CN1010097B - 促生长素的溶解和复性方法 - Google Patents
促生长素的溶解和复性方法Info
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- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
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Abstract
公开一种从宿主细胞的折射体中溶解出促生长素蛋白并使其获得天然性状的方法。该方法包括这一发现，即尿素或二甲砜的水溶液能用来有效地溶解含有促生长素蛋白的折射体。一经溶解，促生长素在尿素或二甲砜溶液中，与温和氧化剂接触长到足以形成二硫键的时间，即可被复性。这种复性即使在高蛋白浓度、制品不纯和不存在还原剂的情况下，亦能有效地产生。
Description
重组DNA技术已使异源蛋白质能在一些宿主细胞如大肠杆菌（E.CoLi）中得以表达，但已有报道指出，有些异源蛋白质，如促生长素，往往在表达后仍不同程度地被封闭于宿主细胞的胞质折射体内。
一些促溶剂，如盐酸胍、硫氰化钠、尿素和不同的去污剂。已被用来破坏蛋白质分子内的非共价联系。例如已有实验表明，在促溶剂的作用下，蛋白即“展开”，见Stryer，Biochemistry，《生物化学》（1981年第二版）34-35页，W.H.Freeman和Cempany。同样地，促溶剂还能使多亚基蛋白质解离，形成其各个亚基。
最近欧洲专利申请114，506A号公布，异源蛋白质能用某种烈性促溶剂如盐酸胍、去污剂如十二烷基硫酸钠和硫氰酸盐从折射体内溶解出来。而尿素这种较弱的促溶剂则对折射体无溶解作用。但盐酸胍这样的强变性剂是很昂贵的。此外，异源蛋白质一经溶于强变性剂，还必须把它移入不会干扰以后的离子交换纯化步骤的弱变性剂中。
因此，本发明的目的是提供一能从宿主细胞的折射体中溶解出异源促生长素蛋白，并使其复性的改良方法。
提供应用既容易得到，又相对便宜的试剂的方法，是本发明的目的之一。
在相当高的促生长素浓度下进行复性也是本发明的一个目的。
使促生长素蛋白的溶解和/或复性在有或无还原剂存在的情况下都能进行则是本发明的另一目的。
另外，采用一种在生态学意义上较以往所用试剂更为安全的试剂也是本发明的目的。
本发明的所有这些目的和优越性对于那些熟悉以下叙述和例证的人来说将是显而易见的。
简言之，本发明提供了一种从宿主细胞的折射
体内溶解出促生长素蛋白并使之复性的方法。特别是本方法还包括这样一个发现，即观察到一种尿素或二甲砜的水溶液能用来有效地溶解含有促生长素这类蛋白质的折射体。令人惊奇的是，还进一步发现促生长素蛋白一经溶解，在尿素或二甲砜的溶液中与温和氧化剂接触的时间足以使蛋白质天然构象中的二硫键得以形成，促生长素蛋白即可复性。同时，这种复性过程即使在高蛋白浓度，制品不纯甚至不用还原剂的情况下都能高效率地发生。
为了说明本发明的目的，似乎应考虑对一些术语作如下定义：“促生长素”指包括但并不只限于哺乳动物的促生长素，如人、羊、猪和牛的促生长素，和鸟类的促生长素。除了适用于上述具有天然顺序的蛋白质外，本发明同样适用于一系列与天然存在的蛋白有关，且具有促生长素样活性的类似物和同源物。对本方面熟悉的人们将明白其它具有与促生长素相似化学性质的促生长素类的蛋白，如催乳素和胎盘催乳素，从纯化上考虑实际上是与促生长素等同的。有鉴于此本发明亦包括这样一些蛋白质。
“异源”蛋白质是指宿主细胞正常情况下不产生的蛋白质。重组DNA技术已使大量异源蛋白质在转化的宿主细胞中得到表达，但尚不十分了解的是，这些蛋白质常会被隔离在宿主细胞胞质的不溶性光折射体中。
“折射体”指这样的包含体或胞质内凝聚物、它们，至少其中一部分，含有被提取的异源促生长素。这些凝聚物在相差显微镜下看上去象一些明亮的斑点。
