KR100487299B1 - 소마토트로핀의 가용화 및 천연화 방법 - Google Patents
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Abstract
천연화된 소마토트로핀을 얻기에 효과적인 조건하에서 소마토트로핀을 C10, C12 , C16 또는 C18 아실 글루타메이트와 C10, C14 알킬 설페이트, 알콜 에톡시 설페이트, 라우로일 에틸렌디아민트리아세트산(LEDA), C10~C18 선형 알킬 벤젠 설포네이트, 디페닐 디설포네이트 또는 아실 아미노산을 포함하는 가용화제 조성물과 물에 접촉시키는 것을 포함하는 소마토트로핀의 천연화방법.
Description
본 출원은 1996.12.31일자로 제출된, 미국 임시 출원번호 제 60/034,808호를 우선권으로 주장한다.
발명의 배경
소마토트로핀은 원래 여러 동물들의 뇌하수체 추출물에서 발견되는 성장호르몬이다. 재조합 DNA기술로 인해 여러 숙주세포들로부터 이형의 단백질로서 소마토트로핀을 발현시키는 것이 가능하게 되었다. 재조합 DNA를 사용하여 형질전환된 대장균 박테리아 같은 미생물내에서 생성된 소마토트로핀과 같이, 재조합 소마토트로핀은 일반적으로 생활성이 감소되었거나 또는 실질적으로 생활성이 전혀 없는 침전, 변성된 상태로 숙주세포에 의해 생산된다. 생활성이 없는 것은 일반적으로 디설파이드 결합이 형성되지 않은 재조합 소마토트로핀 분자 구조에 기인한 것이다. 대장균 세포와 같은 숙주세포들의 비교적 높은 산화환원 전위로 인하여, 재조합 소마토트로핀은 실질적으로 (디설파이드 결합이 없는)축소된 형태로서 숙주세포 내에서 생산되는 것으로 생각된다. 소 소마토트로핀(bST) 및 돼지 소마토트로핀(pST)과 같은 대부분의 재조합 소마토트로핀들은 숙주세포내에서 봉입체(inclusion bodies) 또는 굴절체(refractile bodies)로서 언급되는 재조합 소마토트로핀과 이들의 올리고머들을 포함하는 세포질 응집체로서 존재한다.
재조합 소마토트로핀을 생활성이 있는 상태로 회수하기 위해서는, 필수적이지는 않으나 바람직하게는 소마토트로핀 단량체들이 생성될 수 있도록 봉입체 형태와 같은 소마토트로핀을 가용화시켜서 생활성이 있는 구조로 천연화한 후, 숙주세포로부터 분리한다. 천연화된 소마토트로핀은 이량체와 같은 올리고머들 및 숙주세포 단백질과 같이 다른 소마토트로핀 종류들과 같은 불순물들을 이온 교환법(본 명세서에서 참고문헌으로 포함된 미국특허 제5,182,369호에 개시됨)으로 침전시켜 제거하거나, 다른 적합한 기술들을 사용하여 불순물들을 제거하여 더 정제할 수 있다.
예를들면, 본 명세서에서 참고문헌으로 포함된 벤틀 등의 미국특허 제4,652,630호는 재조합 소마토트로핀을 포함하는 봉입체를 가용화하기 위하여 요소(urea) 수용액을 사용하여, 봉입체로부터 소마토트로핀을 가용화하고 천연화시키는 방법을 언급하고 있다. 벤틀 등은 가용화 단계에서 농도 2.5~7.5M, pH 약 9~12 사이의 요소 수용액을 사용하는 것을 보고하고 있다. 일단 가용화된 후에는, 소마토트로핀 단백질은 염기성 pH에서 벤틀 등의 방법에 따라서 천연화될 수 있다.
다른 방법들은 소마토트로핀을 가용화하고 천연화하는데 가용화제(detergent)를 사용하였다. 예를들면, 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 유럽 특허공보 제229,110호와 263,902호(업존사)는 형질전환된 미생물로부터 소마토트로핀의 불용성 형태를 가용화제 존재하에서 가용화하고 산화시킴으로써 천연적인 디설파이드 결합형태로 전환시키는 방법을 개시하고 있다. 이 방법은 소듐 도데실설페이트(SDS) 가용화제 또는 다음 일반식의 가용화제를 사용하며,
CH3-(CH2)n-CO-NR1-CHR2-COOH
여기에서 n은 8~20; R1은 메틸 또는 에틸; R2는 수소, 에틸, 메틸, n-프로필 또는 이소프로필이다.
이들 명세서에는 다음의 일반식으로 표시되는 N-라우로일 메틸 글리신의 수용액을 사용하여 농도 0.1~0.5M, pH 8~10.5의 소듐 보레이트 완충액 중에서 재조합 bST를 가용화시키는 특정 방법을 더 개시하고 있다.
