗原结合亲合力时，发现亲合力为0.65×10-9M。
实施例8：人轻链文库的制备
为了制备比人源化抗体具有较低的HAMA反应危险性并保持3E8的抗原结合能力的新的抗体，用人轻链替换3E8抗体的人源化轻链。首先，利用Hofman等描述的方法(Hofman et al.，1982，Am.J.Clin.Pathol.，77(6)：710-713)从人PBL(外周血淋巴细胞)制备轻链文库。
具体地，从人PBL分离总RNA，然后利用分离的总RNA作为模板，逆转录酶(Superscript II，Gibco BRL)和SEQ ID NO：24表示的CKld引物选择性地合成人轻链cDNA。利用合成的cDNA作为模板，用SEQ ID NOs：25-29表示的人卡帕轻链可变区的5’特异性引物(VK1，VK2，VK3，VK4和VK5)和CKld引物进行PCR，从而选择性地扩增人抗体轻链基因。
利用TaqDNA聚合酶进行PCR，条件是95℃预变性5分钟和20个“在95℃变性50秒，在55℃退火50秒和在72℃延长1分钟”循环。测定20个PCR循环以增加人抗体的多样性。
用SacI和XbaI消化通过PCR获得的人轻链DNA片段，然后插入到本发明的人源化抗体3E8的Fab的表达载体pC3-Q-3E8的SacI/XbaI位点。
具体地，pC3-Q-3E8用SacI和XbaI消化后，将其纯化，在16℃过夜的条件下与通过PCR获得的DNA片段连接，然后在70℃孵育10分钟以灭活连接酶。然后，将糖原和3M醋酸钠添加至反应混合物，然后用乙醇补充，然后放置在-20℃过夜沉淀DNA。沉淀的DNA用70％乙醇洗涤，干燥，然后在20μl的蒸馏水中悬浮。这样获得的连接DNA通过电穿孔转化至Electro-Ten blue E.coli感受态细胞。
例子9：选择具有强抗原结合能力的3E8/BSM22突变克隆
为从实施例8制备的文库细胞中发现新的结合到TAG-72的抗体，进行如实施例2所述的菌落转移检测。
为了确定细胞克隆是否比野生3E8 Fab具有更好的抗原结合能力，如实施例2所述利用结合生物素的3E8 Fab抗体进行竞争性ELISA。结果，获得了比对照3E8 Fab具有更低ELISA值的突变克隆。
如实施例3所述检测每个克隆的抗原结合能力。结果，分离了比3E8 Fab具有更好的抗原结合能力的克隆。利用T7Sequenase V2.0DNA测序试剂盒(Amersham)测定每个突变克隆的轻链可变区的核苷酸序列。发现所测定的核苷酸序列编码氨基酸序列SEQ ID NO：22(参见图7)。获得的Fab突变体命名为3E8/BSM22，和表达载体命名为pC3-Q-3E8/BSM22。
实施例10：全IgG形式的3E8/BSM22抗体的表达载体的构建
为了制备包含3E8/BSM22抗体的人轻链的全IgG形式的3E8/BSM22抗体，将人轻链基因克隆进入本发明人源化抗体3E8的表达载体(pdCMV-dhfr-3E8)的轻链基因的克隆位点。
首先，将BsiWI限制性酶识别序列导入可变区和恒定区之间的位点，以仅仅克隆表达载体pdCMV-dhfr-3E8的轻链基因中的可变区基因，这样产生盒式载体pdCMV-dhfrC-3E8(图8)。更具体地，利用pdCMV-dhfr-3E8作为模板，以SEQ ID NO：30表示的LHS42和KCBsiWIback引物对，和另一个SEQ ID NO：32表示的KCBsiWIfor和CKld引物对进行PCR。利用SEQ ID NO：30表示的LHS42和CKld引物通过重组PCR连接这2个PCR产物。首先，用HindIII和XbaI消化产生的DNA片段然后插入到pdCMV-dhff-3E8载体的轻链基因位点来替换该轻链基因，这样产生pdCMV-dhfrC-3E8(图8)。