“宿主细胞”指一种微生物细胞，如细菌和酵母或其他适宜的细胞，如动、植物细胞，它们已被转化用以表达异源促生长素。宿主细胞在本发明中被看作是那些表达了外源促生长素然后将此激素封闭进折射体的细胞。一种典型的宿主细胞是大肠杆菌（E.CoLi）K12（W3110/PBGH-1株），该细胞已被转化来表达牛促生长素。
“复性”是指促生长素蛋白折迭和氧化形成具有其生物活性的天然构型。
“折迭”是指蛋白质整体构型的恢复足以使之适当的氧化。折迭是通过降低尿素的变性效应来完成的，如有必要，将尿素浓度调节到一适当水平，从而保证蛋白质中氨基酸的相互作用以呈现其二、三级结构。
“氧化”是指分子内二硫键的形成，以获得稳定的天然构型，从而保证其生物活性。
“温和氧化剂”指一种促使流基氧化，使其形成分子内二硫键。但不氧化蛋白中其它取代基团的试剂。在采用温和氧化剂如过氧化氢的同时，暴露于空气的方法也是完全可接受的并且更为可取。
“生物活性”是指促生长素能够产生其应产生的体内生理反应。此生物活性能通过已去除内源性促生长素的特定物种的适宜的体内生物测定实验来鉴定。本发明采用一种适用的促生长素生物测定法，称之为“大鼠增重生物测定法”。该方法中，促生长素制品的生物活力是相对一已知制品（如提取的天然促生长素）来估价的。系通过比较不同的制品剂量与对去垂体大鼠体重的增长量的关系来确定。
促生长素是由腺垂体（垂体前叶）分泌的激素，已知该激素能对骨骼生长率和体重增加率产生影响，并已表明给予促生长素能使泌乳动物如奶牛和山羊的产乳量增加。典型的促生长素大约191个氨基酸组成，分子量约为22，000道尔顿。好几个物种的促生长素的整个氨基酸序列现已发表，这些物种包括人和动物中的鸟类、绵羊、猪和牛。在考虑“保守”氨基酸的替换时，曾将几个物种的促生长素的氨基酸序列作了比较，结果表明这些激素有相当高的同一性。概括讲，某些“保守的”氨基酸替换能够在不致使蛋白质总的化学性质发生根本变化的情况下发生。例如脂性疏水残基（异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸，蛋氨酸）之间的替换，极性残基之间的替换（如精氨酸和赖氨酸之间，谷氨酰胺和天门冬氨酰胺之间以及谷氨酸和天门冬氨酸之间的互换）。相反电荷的离子残基之间的替换也已被证实，如天门冬氨酸或谷氨酸和赖氨酸之间的互换。此外，一些“激烈的”替换（即导致侧链类型发生变化的替换）也能在不致使蛋白质功能和化学性质发生根本改变的情况下发生，只要这些替换发生的位点对蛋白质的构象不产生关键性影响以及这种替换的程度还不算太大。
下面的表一列出已报道的几个物种的生长激素的一级结构。以下的缩略字用于表一中：BGH（牛生长激素）;PGH（猪生长激素，即家猪）;OGH（羊生长激素，即绵羊）;AGH（鸟生长激素，即家禽）;HGH（人生长激素）。符号“X”表
示氨基酸序列中的一个空位，它在序列中只用来表示一些代表性的生长激素的排列。如果在某一特定序列中标上数字，则允许不再插入这种“X”符号，例如BGH序列中第126位亮氨酸（或象例10中所用的等位变化一样，为缬氨酸）。
根据已报道的序列，在下面的表二中提供出各种特殊氨基酸的相应含量。
已有文献报道促生长素蛋白同源性地具有二硫桥，并进一步证实哺乳动物的促生长素组成了一个同源的蛋白质家族。
现已知道大多数异源蛋白质在大肠杆菌中表达后，都不同程度地被封闭进细菌胞质中的折射体内。这一点虽还不十分了解，但认为至少部分是由于宿主细胞中异源蛋白质产量过高的缘故。据认为大肠杆菌内有相当高的氧化还原电位，因而致使异源促生长素基本上是以还原态（即无二硫键联结的）存在于折射体内。
