CN101029342A - 对胃癌淋巴结转移的检测 - Google Patents

Abstract

检测胃癌淋巴结转移的方法、组合物和物品，涉及诊断胃癌淋巴结转移、区分阴性淋巴结和胃癌淋巴结转移，测试组织样品以确定胃癌分期状况。

Description

对胃癌淋巴结转移的检测

发明背景

全世界每年大约有876,000例新胃癌症病例(Shibuya，Mathers等人，2002)。在美国，2005年胃癌症的估计新病例和死亡分别是21,860和11,550(Jemal，Murray等人，2005)。胃癌是最常见的(90％-95％)胃癌症类型，按发生率顺序，接着是淋巴瘤、类癌瘤和间充质纺锤细胞肿瘤(Kumar，Cotran等人，2003)。

完全局部区域控制是胃癌后存活的关键的治疗，该完全局部区域控制包括全胃切除术或胃次全切除术，前哨(sentinel)淋巴结清扫术，扩展淋巴结清扫术，以及受转移影响的附近组织切除，例如脾切除术和胰切除术(Hartgrink和van de Velde 2005；Kitagawa，Fujii等人，2005)。在所有治疗的外科手术后出现复发的患者中，最高达87.5％是由局部复发或残留的区域淋巴结转移所引起的(Songun，Bonenkamp等人，1996)。

在包含148位胃食管接合处(GEJ)癌患者的研究中，结论表明，局部淋巴结中微转移的存在，是较差预后的关键指标(indicator)(Heeren，Kelder等人，2005)。胃癌淋巴结转移当前普遍的分期/诊断，是通过触诊和术中(intra-operative)冷冻切片检查进行的。淋巴结冷冻切片检查显示74％的灵敏度(Kitagawa，Fujii等人，2005)。

利用正确的基因标记，基因表达分析和检测技术，例如RT-PCR或定量PCR，可以提供诊断或预后胃癌的可选择方法。这些方法有潜力提供更好的转移检测试验灵敏度和准确度。以前报道的基因标记包括CK19(Matsuda，Kitagawa等人，2004)、癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白-20(CK-20)，以及MAGE-3(Okada，Fujiwara等人，2001)、CK18、MUC1、hTRT(Ajisaka和Miwa 2003)。遗憾地是，如公开数据所示，大多数这些标记在测试的所有肿瘤组织和肿瘤细胞系中的表达不一致。在15％(CEA)至高于70％(MAGE-3)的组织学检查所证实的胃癌淋巴结转移中，通过RT-PCR未检测到标记(Okada，Fujiwara等人，2001)。CK20用作来自胰癌、结肠癌、胃癌及肺癌的血液中散布的癌细胞的RT-PCR测试标记(Chausovsky，Luchansky等人，1999；Chen，Chen等人，2004)。

本文鉴定了在胃癌淋巴结转移中以易于检测的水平一致性表达的标记，所述表达水平能与所述标记在正常淋巴结中的背景表达相区分。这些标记可用于来自胃癌或类似细胞来源的癌，例如食道癌、胰腺癌和肠癌的散布的癌细胞检测中。

发明概述

在本发明一方面，鉴定了用于检测胃癌淋巴结转移的一组18个基因标记。这些标记基因在正常胃组织中高水平表达，而且该表达在不同分化状态的胃癌中能保持良好，而在正常淋巴结中，这些基因的背景表达水平相对较低。在胃癌淋巴结转移中，这些基因标记的表达水平显著高于正常淋巴结。

在本发明另一方面，诊断胃癌淋巴结转移的方法包括：从患者获得生物学样品，和测量选自标记组的基因的表达水平，其中，基因表达水平在预定截止值(cut-off)水平以上指示胃癌转移。优选地，生物学样品是淋巴结样品。

在本发明另一方面，标记能单独或组合用于测定中以检测胃癌淋巴结转移，这可用于辅助制定临床决策。

在本发明另一方面，基因标记能单独或组合用于测定中以鉴定与胃癌有相似起源的癌，例如胰腺癌、食道癌或肠癌的转移的起源。

在本发明另一方面，标记能单独或组合用于收集、检测和鉴定来自胃癌或具有相似组织起源的癌例如胰腺癌、食道癌或肠癌的血液中散布的癌细胞。

在本发明另一方面，标记可单独或组合用于免疫细胞化学研究中，以用于检测胃癌或具有相似组织起源的癌例如胰腺癌、食道癌或肠癌的转移。

在本发明的再一方面，标记可以在术中测定。术中测定通过包括以下步骤的方法进行：从自胃引流的淋巴结制备RNA；进行特异性针对一种或多种标记的定量RT-PCR法，和确定该标记的存在是否超出了预定截止值。该截止值可以是绝对值或相对于对照基因表达的值。

本发明包括进行本文所提供方法的微阵列或基因芯片。

附图简述

图1表示的是实施例1，标记鉴定中10例胃癌，10例正常胃组织，和6例正常淋巴结(如LN所示)(正常淋巴结有7个芯片，1个样品在芯片上运行了2次)的微阵列结果(HG U133A，来自所有探针组的信号)的等级聚类(hierarchical clustering)分析。

图2表示的是10例胃癌，10例正常胃组织和6例正常淋巴结(正常淋巴结有7个芯片，1个样品在芯片上运行了2次)的微阵列结果(HG U133A，来自20个选择的标记基因探针组的信号)的等级聚类分析。该图显示了胃癌、正常胃组织和正常淋巴结样品间20个探针组(代表18个基因)的芯片信号水平。正常淋巴结(如LN所示)组与胃癌/正常胃组织之间基因信号水平的显著差异在实施例1，标记鉴定中阐明。

图3A和3B显示了对于确证研究(1)鉴定的标记基因信号的平均值和标准误，所述确证研究(1)包括实施例2，确证研究(1)——微阵列测试中记载的6例正常淋巴结和3例已证实胃癌转移的淋巴结的微阵列研究。

图4是包括来自6例不同患者的全部10例正常淋巴结，和来自13例不同患者的16例已组织学证实胃癌转移的淋巴结的PCR研究原始Ct结果图示。显示了每种标记基因的平均原始Ct和标准误。数据获取如实施例2，确证研究(2)——实时RT-PCR测试中所述。

图5是包括来自6例不同患者的全部10例正常淋巴结，和来自13例不同患者的16例已组织学证实胃癌转移淋巴结的PCR研究标准化Ct结果图示。基于官家基因HPRT1 Ct结果，将Ct值标准化。显示了每种标记基因的平均标准化Ct和标准误。数据根据实施例2，确证研究(2)——实时RT-PCR测试获取。

发明详述

本说明书中记载和要求保护的本发明方法、组合物、物品和试剂盒，包括一种或多种标记。本说明书中通篇使用“标记”指：

a)基因和基因表达产物，例如mRNA及相应的cDNA、肽、蛋白、前述每一项的片段和互补体，以及

b)组合物，例如探针、抗体、配体、半抗原以及标记物，所述组合物通过与a)物理或化学相互作用显示基因表达或基因表达产物的存在，且其中基因、基因表达产物或组合物符合：

i)SEQ ID NO：＿，

ii)SEQ ID NO：＿与SEQ ID NO：＿，SEQ ID NO：＿，SEQ ID NO：＿，SEQ IDNO：＿中成员之一的组合，

iii)SEQ ID NO：＿与SEQ ID NO：＿，SEQ ID NO：＿，SEQ ID NO：＿，SEQ IDNO：＿的全部的组合，

iv)SEQ ID NO：＿-SEQ ID NO：＿，或

v)SEQ ID NO：＿-SEQ ID NO：＿。

当基因包含序列时，所述基因对应于SEQ ID NO所示的该序列。当基因区段或片段包含对照序列的部分或其足以将其称为基因的序列的互补体时，所述基因区段或片段对应于所述基因的序列。当基因表达产物的RNA、mRNA或cDNA与含有所述序列的组合物(例如探针)杂交时，或者在肽或蛋白的情况下，其由所述mRNA编码时，所述基因表达产物对应于所述的序列。当基因表达产物的区段或片段包含对照基因表达产物的部分或其足以将其称为基因或基因表达产物的序列的互补体时，所述基因表达产物的区段或片段对应于所述的基因或基因表达产物的序列。

ii和iii的标记是优选的。iv和v的标记是最优选的。

样品制备

组织中的转移和微转移分布在淋巴结或其它组织中是不均衡的。因此，应当获取足够大的样品以使转移不会被遗漏。在本方法中，组织取样的一个方法是匀浆大的组织样品，且随后将匀浆物的合适部分用于制备RNA以进行分子测试。

优选地，本发明方法中使用的样品是来自从胃引流的淋巴结的淋巴结样品。制备用于RT-PCR测定的所述样品的一种有用方法如下所述；用Omni匀浆器和一次性探针进行匀浆，然后用RNeasy(Qiagen)试剂盒试剂进行RNA纯化：

匀浆

a)如果以前没有记录，则测定样品的以毫克计的重量。将一张新蜡纸放在天平上，配衡，并称样品重量。优选地，结样品大于30mg。

b)用新解剖刀将来自相同结的所有组织切成直径约4mm的碎片。在处理过程中小心操作以免组织污染。

c)加匀浆(RLT)缓冲液到聚丙烯匀浆管。优选地，每100mg组织用2mL匀浆缓冲液。

d)用干净镊子转移组织至匀浆缓冲液。

e)在人工匀浆器上放置新的匀浆探针。

f)完全匀浆每个结。

g)按标准Qiagen方案按照RNA纯化方法处理匀浆物，使用前将RNA储存在-65℃或以下。

h)除去匀浆探针。

i)将剩余匀浆物储存在-65℃或以下，以供可能以后的使用。

诊断测定

本发明的标记用于提供重要的临床信息，例如胃癌是否已经转移到淋巴结，该信息是胃癌临床分期和患者预后的指示。

总之，该信息在本说明书中是指“诊断信息”。此外，该诊断信息包括其在提供治疗中作为组分的用途。例如，有该诊断信息的医师，可以基于癌已转移到淋巴结的指示进行治疗(例如辅助治疗)。

测量本发明标记的优选方法，包括确定编码蛋白或肽的基因所产生的mRNA的量。这可以通过竞争性逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时RT-PCR、RNA印迹分析或具有类似能力的其他测试来实现。当本发明的大量标记被同时测量时，优选从mRNA(RNA)产生扩增的互补RNA(cRNA)，然后将其应用于DNA微阵列进行测试和分析。多种不同的阵列构造和其制备方法是本领域技术人员已知的，并且记载在美国专利例如：5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734和5,700,637中。

微阵列技术允许同时测量数千种基因稳定状态的mRNA水平，因此提供了鉴定诸如不受控制的细胞增殖的开始、停滞或调节的效应的强大工具。尽管微阵列芯片的构建存在区别，但下游数据分析和输出却是相似的。这些分析的结果一般是从探针组接受的信号强度的测量值，该探针组用于检测从与微阵列已知位置上的核酸序列杂交的样品制备的靶序列。一般，信号强度与制备的靶的量成比例，且因此与样品细胞中表达的mRNA成比例。大量的这种技术是可获得的且是有用的。测定基因表达的优选方法可见于美国专利6,271,002；6,218,122；6,218,114；和6,004,755中。

