DK172526B1 - Fremgangsmåde til indvinding af biologisk aktivt bovint og porcint somatotropinprotein fra refraktile legemer i en værtscel - Google Patents

Description

i DK PR 172526 B1

Rekombinant DNA teknologi har muliggjort ekspressionen af heterologt protein i værtsceller som f.eks. E. coli bakterier. Det er blevet rapporteret, at visse heterologe proteiner som f.eks. somatotropiner (væksthormoner) 5 udskilles i forskellig grad efter ekspression i refraktile legemer indeni værtscellens cytoplasma.

Chaotropiske midler, såsom guanidinhydrochlorid, natriumthiocyanat, urinstof og forskellige detergenter er blevet anvendt til at itubryde de ikke-covalente 10 intermolekylære tiltrækninger indeni proteiner. For eksempel er det vist, at proteiner kan "foldes ud" ved at udsætte proteinet for et chaotropisk middel, se Stryer, Biochemistry (2. udg., 1981) p. 34-35, W.H. Freeman and Company. På samme måde er det blevet vist, at proteiner, 15 der indeholder multiple subenheder kan opløses i deres respektive subenheder ved at udsætte proteinet for et chaotropisk middel.

For nylig er det blevet rapporteret i europæisk patentansøgning publikation nr. 114.506A, at heterologe 20 proteiner kan solubiliseres fra refraktile legemer under anvendelse af et stærkt chaotropisk middel som f.eks. guanidinhydrochlorid, detergenter som f.eks.

natriumdocecylsulfat og salte af thiocyanat. Anvendelsen af urinstof, et forholdsvis svagt chaotropisk middel, for 25 at solubilisere refraktile legemer er angivet som værende ineffektiv. Stærke denaturerende midler som f.eks. guanodinhydrochlorid er meget kostbare. Herudover må de heterologe proteiner, når de først er solubiliseret i det stærke denaturerende middel, overføres til et svagt 30 denaturerende middel, der ikke vil gribe ind i de senere ionbytterrensningsmetoder.

Formålet med den foreliggende opfindelse er således at tilvejebringe en forbedret fremgangsmåde til DK PR 172526 B1 2 solubilisering og efterfølgende oxidation og naturering af heterologe somatotropinproteiner fra refraktile legemer i værtsceller.

Denne fremgangsmåde er en fremgangsmåde til indvinding af 5 biologisk aktivt bovint somatotropinprotein fra refraktile legemer i en værtscellekultur indeholdende nævnte protein, hvilken fremgangsmåde omfatter a) at adskille og indvinde de refraktile legemer fra værtscellekulturen, 10 b) at bringe de refraktile legemer i kontakt med en vandig urinstofopløsning således at proteinet solubiliseres, c) at oxidere det solubiliserede protein ved at bringe opløsningen indeholdende proteinet i kontakt med et mildt 15 oxidationsmiddel med henblik på at danne intramolekylære disulfidbindinger mellem cysteingrupperne indeholdt i somatotropinproteinet, og d) at genvinde proteinet, hvorved solubiliseringen udføres ved en 20 urinstofkoncentration mellem ca. 1 og 7,5 M, hvorved oxidationen udføres ved en urinstofkoncentration på mellem ca. 4 og 6 M, og hvorved solubiliseringen og oxidationen hver udføres ved et pH over ca. 9 og ved en temperatur over opløsningens frysepunkt og under ca. 25 25 °C.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere en fremgangsmåde til indvinding af biologisk aktivt porcint somatotropinprotein fra refraktile legemer i en værtscellekultur indeholdende nævnte protein, hvilken 30 fremgangsmåde omfatter 3 DK PR 172526 B1 a) at adskille og indvinde de refraktile legemer fra værtscellekulturen, b) at bringe de refraktile legemer i kontakt med en vandig urinstofopløsning ved en koncentration, temperatur 5 og pH, som bevirker, at proteinet solubiliseres, c) at oxidere det solubiliserede protein ved at bringe opløsningen indeholdende proteinet i kontakt med et mildt oxidationsmiddel i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at danne intramolekylære disulfidbindinger mellem 10 cysteingrupperne indeholdt i somatotropinproteinet, og d) at genvinde proteinet, hvorved solubiliseringen udføres ved en urinstofkoncentration mellem ca. 1 og 7,5 M, hvorved oxidationen udføres ved en urinstofkoncentration på 15 mellem ca. 2,5 og 3,5 M, og hvorved solubiliseringen og oxidationen hver udføres ved et pH over ca. 9 og ved en temperatur over opløsningens frysepunkt og under ca. 25 °C.

For bedre at forstå den foreliggende opfindelse angives 20 neden for en række definitioner.

"Heterologe" proteiner er proteiner, der normalt ikke frembringes af værtscellen. Rekombinant DNA teknologien har muliggjort ekspressionen af forholdsvis store mængder heterologe proteiner fra transformerede værtsceller. Selv 25 om det ikke fuldt er opklaret, så udskilles disse fremmede proteiner i uopløselige lysfraktile legemer i værtscellens cytoplasma.

Ved "refraktile legemer" forstås inclusionslegemer eller cytoplasmiske aggregater indeholdende i det mindste 30 delvis det heterologe somatotropin, der skal udvindes.

