KR100318761B1 - 암 특이항원 ｔａｇ-72에 결합하는 인간화 항체 및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체에 관한 것으로, 구체적으로는 TAG-72에 대한 생쥐항체의 CDRs 및 FRs 서열과 가장 유사한 사람 유전자를 대상으로 제조한 인간화 경쇄 및 중쇄 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 형질전환체 그리고 상기 형질전환체를 배양하여 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법을 제공하며, 본 발명의 인간화 항체는 기존의 인간화 항체보다 생쥐유래의 CDRs 및 FRs 아미노산 잔기가 많이 감소되어 반복투여시 인체 면역반응을 유발하는 문제점을 개선하여 항암치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

암 특이항원 ＴＡＧ-72에 결합하는 인간화 항체 및 이의 제조방법{humanized antibodies to TAG-72 and preparation method thereof}

본 발명은 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체, 그의 유전자, 이를 포함하는 발현벡터 및 형질전환체 그리고 상기 형질전환체로부터 인간화 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

보다 상세하게는 TAG-72에 대한 생쥐항체의 CDRs (complementarity determining regions) 및 FRs (framework regions) 서열과 가장 유사한 사람 유전자를 대상으로 제조함으로써 TAG-72에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐유래의 CDRs 및 FRs 아미노산 잔기가 많이 감소되어 항원과의 결합친화도가 높으면서도 반복투여에 의한 면역반응유발의 문제점을 크게 개선할 수 있는 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자, 인간 경쇄 생식세포주(germline) DPK24와 Jk4로 구성된 인간 경쇄 유전자, 이를 포함하는 발현벡터, 형질전환체 그리고 상기 형질전환체를 배양하여 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

종양-특이 당단백질-72(Tumor-associated glycoprotein-72, 이하'TAG-72'라 약칭함)는 일종의 뮤신(mucin) 단백질로서, 대장암, 위암, 이자암, 유방암, 난소암 등의 광범위한 인간 암종(human carcinomas)에서 발현되는 암특이 항원이다.

TAG-72에 특이한 항체로서는 1980년대 초 미국 NIH 국립 암 연구소(NIH National Cancer Institute)의 제퍼리 쉬롬 박사(Dr. Jeffrey Schlom) 그룹에 의하여 사람 유방암 조직의 막분획을 면역원으로 사용하여 제조한 B72.3 생쥐 단일클론항체가 처음으로 보고되었다(Colcher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3199, 1981). 그 후 B72.3보다 항원결합 친화도가 높은 2세대 항체인 CC49과 CC83 등이 동 연구그룹에서 개발되었다(Muraro et al., Cancer Res. 48: 4588, 1988년).

CC49이나 CC83는 80% 이상의 대장암과 약 50%의 유방암에 결합하나 정상조직에는 거의 결합하지 않았다. 또한¹³¹I로 표지된 CC49나 CC83를 암환자를 대상으로 생체내 검출(in vivoimaging)한 결과 원발성 암과 전이된 암을 검출하였다(Divgi et al., Nucl. Med. Biol. 21: 9, 1994년).

그러나, 생쥐 단일클론항체는 인체에 반복 투여하였을 경우 인체의 면역반응을 유발하여 부작용이 생기거나 치료효과가 감소된다. 따라서 이러한 면역반응을 최소한으로 줄이기 위하여 생쥐 항체의 항원결합부위인 CDRs과 항원결합 친화도를 높여주기 위하여 FRs의 몇 아미노산 잔기들을 인간 항체에 이식시킨 인간화 항체들을 제조하여 왔다(Owens and Young, Journal of Immunological Methods 168: 149, 1994). 실제로 이러한 인간화 항체들을 환자에게 반복 투여할 경우 인체면역반응이 많이 감소됨이 보고되었다(Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 2663, 1991년). 그러나, 인간화 항체라 하더라도 생쥐 유래의 아미노산 잔기들이 사람에게 면역반응을 유발시킬 가능성은 여전히 존재한다.

TAG-72에 대한 CC49 생쥐항체의 인간화 항체(HuCC49)도 카시미리 등에 의하여 제조되었다(Kashmiri et al., Hybridoma 14: 461, 1995). 그러나 이 CC49 인간화 항체도 인체면역반응을 유발시킴이 간접적으로 조사되었다 (Makoto et al., manuscript in preparation). 따라서, 이러한 단점을 보완하기 위하여 가능한 한 최소의 생쥐유래의 아미노산 잔기를 가지며 항원결합 친화도를 유지하는 인간화 항체를 개발할 필요성이 대두되었다.

이에 본 발명자들은 상기 HuCC49 인간화 항체보다 생쥐유래의 CDRs 및 FRs 아미노산 잔기들이 많이 감소된 인간화 항체를 제조하기 위하여, TAG-72에 대한 생쥐항체의 CDRs 및 FRs 서열과 가장 유사한 사람 유전자를 검색하고 이를 대상으로 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 제조한 후 이들을 발현벡터에 클로닝하여 숙주세포를 형질전환한 다음 이를 배양하여 인간화 항체를 얻고, 상기 인간화 항체가 기존의 인간화 항체보다 CDRs 및 FRs의 아미노산 잔기가 더 인간화되었음에도 불구하고 항원결합능은 기존의 인간화 항체와 유사한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 TAG-72에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐유래의 CDRs 및 FRs 아미노산 잔기들이 많이 감소되어 인체면역반응을 유발시킬 가능성은 훨씬 적으면서도 항원 결합능을 유지하고 있는, TAG-72에 대한 새로운 인간화 항체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

도 1은 암 특이항원 TAG-72에 대한 생쥐 단일클론 항체 및 인간화 항체 경쇄의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이고,

도 2는 암 특이항원 TAG-72에 대한 생쥐 단일클론 항체 및 인간화 항체 중쇄의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이고,

도 3은 본 발명의 인간화 항체 유전자를 포함하는 발현벡터 pC3-Q-HzCC49Fab을 작제하는 과정을 나타낸 것이고,

도 4는 pCMV-dhfr과 pcDNA3을 이용하여 두 개의 발현 단위(expression unit)를 갖는 발현벡터 pdCMV-dhfr을 제조하는 과정을 나타낸 것이고,

도 5는 pdCMV-dhfr-AKT/HzK의 구조를 나타낸 것이고,

도 6은 박테리오파아지 표면 geneⅢ단백질과 결합하여 발현된 본 발명의 인간화 항체 HzCC49Fab-1과 HzCC49Fab-2의 항원결합능을 기존의 키메라항체 cCC83 Fab항체와 비교하여 나타낸 것이고,

도 7은 본 발명의 인간화 항체 AKA/DPK24, AKT/HzK, AKA/HzK 및 RTA/HzK의 항원결합능을 경쟁적 엘리자(ELISA)를 통하여 나타낸 것이다.

본 발명은 TAG-72에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐유래의 CDRs 및 FRs 아미노산 잔기들이 많이 감소된 인간화 항체 및 이의 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다.

또한 본 발명은 TAG-72에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐유래의 CDRs 및 FRs 아미노산 잔기들이 많이 감소된 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 제공한다.

아울러 본 발명은 상기 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 TAG-72에 대한 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 배양하여 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체를 제조하기 위하여, 우선 TAG-72에 대한 생쥐 단일클론항체의 CDRs 및 FRs 서열과 가장 유사한 사람 유전자를 검색한다.

