CN1495273A - 评估结肠直肠癌 - Google Patents

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Abstract

通过分析一组基因的表达对相信患有结肠直肠癌的患者的结肠直肠癌存在与否或其可能状态进行评估的方法。本发明还涉及以多种媒介物,如微阵列作为含有基因表达分布图的试剂盒。

Description

评估结肠直肠癌
背景
本申请要求2002年3月29日申请的序列号为60/368,798的美国临时申请的利益。
本发明涉及基于生物样本基因表达分布图的结肠直肠癌的诊断和预测。
结肠直肠癌是一种异源疾病,由据认为是通过三种主要分子机制形成的肿瘤组成:1)与染色体不稳定性相结合的多发性结肠腺癌(APC)基因,或β-连环蛋白基因的突变,2)与微卫星序列不稳定性相关的DNA错配修复基因如MLH1,MSH2,PMS2和MSH6的突变,和包含短重复序列基因的突变,以及3)由肿瘤抑制基因启动子区的过甲基化诱导的基因沉默。结肠直肠癌个体的遗传互补可能包括遗传不稳定性、特异突变和基因沉默的不同结合。染色体不稳定性(CIN)一般是癌症的普遍特征。它意味着其中所有的或大部分的染色体丢失或增加了的非整倍体表型。伴随短重复序列突变率的增加,在二倍体肿瘤中发现了微粒体不稳定性(MIN)。这两种遗传不稳定性的形式在结肠直肠癌中很普遍。
因此结肠直肠癌具有复杂的起源并且包括不同生物通路间大量的相互作用。用于协助提供诊断、预测或治疗监测结果的血清标记、组织学和细胞学检查通常不具有所期望的可信度。同时,使用单独的遗传标记(例如一特殊基因的表达增加)可能是有益的,癌症的多样性使遗传标记的组合可能成为最好的途径。
发明概述
本发明是评估结肠直肠癌存在或不存在,或者被认为患有结肠直肠癌的患者其可能状态的方法。在本方法中,通过分析患者样本的基因表达分布图确定患者是否得了结肠直肠癌,患者是否未得结肠直肠癌,患者是否可能要得结肠直肠癌,或正在接受治疗的结肠直肠癌患者对治疗的反应。
本发明的一个方面涉及用于实施该方法的制品。这样的制品包括基因表达分布图或固定于机器可读媒介如计算机可读媒介的基因表达分布图的表现物。
用来鉴别基因表达分布图的制品也可以包括用于捕捉和/或显示基因存在,缺失或表达程度的基片或平面,如微阵列。
发明详述
很少发现组织样本中单纯的特定核苷酸序列的存在或缺失具有诊断或预测价值。另一方面,关于多种蛋白、肽或mRNA表达的信息正越来越受到重视。具有表达蛋白、肽或mRNA(这样的序列是指“基因”)的潜在可能的特定核苷酸序列仅在给定细胞的基因组中存在并不能决定该蛋白、肽或mRNA一定会在给定的细胞中表达。给定的基因能否表达蛋白、肽或mRNA以及表达到何种程度取决于多种复合因子。不考虑理解和评估这些因子的困难程度,检测基因表达可以为如肿瘤发生、转移、细胞凋亡以及其他临床有关现象等重要事件的发生提供有用的信息。通过基因表达分布图可以发现基因激活或失活程度的相对指标。本发明的基因表达分布图可用于结肠直肠癌患者的诊断和治疗。
样品制备需要收集患者样本。本发明使用的病例样本是那些疑为含有患病细胞的样本,如取自结肠样本或外科切除样本的上皮细胞。获得可疑样本的一种有用技术是激光捕捉微切片技术(LCM)。激光捕捉微切片技术提供了一种选择需研究细胞的方法,并最小化由细胞种类的不均一性造成的易变性。因此,正常细胞和癌细胞之间的基因表达中度或细小的变化都可以被轻易检测到。在优选的方法中,样本包括从外周血中提取的循环系统上皮细胞。这可以按照多种方法获得,但最优化的方法是参考引用Immunivest公司的美国专利6,136,182所描述的磁性分离技术。一旦得到含有所关注细胞的样本,就提取其RNA,扩增得,并获得基因表达分布图,优选的通过微阵列获得合适组配的基因。
确证基因表达分布的优选方法包括,确定一个能够编码蛋白质或肽的基因所产生的RNA的量。这可通过逆转录酶PCR(RT-PCR),竞争性RT-PCR,实时RT-PCR,差异显示RT-PCR,Northern杂交分析和其他相关实验实现。当可能用单个PCR反应实施这些技术时,最好扩增来自mRNA的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)并用微阵列对其分析。对本领域的技术人员来说大量不同的阵列构型及其生产方法是已知的,并且也在如下的美国专利中有描述:5,445,934;5,532,128;5,556,752;5,242,974;5,384,261;5,405,783;5,412,087;5,424,186;5,429,807;5,436,327;5,472,672;5,527,681;5,529,756;5,545,531;5,554,501;5,561,071;5,571,639;5,593,839;5,599,695;5,624,711;5,658,734;和5,700,637;这些专利披露的技术在此引入作为参考。
微阵列技术允许同时检测数千基因的稳定状态的mRNA水平,因此它为检测非控制的细胞增殖效果,如启动、抑制或调节等提供了一个强有力的工具。现在两种微阵列技术正被广泛使用。第一种是cDNA阵列,第二种是寡核苷酸阵列。尽管这些芯片在构造上存在差异,但其下游数据的分析和输出实质上是相同的。这些分析的结果典型地是对由标记探针获得的信号强度的测定,所述的探针用于检测与阵列上已知位点的序列杂交的、来自样品的cDNA序列。典型地,所述的信号强度与cDNA的含量,或者说样本细胞中所表达的mRNA的量成比例。有许多这样的技术可以获得并且是有用的。优选的检测基因表达的方法可以在美国专利中找到,如Linsley等人的专利6,271002;Friend等人的专利6,218,122;Peck等人的专利6,218,114;Wang等人的专利6,004,755,其所公开的内容均在此引入作为参考。
基因表达水平的分析通过比较强度进行。最好是通过制备一种待测样品中基因表达强度相对于对照样品中基因表达强度的比值矩阵进行。例如,可以将疾病组织中基因表达的强度与相同类型正常组织中的表达强度进行比较(例如患病的结肠组织样本对正常的结肠组织样本)。这个表达强度的比值显示出被测样本和对照样本中基因表达的倍数变化。
基因表达分布图也可以通过很多方法显示。最普遍的方法是用树突状图处理原始的荧光强度或矩阵系数,其中列表示被测样品,行表示基因。数据经这样的处理后那些具有相似表达分布的基因就会相互邻近。每个基因的表达比率可用一种颜色显示。例如,小于一的比率(表示下调)可以出现在图谱的蓝色部分,而大于一的比率(表示上调)可以出现在图谱的红色部分。商业上可购买到的计算机软件程序很适合显示这样的数据,包括Silicon Genetics有限公司的“GENESPRING”,Partek有限公司的“DISCOVERY”和“INFER”软件。
用于本发明的方法的受调节基因如表1所示。患病细胞中差异表达的基因表现为上调或下调。上调和下调是相对的术语,表示可检测到的相对于某种基线的基因表达的量的差异(超出检测系统的噪音影响)。在这种情况中,基线是正常细胞测得的基因表达。再使用同样的测量方法确定患病细胞中所关注的基因相对于基线水平是上调或下调。上下文中,患病的,是指伴随细胞非控制增殖而出现的机体状态的改变,此种改变中断。扰乱,或潜在的打乱机体功能的适当表现。当某人基因型或表型的一些方面一致表现出存在特定疾病时,他就被诊断为患有该种疾病。作出诊断或预测的行为包括确定疾病表象/状态的情况,如治疗监测。在治疗监测中,比较经过一段时间治疗后的基因表达确定基因表达分布图是否有变化,或其变化与正常组织的模式更为一致来考虑疗程的效果从而作出临床判定。
优选的,上升或下降调节的水平是以杂交的微阵列探针测量强度的成倍变化来区别的。2倍差异或p值小于0.5对于作出这样的辨别是优选的。即当认为与在正常细胞中相比一个基因在患病细胞中差异表达时,患病细胞中的强度至少是超出正常细胞的2倍或低于正常细胞2倍。差异倍数越大,基因越优选用作诊断。本发明选择用作分析表达分布图的基因具有产生使该基因区别于正常基因或非调节基因的信号的表达水平,该信号量超出使用临床实验室检测设备的背景量。
利用统计值可用于确定地使调节基因与非调节基因和噪音区别开。通过统计检验发现在不同样本组之间有显著差异的基因。Student’s T检验就是一个发现两组之间显著差异的有力的统计检验的例子。p值越小,不同组之间基因显示差异的证据就越有说服力。然而既然微阵列可以同时检测多个基因,那么就需要同时进行万次的统计检验。因此,就存在偶尔看到极小p值的可能,并利用Sidak校正以及作出随机化/排列实验进行调整。T检验中p值小于.05就证明基因是差异显著的。更有说服力的证据是加入Sidak校正因子后p值小于.05。对于每组中的大量样品,经过随机化/排列检验后p值小于.05是差异显著的最有说服力的证据。
另一个可用来选择产生强于非调节基因和噪音信号的基因的参数是绝对信号差异测量值。优选的,调节基因的表达形成的信号与正常基因或非调节基因(以绝对值为基础)至少有20%的差异。更优选的,调节基因形成的表达模式与正常基因或非调节基因至少有30%的差异。
将基因分组以便于通过获得一组基因中一套基因的信息为诊断、预测或治疗等相关临床判断提供可靠的基础。这些套基因构成了本发明的框架(portfolios)。此例中,由该框架支持的判断包括结肠直肠癌。基因表达分布图的框架包含实施例3中描述的基因联合组合。对于大多数诊断标记物来说,最好使用尽量少的标记物就足以充分作出一个正确的医学判断。这就避免了使用那些悬而未决需作进一步分析的治疗措施带来的延误,同时又避免了时间和资源的不合理使用。此例中,这样的最小量的框架包含实施例4中的基因组合。
优选的,构建这样的框架以保证该框架中的基因组合相对于单个基因或随机选择的基因组合显示出更好的灵敏度和特异性。在本发明中,框架的灵敏度反映在一个基因在疾病状态下相对于其在正常状态下所表现出的基因表达的成倍差异中。特异性可以反映在对所关注的基因表达信号相关性的统计测量中。例如,标准差就是这样一个有用的度量。当考虑将一组基因掺入到某一框架中时,表达测量值的标准差越小其特异性越大。其他检测变量,如相关系数也包括在使用范围内。
最优选地,建立基因表达框架的方法是运用优化算法,如在确定股票投资中广泛使用的平均方差算法的。这一方法在同日期的Tim Jatkoe等人标题为“笼统投资选择”的同时待审的专利申请中有详细表述。该方法实质上要求一套输入值(财务应用中的库存,这里指通过强度测定的表达),其可优化收到的返回值(例如形成的信号)以进行应用,同时最小化返回值的可变性。许多商业软件程序适合进行这样的操作。在整个说明书中称为“Wagner软件”的“Wagner联合均值-方差优化应用程序”是优选的。这个软件使用“Wagner联合均值-方差优化库”中的功能,来确定有效边界和Markowitz意义上优选的优化框架。
由于该软件用于金融分析目的,因此使用这种类型的软件需要将微阵列数据进行转换,使数据以股票回报值和风险测量值的方式输入处理。例如,当Wagner软件与微阵列强度测定协同应用时,要运用以下的数据转换方法。
首先通过确定那些其表达至少显示出某种微小差异水平的基因,对基因进行预选择。优选的预选择过程如下所述。选择一个基线组。典型的基线组包含来自未患有所述疾病的群体的基因。例如,在选择所用于诊断乳腺癌的框架时,可以将未患乳腺癌患者的样本用作制备基线组。一旦选择了基线组,就可以计算出基线组样本中每个基因的表达指标的算术平均值和标准差。典型的,这个指标是微阵列记录的荧光强度。随后将通过计算得到的统计学数据用于计算每个基因的基线值(X*标准差+均值)。这就是基因的基线记录,其它所有样本都要与其相比较。X是由制定框架的人选择出来的严格变量。X的数值越大就越严格。优选的X数值范围是0.5-3,更优选的是2-3,最优选的是3。
随后计算每个实验样本(那些所关注的样本)与基线记录的比值。再将这些比值转换成易于软件处理的底数为10的对数值。该方法使下调基因显示为使用Wagner软件并按照Markman均值-方差算法所必需优化的负值。
将包含这些转换比值的预处理数据作为输入替代用于金融分析目的的Wagner软件中通常使用的资产回报值。
一旦制定出有效边界,对于一个给定的输入水平值(返回值)或对应于边界上的一个点的方差,就可以选择出一个优化框架。这些输入值或方差是制定框架的人预先确定的标准数集。换句话说,寻求最适框架的人决定一个可接受的输入水平(表明灵敏度)或者一个给定的方差水平(表明特异性),选择位于该输入水平或方差相应的有效边界选择基因。当选定了输入水平或方差,Wagner软件就能够选择出这样的基因。Wagner软件可以像对股票笼统投资中每支股票所做的那样,分配所述框架中每个基因的分量。
将患者样本框架中的基因中的表达,与用于构建所述框架的差异表达基因的计算值相比较,就可以确定该样本是否患有该框架所诊断的疾病。优选的,首先通过将在选择框架的过程中给每个基因分配的权重乘以框架中每个基因的强度值,加和得到框架值。然后用(Y*标准差+基线组中框架的均值)计算临界值,其中Y是一个严格数值,具有与上述X相同的含义。一个样本具有的框架值大于基线组的框架值,则此样本就被归为患病类。需要时,可以根据已知的统计学方法重复上述过程提高可信度水平。
任选的,可以重复进行上述过程直到获得预期的最高准确度。
框架选择的过程和未知量的表征过程概括如下:
1.选择基线组
2.计算基线组样本中每个基因的均值和标准差