DK PR 172526 B1

Disse aggregater forekommer som lyse pletter i et fasekontrastmikroskop.

Ved "værtsceller" forslås en mikrobiel celle som f.eks. bakterier og gær eller andre passende celler som f.eks.

5 dyre- og planteceller, der er transformeret til at udtrykke det heterologe somatotropin. Værtsceller, der falder inden for den foreliggende opfindelses rammer, er sådanne, hvori det heterologe somatotropin udskilles efter ekspression i refraktile legemer. Et eksempel herpå 10 er værtscellen E. Coli K12 (stamme W3110/pBGH-l), der er transformeret til at muliggøre ekspression af bovint somatotropin.

"Naturering" hentyder til foldning og oxidation af somatotropinproteinet til dettes oprindelige form til 15 opnåelse af biologisk aktivitet.

"Foldning" hentyder til tilbagevenden til en sådan form af proteinet, at det er muligt, at dette kan oxideres.

Foldning udføres ved at reducere den denaturerende virkning af urinstoffet ved at indstille 20 urinstofkoncentrationen til et passende niveau, evt. for at muliggøre at aminosyresekvensen af proteinet kan reagere med hinanden og genoptage dettes oprindelige sekundære og tertiære opbygning.

"Oxidation" refererer til dannelsen af intramolekylære 25 disulfidbindinger til opnåelse af den stabile oprindelige form for at sikre biologisk aktivitet.

Ved "svagt oxiderende middel" forstås et middel, der fremmer oxidationen af sulfhydrylgrupper, hvorved der dannes intramolekylære disulfidbindinger, medens andre 30 substituentgrupper i det pågældende protein ikke oxideres. Medens svage midler som f.eks. hydrogenperoxid kan anvendes, er udsættelsen for luft acceptabel og at foretrække.

5 DK PR 172526 B1

Ved "biologisk aktivitet" forstås, at somatotropinet er i stand til at udføre det in vivo fysiologiske respons. Den biologiske aktivitet kan bestemes, når der ikke afprøves in vivo, ved at udføre forsøg i særlige arter, idet man 5 udfører passende bioforsøg. Et passende bioforsøg for de somatotropiner, der er fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er "rotte-vægtforøgelse-bioforsøget".

I dette bioforsøg undersøges bioaktiviteten af somatotropinpræparater i forhold til et kendt præparat 10 (d.v.s. ekstraheret oprindeligt somatotropin) ved at relatere vægtforøgelsen af hypofysektomiserede rotter til forskellige mængder af det administrerede præparat.

Udtrykket "somatotropin" som anvendt i forbindelse med den foreliggende opfindelse betyder bovint og/eller 15 porcint somatotropin. Udtrykket indbefatter både somatotropinproteiner med naturligt forekommende aminosyresekvenser og analoger og homologer af de naturligt forekommende somatotropiner. Det er for eksempel kendt, at visse "konservative" substitutioner af 20 aminosyrer kan forekomme uden væsentlig ændring i et proteins samlede kemiske egenskaber. Eksempler på sådanne substitutioner er substitutionen af alifatiske hydrofobe grupper med hinanden (isoleucin, valin, leucin og methionin) og substitution af polære grupper med hinanden 25 (arginin i stedet for lysin, glutamin i stedet for asparagin og glutaminsyre i stedet for aspartinsyre). Det har vist sig, at iongrupper med modsat ladning kan substitueres med hinanden, for eksempel aspartinsyre eller glutaminsyre i stedet for lysin. Endvidere kan 30 substitutioner, som er "radikale" (repræsenterende forskellige typer sidekæder), forekomme uden væsentlig ændring i funktion eller kemiske egenskaber, når substitutionsstedet ikke er kritisk for konformation og substitutionsgraden ikke er omfattende. I det omfang, at 35 sådanne somatoproteiner er ækvivalenter med hensyn til DK PR 172526 B1 6 solubiliserings- og oxidationsformål, indbefatter den foreliggende opfindelse sådanne somatotropinproteiner.

Det er blevet angivet, at de fleste heterologe proteiner udtrykt i E. coli bakterier udskilles i forskellig mængde 5 efter ekspression i de refraktile legemer indeni bakteriernes cytoplasma. Selvom dette ikke er fuldt opklaret, antages det, at det i det mindste delvis skyldes en overproduktion af heterologt protein i værtscellen. Heterologe somatotropiner antages at findes 10 i de refraktile legemer i væsentlig reduceret form (uden disulfidbindinger) på grund af det forholdsvis høje redoxpotentiale i E. coli cellen.

Adskillige somatotropiner er blevet udtrykt i E. coli bakterier. For eksempel er bovint somatotropin (E. coli 15 K12 stamme W3110/pBGH-l) omhandlet i europæisk

patentansøgning publikation nr. 75 444A (USA

patentansøgning serial nr. 303 689 indleveret 18.

september 1981) og porcint somatotropin er omhandlet i europæisk patentansøgning publikation nr. Ill 389A (USA 20 patentansøgning serial nr. 439 977 indleveret 8. november 1982.