然后，通过重组PCR将BSM22载体的可变区序列与轻链基因的信号序列连接。更具体地，为扩增抗体基因的信号序列，利用pdCMV-dhfr-AKA/HzK作为模板，用SEQ ID NOs：30和33分别表示的引物对LHS42和KcleaderBack进行PCR。还有，为扩增Fab的轻链可变区基因，利用pC3-Q-3E8/BSM22作为模板，用SEQ ID NOs：34和31分别表示的KCfor和KCBsiWIback引物对进行PCR。为了连接信号序列和人轻链可变区基因，利用SEQ ID NOs：30和31分别表示的的LHS42和KCBsiWIback引物对进行重组PCR。利用Taq DNA聚合酶进行重组PCR，条件是95℃预变性5分钟和30“在94℃变性50秒，在55℃退火50秒和在72℃延长1分钟”的循环。
用HindIII和BsiWI消化产生的DNA片段，然后插入到动物表达载体pdCMV-dhfrC-3E8的HindIII/BsiWI位点，这样产生表达质粒pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22。pdCMVdhfrC-3E8/BSM22质粒保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心；52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)，2004年5月31日，登记号KCTC 10647BP。
实施例11：评价3E8/BSM22抗体的抗原结合亲合力
本发明的3E8/BSM22抗体的抗原结合亲合力如下测定。如实施例5所述，将本发明的表达质粒pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22导入进入COS7细胞以产生全IgG形式的抗体。通过竞争性ELISA测量培养物上清夜中的表达的3E8/BSM22抗体的抗原结合亲合力。3E8/BSM22抗体的KD约为4.5×10-10M，和3E8抗体的KD约为5×10-10M。这样，发现3E8/BSM22抗体比3E8抗体的抗原结合亲合力高约1.5倍。
实施例12：3E8/BSM22抗体-表达细胞系的建立
如实施例6所述建立用表达载体pdCMV-dhfr-3E8/BSM22转化的CHO细胞系以生产3E8/BSM22抗体。
选择以高浓度表达3E8/BSM22抗体和表现出良好生长速度的克隆并将其命名为“4D12-B31细胞系”，其保藏在KCTC(韩国典型培养物保藏中心；52，Oun-dong，Yusong-ku，Taejon，Korea)，2004年5月31日，登记号KCTC 10646BP。
实施例13：AKA和3E8抗体的体内分布和肿瘤靶向
在人结肠癌异种移植的无胸腺小鼠中检测3E8和AKA/HzK抗体的体内分布和肿瘤靶向。用放射性同位素125I标记纯化的3E8和AKA/HzK抗体。TLC(薄层色谱法)显示125I标记抗体具有大于99％的放射化学纯度。将125I标记的3E8或AKA/HzK抗体静脉注射进入小鼠模型，然后在注射抗体4，24，48和72小时之后检测它的体内分布。测定肿瘤和分化组织中每克组织(％ID/克组织)的注射剂量百分比，结果显示在图10和下面的表1中。AKA/HzK(图10的A图)和3E8(图10的B图)都靶向肿瘤。注射抗体24小时之后获得肿瘤组织的最大放射性。在所有时间点，肿瘤组织中的3E8比AKA/HzK保持更高的水平。还有，测试期间发现125I-3E8高水平保留在肿瘤组织中。然而125I-AKA/HzK在肿瘤组织中的累积随着时间降低。与125I-AKA/HzK相比，24，48和72小时的后注入在肿瘤组织中131I-3E8的累积分别增加到约167％，224％和236％。这些结果显示3E8对肿瘤具有更高的亲合力并且比AKA/HzK对肿瘤具有更好的结合能力。
表1.125I-AKA/HzK和125I-3E8在无胸腺小鼠*的LSI74T肿瘤中的生物分布
*小鼠组数，n＝3，数据记录为平均值±SD，在AKA和3E8之间的肿瘤摄取的差值在所有时间点都是统计显著性(P＜0.05)。
实施例14：3E8的放射性免疫治疗效果评价