3.计算每个基因的(X*标准差+均值)。这就是基线记录,其它所有的样本都要与这个基线记录相比较。X是一严格变量,X数值越大就越严格。
4.计算根据步骤3得到的每个实验样本对基线记录的比值。
5.转换数值,使值小于1的比值成为负数(例如使用底数为10的对数)。(现在下调的基因有正确的负值以符合MV优化的需要)。
6.将这些转换的比值作为输入值,替换软件应用中通常使用的资产回报值。
7.该软件将标绘出有效的边界线,并且返回一组沿此有效边界线上任意一点的优化框架。
8.在此有效边界线上选择一个所需的返回值或者方差
9.通过将在选择框架的算法中所给定的权重乘以每个基因的强度值,加和计算每个样本的框架值。
10.将基线组的框架值的均值加上Y与基线组的框架值的标准差的乘积,计算出临界值。大于该临界值的数值应被归为实验组。
11.任选的,可以重复进行上述过程,直到获得预期的最佳准确度。
可选择的,首先通过确定那些其表达至少显示出某种微小差异水平的基因,对基因进行预选择。在这个可选择的方法中,预选择优选的以 1 ≤ | ( μ t - μ n ) ( σ t + σ n ) | 给出的阈值为基础,其中μt是已知患病或有该疾病的样本子集的均值,μn是正常样本子集的均值,σtn表示联合标准差。通过对根据 0.5 ≤ | ( μ t - MA X n ) ( σ t + σ n ) | 得到的数据的预选择,噪音中止点的信号也能在其中使用。这就确保基于差异调节进行预选择的基因具有临床上的显著差异。即超过了适于测定各种临床参数的仪器产生的噪音水平。对于根据这些标准预选的每个标记物建立一个矩阵,其中列表示样本,行表示标记物,并且每个元件都是根据
Figure A0313120500093
对该标记物的表达进行标准化后所得到的强度测量值,其中I代表强度测量值。
也可以通过设置附加的边界条件来定义优化框架。例如,框架的大小可限定为固定的值域或标记物的数目。这或者可以通过制定更为严格的预选标准(例如以 0.8 ≤ | ( μ t - MAX n ) ( σ t + σ n ) | 代替 0.5 ≤ | ( μ t - MAX n ) ( σ t + σ n ) | )或通过使用程序特征如限制组合大小来实现。例如可以设置边界条件使有效边界线从最优化的10个基因中选出。也可以使用所有的预选基因确定有效边界线后再限定选择基因的数目(例如不超过10个)。
选择框架的过程也包括应用探索式的规则。优选的,这样的规则是基于生物学和对用于产生临床结果的技术理解的基础上制定的。更优选的是,它们应用到优选方法的输出数据中。例如,选择框架的均方差法可以应用于乳腺癌样本中大量差异表达基因的微阵列数据。这种方法得到的输出数据将会是一套优选的基因,包括既在外周血中表达也在患病乳腺组织中表达的一些基因。如果这种检测方法用到的样本来自外周血,并且某些基因既在乳腺癌个例也在外周血中差异表达,那么就可以应用探索式的规则,从排除了那些在外周血中差异表达的基因而得到的有效边界线上选择框架。当然,这个规则可以在形成有效边界线前应用,例如,将该规则应用到数据的预先选择中。
可以应用其他与未有定论的生物学问题无必然联系的探索式规则。例如,可以应用只有给定百分比的框架可用特定的基因表示的规则。商业上可购买的软件如Wagner软件就提供了这类型的探索式规则。这是非常有用的,例如,除了正确度和精密度(例如,预支专利转让费)等,其他因素也会影响包括一个或多个基因的可用性。
本发明的一个方法包括如上所述将基因表达分布图与多种基因(或分布图)比较以进行诊断。每个基因的基因表达分布图包括固定于如计算机可读的媒介物上的框架。这可以采取很多形式。例如,可以建立一个输入表示疾病的信号范围(例如强度测定值)的表格。可以将病例的实际数据与表格中的值进行比较以确定该患者的样品属于是正常的或患病的。在一个改进的具体实例中,表达信号的模式(例如荧光强度)以数字或图形方式记录。再将与病例样本相结合使用的框架中的基因表达模式与上述表达模式比较。然后利用模式比较软件确定该病例样本是否具有表示所讨论的疾病的模式。当然这些比较也可用于确定该病例的结果是否正常。再将样本的表达分布图与正常或对照细胞的框架相比较。如果样本表达模式与结肠直肠癌的表达模式一致,那么(无抵消性的医学理由)该病例就被诊断为结肠直肠癌阳性。如果样本表达模式与正常或对照细胞的表达模式一致,那么该病例就被诊断为结肠直肠癌阴性。
许多公知的识别模式的方法是适用的。下列参考提供了一些例子:
加权阈值Weighted Voting:
Golub,TR.,Sclonim,DK.,Tamaya,Huard,C.,Gaasenbeek,M.,Mesirov,JP,Coller,H.,Loh,L.,Downing,JR.,Caligiuri,MA.,Bloomfield.,CD.,Lander,ES.癌症的分子分类:利用基因表达检测的分类发现和分类预测。科学Science 286:531-537,1999
支持矢量机器Support Vector Machine:
Su,Al.,Welsh,JB.,Sapinoso,LM.,Kern,SG.,Dimitrov,P.,Lapp,H.,Schultz,G.,Powell,SM.,Moskaluk,CA.,Frierson,HF.Jr,Hampton,GM.利用基因表达信号的人类癌症的分子分类。癌症研究Cancer Research 61:7388-93,2001
Ramaswamy,S.,Tamayo,P.,Rifkin,R.,Mukherjee,S.,Yeang,GH.,Angelo,M.,Ladd,C.,Reich,M.,Latulippe,E.,Mesirov,JP.,Poggio,T.,Gerald,W,Loda,M.,Lander,ES.,Gould,TR利用肿瘤基因表达信号的多种类癌症诊断。美国国家科学院院刊Proceedingsof the National Academy of Sciences of the USA 98:15149-15154,2001
K-最邻近值K-nearest Neighbors:
Ramaswamy,S.,Tamayo,P.,Rifkin,R.,Mukherjee,S.,Yeang,GH.,Angelo,M.,Ladd,C.,Reich,M.,Latulippe,E.,Mesirov,JP.,Poggio,T.,Gerald,W.,Loda,M.,Lander,ES.,Gould,TR.利用肿瘤基因表达信号的多种类癌症诊断。美国国家科学院院刊Proceedingsof the National Academy of Sciences of the USA 98:15149-15154,2001
相关系数Correlation Coefficients:
van’t Veer LJ,Dai H,van de Vijver MJ,He YD,Hart AA,Mao M,Peterse HL,vander Kooy K,Marton MJ,Witteveen AT,Schreiber GJ,Kerkhoven RM,Roberts C,LinsleyPS,Bemards R,Friend SH.基因表达分布图预测乳腺癌的临床结果。自然Nature.2002 Jan 31:415(6871):530-6
本发明的基因表达分布图也可以与其他在癌症诊断、预测、或治疗监测中所使用的非遗传的诊断方法联合使用。例如,在一些情况中,将如上所述的基于基因表达能力的诊断方法与从如血清蛋白标记(例如癌胚性抗原)的传统标记物中得到的数据结合使用是很有益的。这样存在的标记物范围包括如CA19-9,CA125,CK-BB和鸟苷酸环化酶C的分析物。在这样的一个方法中,对治疗患者周期性采血,然后将血样作上述血清标记之一的酶联免疫检测。当标记的浓度暗示了肿瘤复发或治疗失败时,可以随后对样本源作基因表达分析。如果存在所怀疑的肿块,就进行更好的针吸采样并如上所述对取自肿块的细胞进行基因表达分布图分析。可选择的,组织样本可以取自刚摘取肿瘤的组织的邻近区域。当其他检测结果不确定时,这种方式特别有用。
当其它诊断的可靠性值得怀疑时,联合使用遗传标记和其他诊断是最优选的。例如,众所周知CEA血清水平在相当程度上受到与患者癌症状态毫无关系的因子的影响。当一个患者被监测到在接受结肠癌治疗后显示常规CEA检测高水平时,那联合进行基因表达/CEA检测是有益的。
本发明的制品包括用于治疗、诊断、预测和其它疾病评估的基因表达分布图的表示物。这些分布图表示物简化为可被机器自动可读的媒介物,如计算机可读媒介(磁性的,光学的及类似的)。制品也包括在这种媒介中评估基因表达分布图的指令说明。例如,制品可能包括具有用于比较上述基因组合的基因表达分布图的计算机指令的CD ROM。制品可能也含有基因表达分布图的数字记录以用于与病例样本的基因表达数据进行比较。可选择的,所述的分布图可以不同的表现格式记录。图形记录就是这样的一种格式。上文提到的“GENESPRING”和“DISCOVER”计算机程序中整合的聚类算法就可很好的协助这些数据形象化。
根据本发明生产制造的不同类型的物品是指用于揭示基因表达分布图的媒介物或格式化检测。这些可以包括,例如微阵列,其中将序列互补物或探针固定于基片上,它与表示所关注基因的序列联合建立一个易读行列式。可选择的,根据本发明的制品可以被制作成进行杂交、扩增,以及形成表示所关注的基因表达水平的信号以用来检测结肠直肠癌的试剂盒。
根据本发明制备的试剂盒包括确定基因表达分布图的格式化检测。这就包括了进行检测所需的如试剂和说明指令等所有或部分材料。
本发明进一步用下列非限定性的实施例说明。
实施例:根据本发明的基因分析是通过参考GenBank数据库中的基因ID号鉴定的。它们与编码产生蛋白质或肽的全长核苷酸序列典型相关。本领域的技术人员公认全长核苷酸序列的鉴定不是一个分析观点所必需的。即可以根据公知的为评估相关基因表达设计探针的原理进行部分序列或ESTs选择。
实施例1-样品处理和LCM
收集接受结肠直肠肿瘤外科手术患者的27个新鲜冷冻组织样本。19个样本是结肠直肠恶性肿瘤实例,8个样本是正常的结肠粘膜。组织在获得后的20-30分钟内快速液氮冷冻,并随后贮存于-80℃。为了激光捕捉,将样本切片(6μm),一切片封固于玻璃载片上,另一切片封固于已被固定于玻璃载片(Micro SlidesColorfrost,VWR Scientific,Media,PA)上的膜(P.A.L.M.)上.封固于玻璃载片上的切片在冷的丙酮中固定,并用Mayer’s苏木精(Sigma,St.Louis,MO)染色.病理学家为诊断和定级分析样本。由附带的使用Dukes分级的外科病理学和临床报告进行临床阶段评估。封固于膜上的切片在100%乙醇中固定5分钟,在曙红/100%乙醇(100μg曙红溶于100ml脱水乙醇)中复染1分钟,快速在100%乙醇中浸泡一次以除去未结合染料,空气中干燥10分钟。
结肠直肠腺癌中的两个为等级1,10个为等级2,5个为等级3。一个恶性肿瘤样本是盲肠的类癌瘤,另一个是转移的黑色素瘤的损伤。两个腺癌样本表现为粘蛋白状亚型,一个为章形细胞亚型。腺癌样本按Dukes分级划分如下:Dukes A:2,Dukes B:5,Dukes C:7,Dukes D:3。六个腺癌样本在手术前放疗过。
在LCM中使用前,膜(LPC-MEMBERANE PEN FOIL 1.35μmNo.8100,P.A.L.M.GrmbH Mikrolaser Technologie,Bemried,Germany)和载片经过预处理以除去RNA酶,并且增强组织样品在膜上的吸附。简要的,载片用DEPH2O洗涤,膜用RNase AWAY(Molecular Bioproducts,Inc.,San Diego,CA)洗涤并用DEP H2O冲洗。膜粘附到玻璃载片上后,载片于120℃烘烤8小时,用TI-SAD处理(Diagnostic Products Corporation,Los Angeles,CA,以1∶50溶于DEPH2O,用脱脂棉过滤),+37℃孵育30分钟。使用前,立即将10μl小份的RNA酶抑制剂溶液(RNA酶蛋白质抑制剂2500U=33U/μl N211A,Promega GmbH,Mannheim,Germany,0.5μl溶于400μl冷的含有0.15mol NaCl,10mmol TrispH8.0,0.25mmol二硫苏糖醇的溶液)铺展到膜上封固组织样本的位置。
封固于膜上的组织切片用于LCM。利用PALM自动微光束技术(P.A.L.M.Microlaser Technologie,Carl Zeiss,Inc.,Thornwood,NY)可捕捉的约2000个上皮细胞样品,并连接到Zeiss Axiovert 135显微镜中(Carl Zeiss Jena GmbH,Jena,Germany)。正常粘膜的外周基质和癌症样本中偶然的干扰基质成分都包括在内。捕捉到的细胞置于100%乙醇的小管中于-80℃保存。
实施例2-RNA提取和扩增
利用Zymo-Spin柱(Zymo Research,Orange,CA92867)提取通过LCM捕捉的细胞的总RNA。将约2ng总RNA重悬于10μl水并且利用T7 RNA聚合酶进行两轮扩增直至扩增的RNA产量约为50μg。
实施例3-cDNA微阵列杂交和定量