진뱅크 데이터 베이스(GenBank data base)로부터 사람의 유전자를 선별한 결과 사람 면역글로불린 카파(κ)쇄의 가변영역 생식세포주(germline) 유전자 DPK24와 Jk4가 생쥐항체 CC49 경쇄의 가변영역 유전자와 가장 유사한 유전자이고, 사람면역글로불린 중쇄의 가변영역 생식세포주 유전자 DP25가 생쥐항체 CC49 중쇄의 가변영역 유전자와 가장 유사한 유전자임을 확인하였다.

따라서 상기 유전자를 대상으로 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 제조한다. 구체적으로 인간화 항체의 경쇄 유전자를 제조하기 위하여, DPK24 및 Jk4와 사람경쇄 불변영역유전자 Cκ를 재조합시킨 유전자 (DPK24-hCκ)를 주형으로 하여 서열 1과 서열 2, 서열 3과 서열 4, 그리고 서열 5와 서열 6의 시발체를 각각 이용하여 PCR을 수행한다. 상기 3개의 PCR 산물을 다시 주형으로 하여 서열 1과 서열 6의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행함으로 약 700bp 의 인간화 경쇄 유전자를 얻어 HzCC49 인간화경쇄로 명명하였다.

구체적으로 서열 1의 시발체는 제한효소 SacI의 인식서열 (GAGCTC)을 갖고 있으며, 서열 6 의 시발체는 hCκ의 3'-말단에 상보적인 뉴크레오타이드 서열을 갖고 있고 또한 XbaI의 인식서열(TCTAGA)을 갖고 있다.

상기와 같이 제조된 HzCC49 인간화경쇄는 기존의 HuCC49 인간화 항체 경쇄의 7 개의 생쥐 FRs 아미노산 잔기와 CDR1 및 CDR2를 사람항체 경쇄가변영역 DPK24와 Jk4의 것으로 치환한 것이다(도 1 참조).

또한 인간화 항체의 중쇄 유전자를 제조하기 위하여, 사람항체 가변영역유전자 DP25과 사람중쇄불변영역유전자 Cγ1를 재조합시킨 유전자(DP25-hCγ1)를 주형으로 하여 서열 7과 서열 8, 서열 9와 서열 10, 서열 11과 서열 12, 서열 13과 서열 14, 그리고 서열 15와 서열 16의 시발체를 각각 이용하여 PCR을 수행한다. 상기5개의 PCR 산물을 다시 주형으로 하여 서열 7과 서열 16의 시발체를 이용하여 재조합PCR을 수행함으로 약 700bp 의 인간화 중쇄 Fd(가변영역 + CH1 도메인) 유전자를 얻어 HzCC49Fd-1로 명명하였다.

본 발명에서는 상기 인간화중쇄 HzCC49Fd-1에서 생쥐유래의 71, 93번 (Kabat number) 아미노산 잔기를 더 인간화시키기 위하여 71번의 알라닌(alanine)과 93번의 트레오닌(threonine)을 각각 아르기닌(arginine)과 알라닌으로 치환시킨다.

우선 93번 잔기를 치환하기 위하여 HzCC49Fd-1을 주형으로 하여 서열 7과 서열 17 및 서열 18과 서열 16의 시발체를 각각 이용하여 PCR을 수행한다. 상기 2개의 PCR 산물을 다시 주형으로 하여 서열 7과 서열 16의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행하여 약 700bp 의 인간화 중쇄 Fd유전자를 얻는다. 이에 더하여 71번 잔기를 치환하기 위하여 상기에서 분리한 약 700bp 의 인간화 중쇄 Fd유전자를 다시 주형으로 하여 서열 7과 서열 19 그리고 서열 20과 서열 16의 시발체를 각각 이용하여 PCR을 수행한다. 상기 2개의 PCR 산물을 다시 주형으로 하여 서열 7과 서열 16의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행하여 약 700bp 의 인간화 중쇄 Fd유전자를 얻어 HzCC49Fd-2로 명명하였다.

상기 서열 7의 시발체는 제한효소 XhoI의 인식서열을 갖고 있고, 서열 16의 시발체는 hCγ1의 CH1 도메인의 3'-말단에 상보적인 뉴크레오타이드 서열을 갖고 있으며, XbaI의 인식서열(ACTAGT)을 갖고있다.

상기와 같이 제조된 HzCC49Fd-1 인간화 중쇄의 가변영역은 기존의 HuCC49 인간화 항체 중쇄의 11 개의 생쥐 FRs 아미노산 잔기와 4개의 생쥐 CDRs 아미노산 잔기를 사람항체 DP25 중쇄의 것으로 치환한 것이고, HzCC49Fd-2 인간화 중쇄의 가변영역은 기존의 HuCC49 인간화 항체 중쇄의 13 개의 생쥐 FRs 아미노산 잔기와 4개의 생쥐 CDRs 아미노산 잔기를 사람항체 DP25 중쇄의 것으로 치환한 것이다(도 2 참조).

한편 본 발명은 상기와 같이 제조된 인간화 중쇄 HzCC49Fd-1의 아미노산 잔기를 보다 인간화시킨 중쇄 유전자를 제공한다. HzCC49Fd-1는 71, 73, 93번 잔기가 각각 알라닌(alanine), 라이신(lysine), 트레오닌(threonine)인 반면, 인간항체의 중쇄 가변영역 유전자 DP25는 각각 아르기닌(arginine), 트레오닌, 알라닌이다. 본 발명의 방법에 따라 HzCC49Fd-1의 71, 73, 93번 위치의 세 아미노산 잔기 중 한 개, 두 개, 또는 세 개의 아미노산 서열을 인간 중쇄 DP25의 아미노산으로 치환한 인간화 항체를 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서는 상기 71, 73, 93번 위치에 알라닌-라이신-트레오닌(AKT)을 갖는 인간화 중쇄유전자로부터 알라닌-라이신-알라닌(AKA) 잔기를 갖는 인간화 중쇄유전자를 제조하고, 또는 아르기닌-라이신-트레오닌(RKT)을 갖는 인간화 중쇄유전자로부터 아르기닌-트레오닌-알라닌(RTA) 잔기를 갖는 인간화 중쇄유전자를 제조한다.

또한 본 발명은 TAG-72에 대한 인간화 항체의 상기 경쇄 및 중쇄 Fd 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 배양하여 TAG-72에 대한 인간화 항체 Fab를 제조하는 방법을 제공한다.

TAG-72에 대한 인간화 항체 Fab를 제조하기 위하여, 우선 본 발명에서는 상기 인간화 Fab 항체의 경쇄 및 중쇄유전자를 포함하는 발현벡터를 작제한다.

구체적으로, 목적하는 항체의 Fab을 박테리오파아지의 geneⅢ 단백질과 융합된 형태로 발현하게 하는 플라스미드인 pComb3HSS에서 geneⅢ 단백질과 융합되어 발현될 중쇄의 첫번째 아미노산인 글루타민을 유지시켜 주기 위하여 XhoI 위치의 앞에 있는 아미노산 서열 EVQL(글루탐산-발린-글루타민-루이신)을 QVQL(글루타민-발린-글루타민-루이신)로 변형시켜 pComb3HSS-Q를 제조한 다음, SacI과 XbaI 위치에 HzCC49 경쇄 유전자를 클로닝하고 XhoI과 SpeI 위치에 HzCC49Fd-1이나 HzCC49Fd-2 중쇄 유전자를 클로닝하여 인간화 항체 HzCC49Fab-1과 HzCC49Fab-2의 발현 플라스미드를 각각 제조하고 이를 pC3-Q-HzCC49Fab-1과 pC3-Q-HzCC49Fab-2라 각각 명명하였다(도 3 참조). 상기 발현벡터 pC3-Q-HzCC49Fab-2로 대장균(E. coli) XL1-blue 균주를 형질전환하여 대장균 형질전환체를 제조하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 6월 3일자로 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0487BP).

