CN101033255A - P11与sak的融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种P11与Sak的融合蛋白及其制备方法和用途，此融合蛋白是利用重叠延伸PCR的方法将P11编码序列融合在SAk的N－端，中间以连接序列连接，获得融合基因，插入到pBV220载体上，并在宿主菌JM103中表达，并经离子交换和凝胶过滤纯化获得重组融合蛋白。P11与Sak的融合蛋白的溶栓活性高于单独的SAK，且半衰期延长、免疫原性降低，该重组蛋白可以用于制备治疗心脑血管疾病的药物，从而提高药物的溶栓效果，加上半衰期延长，减少患者的药物使用量，降低药物成本和价格。

Description

P11与SAK的融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地说涉及一种融合蛋白及制备方法和用途。

背景技术

目前心血管疾病严重影响着人类的健康，人们致力于研究各种抗栓溶栓药物，葡激酶(staphylokinase，简称SAK)作为已经上市的新型溶栓药物，具有较好的溶栓功能和安全性。天然葡激酶是金黄色葡萄球菌溶原性噬菌体合成的一种单链蛋白。葡激酶本身不具有酶活性，其可与血栓表面的纤溶酶原1∶1结合形成复合物，并进一步激活纤溶系统(Kyu-Sil Choi等，HeterotetramerBiological chemistry 2001，276(27)；25212-25221)。由于SAK激活纤溶酶原具有纤维蛋白专一性，而且对陈旧性血栓和富含血小板血栓的溶解作用比其他溶栓药物更强，因此SAK是一种具有良好应用前景的溶栓药物(Collen，D.等，J Biol Chem，1993.268：p.8284-8289.；Collen D等，Blood，1994，84：680～686.Lijnen H R等，J B iol Chem，1991，266：11826～11832)。但由于SAK属于异体蛋白，其免疫原性大大限制了它在临床的应用(Declerck P J等，Throm bH aemost，1994，71：129～133)。

P11蛋白(calpactin I，light chain)在人体内广泛存在，属于S100家族的一员(Schafer BW等，Trends Biochem Sci，1996，21(4)：134-140)，又称为S100A10。P11通常作为膜联蛋白annexin II异四聚体复合物(AIIt)的亚基调节血液纤溶系统(S.Rety等，Nat.Struct.Biol.6(1999)89-95.27.G.Kassam等，Biochemistry 37(1998)16958-16966.)，可以单独或者与annexin II以复合物的形式刺激组织型纤溶酶原活性因子(t-PA)调节纤溶酶原活性(G.Kassam等，Biochemistry 37(1998)16958-16966.；Travis J等。BIOLOGICAL CHEMISTRY，2003，278(28)：25577-25584；Hyoung-Min Kang等，TCM 1999，9(3/4)；92-102)。因此，如果将P11与SAK连接在一起，有可能产生结合两者的优点溶栓活性更好的蛋白。

发明内容

本发明目的提供一种溶栓活性高、半衰期长的融合蛋白。

本发明的另一目的提供了上述融合蛋白的制备方法。

本发明的还一个目的提供了融合蛋白在制备溶栓药物上的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

一种P11与SAK的融合蛋白，是由(a)或(b)组成的蛋白质：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代，缺失或者叠加一个或者几个氨基酸衍生的蛋白质且与(a)蛋白具有相同的功能。

上述融合蛋白在制备治疗心脑血管疾病的药物上的应用。

上述融合蛋白在制备治疗溶栓药物上的应用。

上述融合蛋白按照通常的方法，可以制成各种剂型，例如注射液、口腔崩解剂或肠溶片剂等。

上述融合蛋白的制备方法，包括利用重叠延伸PCR的方法将P11编码序列融合在SAK的N-端，中间以连接序列连接，获得融合基因；然后插入到载体上，并在宿主菌中表达，并经离子交换和凝胶过滤纯化获得重组的融合蛋白。

上述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)融合蛋白基因的克隆

首先通过重叠延伸PCR方法以P11基因为模板加入P11上游引物、连接序列引物1、连接序列引物2获得P11与连接序列相连的序列；再次通过重叠延伸PCR方法以上述序列与SAK序列为模板加入P11上游引物和SAK下游引物获得融合P11与SAK融合蛋白的DNA序列，具体所用引物序列为：

P11上游引物：5’gc gaattcatgccatctcaaatggaacacg 3’

连接序列引物1：

5’tcatcgcctttgctgccgccgccgccgctgccgccgccgccgctgccgccgccgcccttctttcccttctgcttc 3’

连接序列引物2：5’caaaataactcgcgtcatcgcctttgctgccgcc 3’

SAK下游引物：5’gc ggatcctcatttcgcacgttctataacaaccgctg 3’