已有若干种促生长素在大肠杆菌中被表达。例如人促生长素（在E.COLi K12，W3110/P107株中表达），公布于美国4，342，832号专利中;牛促生长激素，公布于欧洲专利申报表第75，444A号（美国申请系列第303，689号，1981年9月18日归档，由E.CoLi K12，W3110/PBGH-1株表达）;猪促生长素公布于欧洲专利申报表第111，389A号（美国申请系列439，977号，1982年11月8日归档）;以及鸟类促生长素，公布于1983年9月13日归档的PCT申报表W084/01150号。
为达本发明的目的，用标准的生物技术即能获得折射体。例如预先用0.25%重量百分比的甲苯和酚杀死的宿主细胞即能被常规的机械方法如Manton-GauLin匀浆器或法兰西压力机（French Press）破碎。破碎步骤最好到这样的程度，即宿主机体的细胞碎、片被充分打碎到不致在低速离心时从匀浆液中沉淀出来。而折射体能在低速离心时从匀浆中沉淀出来。最好将折射体再悬浮、洗涤和离心一次，然后弃去上清，留下的沉淀就基本上成为纯制品。虽然对本发明无关紧要，但最好还是将折射体制品再匀浆一下，以避免折射体集聚，从而保证制品中的折射体能自由分散。制品最好用每平方英寸3，000至5，000磅（表压）在Manton-GauLin匀浆器中匀浆。
尽管前已报道尿素在用来使蛋白质展开，以及将多亚单位蛋白质解离成它们各自的亚基时是一种有效的试剂，但现已发现，与以前的看法相反，只要把宿主细胞的折射体用一有效剂量和浓度的尿素来处理，就可把促生长素从折射体内充分溶解出来。从下面的讨论可知道尿素在特定的浓度和pH值时，就成为一有效溶解试剂。另外，碱性二甲砜的水溶液也被发现是一种把促生长素从折射体中提取出来的有效溶剂系统。虽然在多数情况下会将尿素或二甲砜单独使用，但某些情况下将这两种试剂合用还是可取的。
所需的尿素或二甲砜浓度和绝对量取决于pH值，以及特定的促生长素和将被溶解的蛋白质含量。由于尿素或二甲砜都容易获得，且相当便宜，在生态学意义上又比其他烈性解离试剂安全，同时又基本上不干扰以后的纯化步骤，因此采用这两种试剂在经济上是有利的。
为了使说明更简洁明了，下面的叙述将着重说明尿素的用法。对本文理解深入者亦会认识到类似的作用参数（如浓度、绝对量，pH值、温度等）也会影响采用二甲砜所获得的结果。参见例13。
含促生长素蛋白的大肠杆菌折射体曾被程度不同地溶解于pH为中性，浓度从8摩尔到10摩尔的尿素水溶液中，对一基本纯的折射体制品，如果用接近中性pH的尿素处理一短时期，就只能有相对少量被部分地溶解。随着尿素浓度的降低，溶解度也下降。在中性pH条件下，如果尿素浓度低于8摩尔太多，就几乎测不到溶解过程的发生。
疏水蛋白质总的说来在低温下较多地溶于水溶液。本发明观察到尿素对促生长素蛋白的溶解，在低温如4℃时比室温，如20至25℃时更大。除了较高的溶解性，低温溶解还增强尿素溶液的稳定性，并抑制有可能存在于折射体制品中的蛋白酶活性。虽上述优越性已表明是低温下操作的结果，但对本发明来说这并不紧要。相反，只要蛋白质并未发生不可逆的变性，就可以选择其它操作温度。但在多数情况下，把操作温度定于25℃和溶剂冰点之间将是非常优越和可取的。
本发明中，大剂量促生长素蛋白的溶解通过调节尿素溶剂的pH值的高低来达到。下述实例虽可证实溶剂的pH被调到较酸或较碱时会导致不能预料的效果，但调到碱性还是可取的，因为中和步
骤，特别是还原单体的氧化步骤是一种碱催化过程。溶剂pH可通过加入一种适宜的碱如氢氧化钠而调节得更具碱性。折射体溶解后，溶剂的pH则可能下降，因此需定期加碱以维持其碱性。折射体在尿素浓度达到或超过每毫升60毫克时即被完全溶解，但其浓度低至1摩尔时，溶解也是成功的。溶解所需条件（即尿素浓度，相应于折射体含量的溶液剂量和溶液的pH值）将取决于特定的折射体成分和待溶解折射体的量。