利用一套由约20,000个人cDNA克隆组成的cDNA微阵列检测样本。将约30个植物基因印迹到微阵列上作为非特异杂交对照。利用LCM捕捉细胞的5μg aRNA合成Cy3标记的cDNA探针。探针用Qiagen’s核苷酸去除柱(Nucleotide Removal Columns)纯化然后经14-16小时杂交到微阵列上。载片在扫描前经过洗涤并于空中干燥。扫描微阵列的Cy3荧光并用ImaGene软件(Biodiscovery,Los Angeles,CA)定量。对于每个cDNA克隆,进行重复点和重复阵列的四次测量并将所得强度值平均。
利用第三代微阵列点样仪(Molecular Dynamics)将cDNAs印迹到氨基硅烷涂层的载片上(Corning)。cDNAs经PCR扩增,纯化(Qiagen PCR纯化试剂盒),并与10M NaSCN印迹缓冲液1∶1混合。杂交前微阵列在异丙醇中室温孵育10分钟。探针于95℃孵育2分钟,室温孵育5分钟,然后加到三个平行测定的载片上。用DPX(Fluka)将盖片密封到载片上并于42℃孵育过夜。然后将载片在1×SSC/0.2%SDS和0.1×SSC/0.2%SDS中于55℃洗涤5分钟,0.1×SSC中浸润并干燥后用第三代微阵列扫描仪(Molecular Dynamics)扫描。用AUTOGENE软件(Biodiscovery,Los Angeles)分析每个点的荧光强度。
对芯片强度进行线性标准化使得每个芯片的强度记录75th个百分点相当于值100。芯片上的每个基因通过将该基因的强度记录除以所有样本的基因表达值记录的中间值标准化。在聚类前,那些至少在一个样本中不具有100或更大的强度记录的基因被滤掉了以限制对相似性量度的背景影响。选择一套6255个基因作聚类分析。利用作为相似性测量的相关度进行分级聚类,使具有表现正变化同时不考虑其负变化(Silicon Genetic,Sunnyville,CA)的基因的样品聚类到一起。系统图的每一个主要节点可被认为是样本的一个亚组。通过将每个肿瘤亚组与正常组进行比较鉴定差异表达的基因。筛选是基于 1 ≤ | ( μ t - μ n ) ( σ t + σ n ) | 给出的信噪比测量阈值,其中μt是肿瘤子集的平均数,μn是正常样本子集的平均数,σtn表示结合标准差。组内一个基因的强度记录的变异系数必须低于0.33,因为基因处于成对方式比较之中。肿瘤组的中间值与正常组的中间值相比大于2或等于2是为上调,小于或等于0.5倍时为下调。如果一个基因符合所有标准则被选择出来。在所有的比较中均被筛选出来的基因即被认为是在结肠直肠癌中稳定调节异常的。利用T检验假定不等方差计算统计学显著性p值。用于聚类的一套基因也用软件包(Partek,St Louis,MO)进行主成分分析(PCA)。然后将数据投射到简化的三维空间。正常的和结肠直肠肿瘤的样本以映射表达水平表现出来。
建立有很大上调差异的基因列表以用来区别肿瘤和正常样本。利用 0.5 ≤ | ( μ t - MAX n ) ( σ t + σ n ) | 作为信噪比中止点先挑选出123个基因。以等于或大于1.5的比率作为上调的最低标准。也包括 0.9 ≤ | ( μ t - μ n ) ( σ t + σ n ) | 的基因。已经建立了一个四基因的框架,每个基因在肿瘤和正常细胞间都有至少3倍的差异。
结肠直肠癌中差异表达的基因。与正常结肠粘膜相比,39个基因在所有的肿瘤样本中差异表达。除了一个异常值,37个基因在所有的肿瘤中显著下调。2个上调。基因的同一性通过微阵列上cDNA克隆的测序验证。结果如表1所示。
表1调节基因
  登记号   基因描述 平均信号强度(正常) 平均信号强度(肿瘤)   P值
  AF071569   钙调蛋白激酶II基因亚型delta2     93     39   4.64E-09   Seq.ID No.1
  AB014530   KIAA0630蛋白质的人类mRNA     108     50   4.83E-07   Seq.ID No.2
  AK000319   人KIAA0630 cDNA     236     69   7.84E-06   Seq.ID No.3
  U81504   AP-3复合物的Beta-3A-衔接蛋白亚基mRNA     241     75   3.52E-05   Seq.ID No.4
  AB011166   人KIAA0594 cDNA     116     55   3.53E-05   Seq.ID No.5
  AB040914   人KIAA1481 cDNA     187     59   8.85E-05   Seq.ID No.6
  AK025205   人FLJ21552 cDNA     322     97   0.00013   Seq.ID No.7
  AJ278219   脂肪酸羟化酶     143     53   0.00011   Seq.ID No.8
  AB046854   人KIAA1634 cDNA     142     59   0.00020   Seq.ID No.9
  R00585   未知     149     57   1.28E-09   Seq.ID No.10
  S45844   Spi-B转录因子     140     43   0.00043   Seq.ID No.11
  X98311   癌胚性抗原家族成员2(CGM2)     6137     223   0.00044   Seq.ID No.12
  BAA78050   NADPH氧化还原酶同源物     163     84   0.00048   Seq.ID No.40
  N72128   未知     164     77   0.00068   Seq.ID No.13
  AB040955   人KIAA1552 cDNA     334     120   0.00067   Seq.ID No.14
  AF125101   HSPC040蛋白质     363     115   0.0011   Seq.ID No.15
  AB023229   人KIAA1012 cDA     263     88   0.00099   Seq.ID No.16
  N95761   a-L-岩藻糖苷酶基因     429     104   0.00047   Seq.ID No.17
  AK025033   人FLJ21380 cDNA     180     85   0.0010   Seq.ID No.18
  L10844   人细胞生长调节蛋白     206     101   0.0013   Seq.ID No.19
  H96534   Gp25L2蛋白质的人类mRNA     147     58   0.0015   Seq.ID No.20
  AK001521   人FLJ10659 cDNA     157     60   0.0019   Seq.ID No.21
  AF151039   HSPC205蛋白质     117     60   0.0017   Seq.ID No.22
  AF052059   SEL 1L蛋白质     168     53   0.0016   Seq.ID No.23
  N24597   未知     166     62   0.0016   Seq.ID No.24
  AK001950   内着丝粒蛋白     148     64   0.0029   Seq.ID No.25
  BAA02649   巨噬细胞消除受体I型     118     44   0.0031   Seq.ID No.41
  N75004   未知     98     48   0.0031   Seq.ID No.26
  W16916   人KIAA0260 cDNA     162     61   0.0037   Seq.ID No.27
  X52001   人类内皮素3mRNA     89     33   0.0042   Seq.ID No.28
  T50788   未知     364     102   0.0059   Seq.ID No.38
  AJ005866   推定的sqv-7样蛋白     381     163   0.0049   Seq.ID No.29
  AF113535   MAID蛋白质     218     100   0.0053   Seq.ID No.39
  AB037789   人KIAA1368 cDNA     164     62   0.0068   Seq.ID No.30
  M33987   碳酸酐酶     652     46   0.0074   Seq.ID No.31
  M77830   桥粒斑蛋白1(DP1)     184     81   0.0092   Seq.ID No.32
  H81220   EST功能域转录因子ELF1     113     55   0.017   Seq.ID No.33
  AF000592   人染色体21q11-q21基因组克隆     33     69   1.16E-05   Seq.ID No.35
  AK021701   人FLJ11639 cDNA     31     63   0.00070   Seq.ID No.36
实施例4结肠直肠肿瘤的优化框架
利用方差优化算法生成多重基因基础的标记,其中包括可结合使用以区别正常和肿瘤样本的基因。利用样本和如实施例1-3所描述的微阵列进行强度检测。肿瘤和正常样本间有5倍差异的数据先被预选出来用作分析。根据这个标准预选出来的基因的表达数据随后作进一步使用。每个基因的强度测量值的平均数和标准差是以非转移性样本作为基线计算出来的。然后对于每个基线基因(X值指定为3)计算差别值X*(标准差+平均值)。这个值用来确保结果框架是有说服力的。再用差别值与基线值的比率计算每个转移性样本。这个比率随后被转换成常用对数。然后这个数据被输入Wanger软件,以产生用来选择4基因框架的有效边界。这套基因包括一未知序列,前胶原I型,核糖体蛋白的大亚基L21,和纤连蛋白。这些基因确定为Seq.ID.No.42,Seq.ID.No.43,Seq.ID.No.44和Seq.ID.No.45的序列。换句话说,形成框架的基因组合可以为关于结肠直肠癌的临床判定提供有用的诊断信息。当使用选自与附加标记(遗传或非遗传的)相关的框架的基因组合特别有益。
优化的基因框架:
>gi|1264443|gb|N92134.1|N92134 za23f09.r1 Soares fetal liver spleenINFLS Homo sapiens cDNA clone IMAGE:293417 5’similar to gb|M87908|HUMALNE32 Human carcinoma cell-derived Alu RNA transcript,(rRNA);gbX57025_mal INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR IAPRECURSOR(HUMAN)
>gi|2221047|gb|AA490172.1|AA490172 ab06b08.s1 Stratagene fetalretina 937202 Homo sapiens cDNA clone IMAGE:839991 3’similar to gb:J03464PROCOLLAGEN ALPHA 2(I)CHAINPRECURSOR(HUMAN)
>gi|2188912|gb|AA464034.1|AA464034 zx86b09.r1 Soares ovarytumor NbHOT Homo sapiens cDNA clone IMAGE:810617 5’similar toSW:RL21_HUMAN P46778 60S RIOSOMAL PROTEINL21
>gi|834491|gb|R62612.1|R62612 yi12d01.s1 Soares placenta Nb2HPHomo sapiens cDNA clone IMAGE:139009 3’similar to gb:X02761-cds1FIBRONECTIN PRECURSOR(HUMAN);
使用不同的标准但相同的方法,通过软件选出了又一个四基因框架。这些是Seq.ID.No.42,Seq.ID.No.43,Seq.ID.No.44和Seq.ID.No.45的序列。两个基因与第一个四基因框架重叠。两个优化框架也可以结合形成一个六基因框架。
优化的基因框架:
>gi|2114953|gb|AA431245.1|AA431245.1 zw78d06.r1Soares_testi_NHT Homo sapiens cDNA cloneIMAGE:782315 5’similar towp:F36H1.2 CE05814 ANKYRIN LIKE
>gi|2156172|gb|AA443497.1|AA443497 zw34d03.r1 Soares ovarytumor NbHOT Homo sapiens cDNA clone IMAGE:771173
>gi|2221047|gb|2| AA490172 ab06b08.s1 Stratagen fetal retina 937202Homo sapiens cDNA clone IMAGE:839991 3’similar to gb:J03464PROCOLLAGEN ALPHA 2(I)CHAINPRECUSOR(HUMAN)