在一个实施方案中，确立了基因组合(portfolio)，从而该组合中的基因组合相对于单个基因或随机选择的基因组合而言，显示改进的灵敏度和特异性。在本发明上下文中，组合的灵敏度优选反映在相对于正常状态的疾病状态中基因表达的倍数差别。特异性优选反映在基因表达信号与人们在进行测定中感兴趣的参数(癌性的、转移的、可能复发等)之间相关性的统计学测量中。例如，标准差能用作该测量。在考虑包括于组合中的一组基因时，表达测量的小标准差与更高的特异性相关。也可以以所述资格使用其它变差，例如相关系数的测量。本发明也包括上述方法，其中特异性为至少约70％，优选至少约80％，且更优选至少约90％。本发明也包括上述方法，其中灵敏度为至少约80％，且优选至少90％。

分析基因的表达水平，可以通过比较微阵列信号强度进行。这最好通过产生测试样品基因表达强度相对于对照样品基因表达强度的比率矩阵来进行。例如，将疾病组织的基因表达强度与相同类型良性或正常组织的表达强度进行比较。这些表达强度的比率显示了测试样品与对照样品基因表达的倍数变化。

本发明也包括上述方法，其中表达模式的比较是用模式识别法进行的。本发明的一个方法包括对各种基因(或组合)比较基因表达谱以由此确定诊断。将构成组合的每个基因的基因表达谱固定于介质中，例如计算机可读介质中。这可以采取多种形式。例如，确立表格，将指示疾病的信号范围(例如强度测量值)输入至该表中。接着将实际的患者数据与表中的值进行比较，以确定该患者样品是正常的、良性的还是患病的。在更复杂的实施方案中，将表达信号模式(例如荧光强度)数字化或图象化地进行记录。然后将与患者样品结合使用的基因组合的基因表达模式与表达模式进行比较。

模式比较软件可用于确定患者样品是否有指示疾病的模式。当然，这些比较也能用于确定患者是否不可能患有该疾病。然后将样品的表达谱与对照细胞的组合进行比较。如果样品表达模式与癌症表达模式一致，那么(在不存在对抗医学考虑的情况下)该患者应该以治疗胃癌患者来进行治疗。如果样品表达模式与正常/对照细胞表达模式一致，那么患者诊断为癌症阴性。

多种已知的模式识别法可用于比较与转移一致的模式和患者样品产生的模式。下列参考文献提供了某些实例：Weighted Voting：Golub等人，(1999)；SupportVector Machines：Su等人，(2001)；Ramaswamy等人，(2001)；K-nearest Neighbors：Ramaswamy(2001)；以及Correlation Coefficients：van’t Veer等人，(2002)。

优选地，上调和下调水平基于杂交的微阵列探针强度测量的倍数变化来区分。对于作出这样的区分，优选1.5倍的差别(或者p值小于0.05)。即，在基因被认为在疾病细胞相对于正常细胞有差别地表达之前，疾病细胞与正常细胞相比，被发现产生了至少约1.5倍或2/3的强度。倍数差别越大，基因用作诊断或预后工具的用途更优选。本发明基因表达谱的所选基因有导致产生这样信号的表达水平，该信号能够通过用临床实验仪器以超过背景的量与正常或非调节基因的信号进行区别。

统计学值能用于确信地区分调节基因与非调节基因及噪音。统计学检验可以发现在不同组样品中有最显著差别的基因。斯氏T-检验是强有力统计学检验的例子，该检验可用于发现两组之间的显著差异。p-值越低，基因在不同组之间显示出差异的证据就更为引人注目。然而，因为微阵列每次测量多于一个基因，所以可以同时要求好几万个统计学检验。鉴于此，，人们不太可能仅仅偶然地得到小p-值，且可利用Sidak校正以及随机化/排列实验对此进行调整。T-检验p-值小于0.05，是基因有显著差别的证据。更引人注目的证据是，加入Sidak校正因数后，p-值小于0.05。对每组大量样品来说，在随机化/排列检验之后，p-值小于0.05，是显著区别的最引人注目的证据。

本发明包括用于进行本文所提供的方法的微阵列或基因芯片。微阵列包含相应于标记的分离核酸序列，其互补体，或其部分，其中该组合足以在生物学样品中表征胃癌或复发风险。微阵列优选测量或表征至少约1.5倍超表达或表达不足，提供了超表达或表达不足的统计学显著性p-值，或p-值小于0.05。优选地，微阵列包含cDNA阵列或寡核苷酸阵列，并且可以包含一种或多种内部对照试剂。

基因表达谱也可以以多种方式显示。一个最常见的方法是将原始荧光强度或比率矩阵排列成树形图，其中列表示测试样品，而行表示基因。该数据进行这样的排列，以便使具有相似表达谱的基因彼此接近。每种基因的表达比率可用颜色显现。例如，比率小于1(指示下调)可以谱的蓝色部分出现，而比率大于1(指示上调)可以谱的红色部分的颜色出现。商业上可获得的计算机软件程序可用于显示这样的数据，该程序包括来自Silicon Genetics，Inc.的“GENESPRING”和来自Partek，Inc.的“DISCOVERY”及“INFER”软件。

本发明的调节的基因在实施例中有记载。相对于没有转移状况的淋巴结，差别表达的基因在有胃癌转移的淋巴结中被上调。上调是一个相对术语，意指在基因表达量上相对于某些基线发现的可检测的差别(超出用于对其进行检测的系统的噪音贡献)。在该情况中，基线是没有胃癌转移的正常淋巴结的标记所测量的基因表达。用相同的测量法，测试的淋巴结样品中的目的基因相对于基线水平上调或者没有变化。诊断或预后包括确定疾病/状态问题，例如确定复发可能性和治疗类型。确定复发可能性涉及将该模式与已知复发和/或已知不复发的事件的相关模式相比较，或者涉及超出了为该区别设置的截止值(在PCR情况下，通常为Ct)。

可以将基因编组，从而使由关于该组中基因的组获得的信息提供作临床相关决定，例如诊断、预后或治疗选择的一个合理基础。这些基因的组组成了本发明的组合。如同大多数诊断标记一样，通常需要用足以作出正确的医疗判断的最少的标记。这防止了进一步分析之前的治疗的延迟，以及徒然的时间和资源的利用。

确立基因表达组合的一个方法是使用最优化算法，例如广泛用于确立股票组合的平均方差算法。该方法在美国专利公开号20030194734中有详细记载。本质上，该方法要求确立将使人们由于使用其而收到的盈利(例如产生的信号)最优化同时使盈利的可变性最小化的一组输入(金融应用中的股票，本文表示为用强度进行测量的)。许多商业软件程序可以用于进行该操作。优选“WagnerAssociates平均方差最优化应用(Mean-Variance Optimization Application)”，该软件在本说明书全文中称为“Wagner软件(Software)”。该软件利用来自“WagnerAssociates平均方差最优化文库(Mean-Variance Optimization Library)”的函数，来确定有效边界，且优选在Markowitz意义下的最佳组合。使用该类型软件要求转换微阵列数据，从而当所述软件用于其预期的金融分析目的时，使该数据以股票盈利和风险测量所使用的方式被处理为输入。

选择组合的方法也包括启发式规则的应用。优选地，该规则基于生物学和对用于产生临床结果的技术的理解进行制定。更优选地，将该规则应用到最优化方法的输出中。例如，组合选择的平均方差法可以应用于癌症受试者中多种差别表达的基因的微阵列数据。该方法的输出将会是一组最优化的基因，其包括表达在外周血及疾病组织中的某些基因。如果检测方法所用的样品获自外周血而且在癌情况下差别表达的某些基因也能在外周血中差别表达，那么启发式规则能够应用，其中该组合选自排除了在外周血中差别表达的那些有效边界。当然，该规则也能在有效边界形成之前应用，例如，在数据预选择过程中应用该规则。

其它启发式规则也可应用，该规则不一定与正在讨论的生物学相关。例如，人们可应用如下规则，其中仅仅组合的规定百分数可由特定的基因或基因的组表示。商业可获得的软件，例如Wagner软件，可容易容纳这些类型的启发式。例如，在准确和精密之外的其它因素(例如预期的许可费)对包括一种或多种基因的需求有影响时，该规则将是有用的。

本发明的基因表达谱也可以与用于癌症诊断、预后或治疗监控的其它非遗传学诊断方法联用。例如，在某些情况下，将基于上述方法的基因表达的诊断能力与来自传统标记例如血清蛋白标记(例如，癌抗原27.29(“CA 27.29”))的数据联用，将是有利的。在一种所述方法中，从经治疗的患者周期性取血，然后进行上述一种血清标记的酶免疫测定。当标记浓度提示肿瘤复发或治疗失败时，采集可用于基因表达分析的样品源。可选择地，组织样品可采集自与以前切除肿瘤的组织邻近的区域。在其它测试产生了模棱两可的结果时，该方法特别有用。

本发明包括生成胃癌诊断患者报告的方法以及由此获得的报告，这通过从患者获得生物学样品；测量样品的基因表达；以及用由此获得的结果生成报告来实现。报告也包括患者结果和/或相对于患者群体的风险可能性的评估。

本发明包括组合物，该组合物包含至少一种相应于标记的微阵列探针组或PCR引物/探针组。

本发明的物品包括基因表达谱的表示物(representation)以及关于其使用的人或机器可读的说明书，所述表示物用于治疗、诊断、预后以及以其他方式评估疾病。将这些谱的表示物还原到机器能自动阅读的介质，例如计算机可读介质(磁的、光学的、等等)。例如，物品可以包括含有计算机指令的CD ROM，所述指令用于比较上述基因组合的基因表达谱。物品也可以含有数字化记录于其中的基因表达谱，从而其能与患者样品的基因表达数据比较。可选择地，该谱可以以不同的表示格式记录。图形记录是一种这样的格式。聚类算法，例如整合在上述的Partek，Inc.的“DISCOVERY”和“INFER”软件中的那些算法，能最佳地辅助这些数据的显现。

根据本发明的不同类型的制品，是用于揭示基因表达谱的介质或格式化的测定。这些制品可包括，例如序列互补体或探针固定于基质的微阵列，其中指示目的基因的序列与所述序列互补体或探针结合，从而产生了对其存在的可读性确定。可选择地，根据本发明的物品可以包装在试剂盒中，以用于进行杂交、扩增和产生信号，其指示目的基因的表达水平以用于检测癌症。