본 발명의 인간화 항체를 박테리오파아지의 표면 geneⅢ 단백질에 융합시킨 형태로 발현시키기 위하여, 상기 대장균 형질전환체를 배양하고 여기에 헬퍼파아지(Helper phage)를 첨가하여 함께 배양함으로써 대장균 형질전환체를 헬퍼파아지로 감염하고 대장균 세포로부터 만들어진 본 발명의 인간화 항체 HzCC49Fab을 발현하는 박테리오파아지를 분리한다.

구체적으로 본 발명에서는 헬퍼파아지로 VCS M13을 이용하여 VCS M13 표면에노출된 HzCC49Fab 인간화 항체를 제조하였다.

또한 본 발명에서는 HzCC49 Fab항체를 geneⅢ와 융합되지 않은 분리된(soluble) Fab 형태로 발현시키기 위하여, 상기 발현벡터 pC3-Q-HzCC49Fab-1이나 pC3-Q-HzCC49Fab-2를 SpeI-NheI으로 절단하고 다시 연결하여 geneⅢ를 제거하였다. 이 분리된(soluble) Fab의 발현벡터를 각각 pC3-Q-HzCC49Fab-1-dgⅢ와 pC3-Q-HzCC49Fab-2-dgⅢ라 명명하고E.coliXL1-blue 균주에 도입하여 대장균 형질전환체를 만들었다.

상기 형질전환체를 IPTG가 첨가된 배양에서 배양한 다음 세포를 원심분리한 후 페리플라슴 추출물(periplasmic extract)의 상등액을 회수하여 분리된(soluble) Fab을 제조하였다.

한편, 인간화 항체의 Fab 절편이 아닌 온전한 형태의 인간화 항체를 발현하기 위한 발현벡터로 pdCMV-dhfr을 제공한다. 상기 발현벡터 pdCMV-dhfr은 본 발명자들이 포유동물세포에서 단백질을 발현시키기 위해 개발한 발현벡터 pCMV-dhfr(KCTC 8671P : 특허등록 제162021호)과 pcDNA3(Invitrogen사)을 이용하여 제조된다. pCMV-dhfr은 하나의 외부 유전자만을 발현시킬 수 있으므로 항체발현을 위해서는 중쇄 또는 경쇄의 발현벡터를 별도로 제작한 후 두 발현벡터를 동물세포에서 공형질감염(cotransfection)시켜 주어야 한다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 두 개의 발현단위(expression unit)를 갖는 발현벡터 pdCMV-dhfr를 제조하였다.

구체적으로, 우선 pcDNA3을 이용하여 멀티클로닝 위치가 다른 두 개의 발현단위를 갖는 벡터 pcDCM을 제조하고(도 4a 참조), pCMV-dhfr로부터 dhfr 발현단위를 분리하여 pcDCM의 PvuI-NruI위치에 클로닝하여 pcDCM-dhfr을 제조한 다음, 멀티클로닝 위치의 ApaI위치를 제거하여 pdCMV-dhfr을 제조한다(도 4b 참조). ApaI위치를 제거한 이유는 항체의 중쇄 가변영역 바로 뒤에 ApaI 위치가 존재하여 중쇄 가변영역만을 치환시키기가 적합하게 되어 있는데, ApaI 위치가 벡터내에 존재하면 가변영역 바로 뒤의 ApaI 위치를 이용할 수 없기 때문이다.

이상과 같이 제조된 pdCMV-dhfr에 절편이 아닌 온전한 형태의 인간화 항체의 중쇄 유전자를 클로닝하여 각각의 발현 플라스미드를 pdCMV-dhfr-AKT, pdCMV-dhfr-AKA 및 pdCMV-dhfr-RTA로 명명하였다.

또한 온전한 형태의 인간화 항체의 제조에 필요한 인간화 경쇄 유전자를 제조하기 위해 pC3-Q-HzCC49Fab-1을 주형으로 한 PCR을 수행하여 인간화 경쇄 DNA를 합성하고, CC83항체 경쇄의 신호서열(signal sequence)이 들어있는 pcCC83κ를 주형으로 한 PCR을 통해 신호서열의 DNA를 합성한 후, 재조합 PCR을 수행하여 경쇄 가변영역 앞에 항체 경쇄의 신호서열이 연결된 750bp의 DNA를 pdCMV-dhfr의 HindⅢ/XbaI 위치에 삽입하여 pdCMV-dhfr-HzCC49K를 제조한다.

이와 같이 제조된 인간화 경쇄와 DPK24의 아미노산 서열은 CDR3의 93번 아미노산만이 차이가 있는데, 인간화 경쇄는 93번째 아미노산이 세린(serine)이고 DPK24는 아스파라긴(asparagine)이다. 이 세린을 아스파라긴으로 바꾸어 완전한 인간 경쇄를 만들기 위해 pdCMV-dhfr-HzK를 주형으로 서열 34와 서열 36의 시발체를 이용한 PCR을 통해 얻어진 DNA와 서열 37과 서열 33의 시발체를 이용하여 PCR을 한 DNA 단편을 재조합 PCR하였다. 이후 생성된 750bp의 DNA를 pdCMV-dhfr 벡터의 HindⅢ/XbaI 위치에 삽입하여 pdCMV-dhfr-DPK24를 제조한다.

상기 pdCMV-dhfr-HzCC49K로부터 인간화 경쇄가 들어 있는 DNA절편을 분리하여 pdCMV-dhfr-AKT에 삽입시켜 얻은 플라스미드를 pdCMV-dhfr-AKT/HzK로 명명하였다(도 5 참조).

또한 pdCMV-dhfr-HzCC49K로부터 인간화 경쇄가 들어 있는 DNA절편을 분리하여 pdCMV-dhfr-AKA에 삽입시켜 얻은 플라스미드를 pdCMV-dhfr-AKA/HzK라 명명하였다.

pdCMV-dhfr-HzCC49K로부터 인간화 경쇄가 들어 있는 DNA절편을 분리하여 pdCMV-dhfr-RTA에 삽입시켜 얻은 플라스미드를 pdCMV-dhfr-RTA/HzK라 명명하고 이를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 5월 30일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0623BP).

또한 pdCMV-dhfr-DPK24로부터 인간화 경쇄 DPK24가 들어 있는 DNA 절편을 분리하여 pdCMV-dhfr-AKA에 삽입하여 얻은 플라스미드를 pdCMV-dhfr-AKA/DPK24로 명명하고 이를 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 5월 30일자로 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 0624BP).

본 발명 HzCC49 Fab항체의 항원결합능을 조사하기 위하여, 항체의 표적항원인 BSM (Bopvine submaxillary mucin)을 엘리자-웰 플레이트(ELISA-well plate)에고정시키고 파아지-결합 Fab(phage-displayed Fab)을 각 웰에 첨가하여 반응시킨 후 항원-항체 특이반응 정도를 측정하였다.

그 결과 HzCC49Fab-1파아지, HzCC49Fab-2파아지, cCC83Fab-파아지의 항원결합능은 거의 동일하게 나타났으며(도 6 참조), 이들의 분리된(soluble) Fab도 항원결합능을 보유한 것으로 나타났다(표 1 참조).