Når man skal udføre opfindelsen, kan de refraktile legemer udvindes under anvendelse af almindelige biologiske standardmetoder. For eksempel kan værtscellen, 25 der forud er dræbt med en opløsning af 0,25 vægtprocent af både toluen og phenol, itubrydes under anvendelse af almindeligt anvendte mekaniske metoder som f.eks. en Manton-Gaulin homogenisator eller en French presse. Det foretrækkes, at itubrydningen udføres således, at 30 celleresten fra værtorganismen er tilstrækkelig itubrudt, så den ikke falder til bunds i homogenatopløsningen i en centrifuge med lav hastighed. Under centrifugering med lav hastighed bundfælder de refraktile legemer fra homogenatopløsningen. De refraktile legemer genopslaanmes 7 DK PR 172526 B1 fortrinsvis, vaskes og centrifugeres igen. Den supernatante del bortkastes, hvilket giver et i det væsentlige rent præparat. Skønt det ikke er kritisk for udførelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, 5 foretrækkes det, at præparatet af det refraktile legeme atter homogeniseres for at sikre et frit dispergeret præparat, således at de refraktile legemer ikke agglomererer. Præparatet homogeniseres fortrinsvis i en Manton-Gaulin homogenisator ved 3000-5000 psig.

10 Medens det tidligere er blevet angivet, at urinstof er et effektivt middel til at åbne proteiner og opløse protein af flere enheder i de respektive subenheder, har det vist sig, i modsætning til tidligere, at somatotropiner effektivt kan solubiliseres fra værtscellens refraktile 15 legemer ved at underkaste de refraktile legemer en effektiv mængde og koncentration af urinstof. Det vil fremgå af diskussionen nedenfor, at urinstof er et effektivt solubiliserende middel ved særlige koncentrationer og pH-værdier. Sandsynligvis vil man i de 20 fleste tilfælde anvende urinstof alene, men i visse tilfælde kan man foretrække at anvende urinstof sammen med dimethylsulfon.

Den koncentration og den absolutte mængde af urinstof, der er nødvendig, vil afhænge af pH-værdien, den 25 pågældende somatotropin og mængden af protein, der skal solubiliseres. Anvendelsen af urinstof er økonomisk at foretrække, da det er let tilgængeligt, forholdsvis billigt, sikkert set rent økologisk end stærkere chaotropiske midler og i det væsentlige ikke griber ind i 30 de senere rensningsprocedurer.

Refraktile legemer af E. coli indeholdende somatotropinproteiner solubiliseredes i forskellig grad i en vandig opløsning indeholdende ca. 8M og 10M urinstof ved nær neutral pH. Kun delvis solubilisering af en DK PR 172526 B1 8 forholdsvis lille mængde af et i det væsentlige rent præparat af refraktile legemer fås med urinstof ved omkring neutral pH i løbet af kort tid. Efterhånden som urinstofkoncentrationen stiger, stiger graden af 5 solubilisering. Ved en urinstofkoncentration meget under ca. 8M og nær neutral pH ses kun ringe solubilisering.

Hydrofobe proteiner er sædvanligvis mere opløselige i vandig opløsning ved reducerede temperaturer. Med hensyn til den omhandlede fremgangsmåde har det vist sig, at 10 solubiliseringen af de somatotropinlignende proteiner med urinstof var større ved reduceret temperatur, typisk ved 4 °C end ved stuetemperatur, typisk 20-25 °C. Udover større solubilitet bevirker solubilisering ved lavere temperaturer en forøget stabilitet af urinstofopløsningen 15 og hæmning af proteasevirkning, som kan findes i præparatet af de refraktile legemer. Medens de fordelagtige virkninger beskrevet ovenfor skyldes, at man arbejder ved lave temperaturer, er en sådan arbejdsmåde ikke kritisk ved den omhandlede fremgangsmåde. Man vil 20 snarere foretrække andre temperaturer, så længe som proteinet ikke denatureres irreversibelt. Imidlertid antages det i de fleste tilfælde, at temperaturer under 25 °C, men over opløsningens frysepunkt vil være mest fordelagtige og foretrækkes derfor.

25 Ved den omhandlede fremgangsmåde opnåedes solubilisering af signifikante mængder af somatotropinprotein ved at sænke eller hæve den vandige urinstofopløsnings pH.

Medens den uventede virkning af indstilling af opløsningens pH til mere sur eller basisk pH vil fremgå 30 af de efterfølgende eksempler, foretrækkes en indstilling til en alkalisk pH-værdi, da natureringen, specielt oxidationen af den reducerede monomer, er basekatalyseret. Opløsningens pH kan blive mere alkalisk ved tilsætning af en passende base som f.eks.

9 DK PR 172526 B1 natriumhydroxid. Efterhånden som de refraktile legemer opløses, kan opløsningens pH øges, hvilket kræver periodisk tilsætning af mere base for at opretholde alkaliske tilstande. Refraktile legemer er blevet 5 fuldstændigt solubiliseret ved koncentrationer så høje som 60 mg/ml. Herudover er solubilisering blevet opnået ved urinstofkoncentrationer så lave som 1,0M. De nødvendige solubiliseringsbetingelser (d.v.s.

urinstofkoncentration, mængden af anvendt 10 urinstofopløsning i forhold til mængden af refraktile legemer og opløsningens pH) vil afhænge af sammensætningen af det pågældende refraktile legeme og mængden af refraktile legemer, der skal solubiliseres.