本发明也包括实施测定以确定胃癌淋巴结转移的试剂盒。根据本发明制备的试剂盒包括格式化测定。这包括实施测定所需的所有材料或某些材料，例如试剂、和说明书和介质，通过这些材料，核酸序列、其互补体或其部分能被测定。当测定以另一种格式进行时，试剂盒将有特定于该格式的组分。例如，如果格式是扩增格式，例如PCR、滚环扩增法(RCA)、连接酶链反应法(LCR)、链置换扩增法(SDA)、基于核酸序列的扩增法(NASBA)时，试剂盒将包含适于所述技术的试剂和材料。

在一个实施方案中，试剂盒包括用于扩增和检测标记的试剂。任选地，试剂盒包括样品制备试剂和/或从组织例如淋巴结组织提取核酸的物品(例如管)。试剂盒也包括使样品污染风险最小化的物品(例如用于淋巴结解剖和制备的一次性解剖刀和表面)。

在优选的试剂盒中，包括一管式(one-tube)QRT-PCR法的必要试剂，例如逆转录酶、逆转录酶引物、相应PCR引物组(优选针对标记和对照)、热稳定DNA聚合酶如Taq聚合酶、以及合适的检测试剂，所述检测试剂非限制性地例如蝎子探针(scorpion probe)、用于荧光5’核酸酶测定的探针、分子信标探针、单染色引物、或者对双链DNA特异性的荧光染料如溴化乙锭。优选引物为产生高浓度的量。热稳定DNA聚合酶是常规的并且从多个制造商可商业获得的。试剂盒中的其它材料可以包括：合适的反应管或小瓶，屏障组合物例如蜡珠，任选地包括镁；用于逆转录酶和PCR阶段的反应混合物(一般为10X)，包括必要的缓冲液和试剂例如dNTP；无核酸酶或无RNA酶的水；RNA酶抑制剂；对照核酸和/或可用于逆转录酶和/或QRT-PCR反应PCR阶段的任何其他缓冲液、化合物、辅因子、离子成分、蛋白和酶、聚合物等等。任选地，试剂盒包括核酸提取试剂和材料。

也可能测定基因标记的表达产物(它们本身已经包括在标记定义中)，例如多肽和蛋白。可用于这种测定的方法包括将样品与针对标记的抗体接触。这些抗体用于开发用于检测标记的非常特异的测定，而且允许测试以多种不同格式进行。优选地，抗体是标记的单克隆抗体。如果该标记是分泌的蛋白或多肽，那么与正常表达水平相比，在疾病组织中的表达为100-1000倍。用于这种测定的试剂盒包括一般用于该测定格式的试剂，例如标记的抗体试剂。

下面实施例用于解释而不是限制所要求保护的发明。本文引用的所有参考文献均在此引入本文作为参考。

实施例1标记鉴定

将10个胃癌、10个正常胃组织和6个经过组织学验证的正常淋巴结的新鲜冷冻的样品，用于鉴定检测胃癌淋巴结转移的基因标记。按标准厂家建议的方案使用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Catlog#74106)从这些组织制备RNA。通过RNA线性扩增制备生物素标记的aRNA靶(Ambion，MessageAmp II aRNAAmplification Kit，Catlog# 1751)。将制备的靶应用到按标准Affymetrix建议的方案处理的Affymetrix HG U133A芯片上。收集芯片结果，将其全局地换算成靶信号600。进行微阵列结果(HG U133A芯片组)的等级聚类分析，用Partek Pro6.0统计学分析芯片结果。使用ANOVA和倍数变化分析鉴定目的基因。将具有下列特性的基因选为用于检测胃癌淋巴结转移的候选标记：a)在正常胃组织中稳定表达，b)在胃癌中表达保持稳定，以及c)在正常淋巴结与胃癌之间表达水平有明显差异。

20个探针组(代表18个基因)满足上述标准。在正常淋巴结组与胃癌/正常胃组织之间基因信号水平的明显差异具有统计学显著性。微阵列结果总结在表1中，其中显示了20个探针组中每一个的平均信号和标准差。关于标记的更多信息显示在表2中，且聚类分析显示在图1(HG U133A所有探针组)和图2(仅标记)中。这些标记的表达在胃癌转移情况下的淋巴结中增加。将标记根据功能分类，如表3中所示。

表1.微阵列结果概述

		平均值			标准差
								Affymetrix：PSID	基因	淋巴结	正常胃	胃癌	淋巴结	正常胃	胃癌
209369_at	ANXA3	150	2077	1886	28	645	1193
								218261_at	AP1M2	55	1061	735	25	237	446
201243_s_at	ATP1B1	431	10762	6659	76	2585	3075

204073_s_at	c11orf9	51	2642	1003	30	1099	630
								219010_at	c1orf106	127	1780	1856	28	393	986
201131_s_at	CDH1	587	7333	6444	254	1054	4321
								213050_at	COBL	26	709	317	6	172	213
211843_x_at	CYP3A7	18	788	219	4	349	128
								217901_at	DSG2	189	3077	2162	113	920	1445
210827_s_at	ELF3	183	2498	2282	50	315	1456
								202454_s_at	ERBB3	124	2649	2411	32	489	1472
219545_at	KCTD14	20	727	362	2	184	201
								209211_at	KLF5	52	1227	1312	23	266	852
209008_x_at	KRT8	158	6815	7412	20	1736	4803
								202890_at	MAP7	31	921	756	22	226	335
201468_s_at	NQO1	225	7017	3107	57	1242	1939
								210519_s_at	NQO1	235	5276	3688	51	1126	2123
201467_s_at	NQO1	15	1585	1076	7	293	678
								219395_at	RBM35B	78	1145	867	46	337	530
211689_s_at	TMPRSS2	9	1549	632	5	569	432

表2：基因标记及其Affymetrix探针组信息

基因	基因名称/描述	AffymetrixPSID	NCBI参考序列(mRNA)	Seq.IDNo.
					ANXA3	膜联蛋白A3	209369_at	NM_005139
AP1M2	连接物相关蛋白复合物1，mu2亚单位	218261_at	NM_005498
					ATP1B1	ATP酶，Na+/K+运输，β1多肽	201243_s_at	NM_001677，NM_001001787
C11orf9	染色体11可读框9	204073_s_at	NM_013279
					C1orf106	假定的蛋白FLJ10901，染色体1	219010_at	NM_018265

	可读框106
					CDH1	钙粘着蛋白1，1型，E-钙粘着蛋白(上皮)	201131_s_at	NM_004360
COBL	cordon-bleu同源物(小鼠)	213050_at	NM_015198
					CYP3A7	细胞色素P450，家族3，亚家族A，多肽7	211843_x_at	NM_000765
DSG2	桥粒芯糖蛋白2	217901_at	NM_001943
					ELF3	E74样因子3(ets域转录因子，上皮特异性的)	210827_s_at	NM_004433
ERBB3	v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同源物3(鸟类)	202454_s_at	NM_001982，NM_001005915
					KCTD14	包含14的钾通道四聚化结构域	219545_at	NM_023930
KLF5	Kruppel样因子5(肠)	209211_at	NM_001730
					KRT8	角蛋白8	209008_x_at	NM_002273
MAP7	微管相关蛋白7	202890_at	NM_003980
					NQO1	NAD(P)H脱氢酶，醌1	201468_s_at	NM_000903NM_001025433NM_001025434
NQO1	NAD(P)H脱氢酶，醌1	210519_s_at	NM_000903NM_001025433NM_001025434

NQO1	NAD(P)H脱氢酶，醌1	201467_s_at	NM_000903NM_001025433NM_001025434
					RBM35B	假定的蛋白FLJ21918	219395_at	NM_024939
TMPRSS2	跨膜蛋白酶，丝氨酸2	211689_s_at	NM_005656

表3.按功能分类的标记

功能	数目	基因
			信号转导	5	ANXA3，ATP1B1，AP1M2，KCTD14，ERBB3
转录因子	2	ELF3，KLF5
			胞间连接点	2	CDH1，DSG2，
未知	4	RBM35B(FLJ21918)，COBL，C1orf106(FU10901)，C11orf9
			细胞结构	2	KRT8，MAP7
细胞质酶	3	NQO1，CYP3A7，TMPRSS2
			总计	18

实施例2：确证研究(1)—微阵列测试

实施确证研究，以验证实施例1所选标记。检查这些标记，以确定它们的表达是否在各种不同状态胃癌淋巴结转移中保持。将Affymetrix DNA微阵列(HG U133A)用于该研究。测试了6个正常淋巴结组织和3个已证实有胃癌转移的淋巴结组织。如上所述，从样品制备RNA。按实施例1所述制备生物素标记的aRNA靶。将靶应用到Affymetrix HG U133A芯片。将芯片结果换算成靶信号600，并进行分析。

每种探针组的平均信号和标准误绘制于图3A，3B中。

实施例3：确证研究(2)——实时RT-PCR检测

进行研究，以用实时RT-PCR验证所选基因标记的性能。测试了10个正常淋巴结和16个已组织学证实胃癌转移的淋巴结(包括用确证研究1中DNA微阵列测试的所有样品)。该10个组织学证实的正常淋巴结来自7个不同患者。该16个证实胃癌转移的淋巴结来自13个不同患者。转移至淋巴结的原发癌的恶性状态是：3例分化良好(促成6个淋巴结)，7例分化差(促成7个淋巴结)，3例分化适中(促成3个淋巴结)。

所有RNA按上述方法制备。cDNA首先按厂家建议方案用高容量cDNA存储试剂盒(High Capacity cDNA Archive Kit)(ABI)从5μg RNA在100uL反应体积中进行制备。将2μL合成的cDNA在50μL体积中，用于实时PCR反应(RT-PCR)。从每种RNA样品制备一种cDNA。为每种基因标记，从AppliedBiosystems Inc(ABI)购买TaqMan基因表达测定。用这些测定和不含AmpEraseUNG的TaqMan通用PCR主混合物(Master Mix)(ABI)，按厂家建议的条件，每管一反应(测定)，进行RT-PCR测试。在每种产生的cDNA中进行一式两份或一式三份PCR反应。PCR在ABI 7900HT分析仪上运行。

测定ID及每一测定的关联序列(基因的一种引物组/探针组)如表4所示：

表4.TaqMan基因表达分析(Applied Biosystems，Inc)

基因	ABI测定ID No.	NCBI参考序列(mRNA)	关联序列	关联序列Seq.ID
					ANXA3	Hs00192983_m1	NM_005139	TCAGAGGAATTGGAACTGATGAGAA
AP1M2	HS00194014_m1	NM_005498	AGGGCAAGCCATTGATCAGCCGCAA
					ATP1B1	Hs00426868_g1	NM_001677，NM_001001787	CAGTGCACTGGCAAGCGAGATGAAG
C11orf9	Hs00973712_g	NM_013279	GTCATGGCCTTCAGCGTGGTGTCCA
					C1orf106	Hs00250963_m1	NM_018265	TGGGACAGCTGGGGAAGCTCCAGGC
CDHI	Hs00170423_m1	NM_004360	CCCGCCCCATCAGGCCTCCGTTTCT
					COBL	Hs00323596_m1	NM_015198	CTGAGAAAGGTGCCCTTGCTCGTGT
CYP3A7	Hs02511627_s1	NM_000765	TTATTTTGATGGCTCTAACAGTGAC
					DSG2	Hs00170071_m1	NM_001943	CAGAGAGGAACACAGCAGCTACACT
ELF3	Hs00231786_m1	NM_004433	CAAGCACGCGCCCAGAGGCACCCAC
					ERBB3	Hs00176538_m1	NM_001982，NM_001005915	GCAACTCTCAGGCAGTGTGTCCTGG