또한 온전히 인간화된 항체의 항원결합능을 측정해 본 결과, AKT/HzK, AKA/HzK, RTA/HzK, AKA/DPK24 인간화 항체들간에 항원결합능은 차이가 거의 없음을 알 수 있다(도 7 참조). 이러한 결과로부터 인간화 중쇄의 경우 93번 위치의 아미노산 잔기를 사람의 것으로 바꾼 AKA, 71, 73, 93번 위치의 아미노산 잔기를 모두 인간의 것으로 바꾼 RTA 모두 AKT대신 사용하여도 결합도에 문제가 없음을 예측할 수 있다. 또한, 인간화 경쇄 HzK 대신 인간 경쇄 DPK24를 사용하여도 그 친화도에 별 차이가 없어 인간화 경쇄 대신 인간경쇄를 사용하여도 문제가 없음을 알 수 있다.

이하 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

하기 실시예는 본 발명은 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 발현벡터 pdCMV-dhfr의 제조

경쇄와 중쇄를 하나의 벡터로 발현시킬 수 있는 두 개의 발현단위(expression unit)를 갖는 발현벡터 pdCMV-dhfr를 pCMV-dhfr과 pcDNA3(Invitrogen사 제품)을 이용하여 제조하였다. 발현벡터 pCMV-dhfr(KCTC 8671P; 특허등록 제162021 호)은 본 발명자가 포유동물세포에서 단백질을 발현시키기 위하여 개발한 것으로, 이 발현벡터는 한 개의 외부 유전자만을 발현시킬 수 있으므로 항체의 발현을 위해서는 항체의 중쇄 혹은 경쇄의 발현벡터를 별도로 제작한 후 두 발현벡터를 동물세포에 공형질감염(cotransfection) 시켜주어야 한다. 따라서 pCMV-dhfr과 pcDNA3(Invitrogen사 제품)을 이용하여 경쇄와 중쇄 유전자를 하나의 벡터로 발현시킬 수 있도록 하였다.

우선 pcDNA3를 이용하여 멀티클로닝 위치(multicloning site)가 다른 두 개의 발현단위(expression unit)를 갖는 벡터 pcDCM을 제조하였고, pCMV-dhfr으로부터 dhfr 발현단위를 분리하여 pcDCM의 PvuI-NruI 위치에 클로닝시켜 pcDCM-dhfr을 제조하였다. 이 후 멀티클로닝 위치의 ApaI 부위를 제거하여 pdCMV-dhfr을 제조하였다.

이를 구체적으로 살펴보면, 우선 pcDNA3를 HindⅢ와 BamHⅠ으로 절단하고 클리노우(Klenow) 효소로 처리하여 평활말단(blunt-end)을 만든 후 라이게이션시켰다. 이를 다시 제한효소 XhoⅠ과 ApaⅠ으로 처리하고 같은 과정을 반복하였다. 얻어진 플라스미드를 BsmⅠ으로 처리하여 5400bp의 선형화(linearize)하였다. 한편 pcDNA3를 제한효소 BstxⅠ과 NotⅠ으로 절단하고 T4 DNA 폴리머라제로 평활말단을 만든 후 라이게이션시켰다. 다시 PvuⅡ로 절단하여 3234bp의 절편을 순수분리하고 이를 NruⅠ으로 절단하여 1080bp의 DNA 절편을 분리하였다. 이상의 과정을 통해 얻어진 5400bp의 DNA 절편과 1080bp의 DNA 절편을 접합시켜 발현벡터 pcDCM을 작제하였다(도 4a참조).

pcDCM-dhfr은 pcDCM의 PvuI-NruI 위치에 pCMV-dhfr의 dhfr 발현단위를 포함하는 1960 bp의 PvuI-NruI DNA 절편을 삽입함으로써 제조하였다. pcDCM-dhfr의 DNA를 ApaI으로 절단하고 평활말단(blunt-end)으로 만든 후 다시 라이게이션시켜 최종적으로 pdCMV-dhfr로 만들었다(도 4b 참조). 이 ApaI 부위를 제거한 것은 인간화 항체의 중쇄의 가변영역 바로 뒤에 ApaI 부위가 존재하여 중쇄 가변영역만을 치환시키기가 적합하게 되어있는 데, ApaI 부위가 벡터에 존재하면 ApaI 부위를 이용할 수 없기 때문이다.

실제로 인간화중쇄의 발현 플라스미드를 제조할 때에, 먼저 인간화중쇄 AKT를 pdCMV-dhfr의 EcoRI-NotI 위치에 클로닝하여 pdCMV-dhfr-AKT를 제조한 후, 다른 중쇄 AKA나 RTA의 발현 플라스미드를 제조하기 위하여 pdCMV-dhfr-AKT의 EcoRI-ApaI 부위에 AKA나 RTA의 가변영역서열을 갖는 EcoRI-ApaI DNA 절편만을 서브클로닝하였다.

<실시예 2> 인간화 경쇄 유전자의 제조

(2-1) HzCC49Fab의 경쇄 유전자의 제조

생쥐항체 CC49의 경쇄 가변영역의 인간화를 위하여, 우선 CC49 경쇄의 가변영역 유전자와 그 서열이 가장 유사한 사람의 경쇄유전자를 선별하였다. 진뱅크 데이터 베이스(GenBank data base)로부터 사람의 유전자를 선별한 결과 면역글로불린 카파쇄의 가변영역유전자 DPK24가 생쥐항체 CC49 경쇄의 가변영역 유전자와 가장 유사한 유전자임을 확인하였다(도 1 참조).

DPK24 유전자와 인간 면역글로불린 불변영역유전자 Cκ를 재조합시킨 유전자(DPK24-hCκ)를 합성하여 이를 주형으로 사용하여 재조합 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행함으로써 인간화경쇄 가변영역 유전자를 제조하였다.

상기 PCR은 서열 1과 서열 2, 서열 3과 서열 4, 그리고 서열 5와 서열 6의 시발체를 각각 이용하여 94℃에서 1분간 변성시키고 54℃에서 1분간 접합시키며 72℃에서 2분간 태그-중합효소(Tag-polymerase; 베링거-만하임사)로 중합반응을 30회 반복 수행하였다. 이하에서 PCR은 모두 상기와 동일한 조건에서 수행하였다.

서열 1의 시발체는 제한효소 SacI의 인식서열 (GAGCTC)을 갖고 있고, 서열 6 의 시발체는 hCκ의 3'-말단에 상보적인 뉴크레오타이드 서열을 갖고 있으며 XbaI의 인식서열(TCTAGA)을 갖고 있다.

상기 과정으로 분리한 3개의 PCR 산물을 섞고 다시 서열 1 및 서열 6의 시발체로 PCR을 수행하여 약 700bp인 인간화 항체 Fab의 경쇄유전자를 합성하였다.

상기와 같이 제조된 HzCC49 인간화 경쇄는 기존의 HuCC49 인간화 항체의 경쇄의 7개의 생쥐 FRs 아미노산 잔기와 CDR1 및 CDR2를 사람 항체 경쇄가변영역의 DPK24 와 Jk4의 것으로 치환한 것이다.

(2-2) 온전한 인간화 항체의 경쇄 유전자 HzCC49K의 제조

동물세포에서 발현하기 위하여 필요한 카파쇄의 신호서열(signal sequence)을 (2-1)에서 제조한 인간화경쇄의 앞부분에 재조합 PCR에 의하여 융합시킨 후 pdCMV-dhfr 벡터의 HindⅢ/XbaI 위치에 삽입하였다.