CH3-(CH2)10-CO-NR1-CHR2-COOH
유럽 특허공보 제229,110호와 제263,902호에서는 가용화 및 천연화 후에 음이온 교환수지로 가용화제를 제거하는 것을 언급하고 있다.
SDS(소듐 도데실 설페이트)를 사용한 미국특허 제4,677,196호와 제4,766,224호; 요소 또는 구아니딘 하이드로클로라이드와 같은 카오트로픽(chaotropic)제와 조합된 SDS를 사용한 미국특허 제5,023,323호; 사르코실(N-라우로일 사르코신)을 사용한 미국특허 제5,240,834호; 2-아미노-2-메틸-1-프로판올을 사용한 미국특허 제4,975,529호를 포함하는 다른 공보들에서도 다양한 가용화제 및 비가용화제 화합물을 사용하여 재조합 소마토트로핀을 가용화 및 천연화시키는 방법이 개시되어 있다. 이들 특허들은 본 명세서의 참고문헌에 포함되어 있다. 소마토트로핀의 가용화 및 천연화 방법에 SDS를 사용하는 것은 몇몇 참고문헌을 통해 이미 알려져 있으나, SDS는 천연화된 소마토트로핀과 비교적 단단히 결합되어 소마토트로핀 용액으로부터 완전히 제거되기 어렵다는 것도 잘 알려져 있다.
따라서, 고수율과 고순도의 재조합 소마토트로핀을 얻기위한 보다 경제적이고 효율적인 방법들이 당 기술분야에서 요구된다. 특히, 생활성이 있는 상태의 소마토트로핀 분자를 얻기위한 재조합 소마토트로핀 단백질의 가용화 및 천연화 방법이 요구되며, 생물학적으로 쉽게 분해가능한 소량의 가용화제를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 천연화된 소마토트로핀으로부터 쉽게 제거되는 가용화제를 사용하는 방법도 더욱 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 생물학적으로 활성이 있는 재조합 소마토트로핀을 제조하는 방법에 관한 것이다. 좀더 상세하게는, 본 발명은 소마토트로핀을 효과적으로 천연화시킬 수 있는 조건하에서 소마토트로핀을 C10~C18 아실글루타메이트, C10, C14 또는 C18 알킬 설페이트, 알콜 에톡시 설페이트, 라우로일 에틸렌디아민트리아세트산(LEDA), C10~C18 선형 알킬 벤젠 설포네이트, 디페닐 디설포네이트 또는 다음 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 아실 아미노산을 포함하는 가용화제 조성물과 물에 접촉시키는 것을 포함하는 소마토트로핀의 가용화 및 천연화 방법에 관한 것이다.
(I)
상기 식(I)의 A는 CH2CH2CO2H, CH2CH2SCH3, CH2CO2H, CH2CONH2, CH2CH2CONH
2, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)CH2CH3, CH2C6H5, CH2C6H4OH 또는 CH2OH이며, m은 8~16의 정수이다.
CH3(CH2)mCONH(CH2)nCO2H (Ⅱ)
상기 식(Ⅱ)의 n은 1~5의 정수이고 m은 8~16의 정수이다.
더욱 바람직한 실시예로서, 본 발명은 투석막 여과(diafiltration)에 의해 천연화된 소마토트로핀으로부터 쉽게 제거되는 C10 또는 C12 아실 글루타메이트, N-라우로일 사르코신, N-데실설페이트(NDS) 또는 라우로일 에틸렌 디아민-트리아세트산(LEDA)과 같은 소량의 생분해성이 있는 가용화제를 사용하는 재조합 소마토트로핀의 가용화 및 천연화 방법에 관한 것이다.
예시적인 구체예의 설명
본 발명은 천연화된 소마토트로핀을 얻기에 효과적인 조건하에서 소마토트로핀을 가용화제 조성물과 물에 접촉시키는 단계를 포함하는 소마토트로핀의 천연화방법에 관한 것으로서, 여기서 가용화제 조성물은 C10∼C18 아실 글루타메이트, C10, C14 또는 C18 알킬설페이트, 알콜 에톡시 설페이트, 라우로일 에틸렌디아민트리아세트산(LEDA), C10∼C18 선형 알킬 벤젠 설포네이트, 디페닐 디설포네이트, 또는 다음 일반식(I), (Ⅱ)의 아실 아미노산을 포함한다.
(I)
상기 식(I)의 A는 CH2CH2CO2H, CH2CH2SCH3, CH2CO2H, CH2CONH2, CH2CH2CONH
2, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)CH2CH3, CH2C6H5, CH2C6H4OH 또는 CH2OH이며, m은 8~16의 정수이다.