KCTD14	Hs01928822_s1	NM_023930	不能从供应商获得
					KLF5	Hs00156145_m1	NM_001730	ACTGCGATTACCCTGGTTGCACAAA
KRT8	Hs01595539_g1	NM_002273	不能从供应商获得
					MAP7	Hs00187725_m1	NM_003980	GCGAAGCGAAACAGCACCCGACAGC
NQO1	Hs00168547_m1	NM_000903NM_001025433NM_001025434	GAGCCATGGTCGGCAGAAGAGCACT
					RBM35B	Hs00227840_m1	NM_024939	GTGCTGCAGCAGTTCTCACAGCTGG
TMPRSS2	Hs00237175_m1	NM_005656	TCGGTGTGTTCGCCTCTACGGACCA
					HPRT1*	185278564	NM_000194	不能从供应商获得

对来自正常淋巴结(NLN)和已证实胃癌转移的淋巴结(MLN)的样品针对每一标记基因，收集Ct值。将每种基因的原始Ct值根据官家基因HPRT1的Ct进行标准化。总结并分析经过多轮RT-PCR的原始Ct值和标准化Ct值。计算两样品组(NLN，MLN)每种基因的平均原始Ct和标准误，如图4中所示。计算两样品组(NLN，MLN)每种标记基因的平均标准化Ct和标准误，如图5中所示。对基因CYP3A7来说，其Ct值在NLN组中26组PCR反应中的16组中未确定，在MLN组中35组PCR反应中的2组中未确定，而官家基因HPRT1(组成型表达)的一般Ct值获自相同cDNA。对于基因CYP3A7的PCR检测率在NLN与MLN组之间有显著差异(P＜0.0001)。对CYP3A7来说，仅将确定的Ct值用于计算平均值、标准差、标准误及ANOVA。对原始和标准化Ct值进行ANOVA，以测试两组(NLN，MLN)之间差异的显著性，该结果如表5、表6中所示。在所测试的基因中，除CYP3A7之外，再没有PCR反应未确定Ct值的情况。

表5.数据概述及原始Ct值的ANOVA结果

基因

P-值

平均值(MLN)

Std(MLN)

Min(MLN)

Max(MLN)

平均值(NLN)

Std(NLN)

Min(NLN)

Max(NLN)

MS(模型)

MS(误差)

ELF3	9.4E-43	22.2	0.9	20.7	23.8	31.2	0.9	28.3	32.0	1204	0.9
												AP1M2	1.8E-42	24.0	1.0	22.0	25.8	34.7	1.3	31.1	36.4	1689	1.2
ERBB3	6.6E-41	24.1	1.0	22.7	25.9	31.3	0.5	30.4	32.5	791	0.7
												TMPRSS2	1.1E-39	23.4	1.0	21.9	25.7	34.2	1.6	30.3	36.9	1713	1.6
KRT8	5.5E-36	20.6	1.5	18.0	24.1	30.3	1.1	27.7	31.9	1406	1.8
												C11orf9	2.4E-32	25.5	0.8	24.3	27.0	30.7	0.4	29.7	31.0	329	0.4
RBM35B(FLJ21918)	3.8E-31	26.1	1.1	24.6	28.9	34.2	1.6	30.7	38.0	971	1.8
												DSG2	2.4E-30	24.8	1.1	22.5	27.1	30.2	0.6	28.9	31.3	435	0.9
C1orf106(FLJ10901)	1.4E-29	28.5	1.0	26.6	30.5	33.4	0.8	31.9	34.5	355	0.8
												KLF5	2.6E-29	20.9	1.1	19.6	23.5	27.5	0.7	25.8	28.3	520	0.9
COBL	4.5E-28	27.0	1.0	24.7	28.9	32.8	1.3	29.9	34.9	516	1.3
												NQO1	3.5E-26	22.2	1.3	19.0	23.7	28.5	1.4	26.6	30.8	592	1.7
ATP1B1	7.7E-26	20.9	0.8	19.1	22.3	24.5	0.7	23.6	25.8	195	0.6
												ANXA3	5.2E-22	21.8	1.0	20.4	24.6	27.0	1.2	24.6	28.8	332	1.2
MAP7	2.8E-17	25.6	1.0	24.2	27.2	29.1	1.3	26.6	30.6	180	1.3
												CDH1	9.8E-16	22.0	1.4	19.8	26.3	25.3	0.8	24.5	28.5	164	1.4
KCTD14	1.4E-09	27.6	1.0	25.5	29.1	29.6	1.2	26.7	31.5	62	1.2
												CYP3A7*	7.1E-01	33.4	2.6	30.6	38.7	33.1	3.6	29.5	39.6	1	7.9

表6.数据概述及标准化Ct值的ANOVA结果

基因	P-值	平均值(MLN)	Std(MLN)	Min(MLN)	Max(MLN)	平均值(NLN)	Std(NLN)	Min(NLN)	Max(NLN)	MS(模型)	MS(误差)
												AP1M2	5.2E-42	24.2	1.0	22.2	25.9	34.4	1.2	31.5	37.0	1559	1.2
ELF3	1.5E-40	22.4	1.1	21.2	24.5	31.0	0.8	28.7	32.5	1095	0.9
												TMPRSS2	7.4E-40	23.6	1.2	21.9	25.8	33.9	1.2	30.8	36.1	1582	1.4
KRT8	7.3E-39	20.8	1.3	18.2	23.6	30.0	0.9	28.1	31.1	1288	1.3
												ERBB3	1.0E-38	24.2	0.9	22.8	25.7	31.1	0.8	30.2	33.0	703	0.7

RBM35B(FLJ21918)	5.4E-33	26.3	0.7	25.4	28.4	33.9	1.6	31.2	38.3	874	1.4
												KLF5	1.7E-31	21.1	0.8	19.6	22.9	27.3	0.8	26.2	29.3	475	0.6
C1orf106(FLJ10901)	2.1E-31	28.7	0.8	27.1	30.2	33.1	0.6	32.2	34.5	297	0.5
												DSG2	7.5E-31	24.9	1.0	22.5	26.6	29.9	0.6	28.7	30.8	370	0.7
COBL	9.7E-29	27.1	1.0	25.4	28.5	32.6	1.0	30.3	34.4	445	1.0
												C11orf9	6.9E-26	25.6	0.9	23.9	27.3	30.5	0.6	29.7	31.8	293	0.7
ANXA3	1.0E-20	21.9	1.3	20.1	25.6	26.8	0.7	25.6	27.8	296	1.2
												NQO1	1.7E-20	22.4	1.5	19.1	24.7	28.3	1.7	26.9	31.8	517	2.6
ATP1B1	4.9E-18	21.1	1.0	19.1	22.4	24.3	1.0	23.1	26.7	153	1.0
												MAP7	3.5E-17	25.8	0.9	24.1	27.7	28.9	1.1	25.9	30.0	139	1.0
CDH1	5.8E-13	22.1	1.5	20.1	26.2	25.0	0.7	24.2	28.0	125	1.5
												KCTD14	5.5E-07	27.7	1.1	25.1	29.5	29.4	1.1	25.7	30.8	39	1.2
CYP3A7*	0.82	33.5	3.0	29.9	39.7	33.3	3.9	28.5	40.0	0.5	10.2

除CYP3A7(在许多PCR反应中观察到未确定的Ct值)以外，17个标记在所有16例各种分化状态胃癌转移的淋巴结中(来自13个患者)，都有显著的表达增加。这些标记基因的背景表达水平，在10例所测试的正常淋巴结中是一致的，该表达水平显著低于胃癌转移淋巴结的表达水平。

对17个标记的每个(除CYP3A7以外)生成受试者工作特征(RecieverOperating Characteristic)(ROC)曲线，以显示它们用于两样品组(MLN，NLN)区分测定的潜能。这些曲线分析的总结如表7所示。计算每个基因标记的AUC(曲线下的面积)。测试了两个截止值Ct，且每个截止值Ct值的灵敏度和特异性分别显示在表7中。

表7.每种基因标记Ct结果的ROC曲线综述

		情况A			情况B
								基因	ROC-AUC	截止值Ct#1	灵敏度#1	特异性#1	截止值Ct#2	灵敏度#2	特异性#2
DSG2	1	28.026	1.00	1.00	29.48	1.00	0.89
								RBM35B	1	29.82	1.00	1.00	32.64	1.00	0.89
COBL	1	29.40	1.00	1.00	31.27	1.00	0.89
								ELF3	1	26.06	1.00	1.00	30.71	1.00	0.89
AP1M2	1	28.41	1.00	1.00	33.63	1.00	0.89

NQO1	1	25.17	1.00	1.00	27.08	1.00	0.89
								C1orf106	1	31.20	1.00	1.00	32.17	1.00	0.89
ATP1B1	1	22.90	1.00	1.00	23.66	1.00	0.89
								ERBB3	1	28.16	1.00	1.00	30.62	1.00	0.89
C11orf9	1	28.35	1.00	1.00	30.05	1.00	0.90
								KLF5	1	24.65	1.00	1.00	26.61	1.00	0.90
KRT8	1	25.90	1.00	1.00	29.035	1.00	0.89
								TMPRSS2	1	27.98	1.00	1.00	32.70	1.00	0.89
ANXA3	0.998	24.40	0.97	1.00	25.30	1.00	0.90
								MAP7	0.974	26.545	0.714	1.00	27.03	0.97	0.89
CDH1	0.945	23.83	0.94	1.00	24.69	0.94	0.89
								KCTD14	0.898	26.52	0.17	1.00	28.30	0.69	0.89

实施例4：抗体(预测性的)

合成C-末端标记衍生肽，与匙孔血蓝蛋白偶联，并用于免疫兔以产生多克隆抗体。采用ELISA测试血清抗相应肽的反应性，并亲和纯化阳性的批次。纯化的抗体特异性检测组织切片中的含有肽表位的蛋白。如果相应肽与抗体同时加入，该检测可以通过信号的完全消除而证实。除在免疫组织化学有效的该多克隆抗体以外，也可以产生能检测天然折叠的蛋白的单克隆抗体。为了产生单克隆抗体，产生在哺乳细胞中生成以确保天然折叠和翻译后修饰的纯化抗原。将抗原——标记-IgG恒定部分融合蛋白，在小鼠骨髓瘤细胞中表达，并用Fc部分为饵将分泌蛋白纯化。该纯化的抗原由C-末端多克隆抗体和其它抗标记肽抗体在蛋白印迹中识别。通过从阳性克隆中选出产生与标记反应而不是与IgG恒定部分反应的抗体的那些克隆，将该抗原用于产生抗标记的小鼠单克隆抗体。