Skønt det ikke er kritisk for den omhandlede 15 fremgangsmåde, kan man anvende et passende puffermiddel, der ikke griber ind, for at hjælpe til at dæmpe skiftene i opløsningens pH under solubiliseringen. Passende puffermidler omfatter, men er ikke begrænset til Tris(hydroxy-methyl)aminomethan og ethanolamin.

20 Tris (hydroxymethyl)-aminomethan, i det efterfølgende betegnet "Tris", foretrækkes, da det er billigt og let tilgængeligt. Tris-koncentrationer mellem ca. 10 og 90mM synes signifikant på påvirke somatotropinudbyttet. En frisk fremstillet 50mM Tris-opløsning har en pH på ca.

25 11,5. Imidlertid har Tris med en pK på 8,8 ved 4 eC kun svag pufferkapacitet ved dette høje pH. en Triskoncentration mellem ca. 40 og 60mM foretrækkes for at formindske anvendelsen af Tris, medens man stadig bibeholder en vis pufferkapacitet.

30 Dersom somatotropin findes i de refraktile legemer i aggregeret og/eller oxideret form, foretrkkes det at have et exogent reducerende middel, såsom for eksempel β-mercaptoethanol eller 1,4-dithiothreitol i vandig urinstofopløsning for at fremme spaltningen af de DK PR 172526 B1 10 intramolekylaere og intermolekylære disulfidbindinger.

Dersom et sådant ukorrekt foldet monomert eller aggregeret somatotropin forefindes, vil tilstedeværelsen af reducerende middel typisk forøge genudvindelsen af 5 biologisk aktivt somatotropin. Det har vist sig, at det reducerende middel og sulfhydralgrupperne kan oxidere samtidig i urinstofopløsningen, hvilket giver et godt udbytte af korrekt oxideret monomert somatotropin og ikke nødvendigvis behøver at fjernes inden oxidation af det 10 ønskede somatotropin. Når det drejer sig om N-methionyl bovint somatotropin og N-methionyl porcint somatotropin udtrykt i en E. coli værtscelle, har man set, at proteinet udskiltes i de refraktile legemer i det væsentlige i reduceret form (ingen disulfidbindinger).

15 Derfor var anvendelsen af reducerende midler ikke nødvendig til disse præparater.

I en anden udførelsesform for den omhandlede fremgangsmåde har det yderligere vist sig, at når først somatotropinerne er solubiliserede, kan de let omdannes 20 til deres oprindelige form. I deres oprindelige form indeholder somatotropiner to intramolekylaere disulfidbindinger mellem de fire cysteingrupper.

Uheldigvis kan cysteingrupperne, dersom de oxideres fra den reducerede form, forene sig til dannelse af to 25 intramolekylaere bindinger på en vilkårlig af de tre måder, idet kun en kombination af disse er den oprindelige form. Ligeledes kan cysteingrupper fra et somatotropinmolekyle danne disulfidbindinger med cysteingrupper fra et andet molekyle, hvorved der 30 frembringes dimere, trimere og højere oligomere.

Forholdet mellem korrekt dannet monomer i forhold til ukorrekt dannede monomere og oligomere influeres yderligere af de betingelser, hvorunder somatotropinproteinet foldes og oxideres.

DK PR 172526 B1 11

Inden den omhandlede fremgangsmåde var det almindelig biokemisk praksis, når man naturerede et protein, at flytte proteinet fra den denaturerende opløsning (d.v.s. chaotropiske opløsning) til en acceptabel pufferopløsning 5 som f.eks. natriumdicarbonat ved en pH-værdi, der var passende for det pågældende protein, i nærværelse af et reducerende middel, se Stryer, Biochemistry (2. udg., 1981) p 32-35, W.H. Freeman and Company og Bewley et al., "Human Pituitary Growth Hormone - The Reduction and 10 Reoxidation of the Hormone", Archives of Biochemistry and Biophysics, 138, p. 338-346 (1970). Mængden af anvendt pufferopløsning var således, at proteinkoncentrationen var ret lav, sædvanligvis mindre end ca. 1,5 mg/ml.

Oxidation af proteinet udførtes herefter ved at udsætte 15 opløsningen for luft.

Dannelsen af disulfidbindinger i proteiner antages at ske ved hjælp af en basekatalyseret fri radikal mekanisme således som beskrevet af March i Adv. Organic Chemistry,

McGraw Hill (1977). Idet oxidationstrinnet er 20 basekatalyseret, udføres oxidationstrinnet fortrinsvis ved alkalisk pH. Medens oxidationen, der danner disulfidbindingerne, vil foregå ved pH højere end 7, foretrækkes et arbejds-pH over pK-værdien for en proteinsulfhydrylgruppe (ca. 8,4). Specielt foretrækkes 25 et arbejds-pH mellem ca. 9 og 12. Dersom en puffer anvendes, foretrækkes Tris(hydroxymethyl)aminomethan.