구체적으로 설명하면, pC3-Q-HzCC49Fab-1을 주형으로 하고 서열 32와 서열 33을 시발체로 사용하여 PCR을 수행하여 인간화경쇄의 DNA를 합성하였다. CC83항체 경쇄의 신호서열이 들어있는 pcCC83κ을 주형으로 하여 서열 34와 서열 35의 시발체를 사용하여 PCR을 수행하여 신호서열의 DNA를 합성한 후, 상기에서 얻어진 두 DNA 절편을 다시 서열 34와 서열 33의 시발체를 사용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 그 결과 생성된 750 bp의 DNA 절편을 회수하여 제한효소 HindⅢ와 XbaI으로 절단한 후 pdCMV-dhfr 벡터의 HindⅢ/XbaI 위치에 삽입하였다. 이상과 같이 제조된 플라스미드를 pdCMV-dhfr-HzCC49K라 명명하였다

(2-3) 인간 경쇄 유전자 DPK24의 제조

상기와 같이 제조된 인간화 경쇄와 인간 경쇄 가변영역 생식세포주 유전자의 산물인 DPK24의 아미노산 서열은 CDR3의 93번 아미노산만이 차이가 있는데, 인간화 경쇄는 93번째 아미노산이 세린(serine)이고 DPK24는 아스파라긴(asparagine)이다. 이 세린을 아스파라긴으로 바꾸어 완전한 인간 경쇄 항체를 만들기 위해 pdCMV-dhfr-HzK를 주형으로 서열 34와 서열 36의 시발체를 이용한 PCR을 통해 얻어진 DNA와 서열 37과 서열 33의 시발체를 이용하여 PCR을 한 DNA 절편을 재조합 PCR하였다. 이후 생성된 750bp의 DNA를 pdCMV-dhfr 벡터의 HindⅢ/XabI 위치에 삽입하여 플라스미드 pdCMV-dhfr-DPK24를 제조하였다.

<실시예 3> 인간화 중쇄 유전자의 제조

(3-1) 인간화 중쇄 유전자 HzCC49Fd-1의 제조

생쥐항체 CC49 중쇄 가변영역 유전자의 인간화를 위하여, 우선 CC49 중쇄의 가변영역 유전자와 그 서열이 가장 유사한 사람의 중쇄유전자를 선별하였다. 진뱅크 데이터 베이스(GenBank data base)로부터 사람의 면역글로불린 유전자를 선별한 결과 DP25가 생쥐항체 CC49 중쇄의 가변영역 유전자와 가장 유사한 유전자임을 확인하였다(도 2 참조).

따라서 본 발명자가 제조한 DP25와 사람 중쇄 불변영역유전자 Cγ1을 재조합시킨 유전자 DP25-hCγ1을 바탕으로 주형으로 사용하여 재조합 PCR을 수행함으로써 인간화 중쇄 유전자를 제조하였다.

PCR은 서열 7과 서열 8, 서열 9와 서열 10, 서열 11과 서열 12, 서열 13과 서열 14, 그리고 서열 15와 서열 16의 시발체를 각각 이용하여 94℃에서 1분간 변성시키고 54℃에서 1분간 접합시키며 72℃에서 2분간 태그-중합효소로 중합반응을 30회 반복 수행하였다.

서열 7의 시발체는 XhoI의 인식서열(GAGTCT)을 갖고 있고, 서열 16의 시발체는 hCγ1의 CH1 도메인의 3'-말단에 상보적인 뉴크레오타이드 서열을 갖고 있으며 XbaI의 인식서열(ACTAGT)을 갖고 있다.

5개의 PCR 산물을 섞고 다시 서열 7 및 서열 16의 시발체로 PCR을 수행하여 약 700bp인 인간화 항체 중쇄 유전자 HzCC49Fd-1를 합성하였다.

(3-2) 인간화 중쇄 유전자 HzCC49Fd-2의 제조

HzCC49Fd-1 인간화중쇄의 생쥐유래의 71, 93번 (Kabat number) 아미노산 잔기를 더 인간화시키기 위하여 71번의 알라닌과 93번의 트레오닌을 각각 아르기닌과 알라닌으로 치환시켰다. 우선 93번 잔기를 치환하기 위하여 HzCC49Fd-1을 주형으로 하여 서열 7과 서열 17 그리고 서열 18과 서열 16의 시발체를 각각 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 2개의 PCR 산물을 다시 주형으로 하여 서열 7과 서열 16의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행하여 약 700bp 의 인간화 중쇄 Fd유전자를 얻었다. 이에 더하여 71번 잔기를 치환하기 위하여 상기 유전자를 다시 주형으로 하여 서열 7과 서열 19 그리고 서열 20과 서열 16의 시발체를 각각 이용하여 PCR을 수행하였다. 상기 2개의 PCR 산물을 다시 주형으로 하여 서열 7과 서열 16의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행하여 약 700bp 의 인간화 중쇄 Fd유전자를 얻었다. 이 유전자를 HzCC49Fd-2로 명명하였다.

상기와 같이 제조된 HzCC49Fd-1 인간화 중쇄의 가변영역은 기존의 HuCC49 인간화 항체 중쇄의 11 개의 생쥐 FRs 아미노산 잔기와 4개의 생쥐 CDRs 아미노산 잔기를 사람항체 DP25 중쇄의 것으로 치환한 것이고, HzCC49Fd-2 인간화 중쇄의 가변영역은 기존의 HuCC49 인간화 항체 중쇄의 13 개의 생쥐 FRs 아미노산 잔기와 4개의 생쥐 CDRs 아미노산 잔기를 사람항체 DP25 중쇄의 것으로 치환한 것이다(도 2참조).

(3-3) 인간화 중쇄 유전자 AKT의 제조

HzCC49Fd-1 유전자는 상기 인간화 중쇄에서 71번, 73번, 93번 위치에 AKT(알라닌-라이신-트레오닌) 아미노산 잔기들을 갖지만 중쇄의 신호서열을 박테리아 유전자의 것으로 사용하였고 불변영역도 CH1 도메인까지만 있었으므로, 불변영역까지 다 가지고 있는 인간화 중쇄를 동물세포에서 발현시키기 위해 완전한 형태의 인간화중쇄 유전자 (항체유전자의 신호서열/HzCC49Fd-1의 가변영역/인간항체 불변영역)를 재조합 PCR 방법으로 합성하였다.

우선, 완전한 형태의 중쇄유전자를 갖고 있는 pcCC83Hur1을 주형으로 하고 서열 21와 서열 22의 시발체를 사용하여 PCR을 수행하고, 그 결과 생성된 1,420 bp의 DNA 절편을 회수하여 제한효소 EcoRI과 NotI으로 절단한 후 pdCMV-dhfr 벡터의 EcoRI/NotI 위치에 삽입하여 플라스미드 pdCMV-dhfr-cCC83H를 제조하였다. 이 플라스미드의 가변영역을 AKT 인간화 중쇄의 것으로 치환해주기 위하여, pC3-Q-HzCC49Fab-1을 주형으로하고 서열 23과 서열 24의 시발체를 사용하여 PCR을 수행하여 가변영역의 DNA를 합성하고, CC83항체의 신호서열이 들어있는 pdCMV-dhfr-cCC83H를 주형으로 서열 21과 서열 25의 시발체를 사용하여 PCR을 수행하여 신호서열의 DNA를 합성하였다. 이와 같이 하여 얻어진 두 DNA 절편을 다시 서열 21과 서열 24의 시발체를 사용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 그 결과 생성된 446bp의 DNA 절편을 회수하여 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 pdCMV-dhfr-cCC83H의EcoRI/ApaI 위치에 삽입하였다. 상기와 같은 방법으로 제조된 플라스미드를 pdCMV-dhfr-AKT라 명명하였다.