采用这些和类似抗体可以容易地形成用于标记临床鉴定的试剂盒。这样的试剂盒包括涉及标记鉴定的抗体，合适的指示试剂(例如酶，标记，等等)，以及(任选的)其它在这种试剂盒临床应用中有用的试剂，例如稀释缓冲液、稳定剂和一般用于所述测定的其它材料。试剂盒可用于检测体液中的标记，以筛选或跟踪表达标记的癌症及筛选组织样品中标记蛋白的存在。也可以制备包括所述抗体的试剂盒，以对目的组织进行免疫细胞化学测定。这些试剂盒包括标记蛋白的阳性染色以指示转移。

实施例5：酶免疫测定(预测性的)

对标记进行免疫测定。为了开发酶免疫测定(EIA)，使用包括胃肿瘤样品消化物的抗原标准(通过免疫过氧化物酶染色显示含有该抗原)。将人原发胃癌症样品汇合，于4℃下在10体积含0.2％(w/v)脱氧胆酸钠的pH7.4的10mMTris缓冲液中匀浆。将匀浆物迅速加热至37℃，并在搅拌下加入下列试剂(终浓度)：1mM半胱氨酸(Sigma)，1mM EDTA(Sigma)，以及木瓜蛋白酶(0.8单位/ml)(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，Ind.)。5分钟后，通过加入5mM碘乙酰胺(Sigma)终止消化。将匀浆物在100,000Xg，4℃下离心1小时，然后对含各10mM苯甲磺酰氟和氨基己酸的pH7.4的10mM Tris/0.9％NaCl溶液缓冲液充分透析。将匀浆物在0.5mg蛋白/ml浓度下以小等分试样冷冻。

测量标记的免疫测定法产生的剂量反应曲线将证明在临床显著低浓度水平下的线性。

实施例6记载的抗体的固相制剂是用CNBr-活化的琼脂糖凝胶(Pharmacia)制备的。将微量滴定板(Nunc I Immunoplates；Grand Island BiologicalCo.，Grand Island，N.Y.)在pH 9.6的50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中用抗体(200μl/孔)于4℃下包被18小时。除去抗体溶液之后，将塑料上残留蛋白结合位点通过加入200μl测定缓冲液[含1％(v/v)兔血清和1％(w/v)牛清蛋白的PBS]封闭。室温温育1小时后，将包被的板立即用于测定法。

为了进行测定，于37℃下应用稀释在测定缓冲液中的样品1-5小时。用测定缓冲液洗涤3次后，将200μl与辣根过氧化物酶共价缀合的抗体(Sigma，TypeVI)于37℃应用于每孔中1.5小时。将缀合物稀释至每ml含有10％(v/v)鼠血清的PBS中0.5μg免疫球蛋白的浓度。经上述洗涤之后，室温下每孔应用200μl底物0.5小时。底物溶液包含0.4mg邻苯二胺/ml pH5.0的柠檬酸缓冲液和0.003％过氧化氢。通过加入50μl 2N硫酸终止反应，并用酶测定板阅读器(FisherScientific Co.，Pittsburgh，Pa.)在488nM处监控吸光度。

结合的酶缀合物百分数按下式计算：

(B-B₀)(B_t-B₀)(100)

其中B＝样品吸光度，B_t＝最大吸光度，且B₀＝空白吸光度。用标准消化物和稀释在测定缓冲液中的26-倍稀释的血清样品，一式三份进行每一测定。免疫测定的特异性通过取代固相上的各种抗体试剂，包括CEA抗体和非免疫兔血清，来进行检查。

也评估了获自相应于上述的癌患者的样品。升高的标记值的发生率是90％。癌症组的平均值显著高于对照组(为约250％)。

利用有限数目的患有原发局部疾病的术后胃癌症患者，发生了标记的显著减少。这些数据表明了标记水平和肿瘤负荷之间的关系。因此，该测量对患者监控是有价值的。

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                                序列表

<110>Ming，Xu

<120>对胃癌淋巴结转移的检测

<130>VDX5032USNP

<160>36

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1339

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：ANXA3

<400>1

gaattccgat tagtgtgatc tcagctcaag gcaaaggtgg gatatcatgg catctatctg     60

ggttggacac cgaggaacag taagagatta tccagacttt agcccatcag tggatgctga    120

agctattcag aaagcaatca gaggaattgg aactgatgag aaaatgctca tcagcattct    180

gactgagagg tcaaatgcac agcggcagct gattgttaag gaatatcaag cagcatatgg    240

aaaggagctg aaagatgact tgaagggtga tctctctggc cactttgagc atctcatggt    300

ggccctagtg actccaccag cagtctttga tgcaaagcag ctaaagaaat ccatgaaggg    360

cgcgggaaca aacgaagatg ccttgattga aatcttaact accaggacaa gcaggcaaat    420

gaaggatatc tctcaagcct attatacagt atacaagaag agtcttggag atgacattag    480

ttccgaaaca tctggtgact tccggaaagc tctgttgact ttggcagatg gcagaagaga    540

tgaaagtctg aaagtggatg agcatctggc caaacaagat gcccagattc tctataaagc    600

tggtgagaac agatggggca cggatgaaga caaattcact gagatcctgt gtttaaggag    660

ctttcctcaa ttaaaactaa catttgatga atacagaaat atcagccaaa aggacattgt   720

ggacagcata aaaggagaat tatctgggca ttttgaagac ttactgttgg ccatagttaa   780

ttgtgtgagg aacacgccgg cctttttagc cgaaagactg catcgagcct tgaagggtat   840

tggaactgat gagtttactc tgaaccgaat aatggtgtcc agatcagaaa ttgacctttt   900

ggacattcga acagagttca agaagcatta tggctattcc ctatattcag caattaaatc   960

ggatacttct ggagactatg aaatcacact cttaaaaatc tgtggtggag atgactgaac  1020

caagaagata atctccaaag gtccacgatg ggctttccca acagctccac cttacttctt  1080

ctcatactat ttaagagaac aagcaaatat aaacagcaac ttgtgttcct aacaggaatt  1140

ttcattgttc tataacaaca acaacaaaag cgattattat tttagagcat ctcatttata  1200

atgtagcagc tcataaatga aattgaaaat ggtattaaag atctgcaact actatccaac  1260

ttatatttct gctttcaaag ttaagaatct ttatagttct actccattaa atataaagca  1320

agataataaa acggaattc                                               1339

<210>2

<211>1749

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：AP1M2

<400>2

ggcgcttccg caggaagaag gaagcggcgc cgccatcgcc tcccggcgct ccctccccga     60

ctcctaagtc cttcggccgc caccatgtcc gcctcggctg tcttcattct ggacgttaag    120

ggcaagccat tgatcagccg caactacaag ggcgatgtgg ccatgagcaa gattgagcac    180

ttcatgcctt tgctggtaca gcgggaggag gaaggcgccc tggccccgct gctgagccac    240

ggccaggtcc acttcctatg gatcaaacac agcaacctct acttggtggc caccacatcg    300

aagaatgcca atgcctccct ggtgtactcc ttcctgtata agacaataga ggtattctgc    360

gaatacttca aggagctgga ggaggagagc atccgggaca actttgtcat cgtctacgag    420

ttgctggacg agctcatgga ctttggcttc ccgcagacca ccgacagcaa gatcctgcag    480

gagtacatca ctcagcagag caacaagctg gagacgggca agtcacgggt gccacccact    540

gtcaccaacg ctgtgtcctg gcgctccgag ggtatcaagt ataagaagaa cgaggtcttc    600

attgatgtca tagagtctgt caacctgctg gtcaatgcca acggcagcgt ccttctgagc    660

gaaatcgtcg gtaccatcaa gctcaaggtg tttctgtcag gaatgccaga gctgcggctg    720

ggcctcaatg accgcgtgct cttcgagctc actggccgca gcaagaacaa atcagtagag    780

ctggaggatg taaaattcca ccagtgcgtg cggctctctc gctttgacaa cgaccgcacc    840

atctccttca tcccgcctga tggtgacttt gagctcatgt cataccgcct cagcacccag    900

gtcaagccac tgatctggat tgagtctgtc attgagaagt tctcccacag ccgcgtggag    960

atcatggtca aggccaaggg gcagtttaag aaacagtcag tggccaacgg tgtggagata   1020

tctgtgcctg tacccagcga tgccgactcc cccagattca agaccagtgt gggcagcgcc   1080

aagtatgtgc cggagagaaa cgtcgtgatt tggagtatta agtctttccc ggggggcaag   1140

gagtacttga tgcgagccca ctttggcctc cccagtgtgg aaaaggaaga ggtggagggc   1200

cggcccccca tcggggtcaa gtttgagatc ccctacttca ccgtctctgg gatccaggtc   1260

cgatacatga agatcattga gaaaagtggt taccaggccc tgccctgggt tcgctacatc   1320

acccagagtg gcgattacca acttcgtacc agctagaagg gagaagagat gggggcttga   1380

acacggggct tccttacagc cccggatgca gattttagag ggagggcagg tgcgggctgt   1440

gtgtgtctgt gtgagggcag gtcctggact tggcagtttc ttgctcccag cacccgcccc   1500

ttcctcacct cttccttatt ccataggctg ggagagaaac tctctgcttc cctcgccctt   1560

ggagctttcc ccatccccct gattttatat gaagaaatag aagaggggct tgaagtcccc   1620

ctcgcgagtg ccttcttgca attacctgcc ttagcgggtg ttgcgggtcc ctccttcaca   1680

gccgctgagc ccagaggtcc cgctggcccc tcctctgaat tttaggatgt cattaaaaag   1740

atgaatcta                                                           1749

<210>3

<211>1568

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：ATP1B1

<400>3

cagcggcgcg tcctgcctgc agagagccag gccggagaag ccgagcggcg cagaggacgc     60

cagggcgcgc gccgcagcca cccaccctcc ggaccgcggc agctgctgac ccgccatcgc    120

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gaagaaggag tttctgggca ggaccggtgg cagttggttt aagatccttc tattctacgt    240