I modsætning til tidligere praksis har det nu vist sig, at somatotropiner effektivt kan natureres, medes de stadig er opløst i urinstof- eller 30 dimethylsulfonopløsningen, ved at bringe opløsningen i kontakt med et svagt oxiderende midddel som f.eks. hydrogenperoxid eller luft i tilstrækkelig tid til at oxidere sulfhydralgrupperne, der danner de intramolekylære disulfidbindinger. Det har yderligere DK PR 172526 B1 12 vist sig, at naturering kan udføres ved somatotropinkoncentrationer så høje som 30 mg/ml eller mere, fortrinsvis mindre end ca. 30 mg/ml og foretrukkent mindre end ca. 20 mg/ml. Natureringen skrider frem på en 5 effektiv måde ved tilstedeværelse af forurenende proteiner fra værtscellen med eller uden det reducerende middel. Mængden af somatotropinmonomer kan bestemmes ved en vilkårlig passende biokemisk metode som f.eks. radioimmunforsøg (RIA), 10 størrelseseksklusionschromatografi og væskechromatografi med høj ydeevne (HPLC).

Uden exogene reducerende midler som f.eks. β-mercaptoethanol og 1,4-dithiothreitol eller idet man udelukker oxygen, begynder oxidationen af 15 somatotropinmolekylet ved solubiliseringen.

Urinstofkoncentrationen synes at være den parameter, der har størst indflydelse på udbyttet af den biologisk aktive somatotropinmonomer. Faktisk vil oxidation forekomme i det væsentlige ved en hvilken som helst 20 urinstofkoncentration, ved hvilken somatotropinet vil forblive solubiliseret. Det skal bemærkes, at når først somatotropinerne er solubiliseret, vil det forblive i opløsning ved reducerede temperaturer ved urinstofkoncentrationer på 1M eller lavere. For at 25 optimere produktionen af denne monomer bør man derfor indstille urinstofkoncentrationen fra den værdi, der anvendes til solubiliseringen, således at man opnår den optimale til renatureringen. Den specielt optimale koncentration vil nødvendigvis afhænge af det pågældende 30 somatotropin. Dersom det er ønskeligt at sænke urinstofkoncentrationen efter solubiliseringen, kan fortynding udføres ved tilsætning af destilleret vand eller pufferopløsning. Man kan vælge at anvende reducerende middel for at sænke behovet for hurtig 35 indgriben efter justering af urinstofkoncentrationen.

DK PR 172526 B1 13

Uden reducerende middel falder udbyttet af MBS omtrent 5 vægt% for hver time, der forløber uden fortynding af urinstofkoncentrationen, dersom 7,5M urinstof anvendes til solubilisering.

5 Når det drejer sig om N-methionyl bovint somatotropin, foretrækkes en urinstofkoncentration under natureringen på mellem ca. 4M og 5M. Natureringen synes at være optimal ved ca. 4,5M med faldende monomergenudvindelse og stigende aggregatdannelse ved både højere og lavere 10 urinstofkoncentrationer. Dersom 7,5M urinstof derfor anvendes til solubilisering, foretrækkes en hurtig fortynding til 4,5M urinstof med destilleret vand eller en passende puffer som f.eks. Tris uden reducerende middel for at formindske oxidationen ved den højere ikke-15 optimale urinstofkoncentration.

Dersom det drejer som om N-methionyl porcint somatotropin, der er forskelligt fra MBS i 18 aminosyrer, foretrækkes en urinstofkoncentration under reaktivering på mellem 2,5M og 3,5M. Natureringen foregår optimalt ved 20 ca. 3M urinstof med faldende monomergenudvindelse og stigende aggregatdannelse ved både højere og lavere urinstofkoncentrationer. På samme måde foretrækkes hurtig fortynding fra 7,5M til 3M urinstof ved god blanding, en passende puffer som f.eks. Tris uden reducerende middel 25 for at reducere renaturering ved højere ikke-optimale urinstofkoncentrationer.

Somatotropiner solubiliseret og natureret på den oven for beskrevne måde, blev herefter oprenset ved standard chromatografiske teknikker. Bioaktivitet indikeredes ved 30 positivt respons på vækst-bioforsøg med rotter. I dette forsøg fastsættes bioaktiviteten af det heterologe somatotropin i forhold til kendt somatotropinmateriale (f.eks. bovint eller porcint hypofysesomatotropin) ved at sammenligne vægtforøgelsen hos hypofysektomerede DK PR 172526 B1 14 rotter med varierende mængder af indgivet materiale. Regressionskurver over kropsvægtforøgelse som funktion af de indgivne doser af det pågældende somatotropinmateriale sammenlignes med den kendte standard (d.v.s.

5 hypofysemateriale), og en relativ bioaktivitet angivet i U(enheder E)/mg væksthormon beregnet for det heterologe somatotropinmateriale.

N-methionyl bovint somatotropin, solubiliseret og natureret ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen og 10 derefter oprenset blev herefter indgivet til malkekøer.

Malkekøer indgivet et sådant præparat producerede 10 vægt% til 40 vægt% mere mælk end kontroldyr, se Eppard et al., "The Effect of Long-term Administration of Growth Hormone on Performance of Lactating Dairy Cows", 15 Proceedings of the 1984 Cornell Nutrition Conference.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Den omhandlede fremgangsmåde demonstreredes ved at 20 solubilisere N-methionyl bovint somatotropin (NBS) udtrykt i E. coli således som generelt beskrevet af Seeburg et al., DNA 2(1):37-45 (1983). Omtale af de enkelte trin kan findes i Goeddel et al., Nature, vol.