(3-4) 인간화 중쇄 유전자 AKA의 제조

상기 AKT의 인간화 중쇄의 93번 아미노산 잔기 트레오닌을 알라닌으로 치환시킨 인간화 중쇄 AKA(알라닌-라이신-알라닌)를 제조하기 위하여, 상기 pdCMV-dhfr-AKT를 주형으로 하고 서열 21과 서열 26의 시발체를 이용하여 PCR을 한 DNA 절편과 서열 27과 서열 24의 시발체를 이용하여 PCR을 한 DNA 절편을 다시 서열 21과 서열 24의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 그 결과 생성된 446 bp의 DNA 절편을 회수하여 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 pdCMV-dhfr-AKT의 EcoRI/ApaI 위치에 삽입하였다. 이상과 같이 제조된 플라스미드를 pdCMV-dhfr-AKA라 명명하였다.

(3-5) 인간화 중쇄 유전자 RTA의 제조

상기 HzCC49Fd-2는 71번, 73번, 93번 위치에 RKA(아르기닌-라이신-알라닌)을 갖는 인간화 중쇄 Fd이다. 이 인간화 중쇄의 73번 아미노산 잔기 라이신을 트레오닌으로 치환하여 RTA 인간화 중쇄를 제조하기 위하여, pC3-Q-HzCC49Fab-2을 주형으로 하고 서열 28과 서열 29의 시발체를 이용하여 PCR을 통해 DNA 절편을 얻었다. 다음으로 서열 30과 서열 31의 시발체를 이용하여 PCR을 통해 DNA 절편을 얻었다. 상기 두 DNA 절편을 서열 28와 서열 31의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행하여 RTA 중쇄 가변영역의 DNA를 합성하였다. 이 가변영역에 항체 중쇄의 신호서열을 붙이기 위하여, pdCMV-dhfr-AKT를 주형으로하고 서열 21과 서열 25의 시발체를 사용하여 PCR을 통해 신호서열의 DNA를 합성하고, 위 RTA 가변영역의 DNA 절편을 주형으로 하여 서열 23과 서열 24의 시발체를 이용하여 PCR을 수행한 후, 위 두 합성된 DNA를 혼합하여 다시 서열 21과 서열 24의 시발체를 사용하여 재조합 PCR을 수행하였다. 그 결과 생성된 446 bp의 DNA 절편을 회수하여 제한효소 EcoRI과 ApaI으로 절단한 후 pdCMV-dhfr-AKT의 EcoRI/ApaI 위치에 삽입하였다. 이상과 같이 제조된 플라스미드를 pdCMV-dhfr-RTA라 명명하였다.

<실시예 4> 인간화 Fab 항체를 발현하는 발현벡터의 제조

(4-1) pC3-Q-HzCC49Fab-1과 pC3-Q-HzCC49Fab-2의 제조

상기 실시예 (2-1) 및 실시예 (3-1), (3-2)에서 제조한 인간화 경쇄 가변영역 유전자와 인간화 중쇄 Fd 유전자를 발현하기 위하여, 우선 상기 유전자들을 pComb3HSS(미국 Scripps 연구소)에 클로닝하였다.

인간화 항체 Fab의 양성대조구(positive control)로는 CC49와 동일한 특이성을 가지며 항원 결합친화도가 CC49보다 약 1.5 배 높은 것으로 보고된 키메라(chimeric) CC83 (cCC83) Fab (미국 NCI; Kuroki 등 Cancer Research 50, 4872-4879, 1990)를 사용하였다.

pComb3HSS 는 도 3에 나타난 바와 같이 목적하는 단백질을 geneⅢ와 융합된 단백질의 형태로 발현하게 하는 플라스미드로서, 본 발명에서는 geneⅢ와 융합되어발현될 중쇄의 첫번째 아미노산인 글루타민을 유지시켜 주기 위하여 pComb3HSS 의 XhoI 위치 앞에 있는 아미노산 서열 EVQL(글루탐산-발린-글루타민-라이신)을 QVQL(글루타민-발린-글루타민-라이신)로 변형시켜 pComb3HSS-Q를 제조하였다.

그 후 pComb3HSS-Q의 SacI과 XbaI 위치에 상기 실시예 2-1에서 제조한 경쇄 유전자를 먼저 클로닝하고 다음에 XhoI과 SpeI 위치에 상기 실시예 (3-1)에서 제조한 중쇄 Fd유전자 HzCC49Fd-1을 클로닝하여 인간화 항체 HzCC49Fab-1의 발현 플라스미드를 제조하고 이를 pC3-Q-HzCC49Fab-1이라 명명하였다(도 5 참조). 상기 발현플라스미드에서 HzCC49Fd-1 대신에 실시예 3-2의 HzCC49Fd-2를 클로닝하여 인간화 항체 HzCC49Fab-2의 발현 플라스미드를 제조하고 이를 pC3-Q-HzCC49Fab-2이라 명명하였다.

동일한 방법으로 제조된 cCC83Fab의 발현 플라스미드를 pC3-Q-cCC83Fab이라 명명하였다.

상기 세 발현플라스미드와 음성대조군으로서의 pComb3HSS로 각각 대장균(E. coli) XL1-blue 균주를 형질전환하여 대장균 형질전환체를 제조하였다.

(4-2) 인간화 항체 AKT/HzK의 발현벡터 제조

pdCMV-dhfr-HzCC49K로부터 인간화경쇄가 들어있는 HindⅢ-XbaI 절편을 분리하여 상기 pdCMV-dhfr-AKT의 HindⅢ-XbaI 위치에 삽입시켜 얻은 플라스미드 DNA를 pdCMV-dhfr-AKT/HzK (제 5도)라 명명하였다.

(4-3) 인간화 항체 AKA/HzK의 발현벡터 제조

pdCMV-dhfr-HzCC49K로부터 인간화경쇄가 들어있는 HindⅢ-XbaI 절편을 분리하여 상기 pdCMV-dhfr-AKA의 HindⅢ-XbaI 위치에 삽입시켜 얻은 플라스미드 DNA를 pdCMV-dhfr-AKA/HzK라 명명하였다.

(4-4) 인간화 항체 RTA/HzK의 발현벡터 제조

pdCMV-dhfr-HzCC49K로부터 인간화경쇄가 들어있는 HindⅢ-XbaI 절편을 분리하여 상기 pdCMV-dhfr-RTA의 HindⅢ-XbaI 위치에 삽입시켜 얻은 플라스미드 DNA를 pdCMV-dhfr-RTA/HzK라 명명하였다 (기탁번호: 0623BP).

(4-5) 인간화 항체 AKA/DPK24의 발현벡터 제조

pdCMV-dhfr-DPK24로부터 인간경쇄 DPK24가 들어있는 HindⅢ-XbaI 절편을 분리하여 상기 pdCMV-dhfr-AKA의 HindⅢ-XbaI 위치에 삽입시켜 얻은 플라스미드 DNA를 pdCMV-dhfr-AKA/DPK24라 명명하였다 (기탁번호: 0624BP).

<실시예 5> 인간화 Fab 항체의 제조

(5-1) 대장균 형질전환체의 배양을 통한 인간화 Fab 항체의 생산

본 발명의 인간화 Fab 항체를 제조하기 위하여, 우선 실시예 (4-1)의 대장균 형질전환체를 배양하였다.

Fab을 박테리오파아지의 표면 geneⅢ 단백질에 융합시킨 형태로 발현시키기위하여, 상기 재조합 대장균을 20 μg/ml의 카베니실린(Carbenicillin)과 10 μg/ml의 테트라사이클린(Tetracycline)을 포함시킨 수퍼 현탁(Super Broth, SB) 배지에서 37℃로 밤새 배양하였다. 다음날 100 μl의 배양액을 10 ml의 SB에 넣어주고 37℃에서 3시간 배양하여 A₆₀₀이 0.5-1.0이 되게 한 다음 헬퍼파아지(Helper phage)인 VCS M13을 최종 농도가 10¹⁰pfu/ml 이 되도록 넣어주고, 37℃ 배양기에서 30분간 진탕없이 배양한 후 약 200 rpm 의 속도로 30분간 진탕 배양하였다.