aatattttat ggctgcctgg ctggcatctt catcggaacc atccaagtga tgctgctcac    300

catcagtgaa tttaagccca catatcagga ccgagtggcc ccgccaggat taacacagat    360

tcctcagatc cagaagactg aaatttcctt tcgtcctaat gatcccaaga gctatgaggc    420

atatgtactg aacatagtta ggttcctgga aaagtacaaa gattcagccc agagggatga    480

catgattttt gaagattgtg gcgatgtgcc cagtgaaccg aaagaacgag gagactttaa    540

tcatgaacga ggagagcgaa aggtctgcag attcaagctt gaatggctgg gaaattgctc    600

tggattaaat gatgaaactt atggctacaa agagggcaaa ccgtgcatta ttataaagct    660

caaccgagtt ctaggcttca aacctaagcc tcccaagaat gagtccttgg agacttaccc    720

agtgatgaag tataacccaa atgtccttcc cgttcagtgc actggcaagc gagatgaaga   780

taaggataaa gttggaaatg tggagtattt tggactgggc aactcccctg gttttcctct   840

gcagtattat ccgtactatg gcaaactcct gcagcccaaa tacctgcagc ccctgctggc   900

cgtacagttc accaatctta ccatggacac tgaaattcgc atagagtgta aggcgtacgg   960

tgagaacatt gggtacagtg agaaagaccg ttttcaggga cgttttgatg taaaaattaa  1020

attttaagtg acactacaga aaaacacaaa aaggtgatgg gttgtgttat gcttgtattg  1080

aatgctgtct tgacatctct tgccttgtcc tccggtatgt tctaaagctg tgtctgagat  1140

ctggatctgc ccatcacttt ggctagtgac agggctaatt aatttgcttt atacattttc  1200

ttttactttc cttttttcct ttctggaggc atcacatgct ggtgctgtgt ctttatgaat  1260

gttttaacca ttttcatggt ggaagaattt tatatttatg cagttgtaca attttatttt  1320

tttctgcaag aaaaagtgta atgtatgaaa taaaccaaag tcacttgttt gaaaataaat  1380

ctttattttg aactttataa aaagcaatgc agtaccccat agactggtgt taaatgttgt  1440

ctacagtgca aaatccatgt tctaacatat gtaataattg ccaggagtac agtgctcttg  1500

ttgatcttgt attcagtcag gttaaaacaa cggacaataa aagaatgaac acattcaaaa  1560

aaaaaaaa                                                           1568

<210>4

<211>5511

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：C11orf9

<400>4

acacacacac acccctcccc tgccatccct ccccggactc cggctccggc tccgattgca    60

atttgcaacc tccgctgccg tcgccgcagc agccaccaat tcgccagcgg ttcaggtggc    120

tcttgcctcg atgtcctagc ctaggggccc ccgggccgga cttggctggg ctcccttcac    180

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ggcccggggc tccgaggtgg gcaactctca ggcagtgtgt cctgggactc tgaatggcct    300

gagtgtgacc ggcgatgctg agaaccaata ccagacactg tacaagctct acgagaggtg    360

tgaggtggtg atggggaacc ttgagattgt gctcacggga cacaatgccg acctctcctt    420

cctgcagtgg attcgagaag tgacaggcta tgtcctcgtg gccatgaatg aattctctac    480

tctaccattg cccaacctcc gcgtggtgcg agggacccag gtctacgatg ggaagtttgc    540

catcttcgtc atgttgaact ataacaccaa ctccagccac gctctgcgcc agctccgctt    600

gactcagctc accgagattc tgtcaggggg tgtttatatt gagaagaacg ataagctttg    660

tcacatggac acaattgact ggagggacat cgtgagggac cgagatgctg agatagtggt    720

gaaggacaat ggcagaagct gtcccccctg tcatgaggtt tgcaaggggc gatgctgggg    780

tcctggatca gaagactgcc agacattgac caagaccatc tgtgctcctc agtgtaatgg    840

tcactgcttt gggcccaacc ccaaccagtg ctgccatgat gagtgtgccg ggggctgctc    900

aggccctcag gacacagact gctttgcctg ccggcacttc aatgacagtg gagcctgtgt    960

acctcgctgt ccacagcctc ttgtctacaa caagctaact ttccagctgg aacccaatcc   1020

ccacaccaag tatcagtatg gaggagtttg tgtagccagc tgtccccata actttgtggt   1080

ggatcaaaca tcctgtgtca gggcctgtcc tcctgacaag atggaagtag ataaaaatgg   1140

gctcaagatg tgtgagcctt gtgggggact atgtcccaaa gcctgtgagg gaacaggctc   1200

tgggagccgc ttccagactg tggactcgag caacattgat ggatttgtga actgcaccaa   1260

gatcctgggc aacctggact ttctgatcac cggcctcaat ggagacccct ggcacaagat   1320

ccctgccctg gacccagaga agctcaatgt cttccggaca gtacgggaga tcacaggtta   1380

cctgaacatc cagtcctggc cgccccacat gcacaacttc agtgtttttt ccaatttgac    1440

aaccattgga ggcagaagcc tctacaaccg gggcttctca ttgttgatca tgaagaactt    1500

gaatgtcaca tctctgggct tccgatccct gaaggaaatt agtgctgggc gtatctatat    1560

aagtgccaat aggcagctct gctaccacca ctctttgaac tggaccaagg tgcttcgggg    1620

gcctacggaa gagcgactag acatcaagca taatcggccg cgcagagact gcgtggcaga    1680

gggcaaagtg tgtgacccac tgtgctcctc tgggggatgc tggggcccag gccctggtca    1740

gtgcttgtcc tgtcgaaatt atagccgagg aggtgtctgt gtgacccact gcaactttct    1800

gaatggggag cctcgagaat ttgcccatga ggccgaatgc ttctcctgcc acccggaatg    1860

ccaacccatg gagggcactg ccacatgcaa tggctcgggc tctgatactt gtgctcaatg    1920

tgcccatttt cgagatgggc cccactgtgt gagcagctgc ccccatggag tcctaggtgc    1980

caagggccca atctacaagt acccagatgt tcagaatgaa tgtcggccct gccatgagaa    2040

ctgcacccag gggtgtaaag gaccagagct tcaagactgt ttaggacaaa cactggtgct    2100

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catgatgctg ggcggcactt ttctctactg gcgtgggcgc cggattcaga ataaaagggc    2220

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taacaaagtc ttggccagaa tcttcaaaga gacagagcta aggaagctta aagtgcttgg    2340

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gattccagtc tgcattaaag tcattgagga caagagtgga cggcagagtt ttcaagctgt    2460

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attggctgaa gtaccagacc tgctagagaa gggggagcgg ttggcacagc cccagatctg    3000

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gagccggagc aggagccgga gcccacggcc acgcggagat agcgcctacc attcccagcg    3600

ccacagtctg ctgactcctg ttaccccact ctccccaccc gggttagagg aagaggatgt    3660

caacggttat gtcatgccag atacacacct caaaggtact ccctcctccc gggaaggcac    3720

cctttcttca gtgggtctca gttctgtcct gggtactgaa gaagaagatg aagatgagga    3780

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agatgaagac tatgaatata tgaatcggca acgagatgga ggtggtcctg ggggtgatta    4020

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ggggcctgga catcaggccc cccatgtcca ttatgcccgc ctaaaaactc tacgtagctt    4140

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ctaggctctt atgtgtgcct ttgtttccca tcagactgtc aagaagagga aagggaggaa    4620

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catccttaaa acaattctgt gacatacata ttatctcatt ttacacaaag ggaagtcggg    4860

catggtggct catgcctgta atctcagcac tttgggaggc tgaggcagaa ggattacctg    4920

aggcaaggag tttgagacca gcttagccaa catagtaaga cccccatctc tttaaaaaaa    4980

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gccagcactt tgggaggctg agatgggaag atcacttgag cccagaatta gagataagcc    5100

tatggaaaca tagcaagaca ctgtctctac aggggaaaaa aaaaaaagaa actgagcctt    5160

aaagagatga aataaattaa gcagtagatc caggatgcaa aatcctccca attcctgtgc    5220

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acctagacat ctcatctcag gaagtggtgg tgggggtagt cagaaggaaa aataactgga   5400

catctttgtg taaaccataa tccacatgtg ccgtaaatga tcttcactcc ttatccgagg   5460

gcaaattcac aaggatcccc aagatccact tttagaagcc attctcatcc a            5511

<210>5

<211>4098

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：C1orf106

<400>5

atgctgcaaa tgccgaagtt aaatgaaata cctccgggga gggcaggccg cagggaggct     60

cggggggagg gaagatggcc tggacaaaca ggtcctgaag ctgcgaggct ggagtggagg    120

gcgcaggggc aggcgggcgg cgccagagct ccatgggaca gctggggaag ctccaggcta    180

cctacacaac ctggcccagg ctggtcacgg tgtcccccct ccctgctctg tgccctctcc    240

ttccagaaat ccaccatgga gagtaaggat gaggtcagcg acaccgacag tggcatcatc    300

ctgcagtctg gccccgacag cccggtctcc ccaatgaagg agctgaccca tgcagtgcac    360

aagcagcaga gggccctgga agcgaggctg gaggcctgcc tggaggagct gaggagactc    420

tgccttcggg aagcggagct gacgggcacc ttgccagcgg agtatcccct caaaccaggg    480

gaaaaggccc ccaaggttcg ccgcaggatc ggagcggctt acaaactgga tgactgggcc    540

ttgcacagag aggaccccct aagcagcctg gagcgccagc tggccctgca gctgcagatc    600

acagaggcag cccgtcggct gtgcctggag gagaacctca gcaggcaggc tcggcggcag    660

cggaagcact ccatgctgca ggaggagaag aagctgcagg agctccagcg ctgcctggtc    720

gagcggcggc gcaatagcga gccacctccg gctgctgctc tccccctggg ccgagagctc    780

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gactcagctc accgagattc tgtcaggggg tgtttatatt gagaagaacg ataagctttg    660

tcacatggac acaattgact ggagggacat cgtgagggac cgagatgctg agatagtggt    720

gaaggacaat ggcagaagct gtcccccctg tcatgaggtt tgcaaggggc gatgctgggg    780

tcctggatca gaagactgcc agacattgac caagaccatc tgtgctcctc agtgtaatgg    840

tcactgcttt gggcccaacc ccaaccagtg ctgccatgat gagtgtgccg ggggctgctc    900

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ccacaccaag tatcagtatg gaggagtttg tgtagccagc tgtccccata actttgtggt   1080

ggatcaaaca tcctgtgtca gggcctgtcc tcctgacaag atggaagtag ataaaaatgg   1140

gctcaagatg tgtgagcctt gtgggggact atgtcccaaa gcctgtgagg gaacaggctc   1200

tgggagccgc ttccagactg tggactcgag caacattgat ggatttgtga actgcaccaa   1260

gatcctgggc aacctggact ttctgatcac cggcctcaat ggagacccct ggcacaagat   1320

ccctgccctg gacccagaga agctcaatgt cttccggaca gtacgggaga tcacaggtta    1380

cctgaacatc cagtcctggc cgccccacat gcacaacttc agtgtttttt ccaatttgac    1440

aaccattgga ggcagaagcc tctacaaccg gggcttctca ttgttgatca tgaagaactt    1500

gaatgtcaca tctctgggct tccgatccct gaaggaaatt agtgctgggc gtatctatat    1560

aagtgccaat aggcagctct gctaccacca ctctttgaac tggaccaagg tgcttcgggg    1620

gcctacggaa gagcgactag acatcaagca taatcggccg cgcagagact gcgtggcaga    1680

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catgatgctg ggcggcactt ttctctactg gcgtgggcgc cggattcaga ataaaagggc    2220