电泳检测获得融合蛋白的DNA序列；

(2)原核表达质粒的构建、筛选与鉴定

将融合蛋白的DNA序列用限制性内切酶BamH I、EcoR I进行双酶切，然后通过T₄DNA连接酶与载体pBV220相连，再转入大肠杆菌DH5α中，涂平板挑取阳性克隆，进行双酶切鉴定，并进行基因测序；

(3)融合蛋白的表达及纯化

将测序正确的表达质粒转入宿主菌JM103中，42℃诱导表达4.5hr，收集菌体，超声破碎、离心，然后进行SDS-PAGE，选取pBV220-P11-SAK，阴离子交换层析柱用PB(10mM，pH 8.0)充分平衡，将存于4℃的菌体上清以0.5ml/min的速度上样，然后再以PB以0.5ml/min的速度洗柱至基线，NaCL线形梯度洗脱，即得纯化的P11与SAK的融合蛋白。

上述制备方法中表达菌株大肠杆菌JM103，E.coli DH5α和质粒pBV220都是可以公开得到的产品。

上述制备方法中所用的限制性内切酶、rTaq DNA聚合酶及T₄DNA连接酶，核酸分子量标准DL2000，DNA纯化试剂盒，凝血酶、人纤溶酶原、人纤维蛋白原、活性标准品(1000IU/ml)等都可以在市场上购得。

P11和SAK都可以按照公开的方法得到。

本发明中所述的葡激酶(SAK)具有较强的溶栓作用，而其发挥生物活性的功能域主要在C-端，为了不影响其生物活性，发明人将P11融合在SAK的N-端，两者之间以柔性的氨基酸序列(G-G-G-G-S)₃相连。融合蛋白核苷酸序列的获得首先通过重叠延伸PCR方法获得P11与连接序列(linker)相连，然后再次通过重叠延伸PCR方法融合SAK序列。

发明人研究发现P11与SAK配伍时具有增强SAK溶栓活性的功能，为此构建并制备了P11与SAK的融合蛋白。活性检测显示重组蛋白溶栓活性高于SAK，同时由于融合了人源蛋白，延长了重组蛋白的半衰期，降低了免疫原性。因此该重组蛋白有望成为一种新型有效的溶栓药物，应用于临床。

本发明所具有的优点和有益效果：(1)本发明融合蛋白的溶栓活性高；(2)本发明融合蛋白的半衰期长，从而可以减少药物的用量和次数；(3)本发明融合蛋白降低了免疫原性。

附图说明

图1重叠延伸PCR后的融合DNA序列电泳图谱

1.为融合序列

2.为核酸分子量标准

图2为P11与SAK融合蛋白的DNA序列双酶切电泳图谱

1.核苷酸分子标准(DL2000)

2.pBV220-p11SAK

3.pBV220-p11SAK双酶切

图3SDS-PAGE电泳分析融合蛋白在JM103中的表达结果

1.JM103/pBV220-P11SAK(上清)

2.JM103/pBV220-P11SAK(沉淀)

3.JM103/pBV220-P11SAK(全菌)

4.低分子量蛋白标准

图4融合蛋白的纯化结果

1.纯化结果

2.表达产物

3.低分子量蛋白标准(94000-14400)

图5融合蛋白的溶栓活性比较

1.为SAK蛋白的溶栓活性

2.为P11和SAK的融合蛋白的溶栓活性

具体实施方式

下面以实施例进一步详细说明本发明，但是不对本发明构成任何限制。

实施例1P11与SAK融合蛋白的制备

(1)融合蛋白基因的克隆

首先通过通常的重叠延伸PCR方法以P11基因为模板加入P11上游引物、连接序列引物1、连接序列引物2获得P11与连接序列相连的DNA序列；具体方法：①P11基因获得：根据GenBank(NM 002966.2)设计引物，引物序列为：

上游引物：5’gc gaattcatgccatctcaaatggaac acg 3’

下游引物：5’gc gaatccttacttctttcccttctgcttcat 3’

从人脑cDNA文库中，PCR扩增P11全长编码区，54℃退火延伸，30个循环，获得P11基因；②重叠延伸PCR方法：以P11基因为模板加入P11上游引物、连接引物1、连接引物2、55℃退火延伸，30个循环，获得P11与连接序列相连的DNA序列；

再次通过重叠延伸PCR方法以上述P11与连接序列相连的DNA序列与SAK序列为模板加入P11上游引物和SAK下游引物获得P11与SAK融合蛋白的DNA序列。具体方法：①SAK序列来自解放军军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室；②重叠延伸PCR方法：以上述P11与连接序列相连的DNA序列和SAK序列为模板搭接加入P11上游引物、SAK下游引物55℃退火延伸，30个循环，获得P11与SAK连接序列相连的DNA序列；