281 (oktober 1979); DeBoert et al., Promoters: Structure 25 and Function, p. 462-481, Praeger Scientific Publishing

Co., (1982) og Miozzari et al., J. Bacteriology, vol.

133, p. 1457-1466 (1978). Høstede celler blev itubrudt ved dobbelt passage gennem en Manton—Gaulin homogenisator. De refraktile legemer, indeholdende NBS, 30 blev nedcentrifugeret fra homogenatopløsningen med lav hastighed. Den supernatante del blev bortkastet, de refraktile legemer blev genopslæmmet, vasket og atter nedcentrifugeret som en pille. Den supernatante del blev DK PR 172526 B1 15 atter bortkastet, hvilket efterlod et i det væsentlige rent præparat af refraktile legemer.

De refraktile legemer fremstillet på denne måde blev underkastet forskellige koncentrationer af en vandig 5 urinstofopløsning ved forskellige pH-niveauer ved 25 °C.

Alle pufrede opløsninger indeholdt lOmM Tris-base. pH-Indstilling blev udført ved tilsætning af HC1. Slutkoncentrationen af refraktile legemer var ca. 4 mg/ml opløsning. Opløsningsgraden blev bestemt 10 spektrofotometrisk, idet man antog, at de refraktile legemer udelukkende bestod af protein, og idet man anvendte en extinctionskoefficient (ε) på 0,68 ved 277 nm og 1 cm vandren som indikation for en proteinkoncentration på 1 mg/ml. Udgangskoncentrationen 15 besemtes spektrofotometrisk for en fuldstændigt opløst prøve. Resultaterne af ovennævnte forsøg er angivet i figur 1. Disse resultater understøtter den uventede opdagelse, at indstilling af pH til alkalisk reaktion i det væsentlige forøger solubiliseringsgraden.

20 Eksempel 2

Fremgangsmåden beskrevet i eksempel 1 blev fulgt, bortset fra at temperaturen blev holdt på 4 °C, og pH blev indstillet til både sure og alkaliske værdier. Som i eksempel 1 indeholdt alle pufrede opløsninger lOOmM Tris-25 base. pH-Indstilling til sur reaktion udførtes ved tilsætning af eddikesyre. Resultaterne af dette forsøg er angivet i figur 2. Sammenligning af figur 1 og figur 2 ved konstant urinstofkoncentration og en given pH-værdi, viser solubiliseringsstigning opnået ved reducerede 30 temperaturer (4 °C) i forhold til stuetemperatur (25 eC) .

Sammenlignende Eksempel A

Refraktile legemer MBS blev fremstillet som beskrevet i

eksempel 1. Refraktile legemer blev blandet med en 10M

DK PR 172526 B1 16 urinstofopløsning uden pH-indstilling, således at slutkoncentrationen af refraktile legemer var ca. 5,0 mg/ml. Opløsningen blev blandet og henstod natten over ved 4 °C. Solubiliseringsgraden blev besemt til kun at 5 være ca. 2,9 mg/ml ved hjælp af den oven for beskrevne spektrofotometriske metode. Udgangskoncentrationen af refraktile legemer bestemtes ved at tilsætte nok urinstofopløsning til fuldstændigt at opløse de refraktile legemer, idet man spektrofotometrisk målte den 10 fuldstændigt opløste opløsning og indstillede til fortynding.

Sammenlignende Eksempel 8

Refraktile legemer indeholdende MBS fremstillet som beskrevet i eksempel 1 blev blandet med en vandig 8, OM 15 urinstofopløsning uden pH-indstilling, således at slutkoncentrationen af refraktile legemer var ca. 5,0 mg/ml. Opløsningen blandedes og henstod natten over ved 4 °C. Solubiliseringsgraden bestemtes til ca. 2,4 mg/ml som beskrevet oven for ved den spektrofotometriske metode.

20 Udgangskoncentration af refraktile legemer bestemtes ved at tilsætte nok urinstofopløsning til fuldstændigt at opløse de refraktile legemer, idet man spektrofotometrisk målte den fuldstændigt opløste opløsning og indstillede til fortynding.

25 Eksempel 3

Refraktile legemer indeholdende MBS fremstillet som beskrevet i eksempel 1 blev blandet med en upufret vandig 4,5M urinstofopløsning på en sådan måde, at koncentrationen af refraktile legemer var ca. 66 mg/ml.

30 Opløsningens pH indstilledes fra pH 7 til pH 11 med fortyndet NaOH. Den klarede opløsning angav fuldstændig solubilisering. Koncentrationen af refraktile legemer DK PR 172526 B1 17 blev bestemt til 66 mg/ml spektrofotometrisk som beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 4

Refraktile legemer indeholdende MBS fremstillet som 5 beskrevet i eksempel 1 blev solubiliseret i en vandig 7,5M urinstofopløsning indeholdende lOOnM Tris ved pH

10,5. Urinstofkoncentrationen indstilledes til forskellige niveauer ved at tilsætte lOOmM Tris, og den totale proteinkoncentration blev holdt på ca. 1 mg/ml 10 (bestemt ved spektrofotometrisk analyse af en fuldstændigt opløst prøve) ved tilsætning af et rumfang af den passende urinstofopløsning. Den opløste MBS henstod for at oxidere ved at udsætte opløsningen for luft under omrøring i 24 timer. Resultaterne er grafisk 15 angivet i figur 3. Udbyttet af MBS monomer angives som en vægtprocent af det totale MBS indhold. Som angivet i figur 3 opnås optimal natureringseffektivitet ved en urinstofkoncentration på ca. 4,5M.