CH3(CH2)mCONH(CH2)nCO2H (Ⅱ)
상기 식(Ⅱ)의 n은 1~5의 정수이고 m은 8~16의 정수이다. 상기 가용화제 조성물은 상기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 N-알킬화 유도체를 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 소마토트로핀을 가용화하기에 효과적인 조건하에서 소마토트로핀을 가용화제 조성물과 물에 접촉시키는 단계와, 이어서 소마토트로핀을 천연화시키기 위하여 상기에서 얻은 소마토트로핀 용액의 pH를 조절하는 단계를 포함하는 소마토트로핀의 가용화 및 천연화방법에 관한 것으로서, 여기에서 가용화제 조성물은 C10∼C18 아실 글루타메이트, C10, C14 또는 C18 알킬 설페이트, 알콜 에톡시 설페이트, 라우로일 에틸렌디아민트리아세트산(LEDA), C10∼C18 선형 알킬 벤젠 설포네이트, 디페닐 디설포네이트 또는 다음의 일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 아실 아미노산을 포함하며 ;
(I)
상기 식(I)의 A는 CH2CH2CO2H, CH2CH2SCH3, CH2CO2H, CH2CONH2, CH2CH2CONH
2, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)CH2CH3, CH2C6H5, CH2C6H4OH 또는 CH2OH이며, m은 8~16의 정수이다.
CH3(CH2)mCONH(CH2)nCO2H (Ⅱ)
상기 식(Ⅱ)의 n은 1~5의 정수이고 m은 8~16의 정수이다. 또한 상기 가용화제 조성물은 상기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 N-알킬화 유도체를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 다음의 용어들은 아래와 같이 정의된다.
"소마토트로핀"이라는 용어는 소, 돼지, 인간, 양, 말, 개와 고양이 소마토트로핀과 같은 포유동물의 소마토트로핀과, 닭의 소마토트로핀과 같은 다른 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적에 해당하는 소마토트로핀은 천연으로 존재하는 서열, 소마토트로핀과 유사한 생활성을 갖는 즉, 어린 개체의 성장 속도, 젖분비와/또는 사료효율을 증진시키기에 충분한 정도의 높은 친화력으로 그 동물에서의 소마토트로핀 수용체들과 결합하는 천연 단백질의 유사체(analogs) 및 동족체(homologs)들을 포함한다. 또한 변이체들이 본 발명의 과정에 따른 가용화와/또는 천연화 방법으로 처리되어질 수 있다면, 소마토트로핀은 신장되거나 또는 짧게될 수 있으며, 치환 그리고/또는 다른 단백질에 융합되어진 천연으로 존재하는 소마토트로핀의 변이체를 포함한다.
이형의 단백질로도 언급되는 "재조합" 단백질은 정상적으로는 균주세포에 의하여 생산되지 않는 단백질이다. 재조합 DNA 기술로 인하여 형질전환된 숙주세포들로부터 비교적 많은 양의 이형의 단백질을 발현하는 것이 가능해졌다.
예를들면, 형질전환된 미생물에 의한 다양한 동물들의 재조합 소마토트로핀의 발현은 잘 알려져 있다. 예로서, 고에델 등, "인간 성장호르몬을 암호화하는 DNA 서열의 대장균내 직접발현", Nature 281 : 544-48(1979)와 시버그 등, "소 및 돼지의 성장호르몬의 박테리아에서의 효과적인 발현" DNA 2:37-45(1983)이 있다. 형질전환된 미생물들에서의 소마토트로핀의 생성은 다양한 재조합 유전자 플라스미드에 의하여 이룰 수 있다. 이의 예로서, 영국특허출원 GB 20732445A;과 쇼너 등, "대장균에서의 소성장호르몬 발현에서 mRNA 번역 효율의 역할," PNAS USA 81:5403-07(1984)에 개시된 내용들이 있다. bST(소 소마토트로핀)의 유사체들 또한 공지이며, 예로서 유럽 특허출원 제103,395호에 개시된 바가 있다. 대장균 이외의 형질전환된 미생물에서 bST의 생성은 그레이 등, "Streptomyces lividans에 의한 소 성장호르몬의 합성" Gene 32:21-30(1984)와 효모를 이용한 미국특허 제4,443,539호에 보고된 바 있다.
또한 "굴절체"로 불리기도 하는 "봉입체"들은 회수되어질 재조합 소마토트로핀을 포함하는 세포질 응집체들과 중합체들이다.
"숙주세포"는 박테리아, 효모와 같은 미생물 세포 또는 재조합 소마토트로핀을 발현하기 위하여 형질전환된 동물 및 식물 세포들과 같은 다른 적당한 세포들이다. 숙주세포의 예로서, 소의 소마토트로핀 발현이 가능하도록 형질전환된 대장균 K12(균주 W3110/pBGH-1)가 있다.