使用适宜的非干扰性的缓冲液以阻止溶液pH在溶解过程中的漂移将是可取的，尽管在本发明中并不绝对必要。适宜的缓冲液包括但不只限于三羟甲基氨甲烷和乙醇胺。用三羟甲基氨甲烷，以下称为“Tris”，是可取的，因它价格便宜，容易获得。浓度在10至90毫摩尔之间的Tris看来不会对促生长素的产量有显著影响。新鲜配制的50毫摩尔的Tris溶液其pH约为11.5。但是在4℃时Pk值为8.8的Tris在这种高pH值情况下只有弱的缓冲能力。浓度在约40到60毫摩尔的Tris较为合用，一方面可减少Tris的用量，而且能维持其一定的缓冲能力。
假如促生长素是以多聚和/或氧化形式存在于折射体内，那就适宜于用一种外源性还原剂如β-巯基乙醇或1，4-二硫基苏糖醇的水溶液，以促使分子内和分子间的二硫键断裂。假如这种不正确的折迭单体或聚合体促生长素存在，那么用还原剂处理就会提高促生长素生物活性的恢复程度。已发现还原剂和巯基基团能在尿素溶液中在生成高产量的正确氧化的促生长素单体的同时伴随性地氧化，因此也就无须在氧化促生长素前将它们分离除去。在N-甲硫氨酰牛促生长素（以下简称MBS）和N-甲硫氨酰猪促生长素（MPS）被大肠杆菌宿主细胞表达时，这些激素蛋白被发现基本上是以还原（无二硫键联结）的形式存在于折射体中的。因此，对这些制品就不必再用还原剂。
本方法还进一步发现一旦促生长素被溶解，就很容易转变成它们所应有的天然状态。在其天然状态，促生长素含有两个由四个半胱氨酸残基形成的分子内二硫键。不幸的是，这些半胱氨酸残基在还原态下被氧化时，可以三种方式中的任意一种方式形成两个分子内键，而这三种方式中只有一种能形成确定的天然形态。同样，一些促生长素分子间的半胱氨酸残基也可形成二硫键，从而出现二体、三体甚至多聚体。使促生长素蛋白产生折迭和氧化的条件也对单体和多聚体的正确与错误形态之间的比例产生影响。
在本发明之前，已有使蛋白质复性的标准生化方法，即把蛋白质从变性剂（即促溶剂）中移进合适的缓冲液，例如移入含有某种还原剂，且pH又适宜于特定蛋白质的碳酸氢钠溶液，见Stryer，《生物化学》（1981年，第二版）第32至35页，W.H.Freeman和Company，BowLey等人“人垂体生长激素一激素的还原和再氧化”，ArChives of Biochemistry and Biephysics，1970年，138卷，338至346页。所用的缓冲液体积以能使蛋白质含量变得很低，通常应使蛋白含量在每毫升1.5毫克以下。这样，将试剂暴露于空气，蛋白质即被氧化。
蛋白质中二硫键的形成的机制被认为是一种碱催化的自由基反应，如March的著作“高等有机化学的进展”Mc Graw Hill（1977）中所述，作为碱催化反应，将氧化步骤置于碱性pH下进行是可取的。虽然形成二硫键的氧化反应在pH高于7的情况下也可进行，但使工作pH高于蛋白质中巯基的PK值（约为8.4）是可取的，尤其是在工作pH值处于9至12时为好，缓冲液以选用Tris为好。
和以往事实相反，现已发现在尿素或二甲砜溶液中处于溶解状态的促生长素通过加入温和氧化剂如过氧化氢或在空气中暴露足够长的时间，以使巯基氧化成分子内的二硫键，即可有效地复性。进一步又发现复性可在促生长素的含量高达每毫升30毫克或更多时进行，但每毫升少于30毫克甚至少于20毫克时更可取。不论还原剂是否存在，复性都能以一种有效的方式在杂有宿主细胞的蛋白质的情况下进行。促生长素单体含量可通过任何一种适宜的生化技术如放免测定（RIA），限外层折（分子筛）和高效液相层析（HPLC）来确定。
无外源还原剂如β-巯基乙醇或1，4-二巯基苏糖醇时，或小心除去氧气之后，促生长素分子的氧化便取决于蛋白质的溶解程度。对具有生物活性的促生长素单体的产量来说，尿素的浓度看来是一个最具影响力的参数。确实，氧化过程实质上会在任何使促生长素总保持着溶解状态的尿素浓度时进行，应知道促生长素一旦被溶解，便能在低温和1