>gi|1264443|gb|N92134.1|N92134 za23f09.r1 Soares fetal liver spleenINFLS Homo sapiens cDNA clone IMAGE:293417 5’similar to gb|M87908|HUMALNE32 Human carcinoma cell-derived Alu RNA transcript,(rRNA);gbX57025_mal INSULIN-LILE GROWTH FACTOR IA PRECURSOR(HUMAN);
                                序列表
<110>WANG,YIXIN
<120>评估结肠直肠癌
<130>CDS 267 US NP
<140>TBD
<141>2003-03-21
<150>60/368,798
<151>2002-03-29
<160>49
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1500
<212>DNA
<213>人
<400>1
atggcttcga ccaccacctg caccaggttc acggacgagt atcagctttt cgaggagctt      60
ggaaaggggg cattctcagt ggtgagaaga tgtatgaaaa ttcctactgg acaaggatat     120
gctgccaaaa ttatcaacac caaaaagctt tctgctaggg atcatcagaa actagaaaga     180
gaagctagaa tctgccgtct tttgaagcac cctaatattg tgcgacttca tgatagcata     240
tcagaagagg gctttcacta cttggtgttt gatttagtta ctggaggtga actgtttgaa     300
gacatagtgg caagagaata ctacagtgaa gctgatgcca gtcattgtat acagcagatt     360
ctagaaagtg ttaatcattg tcacctaaat ggcatagttc acagggacct gaagcctgag     420
aatttgcttt tagctagcaa atccaaggga gcagctgtga aattggcaga ctttggctta     480
gccatagaag ttcaagggga ccagcaggcg tggtttggtt ttgctggcac acctggatat     540
ctttctccag aagttttacg taaagatcct tatggaaagc cagtggatat gtgggcatgt     600
ggtgtcattc tctatattct acttgtgggg tatccaccct tctgggatga agaccaacac     660
agactctatc agcagatcaa ggctggagct tatgattttc catcaccaga atgggacacg     720
gtgactcctg aagccaaaga cctcatcaat aaaatgctta ctatcaaccc tgccaaacgc     780
atcacagcct cagaggcact gaagcaccca tggatctgtc aacgttctac tgttgcttcc     840
atgatgcaca gacaggagac tgtagactgc ttgaagaaat ttaatgctag aagaaaacta     900
aagggtgcca tcttgacaac tatgctggct acaaggaatt tctcagcagc caagagtttg     960
ttgaagaaac cagatggagt aaaggagtca actgagagtt caaatacaac aattgaggat    1020
gaagatgtga aagcacgaaa gcaagagatt atcaaagtca ctgaacaact gatcgaagct    1080
atcaacaatg gggactttga agcctacaca aaaatctgtg acccaggcct tactgctttt    1140
gaacctgaag ctttgggtaa tttagtggaa gggatggatt ttcaccgatt ctactttgaa    1200
aatgctttgt ccaaaagcaa taaaccaatc cacactatta ttctaaaccc tcatgtacat    1260
ctggtagggg atgatgccgc ctgcatagca tatattaggc tcacacagta catggatggc    1320
agtggaatgc caaagacaat gcagtcagaa gagactcgtg tgtggcaccg ccgggatgga    1380
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<210>2
<211>5761
<212>DNA
<213>人
<400>2
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ttcattttgt gttattgtga ttgctggtca ggaaaaatgc tgatagaagg agttgaaatc    1920
tgatgacaaa aaaagaaaaa ttactttttg tttgtttata aactcagact tgcctatttt    1980
attttaaaag cggcttacac aatctccctt ttgtttattg gacatttaaa cttacagagt    2040
ttcagttttg ttttaatgtc atattatact taatgggcaa ttgttatttt tgcaaaactg    2100
gttacgtatt actctgtgtt actattgaga ttctctcaat tgctcctgtg tttgttataa    2160
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tgcgtgaaaa caccaagtat tctttttaaa tgaagcacca tgaattcttt tttaaattat    2280
tttttaaaag tctttctctc tctgattcag cttaaatttt tttatcgaaa aagccattaa    2340
ggtggttatt attacatggt ggtggtggtt ttattatatg caaaatctct gtctattatg    2400
agatactggc attgatgagc tttgcctaaa gattagtatg aattttcagt aatacacctc    2460
tgttttgctc atctctccct tctgttttat gtgatttgtt tggggagaaa gctaaaaaaa    2520
cctgaaacca gataagaaca tttcttgtgt atagctttta tacttcaaag tagcttcctt    2580
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ctcatgacaa ctgctgctcg aaatggccat gtgttactaa ctgtcagacg gaagatcttc    1680
tatggagaaa aacaacccga ggacgacagc tctcaggcct tcatttcaac acagaatgga    1740
tctccccgcc tgaaccgggc agaggtccca gccaggcctg caccccagga gccctatgat    1800
gttgtcttgc aacgaaaaga aaatgaagga tttggctttg tcatcctcac ctccaaaaac    1860
aaaccacctc caggagttat tcctcataaa attggccgag tcatagaagg aagtccggct    1920
gaccgctgtg gaaaactgaa agttggagat catatctctg cagtgaatgg gcagtccatt    1980
gttgaactgt ctcatgataa cattgttcag ctgatcaaag atgctggtgt caccgtcaca    2040
ctaacggtca ttgctgaaga agagcatcat ggtccaccat caggaacaaa ctcagccagg    2100
caaagcccag ccctgcagca caggcccatg ggacagtcac aggccaacca catacctggg    2160
gacagaagtg ccctagaagg tgaaattgga aaagatgtct ccacttctta cagacattct    2220
tggtcagacc acaagcacct tgcacagcct gacaccgcag taatttcagt tgtaggcagt    2280
cggcacaatc agaaccttgg ttgttatcca gtagagctgg agagaggccc ccggggcttt    2340
ggattcagcc tccgaggggg gaaggagtac aacatggggc tgttcatcct tcgtcttgct    2400
gaagatggtc ctgccatcaa agatggcaga attcatgttg gtgaccagat tgttgaaatc    2460
aatggggaac ctacacaagg aatcacacat actcgagcaa ttgagctcat tcaggctggt    2520
ggaaataaag ttcttcttct tttgaggcca ggaactggct tgatacctga ccatggtttg    2580
gctccttccg gtctgtgctc ctacgtgaaa cccgagcaac attaaggctt tcagggcttt    2640
tcttggtctt tccttaaaaa gacttggtga ttgggatatt aataatcctt cgtcttcaaa    2700
tgtgatttat gatgaacagt caccattacc cccatcttca cattttgctt ccatatttga    2760
agagtctcac gtgccagtaa ttgaagaatc tttgagagtt cagatatgtg aaaaggcaga    2820
agaattaaag gacattgtgc ctgaaaagaa aagcacttta aatgaaaatc agcctgagat    2880
aaagcatcag tctcttctcc agaaaaatgt gagtaagagg gatccaccca gcagtcatgg    2940
gcacagtaac aagaaaaatc tattaaaagt agaaaatggt gttacacgaa gaggtagatc    3000
ggttagtccc aaaaagccag ccagtcaaca ttcagaggaa catttggata agattcctag    3060
tcctctaaaa aataacccca aaagaagacc cagagatcaa tccctcagcc ccagcaaagg    3120
ggaaaataaa agttgtcagg tcagcaccag ggcaggctct ggacaagatc agtgcagaaa    3180
aagcagaggt cggtcggcca gcccaaaaaa gcagcaaaaa attgaaggaa gcaaagctcc    3240
atcaaatgct gaggccaaat tattagaggg taagagtcga agaatagcag gctatacggg    3300
cagtaatgct gagcagatcc cagatgggaa ggaaaaatca gacgtcatca ggaaagatgc    3360
aaagcagaat cagttggaaa aaagcagaac aaggtctcca gagaaaaaaa tcaaaagaat    3420
ggttgagaaa tctcttccat ccaaaatgac taataagact acaagtaaag aagtatctga    3480
aaatgaaaaa ggaaagaaag taaccacagg agaaacaagt tctagtaacg ataaaatagg    3540
agaaaatgtc cagctatcag aaaagaggct gaagcaagaa cctgaagaga aggtagtttc    3600