"천연화(Naturation)"는 소마토트로핀 단백질의 천연화 단계의 완결시 또는 보다 정제된 후에, 생물학적 활성을 가지도록 하는 올바른 디설파이드 결합의 생성을 포함한다. "접힘(Folding)"은 단백질이 적당한 산화가 가능한 정도로 전체적 구조 형태가 전환되는 것을 의미한다. "산화"는 생물학적 활성을 지니는 구조, 바람직하기로는 천연적으로 생물학적 활성이 있는 구조에 요구되는 분자내 디설파이드 결합의 생성을 의미한다.
"생물학적 활성"은 해당 소마토트로핀이 생체내에서 원래의 생리적 반응을 수행할 수 있음을 의미한다. 생물학적 활성은 특정종에서의 생체내 테스트 없이도 적당한 생물학적 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다. 소마토트로핀에 대한 적당한 생물학적 분석법은 "쥐의 체중 증가량 분석법"이다. 이 생물학적 분석법에서, 소마토트로핀 제제의 생물학적 활성은 공지된 제제(예, 추출된 천연 소마토트로핀)에 대하여, 여러 농도로 투여한 제제의 양에 따른 뇌하수체를 제거시킨 쥐의 체중 증가량을 비교하므로써 평가된다.
본 발명에 따른 소마토트로핀의 가용화 및 천연화방법은 어떠한 유형의 재조합 소마토트로핀, 특히 소 소마토트로핀(bST), 돼지 소마토트로핀(pST), 인간 소마토트로핀(hST)에 적용될 수 있다. 재조합 소마토트로핀을 만들기 위하여 숙주세포들의 형질전환, 배양과 발효는 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 일반적으로 봉입체 형태의 재조합 소마토트로핀은 세포를 분해시켜 봉입체를 방출해내는 통상적인 기술에 의하여 숙주세포 배양액으로부터 회수될 수 있으며, 그 결과의 봉입체들은 분별 원심분리법에 의하여 펠렛으로서 모을 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 가용화제 조성물은 일반적으로 숙주세포로부터 얻은 소마토트로핀의 가용화를 증진시키고/또는 소마토트로핀 분자들을 천연화시키는 가용화제 또는 가용화제들의 조합물(combination)을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용된 가용화제는 천연화단계가 완결된 후에 소마토트로핀 용액으로부터 쉽게 제거될 수 있는 것이다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 가용화제 조성물은 C10∼C18 아실 글루타메이트, C10, C14 또는 C18 알킬 설페이트, 알콜 에톡시 설페이트, 라우로일 에틸렌 디아민트리아세트산(LEDA), C10∼C18 선형 알킬 벤젠 설포네이트, 디페닐 디설포네이트 또는 다음의 일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 아실 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물들을 포함할 수 있다:
(Ⅰ)
여기에서 A는 CH2CH2CO2H, CH2CH2SCH3, CH2CO2H, CH2CONH2, CH2CH2CONH2, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)CH2CH3, CH2C6H5, CH2C6H4OH 또는 CH2OH이고 m은 8∼16의 정수이다:
CH3(CH2)mCONH(CH2)nCOOH (Ⅱ)
여기에서 n은 1∼5의 정수이고, m은 8∼16의 정수이다. 가용화제 조성물은 상기 일반식(Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 N-알킬화 유도체를 포함할 수도 있다.
바람직한 실시예에 있어서, 가용화제는 C10∼C18 아실 글루타메이트 또는 이들의 염이며, 더욱 바람직하게는 C10, C12, C16 또는 C18 아실 글루타메이트 또는 이들의 염이다. 예를들면, 아실기는 코코일, 라우로일, 스테아로일 또는 이들의 혼합물이다. 바람직한 실시예에 있어서, 아실 글루타메이트는 트리에탄올아민, 나트륨 또는 칼륨의 아실 글루타메이트 염이다. 더욱 바람직하게는, 아실 글루타메이트는 소듐 라우로일 글루타메이트(아지노모도사의 아미소프트 LS-11 또는 아미소프트 11(F)), 소듐 코코일 글루타메이트(아지노모도사의 아미소프트 CS-11 또는 아미소프트 CS-11(F)), TEA 코코일 글루타메이트(아지노모도사의 아미소프트 CT-12 또는 아미소프트 CT-12S), TEA 라우로일 글루타메이트(아지노모도사의 아미소프트 LT-12), 소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트(아지노모사의 아미소프트 HS-11 또는 아미소프트 HS-11(F)), 소듐 코코일 글루타메이트와 혼합된 소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트(아지노모사의 아미소프트 GS-11 또는 아미소프트 GS-11(F)), 디소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트(아지노모도사의 아미소프트 HS-21), 포타슘 코코일 글루타메이트(아지노모도사의 아미소프트 CK-11 또는 아미소프트 CK-11(F)), 코코일 글루탐산(아지노모도사의 아미소프트 CA) 또는 수소화 탈로윌 글루탐산(스테아로일 글루탐산)(아지노모도사의 아미소프트 HA) 등이다. 보다 더 바람직한 가용화제 조성물은 소듐 라우로일 글루타메이트, 소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트, 소듐 코코일 글루타메이트, 디소듐 코코일 글루타메이트의 아실 글루타메이트 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 가장 바람직한 가용화제 조성물은 C10∼C12 아실 글루타메이트, 특히 소듐 라우로일 글루타메이트를 포함한다.