Eksempel 5 20 Ved at arbejde som beskrevet i eksempel 4 solubiliseredes" refraktile legemer indeholdende MBS i en vandig 7,5M urinstofopløsning, der indeholdt lOOmM Tris ved pH 10,5.

Efter solubilisering fortyndedes opløsningen til 4,5M urinstof med lOOmM Tris, og pH indstilledes til værdier 25 mellem 10,5 og 8,5. Disse enkeltprøver blev udsat for luft for at oxidere under omrøring i 24 timer. MBS monomer- og oligomerindholdet blev bestemt ved hjælp af HPLC. Medens resultaterne angiver en forholdsvis fladt respons med hensyn til natureringseffektivitet i forhold 30 til opløsningen pH under oxidation, er der en tendens til højere effektivitet ved højere pH. Her ud over katalyserede basen oxidationen således, at den skred hurtigere frem ved mere alkalisk pH.

18 DK PR 172526 Bi

Eksempel 6

Ca. 150 ml af et refraktil legeme præparat fremstillet som beskrevet i eksempel 1 blev sat til ca. 850 ml af en vandig 5,3M urinstofopløsning ved 4 °C. Den fremstillede 5 4,5M urinstofopløsning indstilledes til pH 11 med 50 vægt% natriumhydroxidopløsning. De fuldstændigt opløste refraktile legemer resulterede i en total MBS koncentration på ca. 12,4 mg/ml. Opløsningen omrørtes ved 4 °C natten over for at oxidere MBS. HPLC analyse af den 10 oxiderede opløsning viste et udbytte af MBS monomer på ca. 80 vægt%.

Eksempel 7 N-methionyl porcint somatotropin (MPS) udtryktes i E. coli under anvendelse af almindelige metoder således som 15 angivet i eksempel 1. Efter genudvindelse af refraktile legemer indeholdende MBS, idet man anvendte den tidligere beskrevne måde, solubiliseredes legemerne ved 4 °C i 7,5M urinstof, 90mM Tris, pH 11,0. 113 mg refraktil legeme pellet (våg vægt) opløstes pr. ml af ovennævnte 20 urinstofopløsning. Prøverne fortyndedes med 90mM Tris og/eller urinstof til opnåelse af urinstofkoncentrationer på 4,5M, 3,OM og 2,OM med en MPS koncentration på 4 mg/ml baseret på den våde vægt af pelleten af refraktile legemer. Prøverne henstod for at oxidere ved at udsætte 25 disse for luft natten over under omrøring. HPLC undersøgelse viste et optimalt MPS monomer udbytte ved en urinstofkoncentration på 3M.

Eksempel 8

Ved at arbejde som beskrevet i eksempel 7 solubiliseredes 30 MPS ved 4 eC i vandigt 7,5M urinstof, 90mM Tris ved pH 11 i tre forskellige koncentrationer (20, 40 og 80 mg pellet (våd vægt) pr. ml af ovennævnte urinstofopløsning).

Prøver af opløsningerne fortyndedes med 90mM Tris DK PR 172526 B1 19 og/eller urinstof til opnåelse af en urinstofkoncentration på 3M og MPS koncentrationer på 1 mg/ral. Fortyndede MPS opløsninger anbragtes i luften under omrøring ved 4 °C i 56 timer. Undersøgelser ved 5 hjælp af HPLC angav et gennemsnitligt MPS monomerudbytte på 69 vægt%.

Eksepel 9

Der arbejdedes som beskrevet i eksempel 8 bortset fra, at solubilisering og naturering blev udført i nærværelse af 10 0,lmM 1,4-dithiothreitol. Undersøgelse ved hjælp af HPLC angav et gennemsnitligt MPS monomerudbytte på 66 vægt%.

Eksempel 10

Tre varianter af BGH, nemlig Ala-i, Ala-iVi26 og Met-iVali2«,

blev udtrykt i E. coli således som beskrevet i USA

15 patentansøgning nr. 704 362 indleveret 22. februar 1985.

Der henvises herved til denne patentansgning. BGH

varianterne blev solubiliseret og natureret således som beskrevet i eksempel 1.

Refraktile legemer indeholdende den pågældende BGH 20 variant blev udvundet som beskrevet i eksempel 1. Omtrent 300 g (våd vægt) refraktile legemer blev opslæmmet i vand til opnåelse af en opslæmning på 1 liter. Denne opslæmning blev sat til ca. 5 liter 9M urinstof, 108mM Tris, hvilket gav en solubiliseringsopløsning, der 25 omfattede den pågældende BGH variant i 7,5M og 90mM Tris ved pH 10,5 og 4 eC. Fuldstændig solubilisering skete efter omrøring i nogle få minutter. Fire liter koldt vand blev langsomt tilsat til opnåelse af en natureringsopløsning, der bestod af den pågældende BGH 30 variant i 4,5M urinstof, 54mM Tris ved pH 10,5 og 4 °C. Opløsningen omrørtes, og den pågældende BGH varint henstod for at oxidere i luften i ca. 48 timer. Den oxiderede BGH variantopløsning blev undersøgt ved hjælp DK PR 172526 B1 20 af HPLC, hvilket angav et monomerudbytte på ca. 60-70 vægt% for alle de tre BGH varianter.