aaacaaaaca gaagatcaca aagggaaaga actagaggca gctgacaaaa acaaagagac    3660
tggaaggttc aaaccggaaa gcagttctcc agttaagaaa acactgataa ctccagggcc    3720
ctggaaggtt ccaagtggaa ataaagtcac aggcactatt ggtatggctg agaaacggca    3780
gtaaccttta gtataaaaca aagaaaaaca agttgtaatc ttttcttaca gcagcatttt    3840
tccagaaaaa gccttttttt ttttttcaga tattctgaaa cagataagta catgttaatg    3900
tgagcctcaa gttacctagg ctgcatgaag ggcctttagg attgctaaga accaactgtc    3960
cccctggccg gctgccctcc ctcgctctca ggaaggagct gcatccacat gctcatctga    4020
cccgccctgc tcaggctgcc cagctcgtct tcatgagtgt ctgaacaaat gacatatgtt    4080
gatattaaca atgtggtcac aactcacttt gtatttgtgc caagttatct actgtatcat    4140
gtctgttttt atcctttttg ttcagctgtt tccacagtaa tgaaaaagtt aggtttggct    4200
tggaagttga tgatctcaat agcatgttgc atgtttacag agagaaatat gtgagtcctt    4260
gcagaagaag agactgttaa ctcatcgtta aagatggccg ttgtctcttc taacagctac    4320
tgatgatgtc ccactttaaa aataaaaccc ccaaacatca ctactttaag gaaaaaaaaa    4380
atgtagtcca atattgatgc tttcttatgg ctttttattt taatttggct ggataagttg    4440
tttcaaataa ctgttaaaga tattacttac aattgaatgt ttgaaataag aaagtacttt    4500
aagcaataga gttcatctcc tgctgtgtta tccaacctcg atgtatactt acagcatctc    4560
aggtcaccct ttttatttca gttatttaat tatgaaacca taaagaagca tgtggaaata    4620
gtgtttattg ctctttgaag aaaaaccacc aactatttct ggatattttg gctgtaccta    4680
ctactaaagt cattagtctt taatacataa tacatatttg aaaagtaaac atattatata    4740
gattatgtga gggacttaat catgaaacca gtttcacagt ccaagtacca actcttctgg    4800
tagcaggtgc acaagcttgg gtgtttaaaa acaacctgtg tagggtatgc ccagcaaatg    4860
aggacaaatg tgtagacagt acttactgga tcttatttaa cttttagcta cattaactaa    4920
ctttcttatt taaaaacaag aaagggagac taaacatctg cttaacttgt acacattttc    4980
agaattcttt ttaaaagtct agttaaagat gtttcttaga agttggagac tgttaacaac    5040
ttccataaaa tagatccagg tttttcagtt ccctgaagca gcattcagta gcatctatat    5100
aaataaaggc accttctgag aataaaacta ttttatggag tgtgtgaaca cacttgttct    5160
gtcacctggg ttcatcttgt tgtgaagcac attaggtcca ggtccttccc tctgggagtc    5220
tgactgtgaa actctttaac ccaacaactc aattagcccc tgtagataag acatgcttcc    5280
cagagtgaga tttttgaaat ccccttttca tccagaacta tatttaccca cctattgtaa    5340
ctattcaaat agagcaaaat taggaggctt gataaatact aagaatttag taccacagaa    5400
attatttatt attttccctg tagtccacaa ttagtgataa cgaatcctat ttttgttaac    5460
tgtgacataa ctttgatgtc atatgttgtc ctatgtggtt cttcctaagt aaactctgta    5520
ctgattatat actgacttag caatgtggcc ttggaatgct gagcaaaatg tggatgtact    5580
ggttgtaaat gtttatatat tgtacagtac ctttatatat acacttgagg ttctgattag    5640
<210>10
<211>457
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(242)..(242)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(394)..(394)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(406)..(406)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(457)..(457)
<223>任意碱基
<400>10
tcagtcactc tttcaccctg ccaaagcttc actgtcctac tgattgaatt gtatgtgaga      60
aataaaatgt catcatatta agccactggg atttgtatgt ttatctgtta tagcagcaag     120
tcttaattta cctaatacac acattgtgac agatgttctt aatgtcccac cccatattgt     180
tacatgtcca gctttgagga tccctggcat gtgggggtag gagtttctgg gcatgctgga     240
tncaattccc acttttaagg catctgtggc ctctgtggcc tctgtggcct tcactgttat     300
ggaagggatt tatctggggc accataggaa actttaccat ggcacagtgg acaacctagg     360
agggggtgng gaggaggggc cttcaggccc aacngggggg accagngttc gtggggttag     420
ggtggtttgg ggggttttcc ctcttacccg tgggggn                              457
<210>11
<211>1493
<212>DNA
<213>人
<400>11
aatagggttg gcggctgcag cgggcggcaa acagcccgcc cggcaccacc atgctcgccc      60
tggaggctgc acagctcgac gggccacact tcagctgtct gtacccagat ggcgtcttct     120
atgacctgga cagctgcaag cattccagct accctgattc agagggggct cctgactccc     180
tgtgggactg gactgtggcc ccacctgtcc cagccacccc ctatgaagcc ttcgacccgg     240
cagcagccgc ttttagccac ccccaggctg cccagctctg ctacgaaccc cccacctaca     300
gccctgcagg gaacctcgaa ctggccccca gcctggaggc cccggggcct ggcctccccg     360
cataccccac ggagaacttc gctagccaga ccctggttcc cccggcatat gccccgtacc     420
ccagccctgt gctatcagag gaggaagact taccgttgga cagccctgcc ctggaggtct     480
cggacagcga gtcggatgag gccctcgtgg ctggccccga ggggaaggga tccgaggcag     540
ggactcgcaa gaagctgcgc ctgtaccagt tcctgctggg gctactgacg cgcggggaca     600
tgcgtgagtg cgtgtggtgg gtggagccag gcgccggcgt cttccagttc tcctccaagc     660
acaaggaact cctggcgcgc cgctggggcc agcagaaggg gaaccgcaag cgcatgacct     720
accagaagct ggcgcgcgcc ctccgaaact acgccaagac cggcgagatc cgcaaggtca     780
agcgcaagct cacctaccag ttcgacagcg cgctgctgcc tgcagtccgc cgggcctgag     840
cacacccgag gctcccacct gcggagccgc tgggggacct cacgtcccag ccaggatccc     900
cctggaagaa aaagggcgtc cccacactct aggtgatagg acttacgcat ccccaccttt     960
tggggtaagg ggagtgctgc cctgccataa tccccaagcc cagcccgggc ctgtctggga    1020
ttccccactt gtgcctgggg tccctctggg atttctttgt catgtacaga ctccctggga    1080
tcctcatgtt ttgggtgaca ggacctatgg accactatac tcggggaggc agggtagcag    1140
tgcttccaga gtcccaagag cttctctggg attttcttgt gatatctgat tccccagtga    1200
ggcctgggac ctttttaaga tcgctgtgtg tctgtaaacc ctgaatctca tctggggtgg    1260
gggccctgct ggcaaccctg agccctgtcc aaggttccct cttgtcagat ctgagatttc    1320
ctagttatgt ctggggccct ctgggagctg ttatcatctc agatctcttc gcccatctat    1380
ggctgtgttg tcacatctgt cccctcattt ttgagatccc ccaattctct ggaactattc    1440
tgctgcccct ttttatgtgt ctggagttcc ccaatcacat ctagggctcc tcc           1493
<210>12
<211>2292
<212>DNA
<213>人
<400>12
ccatgggttc cccttcagcc tgtccataca gagtgtgcat tccctggcag gggctcctgc      60
tcacagcctc gcttttaacc ttctggaacc tgccaaacag tgcccagacc aatattgatg     120
tcgtgccgtt caatgtcgca gaagggaagg aggtccttct agtagtccat aatgagtccc     180
agaatcttta tggctacaac tggtacaaag gggaaagggt gcatgccaac tatcgaatta     240
taggatatgt aaaaaatata agtcaagaaa atgccccagg gcccgcacac aacggtcgag     300
agacaatata ccccaatgga accctgctga tccagaacgt tacccacaat gacgcaggat     360