所用的引物(PCR引物由上海生工生物工程公司合成)为：

P11上游引物：5’gc gaattcatgccatctcaaatggaacacg 3’

连接序列引物1：

5’tcatcgcctttgctgccgccgccgccgctgccgccgccgccgctgccgccgccgcccttctttcccttctgcttc 3’

连接序列引物2：5’caaaataactcgcgtcatcgcctttgctgccgcc 3’

SAK下游引物：5’gc ggatcctcatttcgcacgttctataacaaccgctg 3’电泳检测结果显示获得P11与SAK融合蛋白的DNA序列(见图1泳道1)。

(2)原核表达质粒的构建、筛选与鉴定

将融合序列用限制性内切酶BamH I、EcoR I双酶切后用T₄DNA连接酶(限制性内切酶BamH I、EcoR I、rTaq DNA聚合酶及T₄DNA连接酶购自TaKaRa公司；)将融合序列与载体pBV220相连，转入大肠杆菌DH5α中(E.coli DH5α，质粒pBV220为中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所保存，)，涂平板挑取阳性克隆，双酶切鉴定，结果(见图2)；并送基因测序(基因测序由上海申能博彩生物科技有限公司完成)，测序结果显示确实得到SEQ ID NO：1所示的P11与SAK融合蛋白的DNA序列；

(3)融合蛋白的表达及纯化

将测序正确的表达质粒转入宿主大肠杆菌JM103中(表达菌株大肠杆菌JM103为中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所保存)，42℃诱导表达4.5hr；收集菌体，超声破碎、离心，进行SDS-PAGE；结果(见图3，)显示得到P11与SAK的融合蛋白，阴离子交换层析柱用PB(10mM，pH 8.0)充分平衡，将存于4℃的菌体上清以0.5ml/min的速度上样，之后以PB以0.5ml/min的速度洗柱至基线。NaCL线形梯度洗脱。结果(见图4，泳道1为纯化产物)表明纯化效果很好。

实施例2SAK以及P11与SAK融合蛋白的生物学活性测定

琼脂糖-纤维蛋白平板溶圈法(SAKsela O等，Anal Biochem.1981，111：276-282)：125mg琼脂糖溶于23ml生理盐水后，依次加入14μl人凝血酶、28μl人纤溶酶原、1.1ml人纤维蛋白原(人凝血酶、人纤溶酶原、人纤维蛋白原、活性标准品(1000IU/ml)购自国家生物制品检验所)，混匀后倒平板。待溶液凝固后在平板上打孔点样，每孔加样6μl，25℃放置8小时，测量溶圈直径。将SAK(SAK由中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所提供)、P11与SAK的融合蛋白分别用生理盐水稀释至1μM，分别取6ul点样。结果(见图5)显示：P11和SAK的融合蛋白具有溶栓活性，但P11与SAK的融合蛋白的溶栓活性明显高于SAK。

                            序列表

SEQ ID NO：1

<110>中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120>P11与SAK的融合蛋白及其制备方法和用途