가용화제는 아실 N-메틸 글루타메이트, 아실 N-메틸 아스파르테이트 또는 사르코실이나 아미라이트의 N-메틸 유도체와 같은 상기 일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 N-알킬화 유도체일 수도 있다.
아실 글루타메이트는 분말 또는 용액 형태로서 해당 소마토트로핀 혼합물에 첨가될 수 있다. 예를들면, 아실 글루타메이트는 H20 0.84ℓ, 10% NaOH 61㎖, 아실글루타메이트 분말 100g을 첨가하므로써 pH 6.9∼7.0의 10% 저장용액으로서 제조할 수 있다. 가용화나 천연화단계 중에 아실 글루타메이트는 총 천연화 혼합물에 대한 중량비로 약 0.2∼약 5% 범위내의 농도로 전체 혼합물내에 존재하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직한 농도는 약 0.3∼약 3%이다.
본 발명의 방법에서 가용화제 조성물에 아실 글루타메이트의 사용은, 아실 글루타메이트가 일반적으로 저비용이며 순도가 높고, 생물학적으로 쉽게 분해되어 경제적으로나 환경적으로 많은 장점을 제공한다. 또한, 어떤 아실 글루타메이트는 천연화된 소마토트로핀의 혼합물로부터 특히 투석막 여과에 의해, 쉽게 분리될 수 있어 설비와 가동비용을 절감할 수 있으므로, 본 발명의 방법에 전체적으로 경제적인 이점을 부가한다.
또 이와는 달리, 본 발명의 방법에 사용된 가용화제 조성물은 NDS와 같은, C10, C14 또는 C18 알킬 설페이트; C12H25O(CH2CH2O)SO3Na 또는 C12H25O(CH2CH2O)
3SO3Na와 같은 알콜 에톡시 설페이트(스테판사의 스테올TM CS-130, CS-330 또는 CS-430), 또는 C14M29O(CH2CH2O)3SO3Na(헨켈사의 스탠다폴TM ES-40)같은 알콜 에톡시 설페이트; LEDA(헴프셔사의 헴프셔 LEDA); 선형의 도데실벤젠 설포네이트와 같은 C10∼C18 선형 알킬 벤젠 설포네이트 또는 아래 일반식 (Ⅰ) 또는 (Ⅱ)의 아실 아미노산을 포함하고;
(Ⅰ)
여기에서 A는 CH2CH2CO2H, CH2CH2SCH3, CH2CO2H, CH2CONH2, CH2CH2CONH2, CH(CH3)2, CH2CH(CH3)2, CH(CH3)CH2CH3, CH2C6H5, CH2C6H4OH 또는 CH2OH이고 m은 8∼16의 정수이다:
CH3(CH2)mCONH(CH2)nCOOH (Ⅱ)
여기서 n은 1∼5의 정수이고, m은 8∼16의 정수이다.
가용화 및 천연화단계는 동일한 부피와 가용화제 농도에서 실행될 수 있다. 또한 해당 단백질의 가용화는 보다 높은 가용화제 농도에서 용이하게 일어날 수 있으므로, 가용화 단계는 최종 천연화 부피보다 더 적은 부피로 진행될 수도 있다. 그 후에 소마토트로핀 용액을 희석하여 최종의 천연화부피를 얻을 수 있다. 예를들면, 소마토트로핀은 최종의 천연화 부피의 반만큼의 가용화제 용액내에서 가용화될 수 있으며, 그 후 일정량의 물 또는 완충액을 첨가하여 완전한 천연화 부피를 얻을 수 있다.
가용화 단계의 pH는 약 9∼약 13이 바람직하며, 보다 바람직한 것은 pH 약 10∼약 12이다. 천연화 용액의 pH는 약 8∼약 12가 바람직하며, 보다 바람직한 것은 pH 약 9∼약 11이고, 가장 바람직한 것은 pH 약 9.5∼약 10.5이다.
본 발명의 방법에 의해 얻어지는 천연화 소마토트로핀은 적어도 약 80% 수율이며, 예를들면 약 85∼95% 수율로 얻어지고, 여기서 수율이란 [천연화 소마토트로핀 단량체]/[생활성이 감소된 상태의 총 소마토트로핀 단량체]로서 정의된다.