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ctcgggtgtc tttggaactg tgcacaaagg agtgtggatc cctgagggtg aatcaatcaa    2400

gattccagtc tgcattaaag tcattgagga caagagtgga cggcagagtt ttcaagctgt    2460

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gagccggagc aggagccgga gcccacggcc acgcggagat agcgcctacc attcccagcg    3600

ccacagtctg ctgactcctg ttaccccact ctccccaccc gggttagagg aagaggatgt    3660

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ccttgaggag ctgggttatg agtacatgga tgtggggtca gacctcagtg cctctctggg    3900

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ttaactatga gccaggcatc atactaaact tcacctacat tatctcactt agtcctttat    4800

catccttaaa acaattctgt gacatacata ttatctcatt ttacacaaag ggaagtcggg    4860

catggtggct catgcctgta atctcagcac tttgggaggc tgaggcagaa ggattacctg    4920

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acctagacat ctcatctcag gaagtggtgg tgggggtagt cagaaggaaa aataactgga   5400

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<210>12

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<212>DNA

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<220>

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cggaagtcca gcgtgcttgt gtgcctggtg gaaactgagg agcaggatgc atattattca    540

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caggggtaca aggtattctc caagttctac ctgacgtacc ccaccaaaag aaacgaattc    720

cattttaaca tttattcatt caccttcacc tggtggtgat cctcaggagc agagactgtt   780

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tcacaaacat caggcaattt ccagggttgg tctagagtct tgccactaaa tattgatcac   900

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tacctcttgt atggaggtac aaaagactga cctcttacat caaggaactt cctttcccag  1500

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<210>13

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<212>DNA

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gagaagtatc tgacacctca gcttcctcca gttcctataa ttccagagca taaaaagtat    660

agacgagaca gtgcctcagt cgtagaccag ttcttcactg acactgaagg gttaccttac    720

agtatcaaca tgaacgtctt cctccctgac atcactcacc tgagaactgg cctctacaaa    780

tcccagagac cgtgcgtaac acacatcaag acagaacctg ttgccatttt cagccaccag    840

agtgaaacga ctgcccctcc tccggccccg acccaggccc tccctgagtt caccagtata    900

ttcagctcac accagaccgc agctccagag gtgaacaata ttttcatcaa acaagaactt    960

cctacaccag atcttcatct ttctgtccct acccagcagg gccacctgta ccagctactg   1020

aatacaccgg atctagatat gcccagttct acaaatcaga cagcagcaat ggacactctt   1080

aatgtttcta tgtcagctgc catggcaggc cttaacacac acacctctgc tgttccgcag   1140

actgcagtga aacaattcca gggcatgccc ccttgcacat acacaatgcc aagtcagttt   1200

cttccacaac aggccactta ctttcccccg tcaccaccaa gctcagagcc tggaagtcca   1260

gatagacaag cagagatgct ccagaattta accccacctc catcctatgc tgctacaatt   1320

gcttctaaac tggcaattca caatccaaat ttacccacca ccctgccagt taactcacaa    1380

aacatccaac ctgtcagata caatagaagg agtaaccccg atttggagaa acgacgcatc    1440

cactactgcg attaccctgg ttgcacaaaa gtttatacca agtcttctca tttaaaagct    1500

cacctgagga ctcacactgg tgaaaagcca tacaagtgta cctgggaagg ctgcgactgg    1560

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cacaactaaa actggaaatg tatattttgt atatttgaga aaacagggaa tacattgtat    1860

taataccaaa gtgtttggtc attttaagaa tctggaatgc ttgctgtaat gtatatggct    1920

ttactcaagc agatctcatc tcatgacagg cagccacgtc tcaacatggg taaggggtgg    1980

gggtggaggg gagtgtgtgc agcgttttta cctaggcacc atcatttaat gtgacagtgt    2040

tcagtaaaca aatcagttgg caggcaccag aagaagaatg gattgtatgt caagatttta    2100

cttggcattg agtagttttt ttcaatagta ggtaattcct tagagataca gtatacctgg    2160

caattcacaa atagccattg aacaaatgtg tgggttttta aaaattatat acatatatga    2220

gttgcctata tttgctattc aaaattttgt aaatatgcaa atcagcttta taggtttatt    2280

acaagttttt taggattctt ttggggaaga gtcataattc ttttgaaaat aaccatgaat    2340

acacttacag ttaggatttg tggtaaggta cctctcaaca ttaccaaaat catttcttta    2400

gagggaagga ataatcattc aaatgaactt taaaaaagca aatttcatgc actgattaaa    2460

ataggattat tttaaataca aaaggcattt tatatgaatt ataaactgaa gagcttaaag    2520

atagttacaa aatacaaaag ttcaacctct tacaataagc taaacgcaat gtcattttta    2580

aaaagaagga cttagggtgt cgttttcaca tatgacaatg ttgcatttat gatgcagttt    2640

caagtaccaa aacgttgaat tgatgatgca gttttcatat atcgagatgt tcgctcgtgc   2700

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gtaattttat ctaaattaca gtgcagttta gttaatctat taatactgac tcagtgtctg   2820

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atttattttg tggtaatata gtaagttttt ttagaagaca attttcataa cttgataaat   3060

tatagttttg tttgttagaa aagttgctct taaaagatgt aaatagatga caaacgatgt   3120

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agaaatcggt tgctgttttg cttctttttc cctcttattt ttgtattgtg gtcatttcct   3240

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<210>14

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<213>智人(Homo sapiens)

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<400>14

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tggagaacga atttgtcctc atcaagaagg atgtggatga agcttacatg aacaaggtag    720

agctggagtc tcgcctggaa gggctgaccg acgagatcaa cttcctcagg cagctatatg    780

aagaggagat ccgggagctg cagtcccaga tctcggacac atctgtggtg ctgtccatgg    840

acaacagccg ctccctggac atggacagca tcattgctga ggtcaaggca cagtacgagg    900

atattgccaa ccgcagccgg gctgaggctg agagcatgta ccagatcaag tatgaggagc    960

tgcagagcct ggctgggaag cacggggatg acctgcggcg cacaaagact gagatctctg   1020

agatgaaccg gaacatcagc cggctccagg ctgagattga gggcctcaaa ggccagaggg   1080

cttccctgga ggccgccatt gcagatgccg agcagcgtgg agagctggcc attaaggatg   1140

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<213>智人(Homo sapiens)

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cactctgcct caacgcccag ggccgcagaa atggcgaggc cctcatccgc tttgtggaca    1080