通过抗体对肿瘤发育的抑制效果分析和小鼠生存分析2个方法测试3E8抗体的治疗效果。首先为了分析抗体对肿瘤发育的抑制效果，将131I-3E8(20mg/7.4MBq，200mCi)静脉注射进入8只具有人结肠癌异种移植的无胸腺小鼠6次(每星期1次)。用未标记的3E8代替131I-3E8注射8只对照小鼠。结果，用131I-3E8给药的小鼠中的肿瘤生长被延迟(图11)。在处理的小鼠中，肿瘤倍增时间(Td)为13.2天，其比对照小鼠(用未标记的3E8处理)的Td(5.6天)显著延长。在测试小鼠中发现体重没有重大改变。即，对照小鼠的体重随着时间轻微地增加到102％，而处理小鼠的体重降低到了最初体重的87％。
为了评估用131I-3E8处理的小鼠的存活率，每星期用7.4MBq的131I-3E8给药7只无胸腺小鼠，共给药6周。用131I-3E8处理的50％生存比率的时间为90.5天，而比对照小鼠的为42.5天。这样，所处理的小鼠的50％生存比率的时间是对照小鼠长2.1倍(图12)。在测试小鼠中发现体重没有重大改变。即，发现对照小鼠的体重随着时间轻微地增加，而处理小鼠的体重降低了约10％。
工业实用性
如上文所述，本发明提供了通过变异AKA/HzK的重链而具有增强的抗原结合亲合力的人源化抗体，和其它的通过用人轻链替换上面的人源化抗体的轻链而具有增强的抗原结合亲合力的人源化抗体。这些抗体和包括这些抗体的抗癌的组合物对TAG-72抗原比常规AKA/HzK抗体具有更高的结合亲合力，并且能够比常规的抗TAG-72的人源化抗体更加有效地诊断和治疗肿瘤。
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Claims (14)

1.抗肿瘤-相关糖蛋白-72的人源化抗体，其包括(i)氨基酸序列为SEQ ID NO：1的重链可变区，其中第100-103位氨基酸残基具有下面序列式1表示的序列，和(ii)氨基酸序列为SEQ ID No：21或22表示的氨基酸序列的轻链可变区，
[序列式1]
-X100-X101-X102-X103-
其中，X100是色氨酸，X101是异亮氨酸，X102是蛋氨酸，且X103是谷氨酰胺；
X100是亮氨酸，X101是缬氨酸，X102是谷氨酰胺，且X103是甘氨酸；
X100是亮氨酸，X101是异亮氨酸，X102是谷氨酰胺，且X103是甘氨酸；
X100是亮氨酸，X101是缬氨酸，X102是蛋氨酸，且X103是丙氨酸；或
X100是亮氨酸，X101是异亮氨酸，X102是蛋氨酸，且X103是丙氨酸。
2.根据权利要求1的人源化抗体，其中重链可变区的氨基酸序列选自氨基酸序列SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：6。
3.编码权利要求1的重链可变区的核苷酸序列。
4.编码SEQ ID NO：22表示的轻链可变区的核苷酸序列。
5.包括编码权利要求1的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列的重组载体。
6.根据权利要求5的重组载体，其是pC3-Q-3C4，pC3-Q-3D5，pC3-Q-3E8，pC3-Q-NV，pC3-Q-NI或pC3-Q-3E8/BSM22质粒。
7.根据权利要求5的重组载体，其是pdCMV-dhfr-3C4，pdCMV-dhfr-3D5，pdCMV-dhfr-3E8，pdCMV-dhfr-NV，pdCMV-dhfr-NI或pdCMV-dhfrC-3E8/BSM22质粒。
8.用权利要求5的重组载体转化的转化体。
9.根据权利要求8的转化体，其以登记号KCTC 1040BP保藏。
10.根据权利要求8的转化体，其以登记号KCTC 10646BP保藏。
11.权利要求1的人源化抗体的制备方法，其包括培养权利要求8的转化体。
12.包括权利要求1的抗体和药物可接受的载体的抗癌组合物。
13.权利要求1的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
14.权利要求1的抗体在制备用于诊断癌症的药物中的用途。
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