디설파이드 결합의 생성율을 증가시키기 위하여 시스틴 또는 시스테인과 같은 촉매를 천연화단계의 소마토트로핀 조성물에 임의로 첨가할 수 있다.
소마토트로핀의 가용화와/또는 천연화을 위해 사용되는 가용화제 조성물은 하류(downstream) 정제단계에서 방해되지 않도록, 천연화후에 소마토트로핀 용액으로부터 바람직하게 제거된다. 가용화제 조성물은 이온교환, 투석 또는 이들 기술의 조합을 포함하는 다양한 방법들에 의하여 제거될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 가용화제는 투석막 여과(diafiltration)에 의해 천연화 소마토트로핀 조성물로부터 제거된다. 보다 바람직한 실시예에서, 투석막 여과는 셀룰로오즈 막으로 실시된다. 투석막 여과에 의한 C10과 C12 아실 글루타메이트, N-라우로일 사르코신, NDS 또는 LEDA와 같은 가용화제의 제거는, 공지된 방법들보다 현저히 더 적은 턴오버 부피(turn-over volume)로서 가용화제들이 소마토트로핀 혼합물로부터 제거되기 때문에 공정상으로 상당히 이롭다. 몇몇 가용화제들은 투석막 여과로만 제거될 경우, 투석막 여과 완충액의 80부피 이상의 여분액이 요구될 수도 있다. 이같이 큰 부피는 요구되는 투석막 여과 장비의 크기 문제로 인하여 공정처리상 불리하다. 반면, C10과 C12 아실 글루타메이트, N-라우로일 사르코신, NDS와 LEDA는 바람직하게, 턴오버 부피가 30보다 더 적으며 쉽게 제거될 수 있다는 것이 밝혀졌다. C10과 C12 아실 글루타메이트는 특히 투석막여과에 의해 제거될 수 있으며, 보다 바람직하게는 약 10∼20 턴오버 부피로 제거된다.
불순물들의 침전과 실질적으로 가용화제 조성물이 제거된 천연화 소마토트로핀의 정제는 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를들면, 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있는 스토르 등, 미국특허 제 5,182,369호와 벤틀 등의 미국특허 제 4,652,630호는 용액으로부터 생물학적으로 활성이 있는 소마토트로핀 단량체들을 회수 및 정제한 후, 재조합 DNA 방법에 의해 생성된 숙주세포들의 봉입체를 가용화 및 천연화시키는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 본 발명의 방법은 목적되는 동물에 비경구 투여하기에 적당한 소마토트로핀 생성물 제조를 위한 전체 기술의 일부분이다.
다음의 실시예들은 본 발명의 바람직한 구체예의 설명을 포함한다. 본 발명자들에 의해 발견된 기술들을 나타내는 실시예에 개시된 기술들은 본 발명의 실시가 잘 수행될 수 있도록 하는 것임을 당업자들은 이해해야 할 것이며, 따라서 이의 실시를 위한 바람직한 방법들이 구성될 수 있다. 그러나, 본 발명의 개시에 비추어 당업자들은 개시된 특별한 구체예들에서 많은 변화들이 이루어질 수 있으며, 본 발명의 기술사상과 범위를 벗어나지 않고도 동일하거나 또는 유사한 결과를 얻을 수 있음을 이해해야 한다.
실시예
4가지 종류의 아실 글루타메이트와 라우로일 에틸렌 디아민 트리아세트산(LEDA)을 테스트하였으며, 이는 소 소마토트로핀(bST) 봉입체의 가용화와, bST 분자들의 정확한 천연화에 있어 효율이 높음을 보여주었다(실시예 1~3). 돼지 소마토트로핀(pST)의 가용화 및 천연화방법도 실시예들에서 제공된다(실시예 3~4).
실시예 1. bST 봉입체의 가용화
bST 봉입체의 수용성 슬러리를 분석한 결과 45g bST/ℓ가 포함되어 있었다. 사용된 bST는 bST의 N-메티오닐 유도체이며, 그렇지 않으면 페닐알라닌으로 시작되는 천연의 아미노산 서열을 갖는 것이었다. 이 가용화 실험은 실온에서, pH 11.5, bST 20g/ℓ농도의 용액에서 수행되었다. 가용화는 천연화부피의 절반 부피 즉, 천연화가 1% 가용화제와 10g의 bST/ℓ에서 수행된다면, 가용화는 2% 가용화제와 20g의 bST/ℓ를 이용하여 수행되었다. 가용화 후에 부피를 2배로 하여 천연화를 시작하였다.