gcgagcagcg ggacctagcg ctgcagagac acaagcacca catgggcgtc cgctatattg    1140

aggtgtataa agcgacaggg gaggagtttg taaagattgc agggggcaca tcactagagg    1200

tggctcgttt cttgtcacgg gaagaccaag tgatcctgcg gctgcgggga ctgcccttct    1260

cggctgggcc aacggacgtg cttggcttcc tggggccaga gtgcccagtg actgggggta    1320

ccgaggggct gctctttgtg cgccatcctg atggccggcc gactggtgat gccttcgccc    1380

tctttgcttg tgaggagctg gcacaggctg cactgcgcag gcacaagggc atgctgggta    1440

agcgatacat tgaactcttc cggagcactg cagccgaagt gcagcaggtc ttgaaccgct    1500

atgcatccgg cccactcctt cctacactga ctgccccact gctgcccatc cccttcccac    1560

tggcacctgg gactgggagg gactgtgtac gcctccgagg cctgccctac acggccacca    1620

ttgaagacat cctgagcttt ctgggggagg cagcagctga cattcggccc cacggtgtac    1680

acatggtgct caaccagcag ggccggccat cgggcgatgc cttcattcag atgacatcag    1740

cagagcgagc cctagctgct gctcagcgtt gccataagaa ggtgatgaag gagcgctacg    1800

tggaggtggt cccctgttcc acagaggaga tgagccgagt gctgatgggg ggcaccttgg    1860

gccgcagtgg catgtcccct ccaccctgca agctgccctg cctctcacca cctacctaca    1920

ccaccttcca agccacccca acgctcattc ccacggagac ggcagctcta tacccctctt    1980

cagcactgct cccagctgcc agggtgcctg ctgcccccac ccctgttgcc tactatccag    2040

ggccagccac tcaactctac ctgaactaca cagcctacta cccaagcccc ccagtctccc    2100

ccaccactgt gggctacctc actacaccca ctgctgccct ggcctctgct cccacctcag    2160

tgttgtccca gtcaggagcc ttggtccgca tgcagggtgt cccatacacg gctggtatga    2220

aggatctgct cagcgtcttc caggcctacc agctacccgc tgatgactac accagtctga    2280

tgcctgttgg tgacccacct cgcactgtgt tacaagcccc caaggaatgg gtgtgtttgt    2340

aggagagaaa gccaggaggt aagagccagc tgatatcctc ggcgaacatg tctctcctga    2400

gtccagaaga ccagcaccct caacctggta gcttctttct ggcttgtcaa agctctcaga    2460

aggtacctag aggagcccaa gccccagctc catcctccac ttattctgcc tgtttccccc    2520

aaagacaatg gctggaccct gcatgcaggg ctgggggtgg aatggggcta accagctcct    2580

gatggcctga gccaggcatc ttgactggca cctggagagc ccttaagtct gtcctggctg    2640

tggcccatgc cgacagatat cgtggggctg acaggtccac ggcaggcttg ctttctttta    2700

taaaatggaa gctctggtac cttcaatgta tgactcctgg gagaatcaag ggtccatctg    2760

agcctctgag taaagatccc aatgttctac ctctccctgt ccctcttgta ggggataggg    2820

aggcagagag agccagcccc taccctcaga gtatctggac ctcagagacc atgttgtgcc    2880

aggggtggtc ccacctaaag atgctagccc ctctccaggt gggcataagg agtaacagat    2940

ggcaaaacca caaactattt tgatggactg tgctgcagta tcaccagaag acattagggg    3000

gcagtaggcc cccacacaaa accttcaggc ttgaatttta aaggggagga ctttctgcca    3060

acttttcttg tatgccttgg gaaagccagt tgccctgaac ccagcagaca ccatggaatg    3120

tcctttgcac gcattaaatg gtacagaact gaagcctcgg aagcaatttg gaactcgatc    3180

ttctcttcct taaatgaaaa gttattgacc aaatggactt tttaaaagac acaggaccct    3240

taactttgcc ccaaagtgag gggctccaca ccaaccccag gcggaggaac actcagacag    3300

attaaggata ctgttgacct gtcactgttt attatttcag cactaaaact gaggagcctc    3360

aactgctggc tcttcttccc tttgtatttg tgtaaggagc actgcactcc cataaaaggt    3420

tttaaaatac aaaatgtaca agaacacaca attccaagtg ctgtaaacat aactgagaac   3480

cagttccttt actaaacatc cattttataa aacacaaggt ttcaatttga gcccatctga   3540

gccttaaaga tccattctga ataccaaaaa cagggcttca cagccaggcc cagaagaggt   3600

ctggtgataa tggctggccc tgggtgggga tagtttacac ccgggcagca gcaccacaca   3660

tgaacccaaa gacatgttct ttttaaagct gttttcagcc atgtttctct gtgcatctcc   3720

agtaagcaga aggctaccca ttccattcct caacccaaga gctagcacag ttagagtagg   3780

agggggtgcg tactagcacg tgcccagttg ctcagtgctg ctagtagaaa ttgatttgca   3840

tagtccaatg gatgtgtgct ttaacaccac tatgttgcac aaaaatttaa gtctttatct   3900

acaaagccaa aaaatattga ctcttaacac caaagctttt acaaagctga tataaaactg   3960

cttacatagt atacaaagct ctattttaaa atttaatgtt tattttaaat aggaaagcat   4020

t                                                                   4021

<210>20

<211>3226

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：TMPRSS

<400>20

cgcgagctaa gcaggaggcg gaggcggagg cggagggcga ggggcgggga gcgccgcctg     60

gagcgcggca ggtcatattg aacattccag atacctatca ttactcgatg ctgttgataa    120

cagcaagatg gctttgaact cagggtcacc accagctatt ggaccttact atgaaaacca    180

tggataccaa ccggaaaacc cctatcccgc acagcccact gtggtcccca ctgtctacga    240

ggtgcatccg gctcagtact acccgtcccc cgtgccccag tacgccccga gggtcctgac    300

gcaggcttcc aaccccgtcg tctgcacgca gcccaaatcc ccatccggga cagtgtgcac    360

ctcaaagact aagaaagcac tgtgcatcac cttgaccctg gggaccttcc tcgtgggagc    420

tgcgctggcc gctggcctac tctggaagtt catgggcagc aagtgctcca actctgggat    480

agagtgcgac tcctcaggta cctgcatcaa cccctctaac tggtgtgatg gcgtgtcaca    540

ctgccccggc ggggaggacg agaatcggtg tgttcgcctc tacggaccaa acttcatcct    600

tcagatgtac tcatctcaga ggaagtcctg gcaccctgtg tgccaagacg actggaacga    660

gaactacggg cgggcggcct gcagggacat gggctataag aataattttt actctagcca    720

aggaatagtg gatgacagcg gatccaccag ctttatgaaa ctgaacacaa gtgccggcaa    780

tgtcgatatc tataaaaaac tgtaccacag tgatgcctgt tcttcaaaag cagtggtttc    840

tttacgctgt atagcctgcg gggtcaactt gaactcaagc cgccagagca ggatcgtggg    900

cggtgagagc gcgctcccgg gggcctggcc ctggcaggtc agcctgcacg tccagaacgt    960

ccacgtgtgc ggaggctcca tcatcacccc cgagtggatc gtgacagccg cccactgcgt   1020

ggaaaaacct cttaacaatc catggcattg gacggcattt gcggggattt tgagacaatc   1080

tttcatgttc tatggagccg gataccaagt agaaaaagtg atttctcatc caaattatga   1140

ctccaagacc aagaacaatg acattgcgct gatgaagctg cagaagcctc tgactttcaa   1200

cgacctagtg aaaccagtgt gtctgcccaa cccaggcatg atgctgcagc cagaacagct   1260

ctgctggatt tccgggtggg gggccaccga ggagaaaggg aagacctcag aagtgctgaa   1320

cgctgccaag gtgcttctca ttgagacaca gagatgcaac agcagatatg tctatgacaa   1380

cctgatcaca ccagccatga tctgtgccgg cttcctgcag gggaacgtcg attcttgcca   1440

gggtgacagt ggagggcctc tggtcacttc gaagaacaat atctggtggc tgatagggga   1500

tacaagctgg ggttctggct gtgccaaagc ttacagacca ggagtgtacg ggaatgtgat   1560

ggtattcacg gactggattt atcgacaaat gagggcagac ggctaatcca catggtcttc   1620

gtccttgacg tcgttttaca agaaaacaat ggggctggtt ttgcttcccc gtgcatgatt    1680

tactcttaga gatgattcag aggtcacttc atttttatta aacagtgaac ttgtctggct    1740

ttggcactct ctgccattct gtgcaggctg cagtggctcc cctgcccagc ctgctctccc    1800

taaccccttg tccgcaaggg gtgatggccg gctggttgtg ggcactggcg gtcaagtgtg    1860

gaggagaggg gtggaggctg ccccattgag atcttcctgc tgagtccttt ccaggggcca    1920

attttggatg agcatggagc tgtcacctct cagctgctgg atgacttgag atgaaaaagg    1980

agagacatgg aaagggagac agccaggtgg cacctgcagc ggctgccctc tggggccact    2040

tggtagtgtc cccagcctac ctctccacaa ggggattttg ctgatgggtt cttagagcct    2100

tagcagccct ggatggtggc cagaaataaa gggaccagcc cttcatgggt ggtgacgtgg    2160

tagtcacttg taaggggaac agaaacattt ttgttcttat ggggtgagaa tatagacagt    2220

gcccttggtg cgagggaagc aattgaaaag gaacttgccc tgagcactcc tggtgcaggt    2280

ctccacctgc acattgggtg gggctcctgg gagggagact cagccttcct cctcatcctc    2340

cctgaccctg ctcctagcac cctggagagt gcacatgccc cttggtcctg gcagggcgcc    2400

aagtctggca ccatgttggc ctcttcaggc ctgctagtca ctggaaattg aggtccatgg    2460

gggaaatcaa ggatgctcag tttaaggtac actgtttcca tgttatgttt ctacacattg    2520

ctacctcagt gctcctggaa acttagcttt tgatgtctcc aagtagtcca ccttcattta    2580

actctttgaa actgtatcac ctttgccaag taagagtggt ggcctatttc agctgctttg    2640

acaaaatgac tggctcctga cttaacgttc tataaatgaa tgtgctgaag caaagtgccc    2700

atggtggcgg cgaagaagag aaagatgtgt tttgttttgg actctctgtg gtcccttcca    2760

atgctgtggg tttccaacca ggggaagggt cccttttgca ttgccaagtg ccataaccat    2820

gagcactact ctaccatggt tctgcctcct ggccaagcag gctggtttgc aagaatgaaa    2880

tgaatgattc tacagctagg acttaacctt gaaatggaaa gtcttgcaat cccatttgca    2940

ggatccgtct gtgcacatgc ctctgtagag agcagcattc ccagggacct tggaaacagt   3000

tggcactgta aggtgcttgc tccccaagac acatcctaaa aggtgttgta atggtgaaaa   3060

cgtcttcctt ctttattgcc ccttcttatt tatgtgaaca actgtttgtc tttttttgta   3120

tcttttttaa actgtaaagt tcaattgtga aaatgaatat catgcaaata aattatgcga   3180

tttttttttc aaagcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                  3226

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：ANXA3；获自说明书表4

<400>21

tcagaggaat tggaactgat gagaa                                           25

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：AP1M2；获自说明书表4

<400>22

agggcaagcc attgatcagc cgcaa                                           25

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：ATP1B1；获自说明书表4

<400>23

cagtgcactg gcaagcgaga tgaag                                           25

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：C11orf9；序列获自说明书表4

<400>24

gtcatggcct tcagcgtggt gtcca                                           25

<210>25

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：C1orf106；获自说明书表4

<400>25

tgggacagct ggggaagctc caggc                                           25

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：CDH1；获自说明书表4

<400>26

cccgccccat caggcctccg tttct                                           25

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：COBL；获自说明书表4

<400>27

ctgagaaagg tgcccttgct cgtgt                                           25

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：CYP3A7；获自说明书表4

<400>28

ttattttgat ggctctaaca gtgac                                           25

<210>29

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：DSG2；获自说明书表4

<400>29

cagagaggaa cacagcagct acact                                           25

<210>30

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：ELF3；获自说明书表4

<400>30

caagcacgcg cccagaggca cccac                                           25

<210>31

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：ERBB3；获自说明书表4

<400>31

gcaactctca ggcagtgtgt cctgg                                           25

<210>32

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：KLF5；获自说明书表4

<400>32

actgcgatta ccctggttgc acaaa                                           25

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：MAP7；获自说明书表4

<400>33

gcgaagcgaa acagcacccg acagc                                           25

<210>34

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：NQ01；获自说明书表4

<400>34

gagccatggt cggcagaaga gcact                                           25

<210>35

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：RBM35B；获自说明书表4

<400>35

gtgctgcagc agttctcaca gctgg                                           25

<210>36

<211>25

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>misc_feature

<223>基因ID：TMPRSS2；获自说明书表4

<400>36

tcggtgtgtt cgcctctacg gacca                                           25

Claims (26)

1、诊断胃癌淋巴结转移的方法，其包括以下步骤：

a)从患者获取生物学样品，和

b)测量样品中的标记水平；

其中该水平高于预定截止值水平指示胃癌淋巴结转移。

2、权利要求1的方法，其中所述标记是基因、基因片段或其互补体。

3、权利要求1的方法，其中所述标记是蛋白、蛋白片段或多肽。

4、权利要求1的方法，其进一步包括使用其它诊断方法。

5、权利要求4的方法，其中所述其它诊断方法包括进行血清测定。

6、权利要求1的方法，其进一步包括测量组成型表达的基因。

7、权利要求1的方法，其有至少80％的灵敏度。

8、权利要求1的方法，其有至少70％的特异性。

9、确定或调整胃癌患者治疗的方法，其包括以下步骤：

a.从胃癌症患者获得生物学样品；和

b.测量样品中的标记水平；

其中所述水平高于或低于截止值水平与确定或调整治疗的病程或者身体状况是相一致的。

10、权利要求9的方法，其中所述标记是基因、基因片段或其互补体。

11、权利要求9的方法，其中所述标记是蛋白、蛋白片段或多肽。

12、权利要求9的方法，其进一步包括测量组成型表达的基因。

13、权利要求9的方法，其中特异性至少是70％。

14、权利要求9的方法，其中灵敏度至少是约80％。

15、权利要求1的方法，其用微阵列进行。

16、权利要求9的方法，其用微阵列进行。

17、权利要求1的方法，其通过用扩增法进行。

18、权利要求17的方法，其中所述扩增法是PCR。

19、权利要求18的方法，其中所述PCR是RT-PCR。

20、权利要求9的方法，其通过用扩增法进行。

21、权利要求20的方法，其中所述扩增法是PCR。

22、权利要求21的方法，其中所述PCR是RT-PCR。

23、在生物学样品中进行测定以确定胃癌症诊断的试剂盒，其包括用于检测标记的材料。

24、权利要求23的试剂盒，其包括微阵列和试剂。

25、权利要求23的试剂盒，其包括PCR试剂。

26、权利要求23的试剂盒，其包括说明书。

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