摩尔乃至更低浓度的尿素溶液中保持其溶解状态。因此，为提高促生长素单体的产量，就应把尿素从溶解步骤使用的浓度调至为复性所需的最适浓度。特定的最适浓度需视特定的生长激素而定。当溶解后需要降低尿素浓度时，可加入蒸馏水和缓冲液将尿素溶液稀释。采用还原剂，就不需要立即对尿素浓度进行调节。无还原剂会导致单体产量下降。7.5摩尔的尿素用作溶剂时，在尿素稀释前MBS会每小时丢失大约5%（重量百分比）。
对MBS来讲，复性时尿素浓度在4至5摩尔之间为好。在4.5摩尔时，复性看来是理想的，高或低于此浓度都使促生长素单体的产量降低，形成更多的多聚体。因此，假如以浓度为7.5摩尔的尿素作为溶剂，但又不加还原剂的情况时，最好在溶解后迅速加入蒸馏水和适宜的缓冲液如Tris，以便将尿素浓度稀释到4.5摩尔，从而降低在较高的非最适尿素浓度下的氧化反应。
MPS有18个氨基酸与MBS不同，其适宜的尿素浓度在2.5至3.5摩尔之间，而其理想的复性尿素浓度大约为3摩尔，而在较高和较低尿素浓度时都使单体回收下降及聚集体的生成增加。同样地，将尿素浓度在很好混合的情况下迅速从7.5摩尔稀释成3摩尔时，为在无还原剂存在下减少较高的非最适浓度尿素中的复性，采用一种适宜的缓冲液如Tris是可取的。
将上述方法中溶解和复性的生长激素进一步用标准的层析技术纯化。其生物活性则通过对大鼠增重生物测定实验的阳性反应来确定。此测定中，异源生长激素的生物活性要参考相应的一系列已知生长激素制品（即牛和猪的垂体生长激素）的不同剂量对去垂体大鼠相应的增重量来评价。将大鼠增重量对特定的生长激素制品和已知标准品（即垂体制品）的用量作图，得到同一座标系中的两条剂量反应曲线，比较两曲线的回归斜率，即可以不同量标准品所代表的相对活性，以每毫克的单位数计算出异源生长激素制品的相应活性。
MBS用本发明的方法来溶解和复性，其制品被进一步纯化，然后用于泌乳期奶牛，结果使实验组动物的产乳量（重量）比对照组动物的产量高10到40%，见EPPard等人发表在1984年康奈尔营养会议记录中的文章，“长期使用生长激素对泌乳期奶牛产乳行为的影响。”
下面的例子主要用来更好地阐明本发明的实施。这里举例的目的应被理解为仅仅是为了解释本发明的应用方法，而决不是对本发明的应用范围加以一种限制。
例1
本发明已被证明能溶解大肠杆菌表达的N-甲硫氨酰牛促生长素（MBS），Seeburg等人对此已有概述，见DNA1983年二卷1期37至45页，每一步骤的详情可在以下作者的文章中查到，Goeddel等人，Nature281卷（1979年10月）;Deboert等人，起动子：结构与功能，462-481页，Praeger Seientific Publishing CO，（1982年）;MiOzzari等人，J.Bacteriology，133卷，1457至1466页，（1978年）。将收集的细胞在Manton-GuaLin匀浆器中匀浆两次，使细胞破碎，然后低速离心使含有MBS的折射体沉淀，弃去上清，悬浮折射体，并洗涤、离心，弃去上清后，即留下基本上纯的折射体制品。
将上述方法制备的折射体制品在25℃时加入不同浓度和不同pH的尿素溶液。所有缓冲液都含100毫摩尔Tris碱，其pH用盐酸调节，折射体的最终浓度约为每毫升溶液中含4毫克。折射体的溶解度由分光光度学方法确定。假定折射体整个是由蛋白质组成，在277毫微米，光通径为1厘米时，采用消光系数0.68表示每毫升1毫克的蛋白浓度。起始浓度用分光光度学方法定为完全溶解的样品。上述实验结果在图1中表示。该资料支持一个意外的发现，即将pH调至碱性范围时溶解度会大大地增强。
例2
基本上参照例1的方法，只是将温度保持在4℃，pH往酸、碱两个方向调节。与例1相同，缓冲液都含有100毫摩尔Tris碱，pH调向酸性时要用乙酸。该结果在图2中表示。比较图1和图2的结果可看出，在一定的尿素浓度和pH条件下，低温（4℃）比室温（25℃）能明显提高溶解度。
比较实例A