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>717

<212>DNA

<213>Artificial

<223>P11与SAK的融合蛋白

<400>1

atgccatctc aaatggaaca cgccatggaa accatgatgt ttacatttca caaattcgct

60

ggggataaag gctacttaac aaaggagggc ctgagagtac tcatggaaaa ggagttccct

120

ggatttttgg aaaatcaaaa agaccctctg gctgtggaca aaataatgaa ggacctggac

180

cagtgtagag atggcaaagt gggcttccag agcttctttt ccctaattgc gggcctcacc

240

attgcatgca atgactattt tgtagtacac atgaagcaga agggaaagaa gggcggcggc

300

ggcagcggcg gcggcggcag cggcggcggc ggcagcaaag gcgatgacgc gagttatttt

360

gaaccaacag gcccgtattt gatggtaaat gtgactggag ttgatggtaa aggaaatgaa

420

ttgctatccc ctcgttatgt cgagtttcct attaaacctg ggactacact tacaaaagaa

480

aaaattgaat actatgtcga atgggcatta gatgcgacag catatcaaga gtttagagta

540

gttgcattag cgccaagcgc aaagatcgaa gtcacttatt atgataagaa taagaaaaaa

600

gaagaaacga agtctttccc tataacagaa aaaggttttg ttgtcccaga tttatcagag

660

catattaaaa accctggatt caacttaatt acagcggttg ttatagaacg tgcgaaa

717

SEQ ID NO：2

<210>2

<211>239

<212>PRT

<213>Artificial

<223>P11与SAK的融合蛋白

<400>2

Met Pro Ser Gin Met Glu His Ala Met Glu Thr Met Met Phe Thr Phe

1               5                   10                  15

His Lys Phe Ala Gly Asp Lys Gly Tyr Leu Thr Lys Glu Asp Leu Arg

            20                  25                  30

Val Leu Met Glu Lys Glu Phe Pro Gly Phe Leu Glu Asn Gln Lys Asp

        35                  40                  45

Pro Leu Ala Val Asp Lys Ile Met Lys Asp Leu Asp Gln Cys Arg Asp

    50                  55                  60

Gly Lys Val Gly Phe Gln Ser Phe Phe Ser Leu Ile Ala Gly Leu Thr

65                  70                  75                  80

Ile Ala Cys Asn Asp Tyr Phe Val Val His Met Lys Gln Lys Gly Lys

                85                  90                  95

Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

            100                 105                 110

Lys Gly Asp Asp Ala Ser Tyr Phe Glu Pro Thr Gly Pro Tyr Leu Met

        115                 120                 125

Val Asn Val Thr Gly Val Asp Gly Lys Gly Asn Glu Leu Leu Ser Pro

    130                 135                 140

Arg Tyr Val Glu Phe Pro Ile Lys Pro Gly Thr Thr Leu Thr Lys Glu

145                 150                 155                 160

Lys Ile Glu Tyr Tyr Val Glu Trp Ala Leu Asp Ala Thr Ala Tyr Gln

                165                 170                 175

Glu Phe Arg Val Val Ala Leu Ala Pro Ser Ala Lys Ile Glu Val Thr

            180                 185                 190

Tyr Tyr Asp Lys Asn Lys Lys Lys Glu Glu Thr Lys Ser Phe Pro Ile

        195                 200                 205

Thr Glu Lys Gly Phe Val Val Pro Asp Leu Ser Glu His Ile Lys Asn

    210                 215                 220

Pro Gly Phe Asn Leu Ile Thr Ala Val Val Ile Glu Arg Ala Lys

225                 230                 235

Claims (6)

1、一种P11与SAK的融合蛋白，是由(a)或(b)组成的蛋白质：

(a)其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代，缺失或者叠加一个或者几个氨基酸衍生的蛋白质且与(a)蛋白具有相同的功能。

2、权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗心脑血管疾病的药物上的应用。

3、权利要求1所述的融合蛋白在制备治疗溶栓药物上的应用。

4、按照权利要求1所述的融合蛋白，其可以制备的剂型为注射液、口腔崩解剂或肠溶片剂。

5、权利要求1所述的融合蛋白的制备方法，包括利用重叠延伸PCR的方法将P11编码序列融合在SAK的N-端，中间以连接序列连接，获得融合基因；然后插入到载体上，并在宿主菌中表达，并经离子交换和凝胶过滤纯化获得重组的融合蛋白。

6、按照权利要求5所述的的制备方法，包括如下步骤：

(1)融合蛋白基因的克隆

首先通过重叠延伸PCR方法以P11基因为模板加入P11上游引物、连接序列引物1、连接序列引物2获得P11与连接序列相连的序列；再次通过重叠延伸PCR方法以上述序列与SAK序列为模板加入P11上游引物和SAK下游引物获得融合P11与SAK融合蛋白的DNA序列，具体所用引物序列为：

P11上游引物：5’gc gaattcatgccatctcaaatggaacacg 3’

连接序列引物1：

5’tcatcgcctttgctgccgccgccgccgctgccgccgccgccgctgccgccgccgcccttctttcccttctgcttc 3’

连接序列引物2：5’caaaataactcgcgtcatcgcctttgctgccgcc 3’

SAK下游引物：5’gc ggatcctcatttcgcacgttctataacaaccgctg 3’

电泳检测获得融合蛋白的DNA序列；

(2)原核表达质粒的构建、筛选与鉴定

将融合蛋白的DNA序列用限制性内切酶BamH I、EcoR I进行双酶切，然后通过T4DNA连接酶与载体pBV220相连，再转入大肠杆菌DH5α中，涂平板挑取阳性克隆，进行双酶切鉴定，并进行基因测序；

(3)融合蛋白的表达及纯化

将测序正确的表达质粒转入宿主菌JM103中，42℃诱导表达4.5hr，收集菌体，超声破碎、离心，然后进行SDS-PAGE，选取pBV220-P11-SAK，阴离子交换层析柱用PB(10mM，pH 8.0)充分平衡，将存于4℃的菌体上清以0.5ml/min的速度上样，然后再以PB以0.5ml/min的速度洗柱至基线，NaCL线形梯度洗脱，即得纯化的P11与SAK的融合蛋白。

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