물, 가용화제와 NaOH를 조합하였다. 충분한 양의 염기를 첨가하고 봉입체를 가하여 용해시켰으며, pH는 예비실험과 같이 11.5였다. 봉입체를 첨가하며 물, 가용화제와 염기의 혼합물을 교반하고, 그 후 교반을 30분간 계속하였다.
실시예 2. bST의 천연화
천연화단계 또한 실온에서 수행하였다. 가용화 단계 후에, HCl을 첨가하고, 부피를 거의 2배로 하여 pH를 9.5로 조절하였다. 그 후 물을 첨가하여 용액의 최종부피를 만들었다. 그리고 시스틴을 첨가하여 최종농도를 1mM 시스틴으로 만들었다. 천연화 공정이 완전히 수행되도록 혼합물을 밤새 교반하였다.
실시예 1과 실시예 2에서는 비교예인 소듐 라우로일 사르코시네이트 가용화제 및 4가지 다른 아실 글루타메이트 가용화제 조성물 즉, 소듐 라우로일 글루타메이트, 소듐 코코일 글루타메이트와 소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트의 혼합물, 소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트와 디소듐 코코일 글루타메이트, 그리고 LEDA를 사용하였다.
아래의 표 1과 표 2는 여러 조건의 pH와 가용화제 농도에서의 천연화 효율을 요약한 것이다.
* 비교예
* 비교예
실시예 3. 돼지 소마토트로핀의 가용화 및 천연화
pST를 3% 라우로일 아실글루타메이트, 20g/L pST, pH 11∼11.5, 실온에서 최종의 천연화부피의 1/2 부피에서 가용화했다. 사용된 pST는 페닐알라닌으로 시작되는 천연 아미노산 서열을 가지며, 아미노 말단에 부가적으로 알라닌을 갖는 것이었다.
가용화를 한 다음 15∼30분 후에 HCl로 pH를 조절하고 탈이온수로 희석시켜서 최종 천연화부피를 만든 후, 시스틴 촉매를 첨가하였다. 최종 천연화 조건은 10g/ℓpST, 1.5% 아실글루타메이트, 1mM 시스틴, pH 9.5, 실온이었다. 천연화는 몇시간후에 완결되었다.
실시예 4. 천연화된 돼지 소마토트로핀으로부터의 아실글루타메이트 제거
불순물들을 제거하기 위한 pH 침전화를 실시하기 전에, 천연화 단계에서 사용된 라우로일 아실 글루타메이트 가용화제는 투석막 여과방법으로 제거하였다. 아실글루타메이트는 탈이온수중에 1mM NaOH를 포함하는 차가운 투석막 여과 완충액의 15∼20 턴오버 부피로 적절히 제거되었다.
본 발명의 방법들은 상기와 같이 바람직한 구체예로서 설명되었으나, 본 발명의 개념과 기술사상 및 범위내에서 본 방법에 변화들이 적용될 수 있다는 것은 당업자들에게 명백할 것이다. 이러한, 당업자들에게 명백한 모든 유사한 치환 및 변형들은 본 발명의 기술사상과 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주한다.
Claims (63)
- 천연화된 소마토트로핀을 얻기에 효과적인 조건하에서 소마토트로핀을 C10, C12, C16 또는 C18 아실 글루타메이트; C10 알킬 설페이트; 또는 라우로일 에틸렌디아민트리아세트산(LEDA)을 포함하는 수성 가용화제(detergent) 조성물에 접촉시키는 것을 포함하는 소마토트로핀의 천연화방법.
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- 제 1항에 있어서, 상기 소마토트로핀은 소의 소마토트로핀이고, 상기 가용화제는 라우로일 글루타메이트, 코코일 글루타메이트, 탈로윌 글루타메이트 또는 이들의 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 아실 글루타메이트인 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 5항에 있어서, 아실 글루타메이트는 소듐 라우로일 글루타메이트, 소듐 코코일 글루타메이트, TEA 코코일 글루타메이트, TEA 라우로일 글루타메이트, 소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트, 소듐 코코일 글루타메이트와 소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트의 혼합물, 디소듐 수소화 탈로윌 글루타메이트, 포타슘 코코일 글루타메이트, 코코일 글루탐산 또는 수소화 탈로윌 글루탐산인 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
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- 제 5항에 있어서, 상기 가용화제 농도는 조성물의 0.2∼5중량%의 범위이고, 소마토트로핀과 가용화제 조성물의 pH는 8∼13이며, 투석막 여과하여 천연화된 소마토트로핀으로부터 가용화제를 제거하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
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- 제 1항에 있어서, 상기 소마토트로핀은 소의 소마토트로핀이고, 가용화제는 아실 글루타메이트인 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 소마토트로핀은 소의 소마토트로핀이고, 가용화제는 C10 알킬 설페이트인 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 56항에 있어서, 상기 가용화제는 전체 용액의 0.2∼5중량%의 범위에서 존재하는 N-데실설페이트인 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 57항에 있어서, 상기 가용화제 조성물과 소마토트로핀은 pH8∼13의 소마토트로핀 용액을 제공하고, 투석막 여과하여 천연화된 소마토트로핀으로부터 가용화제를 제거하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 58항에 있어서, 상기 투석막 여과는 30 미만의 턴오버 부피를 필요로 하는 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 소마토트로핀은 소의 소마토트로핀이고, 가용화제 조성물은 라우로일 에틸렌디아민트리아세트산(LEDA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 60항에 있어서, 상기 LEDA는 전체 용액의 0.2∼5중량%의 범위에서 존재하는 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 61항에 있어서, 상기 가용화제 조성물과 소마토트로핀은 pH8∼13의 소마토트로핀 용액을 제공하고, 투석막 여과하여 천연화된 소마토트로핀으로부터 가용화제를 제거하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
- 제 62항에 있어서, 상기 투석막 여과는 30 미만의 턴오버 부피를 필요로 하는 것을 특징으로 하는 소마토트로핀의 천연화방법.