tctataccct acacgttata aaagaaaatc ttgtgaatga agaagtaacc agacaattct     420
acgtattctc ggagccaccc aagccctcca tcaccagcaa caacttcaat ccggtggaga     480
acaaagatat tgtggtttta acctgtcaac ctgagactca gaacacaacc tacctgtggt     540
gggtaaacaa tcagagcctc ctggtcagtc ccaggctgct gctctccact gacaacagga     600
ccctcgttct actcagcgcc acaaagaatg acataggacc ctatgaatgt gaaatacaga     660
acccagtggg tgccagccgc agtgacccag tcaccctgaa tgtccgctat gagtcagtac     720
aagcaagttc acctgacctc tcagctggga ccgctgtcag catcatgatt ggagtactgg     780
ctgggatggc tctgatatag cagccttggt gtagtttctg catttcggga agagtgtttt     840
tattatccac ctgcagactg gactggattc ttctagctcc ttcaatccca ttttctcctg     900
tggcatcact aagtataaga cctgctctct tcctgaagac ctataagctg gaggtggaca     960
actcaatgta aatttcaagg aaaaaccctc atgcctgaga tgtgggccac tcagagctaa    1020
ccaaaatgtt caacaccata actagagaca ctcaaattgc caaccaggac aagaagttga    1080
tgacttcatg ctgtggacag tttttcccaa gatgtcccaa gcctcatcgt gacgaggctc    1140
ttatcccact ccatttttcc ctgctcatgc ctgcctcttt aatttggtaa gataatgctg    1200
taactagaat ttcacaatca gcgccttgtg caggcaattt gacagagtgt tggatgtgtc    1260
atgtcatcat gtcaaaccca aatatttgac ctaagggatc ctttattctg cccagtggct    1320
aactttaaca acatccctaa tacaactgtt tattcaaatg cacggtggtc cctgttagag    1380
ttagacctct agactcacct gttctcacgc cctgttttaa tttaacccag ctatgggatg    1440
ccagataaca gaattgctgc ctacgagctg aacagggagg agtttgtgca gttgctgaca    1500
cttcttgttg cacataaata aatacagtgg gtactataga gactcagttg caaaaattaa    1560
caaatatgct gcttgattaa aatgggtagg cttctcatgt ggctcattct ttaatctatt    1620
ctcttttatt tggtttggtt catggggtct ctgcctatgg atcatacttc aaactcttgg    1680
tgtgatcctc ctgattgtca caatattagt taccctggtg tgctgtattc tctaaaacct    1740
ttaaatgttt gcatgcagcc attcgtcaaa tgtcaaatat tctctctttg gctggaatga    1800
caaaaactca aataaatgta tgattaggag gacatcataa cctatgaatg atggaagtcc    1860
aaaatgatgg taactgacag tagtgttaat gccttatgtt tagtcaaact ctcatttagg    1920
tgacagcctg gtgactccag aatggagcca gtcatgctaa atgccatata ctcacactga    1980
aacatgagga agcaggtaga tcccagaaca gacaaaactt tcctaaaaac atgagagtcc    2040
aggctgtctg agtcagcaca gtaagaaagt cctttctgct ttaactctta gaaaaaagta    2100
atatgaagta ttctgaaatt aaccaatcag tttatttaaa tcaatttatt tatattcttc    2160
tgttcctgga ttcccatttt acaaaaccca ctgttctact gttgtattgc ccagtaggag    2220
ctatcactat attttgcaga atggaaactg ccctgactct tgaatcacaa ataaaagcca    2280
attgtatctg tt                                                        2292
<210>13
<211>519
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(212)..(212)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(451)..(451)
<223>任意碱基
<400>13
gaaacaacaa cagtgtaatc tttaacaggg atgttaaagg taagaagtca ggaagataaa      60
ccaaaatgat tgagtatgat aaagaatttt gcatggcgat taaaatagaa aacctataaa     120
tgtagaaaaa gcaggtctgg acttagcaaa gaaacaatat agtttggaga aggcatgaaa     180
taagttcttt tcatgttcac tgctggtcac ancataacag agagtgatgt ggagagcttt     240
gggaaggttt cacgttgagt tacatcagtg gtcaacaatg gagcaacaag actccgtaga     300
ggatgccacc ctgggagaat tgcaagggaa aggaggctga agcacaactg gtaatagcct     360
tcagatattt aatggatatg caaataaagc tctgattaat tgtattttca cttattatat     420
atcatctttg gacctttcta aaagtgggac nctagaaaag atatactgaa actccaaaag     480
aatacttcag ctcgagttga atggattcaa gatgttgtt                            519
<210>14
<211>5294
<212>DNA
<213>人
<400>14
ggctcgcatc cccatagtgc tgggttacag tgaaggtacg ccccgcgctc tgctctggag      60
aggcagggtg ggatagggaa cgtctcgagt ggcgcccgca gtcatggtgg tgttcgttgg     120
ccgccgcctc ccggcgctcc tagggctgtt taagaagaag ggctctgcca aggctgagaa     180
tgacaaacat ctaagtgtag ggcctggcca ggggccaggg tctgcagtgg atgagcacca     240
ggacaacgtc ttctttccca gtgggcgacc cccccacctg gaagagctgc acactcaggc     300
ccaggagggg ctccgctccc tacaacacca agagaaacag aaactgaaca agggtggctg     360
ggaccatgga gacacccaga gtatccagtc ctcccggacg gggccggatg aagacaacat     420
ctccttctgc agtcagacca catcctacgt ggctgagagc tccacagcag aggacgcgct     480
ctccatccgc tcggagatga tccagcgcaa aggctccacc ttccgacccc atgactcatt     540
tcccaaatct ggaaagtcag ggcggcgtcg gcgggagcgg cggagcactg tgctgggact     600
cccgcagcat gtgcagaagg agcttggcct gaggaatgag cgtgaggcac caggcacgcc     660
ccgggctcct ggtgcacggg atgccgtacg catccccaca gtggacggcc gcccccgagg     720
cacctcaggg atgggggccc gggtgtccct gcaggcgctg gaggcggagg cagaggctgg     780
cgctgagaca gaggccatgc tgcagcgcca cattgaccgt gtctaccggg atgacacctt     840
tgttggccgg tccacgggta cccgggcccc accattgacc cggcccatgt ccctagcagt     900
gcctggattg acaggagggg cagggcctgc agagcccctg agcccggcca tgtccatctc     960
cccccaggcc acctacctgt cgaagttgat tccacatgct gtgctgccgc ctacagtgga    1020
cgtggtggcc ctaggccgct gcagcctgcg cacactaagc cgctgcagcc tgcactcggc    1080
cagcccagcc tcagtccgct cgctggggcg cttctcctcc gtctccagcc cacagccccg    1140
cagccgccac ccatcctcct ccagtgacac ctggagccac tctcaatcct ccgacaccat    1200
tgtgtctgac ggttccaccc tctcctctaa gggtggctct gagggccagc cggagagctc    1260
tacggctagc aatagcgtgg taccccctcc ccagggaggc agtgggaggg gctctcccag    1320
tgggggcagc actgctgagg cctcagacac actcagcatt cggagcagtg ggcagttgtc    1380
tggccggagt gtgtccctgc gtaagctgaa gcggcctcca ccccctcccc gccggaccca    1440
ctccctccat cagcggggct tagcagtgcc tgatgggcca ttagggttgc cccctaagcc    1500
tgagcgtaag cagcagcccc agctgcctcg gccacccacc actggtggct cagaaggggc    1560
gggggcagca ccctgtccac ccaacccagc caacagctgg gtacctggct tgtctccggg    1620
tggttcccgg cgccccccac ggtccccaga acggacactt tcgccctcca gtggatactc    1680
gagccaaagt ggtactccca ccctccctcc caagggcctg gcaggtcccc ctgcttcccc    1740
aggcaaggcc cagcccccta aaccagagcg tgtcacgtct cttcgctccc ctggggcctc    1800
cgtctcctct tccctcacgt ctttatgttc ctcctcctct gacccagccc cctcagaccg    1860
ctctgggcca cagatattga cccccctggg tgacaggttt gtcatacctc ctcaccccaa    1920