按例1方法制备含MBS的折射体，将其与10摩尔的尿素混合，不调节pH，混合后的折射体浓度约为每毫升5毫克。使溶液混匀，并在4℃平衡过夜。按上述分光光度法测定溶解度，其值为每毫升仅约2.9毫克。确定折射体的起始浓度时加入足
够的尿素溶液使折射体完全溶解，用分光光度计测定完全溶解溶液的浓度并调节稀释。
比较实例B
按例1方法制备含MBS的折射体，使之与8摩尔的尿素混合，不调pH，使折射体的最终浓度为每毫升大约5毫克，将溶液混匀后4℃平衡过夜，在分光光度计上测得的溶解度为每毫升2.4毫克，确定折射体起始浓度时加入足够的尿素溶液使折射体完全溶解，用分光光度计测定完全溶解溶液的浓度并调节稀释。
例3
按例1方法制备含MBS的折射体，与4.5摩尔无缓冲能力的尿素水溶液混合，使折射体浓度约为每毫升66毫克，加入氢氧化钠液使pH从7升到11，溶液即被认定为完全溶解液。折射体的浓度按例1所述的方法确定为每毫升66毫克。
例4
按例1方法制备含MBS的折射体，溶于含100毫摩尔Tris，pH10.5，浓度为7.5摩尔的尿素水溶液，加入100毫摩尔的Tris将尿素浓度调至不同水平，同时加入一定量的适宜尿素溶液将总蛋白浓度调至每毫升大约1毫克（通过完全溶解样品的分光光度学分析方法确定）。将溶液与空气接触并搅拌24小时，使之氧化。该结果在图3中表示，MBS单体产量以占总MBS含量的重量百分数表示。如图3所示，最佳的复性效率在尿素浓度约为4.5摩尔时得到。
例5
下述操作方法已在例4中述及。将含MBS的折射体溶解于pH10.5，含100毫摩尔Tris的7.5摩尔尿素溶液，然后用100毫摩尔的Tris将溶解液稀释到4.5摩尔，pH调在10.5至8.5之间。这些个别的试验是在暴露于空气及搅拌24小时的条件下进行氧化的。MBS单体和寡聚体含量通过HPLC确定。虽然实验结果指出在氧化过程中复性效率对溶液pH有着相当平伏的反应，但在较高pH时，复性效率仍具有上升趋势。此外，这种碱催化的氧化在较碱性pH水平时反应较快。
例6
按例1方法制备折射体制品，从中取出大约150毫升，在4℃与850毫升5.3摩尔的尿素混合，由此得到4.5摩尔的尿素，然后用50%重量百分比的氢氧化钠液将其pH调至11。完全溶解的折射体使MBS的总浓度约为每毫升12.4毫克。将溶液在4℃搅拌过夜从而使MBS氧化。氧化液的HPLC分析结果表明MBS单体产率约为80%（重量百分比）。
例7
MPS用例1列出的参考文献中所叙述的常规技术在大肠杆菌中表达。然后用前述方法收集含MPS的折射体，在4℃将其溶于pH11.0，含90毫摩尔的Tris，浓度为7.5摩尔的尿素中。每毫升上述尿素溶液溶有113毫克（湿重）折射体颗粒。用90毫摩尔Tris和/或尿素将样品稀释，以得到浓度分别为4.5摩尔，3摩尔和2摩尔的尿素溶液而其中MPS的浓度均为每毫升4毫克（湿重）折射体颗粒。样品在搅拌情况下暴露于空气过夜进行氧化。HPLC测定结果指出在尿素浓度为3摩尔时MPS单体产量最佳。
例8
操作同例7的方法，MPS在4℃分别以三种浓度（每毫升前述尿素溶液中含20、40、和80毫克沉淀（湿重）溶于含90毫摩尔，pH为11，浓度为7.5摩尔的尿素溶液。所有样品液用90毫摩尔Tris和/或尿素稀释到尿素浓度为3摩尔，MPS浓度为每毫升1毫克，然后暴露于空气，4℃搅拌56小时，HPLC测定结果指出MPS单体的平均产量为69%（重量百分比）。
例9
操作基本上参照例8方法进行，但溶解和复性在0.1毫摩尔的1，4-二巯基苏糖醇存在下进行，HLPC测定结果指出MPS单体的平均产量为66%（重量百分比）。
例10
BGH的三种变体，Alα-1Alα-1Vαl126，和Met-1Vαl126，已在大肠杆菌中表达，其操作方法已由G.G.krivi在“原核细胞蛋白质的生产”一文中阐述，且在文献中特别提到。该文章的方法同时也记录在美国专利申请系列704，362号，于1985年2月22日归档。参照例1的常规方使BGH的变体进行溶解和复性。