Eksempel 11

Den strukturelle homologi af somatotropinprotein 5 fremstillet som beskrevet ovenfor sammenlignet med det naturlige hypofysesomatotropin blev bestemt ved hjælp af cirkulær dichromisme som beskrevet af Bewley, Recent Progress in Hormone Research, ^5' 155-210, Academic

Press. Specielt MBS og Ala-i varianten af BGH blev 10 sammenlignet med bovint hypyfysesomatotropin. Prøverne blev opløst i 50mM natriumbicarbonatopløsning, pH 9,5 og analyseret ved hjælp af ovennævnte metode. Resultaterne af denne analyse bekræfter, at det rekombinante somatotropin fremstillet på ovennævnte måde var i form af 15 den opfindelige form efter naturering.

Eksempel 12

Refraktile legemer indeholdende MBS fremstillet som beskrevet i eksempel 1 blev blandet med en upufret vandig 1,0M urinstofopløsning ved 4 °C. pH blev indstillet og 20 holdt ved 12,1 med natriumhydroxid. Opløsningen blev klar, hvilket tilkendegav fuldstændig solubilisering. Koncentrationen af refraktile legemer blev bestemt til ca. 10 mg/ml ved spektrofotometrisk analyse som beskrevet i eksempel 1.

Claims (14)

1. Fremgangsmåde til indvinding af biologisk aktivt bovint somatotropinprotein fra refraktile legemer i en værtscellekultur indeholdende nævnte protein, hvilken 5 fremgangsmåde omfatter a) at adskille og indvinde de refraktile legemer fra værtscellekulturen, b) at bringe de refraktile legemer i kontakt med en vandig urinstofopløsning således at proteinet 10 solubiliseres, c) at oxidere det solubiliserede protein ved at bringe opløsningen indeholdende proteinet i kontakt med et mildt oxidationsmiddel med henblik på at danne intramolekylære disulfidbindinger mellem cysteingrupperne indeholdt i 15 somatotropinproteinet, og d) at genvinde proteinet, hvorved solubiliseringen udføres ved en urinstofkoncentration mellem ca. 1 og 7,5 M, hvorved oxidationen udføres ved en urinstofkoncentration på 20 mellem ca. 4 og 6 M, og hvorved solubiliseringen og oxidationen hver udføres ved et pH over ca. 9 og ved en temperatur over opløsningens frysepunkt og under ca. 25 °C.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvorved oxidationen 25 udføres mens somatotropinet stadigvæk er opløst i den vandige urinstofopløsning anvendt til at solubilisere somatotropinet. DK PR 172526 B1 22

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvorved urinstofkoncentrationen i den vandige opløsning er ca. 4,5 M.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, hvorved nævnte pH 5 er ca. 11.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2,3 eller 4, hvorved temperaturen er ca. 4 °C.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvorved solubiliseringen og oxidationen 10 udføres under i det væsentlige samme betingelser med hensyn til urinstofkoncentration, pH og temperatur.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvorved solubiliseringen og oxidationen udføres i en vandig urinstofopløsning ved en koncentration på ca. 4,5 M, en temperatur på ca. 4 °C 15 og et pH på ca. 11.

8. Fremgangsmåde til indvinding af biologisk aktivt porcint somatotropinprotein fra refraktile legemer i en værtscellekultur indeholdende nævnte protein, hvilken fremgangsmåde omfatter 20 a) at adskille og indvinde de refraktile legemer fra værtscellekulturen, b) at bringe de refraktile legemer i kontakt med en vandig urinstofopløsning ved en koncentration, temperatur og pH, som bevirker, at proteinet solubiliseres, 25 c) at oxidere det solubiliserede protein ved at bringe opløsningen indeholdende proteinet i kontakt med et mildt oxidationsmiddel i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at danne intramolekylære disulfidbindinger mellem cysteingrupperne indeholdt i somatotropinproteinet, og 30 d) at genvinde proteinet, DK PR 172526 B1 23 hvorved solubiliseringen udføres ved en urinstofkoncentration mellem ca. 1 og 7,5 M, hvorved oxidationen udføres ved en urinstofkoncentration på mellem ca. 2,5 og 3,5 M, og hvorved solubiliseringen og 5 oxidationen hver udføres ved et pH over ca. 9 og ved en temperatur over opløsningens frysepunkt og under ca. 25 °C.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, hvorved oxidationen udføres, mens somatotropinet stadigvæk er opløst i den 10 vandige urinstofopløsning anvendt til at solubilisere somatotropinet.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9. hvorved urinstofkoncentrationen er ca. 3 M.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller 10, hvorved nævnte 15 pH er ca. 11.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller 10, hvorved temperaturen er ca. 4 °C.

13. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvorved solubiliseringen og oxidationen 20 udføres under i det væsentlige samme betingelser med hensyn til urinstofkoncentration, pH og temperatur.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, hvorved solubiliseringen og oxidationen udføres i en vandig urinstofopløsning ved en koncentration på ca. 3 M, en 25 temperatur på ca. 4 °C og et pH på ca. 11.