ggtgcctgcc cccttctccc cacctccctc caagcccagg agccctaacc cagctgcccc    1980
tgctctagcc gcccctgctg tggttcctgg gcctgtttct accactgacg ccagtcctca    2040
gtcccctccc actccccaga caaccttgac tccactgcag gagtctcctg tcatctccaa    2100
agaccagtca cccccacctt ccccaccccc atcttatcat ccacccccac cacccactaa    2160
gaagccagag gtggttgtgg aggcaccatc tgcctcagag actgctgagg agcccctcca    2220
agatcccaac tggccccctc ccccaccccc tgcccctgag gagcaggacc tgtccatggc    2280
tgacttcccc ccaccagagg aggctttttt ctctgtggcc agccctgagc ctgcaggccc    2340
ttcaggctcc ccagagcttg tcagctcccc ggctgcttcg tcctcctcag ctactgcttt    2400
gcagattcag cccccgggta gcccagaccc tcctccagct ccgccagccc cagctcctgc    2460
tagttccgcc ccagggcatg tggccaagct ccctcagaag gaaccggtgg gctgtagcaa    2520
gggtggtggg cctcccaggg aggacgtagg tgcgcccctg gtcacgccct cgctcctgca    2580
gatggtgcgg ctgcgctccg tgggtgctcc aggaggggct cccaccccag cactggggcc    2640
atcggccccc cagaaaccac tgcgaagggc cctgtcaggg cgggccagcc cagtgcctgc    2700
cccctcctca gggctccatg ctgcggtccg actcaaggcc tgcagcctgg ccgccagtga    2760
aggcctctca agtgctcagc ccaacggacc gcctgaggca gagccacggc ctccccagtc    2820
ccctgcctca acggccagtt tcatcttctc caagggctct aggaagctgc agctggagcg    2880
gcccgtgtcc cctgagaccc aggctgacct ccagcggaat ctggtggcag aactccggag    2940
catctcagag cagcggccac cccaggcccc aaagaagtca cctaaggctc ccccacctgt    3000
ggcccgcaag ccgtctgtgg gagtcccccc acccgcctcc cccagttacc ctcgagctga    3060
gccccttact gctcctccca ccaatgggct ccctcacacc caggacagga ctaagaggga    3120
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gggtctagaa gaggcagccc ttctttgtcc tctggggtaa atgagcttga cctagagtaa    5100
atggagagac caaaagcctc tgatttttaa tttccataaa atgttagaag tatatatata    5160
catatatata tttctttaaa tttttgagtc tttgatatgt ctaaaaatcc attccctctg    5220
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<213>人
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aacacgagat gactaaaacg gcatctgcat aacaatggga aaaggaagaa caaggtcttg     480
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ggaaaataca ctgaatgcta tttttactaa ccattctatt tttatagaaa tagctgagag     600
tttctaaacc aactctctgc tgccttacaa gtattaaata ttttacttct ttccataaag     660
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tgtatatcat ctattagaat ttacttaatg aaaaactgaa gagaacaaaa tttgtaacca     780
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                                        988
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<221>misc_特征
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<221>misc_特征
<223>任意碱基
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<220>
<221>miac_特征
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<221>misc_特征
<223>任意碱基
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agatacaaag aacttcagga aaaacataaa caagaattgg aagacatgag gaaagctggt     120
cacgaagccc tcagcattat tgtggatgaa tataaggcac tactgcagtc ttcagttaag     180
caacaagtag aagctattga aaaacagtac atttctgcaa ttgagaaaca ggcacacaag     240
tgtgaggagt tgctaaatgc tcagcatcag aggctccttg aaatgctaga tacagagaag     300
gaactgttaa aagaaaaaat aaaggaagct ttgattcagc aatctcaaga acagaaggaa     360
atattggaaa agtgtttgga ggaagaaagg caaagaaata aagaggcatt agtatccgct     420
gcaaagcttg aaaaagaagc agtgaaggat gcagttttaa aagtcgtaga agaagaaaga     480
aaaaatttag aaaaagcgca tgctgaagaa agggaattat ggaagacaga acatgcaaaa     540
gatcaagaaa aagtatctca ggaaattcaa aaagctatac aagaacaaag aaaaataagt     600
caggaaactg ttaaggcagc aataatagaa gagcagaaac gaagtgaaaa ggctgtggaa     660
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aaacccacac tggcattgga taaatcatat tacaccttca aaatacacac tctgaattat     900
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caaaacaata tttagaacta tcaagtgatc taatttattt tcttttggtt tcttctttac    1020
atttactgtt attttattat tattagtagt agcagcaaca gagtatgata tgacccaaaa    1080
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ctattatata ttattttgca aaagtagtaa atatattatt gtttcatgat gactcttgat    1200
gagatgctag aatgtaacca tacatttatc ttattttgag gatagaaata gcatggattt    1260
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ccggcattac ctaacctctt ctgcagttgg atctatgtat tttcattggt ctactgaaaa    1380
cgaacaatac aattaaaagc actaaagatt attatattaa ttcaactttg atctgatata    1440
tcacttaaac taaaggggtg tgtgtggtgt atgcttgttt cctatttctg ctctttaaag    1500
atactttgaa tcaataaaac cattagtcta caaatcaaat tgtgaactta atctctagaa    1560
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tttcccagta tttcagaatg tacttaattc acaggcagga tgcttcaatg caaaatcatg    1680
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<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(261)..(261)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(237)..(237)
<223>任意碱基
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tcaagtcata agataaagtt taatcatttg atcatgttaa aagacacaaa acacagccaa      60
tctaaccaaa tttcaggcat gcatttacat aaatatatta aattaagaaa agaaattgta     120
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<212>DNA
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ttggtttgaa atggcacccc aggactttgg gcctgcctta cttgatagcc tcgttcagtg      60
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ataaacaaga catggttctt gctttcaagg agtgtgtaat tctttagcca gatatggaaa     180
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<210>28
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<212>DNA
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ctaaacaaaa tcattcactt ccctgatttt gataagaaaa ttcctgtaaa gctgtttcct      60
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<212>DNA
<213>人
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ctctgaaatc cagtcaaaat atgactaaag gcccttgcca tgactgatgt attctcctgg     360
ccaacgccaa acaaatggga gcctggttac gagtcagcct tcagggactt gtcacatttc     420
tacttggttt cttccttgtt attgtcataa taaaatgttt tctatgctgt ttagtgcaac     480