含有不同BGH变体的折射体按例1方法制备，将近300克湿重的折射体用水悬浮后得到1升浆液，然后将其与大约5升9摩尔的尿素及108
毫摩尔Tris混合，使不同BGH变体的溶解液由7.5摩尔的尿素和90毫摩尔的Tris组成，其pH为10.5，温度为4℃。搅拌几分钟后得到完全溶解液。缓慢加入4升冷水以便得到复性溶剂，从而使不同BGH变体存在于4.5摩尔浓度的尿素中，其中Tris浓度为54毫摩尔，pH10.5，温度4℃。让溶液与空气接触，并搅拌48小时，不同的BGH变体即被氧化。用HPLC测定，表明三种变体的单体产量几乎都达到60%至70%（重量百分比）
例11
参照前述方法制备结构上均一的促生长素蛋白，并按已叙述的圆二色性法确定天然垂体促生长素的结构。（见Bewley，激素研究的近期进展，35卷，155-210页，科学出版社。）另外还特别将MBS和BGH的Alα-1变体与牛垂体促生长素作了比较。样品溶于pH9.5，浓度50毫摩尔的碳酸氢钠，并用上述技术分析，结果表明按本方法制备的重组促生长素在复性后获得了天然构型。
例12
按例1方法制备含MBS的折射体，在4℃与1摩尔的无缓冲能力尿素混合，用氢氧化钠将pH调节维持在12.1。该溶液即定为完全溶解液。折射体浓度按例1所述方法分析，确定为每毫升大约10毫克。
例13
按例1方法制备含MBS的折射体，在28℃溶于3摩尔的二甲砜，pH为11.8。此时MBS浓度为每毫升2毫克。溶解的MBS经空气氧化后，其氧化产物与用4.5摩尔尿素，在pH11.3（50毫摩尔Tris），5℃时获得的氧化产物在分子间成键程度上没有显著差别。
Claims (15)
1、一种从含有折射体的宿主细胞的折射体内溶解和复性促生长素的方法，其特征在于(a)在温度为该溶液的冰点到28℃以及pH值为9到12.1的条件下，将该折射体与具有1.0M到10M的尿素或二甲砜的水溶液接触进行溶解过程，以及(b)将pH值为8.5到11.8的以及所含尿素或二甲砜浓度为2.0M到7.0M的溶解促生长素水溶液与温和的氧化剂接触进行复性过程，在含有促生长素的半胱氨酸残基物之间形成分子内的二硫键。
2、一种从含有折射体的宿主细胞的折射体内溶解促生长素蛋白的方法，其特征在于在温度为该溶液的冰点到28℃以及pH值为9到12.1的条件下，将该折射体与具有1.0M到10M的尿素或二甲砜的水溶液接触进行溶解过程。
3、根据权利要求2的方法，其中折射体是被溶解于尿素的水溶液中。
4、根据权利要求2的方法，其中溶解是在不用还原剂的情况下进行。
5、根据权利要求2的方法，其中溶解是在还原剂参与下进行。
6、根据权利要求3的方法，其中促生长素是牛促生长素或猪促生长素。
7、根据权利要求2的方法，其中pH值用有效剂量的三羟甲基氨甲烷来维持在所说的pH范围内。
8、一种促生长素蛋白的复性方法，其中该蛋白是通过溶解含有该促生长素的折射体而回收得到的，其特征在于通过将温和的氧化剂与具有pH值为8.5到11.8的以及含尿素或二甲砜浓度为4.0M到5.0M的溶解促生长素的水溶液接触，在含有促生长素的半胱氨酸残基物之间形成分子内的二硫键。
9、根据权利要求8的方法，其中促生长素蛋白的尿素的水溶液中复性。
10、根据权利要求5的方法，其中复性在温度高于溶剂冰点、低于25℃时进行。
11、根据权利要求9的方法，其中复性过程中有还原剂参与。
12、根据权利要求9的方法，其中复性过程中无还原剂的参与。
13、根据权利要求9的方法，其中生长激素是牛或猪的生长激素。
14、根据权利要求2的方法，其中折射体是溶解在二甲砜水溶液里。
15、根据权利要求8的方法，其中促生长素蛋白的复性在二甲砜的水溶液中进行。
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