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| BR102013026129A2 (pt) * | 2013-10-10 | 2016-05-24 | Ouro Fino Participações E Empreendimentos S A | processo para a produção de somatotropina bovina recombinate ativa e produto obtido |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0295859A2 (en) * | 1987-06-15 | 1988-12-21 | Southern Cross Biotech Pty.Ltd. | Production of proteins in active forms |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3985722A (en) * | 1973-12-12 | 1976-10-12 | Ajinomoto Co., Inc. | Process for preparing N-higher aliphatic acyl derivatives of amino acids, peptides or proteins |
| US4443539A (en) * | 1980-02-05 | 1984-04-17 | The Upjohn Company | Process for preparing bovine growth hormone |
| EP0103395A3 (en) * | 1982-08-17 | 1985-05-22 | Biogen N.V. | Dna sequences, recombinant dna molecules and processes for producing bovine growth hormone-like polypeptides in high yield |
| US4511503A (en) * | 1982-12-22 | 1985-04-16 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| US4518526A (en) * | 1982-12-22 | 1985-05-21 | Genentech, Inc. | Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins |
| ES8800957A1 (es) * | 1985-02-22 | 1987-12-01 | Monsanto Co | Un metodo para la solubilizacion y renaturalizacion de proteina somatotropina |
| US4652630A (en) * | 1985-02-22 | 1987-03-24 | Monsanto Company | Method of somatotropin naturation |
| GB8508340D0 (en) * | 1985-03-29 | 1985-05-09 | Creighton T E | Production of protein |
| WO1987000204A2 (en) * | 1985-06-26 | 1987-01-15 | The Upjohn Company | Purification of somatotropin from transformed microorganisms |
| US4766224A (en) * | 1985-08-19 | 1988-08-23 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
| US4677196A (en) * | 1985-09-06 | 1987-06-30 | International Minerals & Chemical Corp. | Purification and activation of proteins from insoluble inclusion bodies |
| US4766205A (en) * | 1985-11-13 | 1988-08-23 | Beatrice Companies, Inc. | Method for isolation of recombinant polypeptides in biologically active forms |
| AU597924B2 (en) * | 1985-12-11 | 1990-06-14 | Natinco Nv | Solubilization of protein aggregates |
| US4888416A (en) * | 1987-03-30 | 1989-12-19 | International Minerals & Chemical Corp. | Method for stabilizing somatotropins |
| US4985544A (en) * | 1987-08-04 | 1991-01-15 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Process for renaturing fish growth hormone |
| JPH01132598A (ja) * | 1987-10-14 | 1989-05-25 | Pitman Moore Inc | 変性剤溶液中に含まれる組換え蛋白質における分子内ジスルフィド結合の生成を促進する方法 |
| US4975529A (en) * | 1989-08-18 | 1990-12-04 | Monsanto Company | Method of folding somatotropins |
| US5182369A (en) * | 1990-02-28 | 1993-01-26 | Monsanto Company | Method for purifying somatotropin monomers |
| US5109117A (en) * | 1990-06-26 | 1992-04-28 | Monsanto Company | Method of somatotropin naturation using urea and a soluble organic alcohol |
| US5023323A (en) * | 1990-09-12 | 1991-06-11 | Monsanto Company | Method of somatotropin naturation |
| US5240834A (en) * | 1991-01-22 | 1993-08-31 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Solubilization of protein after bacterial expression using sarkosyl |
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-
2001
- 2001-11-02 US US10/002,084 patent/US6562951B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0295859A2 (en) * | 1987-06-15 | 1988-12-21 | Southern Cross Biotech Pty.Ltd. | Production of proteins in active forms |
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