ttaggcccta ttctgtagaa gtctcctcta ctattcaggc cactcaaaca ccccaaataa     540
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agggcaagat tcttgccaag agaattaatg tgcgtattga gcacattaag cactctaaga     120
gccgagatag cttcctgaaa cgtgtgaagg aaaatgatca gaaaaagaaa gaagccaaag     180
agaaaggtac ctgggttcaa ctaaagcgcc acgctgctcc acccagagaa gcacactttg     240
tgagaaccaa tgggaaggag cctgagctgc tggaacctat tccctat                   287
<210>45
<211>383
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(147)..(147)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(309)..(309)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(349)..(349)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(365)..(365)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(372)..(372)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(380)..(380)
<223>任意碱基
<400>45
ggaacggaaa aggagaattc aagtgtgacc ctcatgaggc aacgtgttat gatgatggga      60
agacatacca cgtaggagaa cagtggcaga aggaatatct cggtgccatt tgctcctgca     120
catgctttgg aggccagcgg ggctcgnctt gtgacaactg ccgcagacct ggggggtgaa     180
cccagtcccg aaggcactac tggccagtcc tacaaccagt attcttcaga gataccattc     240
agagaacaaa cactaatgtt taatttgccc aatttgagtg cttcatgcct tttaggatgt     300
tacaggctng acagagaagg ttttcccgag gagttaaatc atctttttnc catttcccga     360
ggggncaagg cntgtttttn ttt                                             383
<210>46
<211>523
<212>DNA
<213>人
<400>46
cagaggggca gggcggacgg ctaggagttc aagaaacatc ctggtctgag ggaaaggctg      60
cagctgcacc gccatgaata agcttttcag cttctggaag aggaagaatg agacccgcag     120
ccagggctac aaccttcgag aaaaggattt aaagaaactt cacagagctg cttcagtcgg     180
ggatttgaag aagctgaagg aataccttca gatcaagaaa tatgatgtaa atatgcagga     240
ctatgaatac agaacacctt tgcacctagc ctgtgctaat ggacatacag atgttgtact     300
tttcctaatt gagcaacaat gcaagataaa tgtccgggat agtgaaaaca aatccccatt     360
gattaaggca gtacagtgtc aaaatgagga ttgtgctact attctgctaa actttggtgc     420
agacccagat ctgagggata ttcgttataa tactgttctt cactatgctg tttgtggtca     480
aagtttgtca ttagttgaaa aactgcttga atacgaagct gat                       523
<210>47
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<212>DNA
<213>人
<400>47
tccaaggtca tggcaaaaca tctgaagttc atcgccagga ctgtgatggt acaggaaggg      60
aacgtggaaa gcgcatacag gaccctaaac agaatcctca ctatggatgg gctcattgag     120
gacattaagc atcggcggta ttatgagaag ccatgccgcc gcgacagagg gaaagctatg     180
aaaggtgccg gcggatctac aacatggaaa tggctcgcaa gatcaacttc ttgatgcgaa     240
agaatcgggc agatccgtgg cagggctgct gaggcctgtg ggtgggacac cagtgcgaaa     300
ccctcatcca gttttctctc catctctttt ctttgtacaa tcccatttcc tattaccatt     360
ctctgcaata aactcaaatc acatgtctgc                                      390
<210>48
<211>669
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(641)..(641)
<223>任意碱基
<400>48
ttcttttgga aaaccaaaca tgctttattt catttttttc acaatttatt taaacatctc      60
acatatacaa aataggtaca atttaatttt tctgcttgcc caagaaacaa agcttctgtg     120
gaaccatgga agaagatgaa aatgagactg gcaaagaaca aatgctgaat ctgaagaaga     180
ggacaacttt gggcaaataa tctgcatact tttaattggg aataagatgg aaaatatgaa     240
tgctaaatca aattttttaa aaaatacacc acacgataca actcaataca ggagtatttc     300
ttctcaaatt cttctagcac catcaacatt cttcaagtat ctgaaatact attaattagc     360
acctttgtat tatgaacaaa acaaaacaag gacctcagtt catctctgtc taggtcagca     420
cctaacaatg tggatcacac tcatgggaaa gtgttttgag gtagtttaaa cctttggaag     480
tttgggtttt aaacttccct ctgtggaaga tattcaaaag ccacaagtgg tgcaaatgtt     540
tatggttttt atttttcaat ttttattttg gttttcttac aaaggttgac atttttcata     600
acaggtgtaa gagtgttgaa aaaaaaattt caatttttgg ngggaacggg ggaaggagtt     660
aatgaaact                                                             669
<210>49
<211>431
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_特征
<222>(97)..(97)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(347)..(347)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(349)..(349)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(361)..(361)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(362)..(362)
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<220>
<221>misc_特征
<222>(363)..(363)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(401)..(401)
<223>任意碱基
<220>
<221>misc_特征
<222>(428)..(428)
<223>任意碱基
<400>49
ctttttatat ttattttcat cgctacacaa acatttttta ggagtttgat tctacctcca      60
ttttggttag atatacaaac tctaccccat gagggantgt atggtgtatt tctagattta     120
gcaacaattt tcttgaaaaa tgtacaatac tatagaaaaa tgaagatagt aaataccagg     180
tataagttaa taacagtgtt tcttttgttc agtaataatg aactgtgtac tagcactgaa     240
ctttaggccc tcctatttgc gtattttctg tttgtatatt tttaaataga ggaattgtga     300
ttataatatt attattttgg aatatcctaa atcataaatt caaaacntna tttagttttt     360
nnnttttttt tttaagatgg agtcccgctt tgtcccaggc nggagtgcag tggcatgatc     420
tcagctcnct g                                                          431

Claims (18)

1.一种评估结肠直肠癌状况的方法,包括在选自Seq.ID.No.42-49的基因组合中鉴定每个基因(相对于正常种群的相同基因的表达)的差异调节。
2.权利要求1的方法,其中调节基因表达中存在至少2倍差异。
3.权利要求1的方法,其中表示差异调节的p值低于.05。
4.权利要求1的方法,进一步包括用于非遗传基础的结肠直肠癌诊断。
5.权利要求的方法,其中非遗传基础的癌症标记选自癌胚性抗原、CA19-9、CA125、CK-BB和鸟苷酸环化酶C。
6.一种诊断框架,包括选自Seq.ID.No.42-49的基因组合中分离的核酸序列、其互补序列或其一部分序列。
7.位于基片上的如权利要求6的诊断框架,其中所述的基片适合鉴定包含于其上的基因差异表达。
8.权利要求7的诊断框架,其中所述的基片用于微阵列。
9.权利要求8的诊断框架,其中所述的微阵列是cDNA微阵列。
10.权利要求8的诊断框架,其中所述的微阵列是寡核苷酸微阵列。
11.一种诊断框架,包括选自Seq.ID.No.42-49的基因组合中分离的核酸序列、其互补序列或其一部分序列。
12.一种用于诊断结肠直肠癌的试剂盒,包括选自Seq.ID.No.42-49的基因组合中分离的核酸序列、其互补序列或其一部分序列。
13.权利要求12的试剂盒,进一步包括进行微阵列分析的试剂。
14.权利要求12的试剂盒,进一步包括媒介物,所述的核酸序列、其互补序列或其部分序列通过该媒介物进行检测。
15.一种评估结肠直肠癌疗效的方法,包括选自Seq.ID.No.42-49的基因相结合,鉴定每个基因(相对于正常种群的相同基因的表达)的差异调节。
16.权利要求15的方法,其中对疗效的评估包括确定患者是否好转,非好转,复发,可能好转或可能复发。
17.评估结肠直肠癌状况的制品,包括选自Seq.ID.No.42-49的基因组合中分离的核酸序列、其互补序列或其一部分序列。
18.评估结肠直肠癌状况的制品,包括选自Seq.ID.No.42-49的基因组合中分离的核酸序列、其互补序列或其一部分序列的表示物。
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