상기 과정으로 배양한 세포를 폴리프로필렌(polypropylene) 원심분리관에 옮기고 2,500×g에서 5분간 원심한 후 25 ml SB(70 ug/ml 카나마이신(Kanamycin), 50 ug/ml 카베니실린, 10ug/ml 테트라사이클린)로 부유하였다. 이 부유액을 250 ml 플라스크로 옮겨 30℃의 진탕배양기(300 RPM) 에서 밤새 배양하였다. 다음날 배양액을 멸균된 폴리프로필렌 원심분리관(polypropylene centrifuge bottle)에 옮긴 후 9000×g, 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 새 용기(bottle)에 옮기고 1/5양의 20% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 8000/2.5M NaCl (최종 농도 4% PEG 8000/3% NaCl)을 넣어준 다음 얼음에 1시간 동안 정치하고 9000×g, 4℃에서 15분간 원심분리하였다.

상기에서 원심분리한 상층액은 버리고, 침전물(pellet)을 1 ml의 1% BSA/PBS로 부유한 후, 찌꺼기를 제거하기 위하여 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 조심스럽게 상층액을 새로운 용기에 옮겨 4℃에 보관하였다.

상기 일련의 과정을 통하여 HzCC49Fab-1, HzCC49Fab-2나 cCC83Fab을 발현하는 박테리오파아지와 pComb3HSS로부터 얻은 박테리오파아지를 생산하고 분리하였다.

또한 Fab항체가 박테리오파아지에 붙어있지 않은 분리된(soluble) Fab을 발현시키기 위하여 상기 발현플라스미드 pC3-Q-HzCC49Fab-1, pC3-Q-HzCC49Fab-2와 pC3-Q-cCC83Fab을 각각 SpeI-NheI으로 절단하고 다시 라이게이션하여 geneⅢ를 제거하였다. 이 분리된(soluble) Fab의 발현 플라스미드를 각각 pC3-Q-HzCC49Fab-1-dgⅢ, pC3-Q-HzCC49Fab-2-dgⅢ, pC3-Q-cCC83Fab-dgⅢ라 명명하고 각각E.coliXL1-blue 균주에 도입하여 대장균 형질전환체를 만들었다.

상기 대장균 형질전환체로부터 분리된(soluble) Fab를 분리하기 위하여, 하기의 방법으로 재조합 박테리아의 페리플라슴 추출액을 제조하였다.

구체적으로 재조합 박테리아 세포를 100ml SB배지에서 37℃에서 A₆₀₀이 0.5까지 배양한 후 1 mM IPTG를 첨가하고 30℃에서 밤새 배양하였다. IPTG를 첨가하기 전(유도 전)의 세포와 첨가 후(유도 후)의 세포를 각각 회수한 후 1 ml의 차가운 TES 용액 (0.2 M 트리스-HCl, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 0.5 M 수크로즈)에 다시 부유시켰다. 이 세포에 1/5 농도의 TES 5 ml를 가한 후 얼음 위에 30분간 방치한 다음 세포를 7,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 그 상등액을 회수하였다. 항 인간 F(ab')₂IgG-커플된 감마결합(anti-human F(ab')₂IgG-coupled GammaBind)을 이용한 친화 크로마토그래피를 수행하여 위 상등액으로부터 Fab를 분리하였다. 이때 10%SDS-PAGE를 수행하여 Fab이 순수분리되었음을 확인하였다.

(5-2) COS-7 세포에서의 인간화 항체의 생산

송아지 혈청이 10 % 첨가된 DMEM 배양 배지 (GIBCO사 제품)에서 37℃, 5 % 탄산가스를 유지하면서 COS-7 세포를 계대 배양하였다. 상기 세포를 100 mm 접시에 1×10⁶개 접종하고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 한편, 상기 실시예 4 에서 얻은 발현 벡터를 각각 10 ㎍씩 OPTI MEM I 800 ㎕ 로 희석하고 50 ㎕ 리포펙타민 (Lipofectamine, GIBCO사 제품)도 OPTI MEM I 800 ㎕ 로 희석한 다음 상기 혼합물들을 15 ㎖ 튜브에 혼합하여 15분 이상 실온에서 방치하였다. 혼합물을 방치하는 사이에 전날 접종해 둔 COS-7 세포를 OPTI MEM I (GIBCO사 제품)로 2회 세척하였다. 상기 DNA 와 리포펙타민 혼합물에 6.4 ㎖의 OPTI MEM I를 첨가하여 혼합하고 상기에서 세척한 COS-7 세포 위에 균일하게 부어 주었다. 이를 탄산가스 항온기에서 72시간 동안 배양하고 배양액의 상층액을 모아 초원심 여과장치 (Ultrafiltration Kit)로 농축한 다음 샌드위치 엘리자 (Sandwich ELISA) 방법을 이용하여 항체의 농도를 측정하였다. 이 때, 항-인간 항체 (anti-human IgG)의 전체를 포획 항체 (capture antibody)로 사용하고 농축한 배양액 또는 표준 용액(standard protein)을 일정농도로 첨가하여 37℃, 1시간동안 반응시킨 후 항-인간 항체 (Fc-specific)에 양고추냉이 과산화수소 (horseradish peroxidase) 효소가 결합 (conjugation)된 항체를 결합시켜 492nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 COS-7세포에서 인간화 항체들이 발현되었음을 확인하였다.

<실시예 6> 인간화 Fab 항체의 항원결합특성의 조사

(6-1) 인간화 항체 HzCC49Fab-1, HzCC49Fab-2의 항원결합능 조사

인간화 Fab 항체의 항원결합능을 시험하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조한 HzCC49Fab-1, HzCC49Fab-2 또는 cCC83Fab을 발현하는 박테리오파아지의 항원결합능을 다음과 같은 엘리자(ELISA)반응에 의하여 비교하였다. 음성대조군으로서는 pComb3HSS로부터 얻은 박테리오파아지를 사용하였다.

항체의 표적항원인 BSM (Bopvine submaxillary mucin)을 코팅 완충용액(coating buffer; 0.1 M 카보네이트, pH 8.6)에 10 ug/ml의 농도로 희석한 후, 96 엘리자-웰 플레이트(ELISA-well plate)에 각 100 ㎕를 넣어 37℃에서 1시간 코팅한후, 각 웰을 TBST(20 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 0.3 M NaCl, 0.05% 트윈 20)로 세척하고, 블라킹(blocking) 용액인 3% BSA/PBS를 200 ㎕를 넣어 37℃에서 1시간 방치하였다. 상기 블라킹(blocking) 용액을 버리고 같은 방법으로 웰을 여러번 씻어낸 후 여러 농도로 희석한 파이지-결합 Fab(phage-displayed Fab)을 100 ㎕씩 웰에 반응시킨 후 37℃에서 1시간 배양하고 씻어주었다.

여기에 1:5000으로 희석한 2차 항체인 HRP/항-M13 컨쥬게이트(conjugate)(Pharmacia사, 27-9402-01)를 200㎕씩 넣어 37℃에서 1시간 방치한 후 ABTS 기질(substrate) 용액 [ABTS(Pharmacia 사) 21ml, 30% H₂O₂36u㎕]을 200㎕ 첨가한 다음 녹색반응이 나타날 때까지 실온에 두었다가 405nm의 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이 HzCC49Fab-1파아지, HzCC49Fab-2파아지의 항원결합능은 기존의 인간화 항체를 생산하는 cCC83Fab-파아지의 항원결합능과 거의 동일하게 나타났다. 반면 pComb3HSS로부터 얻은 음성대조군의 파아지는 항원결합능이 없었다.

또한 Fab항체가 박테리오파아지에 붙어있지 않은 분리된(soluble) Fab의 항원결합능을 조사하기 위하여, 분리된 Fab을 발현하는 상기 실시예 5-1에서 제조한 재조합 박테리아의 페리플라슴 추출액으로부터 분리한 분리된(soluble) Fab의 항원결합능을 하기의 엘리자 반응을 이용하여 시험하였다.

상기의 엘리자 반응에서 파아지를 첨가하는 대신에 Fab을 첨가하고 2차 항체인 HRP/항-M13 컨쥬게이트 대신에 염소 항-사람 (Fab')₂-HRP 컨쥬게이트 (Jackson ImmunoResearch 사 제품)를 첨가하였다. 그 결과 하기 표 1에 나타난 바와 같이 HzCC49Fab-1과 HzCC49Fab-2의 soluble Fab도 항원결합능을 보유한 것으로 나타났다.

페리플라슴 추출액의 양 (㎕)	cCC83Fab	HzCC49Fab-1	HzCC49Fab-2
	유도 전	유도 후	유도 전	유도 후	유도 전	유도 후
0	0.004	0.005	0.004	0.005	0.004	0.006
12.5	0.017	0.035	0.017	0.055	0.018	0.062
25	0.018	0.112	0.019	0.105	0.019	0.115
50	0.016	0.257	0.015	0.255	0.022	0.240
100	0.017	0.428	0.017	0.456	0.016	0.474

(6-2) 인간화 항체 AKA/DPK24, AKT/HzK, AKA/HzK, RTA/HzK의 항원결합능 조사

위 4 종류의 인간화 항체의 결합능을 항원 경쟁적 ELISA 방법을 이용하여 비교하였다. 이 항체들의 표적항원으로는 BSM(Sigma사 제품)을 사용하였다. 여러 농도의 항원을 배양액에 발현되어 나온 각 인간화 항체와 섞어 37℃에서 2 시간 정치하여 항원 항체 결합의 평형상태에 이르도록 한 후, 항원(200 ng)을 미리 결합시킨 ELISA 플레이트의 각 웰에 넣어 평형상태에서 결합에 참여하지 않은 항체가 웰에 존재하는 항원에 결합하도록 한 후, 그 양을 염소의 항-인간 IgG(Fc specific)-HRP 컨쥬게이트 항체로 측정하였다.

상기 경쟁적 ELISA 의 결과를 도 7 에 나타내었다. 50% 결합에 해당하는 경쟁 항원(competing antigen)의 몰 농도(M)를 비교함으로써 상대적인 결합도를 비교할 수 있는데, 이 수치가 낮을수록 결합도가 높음을 의미한다.

도 7 에 나타난 바와 같이 AKT/HzK, AKA/HzK, RTA/HzK, AKA/DPK24 인간화 항체들 간의 항원결합 친화도의 차이는 두드러지지 않는 것으로 나타났다. 그 중에서도 AKT/HzK, AKA/HzK, AKA/DPK24 는 50% 저해시의 경쟁 항원의 몰농도가 거의 같았으며, RTA/HzK의 경우는 다른 인간화 항체에 비해 다소 결합도가 낮았으나 큰 차이는 보이지 않았다(도 7 참조). 이상의 결과를 고려할 때, 인간화중쇄의 경우의 93번 위치의 아미노산 잔기를 사람의 것으로 바꾼 AKA, 71, 73, 93번 위치의 아미노산 잔기를 모두 사람의 것으로 바꾼 RTA 모두 결합도에 문제없이 AKT 대신 사용될 수 있을 것으로 보인다. 또한, AKA/HzK 항체와 AKA/HzK 항체의 인간화경쇄 대신인간 경쇄 DPK24를 사용한 AKA/DPK24 항체의 친화도를 비교한 결과 두 항체가 유사한 친화도를 보여, 인간화 경쇄 대신 완전히 인간의 서열로만 이루어진 경쇄 DPK24를 사용하여도 친화도에 문제가 없음을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체 HzCC49는 기존의 인간화 항체 HuCC49와 항원결합능이 비슷하게 유지되는 반면 HuCC49보다 CDRs 및 FRs의 26-28 개의 아미노산 잔기가 더 인간화되어 반복사용시에도 인간 면역반응을 훨씬 덜 유발하여 항암치료에 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (18)

1. 서열 38로 표시되는 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 경쇄를 갖는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체.
2. 서열 41로 표시되는 아미노산 서열의 인간 경쇄 가변영역 생식세포주(germline) 유전자 DPK24와 Jk4를 포함하는 인간 경쇄를 갖는 암특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체.
3. 서열 39로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 갖는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체.
4. 서열 40으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 갖는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체.
5. 서열 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 갖는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체.
6. 서열 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 중쇄를 포함하는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 항체.
7. 서열 38의 아미노산 서열을 암호하는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 경쇄 유전자.
8. 서열 39의 아미노산 서열을 암호하는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 중쇄 유전자.
9. 서열 40의 아미노산 서열을 암호하는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 중쇄 유전자.
10. 서열 41의 아미노산 서열을 암호하는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간경쇄유전자.
11. 서열 42의 아미노산 서열을 암호하는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 중쇄 유전자.
12. 서열 43의 아미노산 서열을 암호하는 암 특이항원 TAG-72에 대한 인간화 중쇄 유전자.
13. 제 7 항의 인간화 항체 경쇄 유전자 및 제 8 항, 9 항, 11 항, 12 항 중에서 선택된 어느 하나의 인간화 항체 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 배양하여 TAG-72에 대한 인간화 항체를 얻는 TAG-72에 대한 인간화 항체의 제조방법.
14. 인간항체 경쇄 유전자 DPK24 및 제 8 항, 9 항, 11 항, 12 항 중에서 선택된 어느 하나의 인간화 항체 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 배양하여 TAG-72에 대한 인간화 항체를 얻는 TAG-72에 대한 인간화 항체의제조방법.
15. 제 13 항 또는 제 14 항의 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터는 pC3-Q-HzCC49Fab-1, pC3-Q-HzCC49Fab-2, pdCMV-dhfr-AKT/HzK, pdCMV-dhfr-AKA/HzK, pdCMV-dhfr-RTA/HzK(수탁번호 : KCTC 0623BP) 또는 pdCMV-dhfr-AKT/DPK24(수탁번호 : KCTC 0624BP)에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 TAG-72에 대한 인간화 항체의 제조방법.
16. 제 13 항 또는 제 14 항의 어느 한 항에 있어서, 상기에 더하여 형질전환체와 함께 헬퍼파아지를 함께 배양하여 TAG-72에 대한 인간화 항체가 박테리오파아지 표면에 노출된 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 TAG-72에 대한 인간화 항체의 제조방법.
17. 제 13 항에 있어서, 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터는 pC3-Q-HzCC49Fab-1-dgⅢ, pC3-Q-HzCC49Fab-2-dgⅢ에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 TAG-72에 대한 인간화 항체의 제조방법.
18. 발현벡터 pC3-Q-HzCC49Fab-2로 대장균(E. coli) XL1-blue 균주를 형질전환하여 얻은 형질전환체E. coliXL1-blue /pC3-Q-HzCC49Fab-2(수탁번호: KCTC 0487BP).