CN100379851C - 生成l-苏氨酸的微生物、生产其的方法、及使用其生产l-苏氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了能够生成L-苏氨酸且具有灭活galR基因的微生物、生成该微生物的方法、以及使用该微生物来生产L-苏氨酸的方法。该微生物可用于高产率生产L-苏氨酸。

Description

生成L-苏氨酸的微生物、生产其的方法、及使用其生产L-苏氨酸的方法

本申请要求2004年2月5日提交给韩国知识产权局(KoreanIntellectual Property Office)的韩国专利申请号10-2004-0007529的优先权，其全文结合于此作为参考。

技术领域

本发明涉及具有灭活galR基因的微生物、生成该微生物的方法、以及使用该微生物来生产L-苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸是必需氨基酸，而且广泛用作饲料和食品添加剂，还作为制药原材料用于合成某些药物。它已通过埃希氏菌(Escherichia)属、棒杆菌属(Coryneform bacteria)、沙雷氏菌属(Seratia)、和Providencia属的人工突变体发酵生产。例如，日本专利公开号10037/81公开了一种使用属于埃希氏菌属的菌株来生产L-苏氨酸的方法，所述菌株需要二氨基庚二酸和甲硫氨酸且耐受苏氨酸生物合成系统的苏氨酸反馈抑制。日本专利申请公开号224684/83公开了一种使用属于短杆菌属(Brevibacterium)的菌株来生产L-苏氨酸的方法，所述菌株耐受S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和α-氨基-β-羟基戊酸且对L-异亮氨酸和L-赖氨酸具有营养需要。韩国专利申请公开号8022/87公开了一种使用属于埃希氏菌属的菌株来生产L-苏氨酸的方法，所述菌株需要二氨基庚二酸和甲硫氨酸且耐受α-氨基-β-羟基戊酸，并额外耐受至少一种选自由利福平、赖氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、和高丝氨酸组成的组的物质，或者具有降低的分解L-苏氨酸的能力。日本专利申请公开号219582/90公开了一种使用属于Providencia属的菌株来生产L-苏氨酸的方法，所述菌株耐受α-氨基-β-羟基戊酸、L-乙硫氨酸、硫代异亮氨酸、羟基硫胺素、和磺胺胍且需要L-亮氨酸还对L-异亮氨酸具有渗漏需要。

然而，上述已知方法的缺点在于它们不能提供较高的L-苏氨酸产量或者具有昂贵的需要诸如二氨基庚二酸和异亮氨酸。换言之，需要二氨基庚二酸的菌株在生产L-苏氨酸中的用途包括二氨基庚二酸的额外发酵，因而可能增加成本。在使用需要异亮氨酸的菌株来生产L-苏氨酸时，必需向发酵培养基中添加昂贵的异亮氨酸，从而增加了成本。

在试图克服这些缺点的尝试中，本发明人开发了耐受L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸且对甲硫氨酸具有营养需要、对异亮氨酸具有渗漏需要的大肠杆菌L-苏氨酸生产菌株。他们通过菌株的发酵成功生产了L-苏氨酸，产量高于先前的菌株。菌株和使用所述菌株来生产L-苏氨酸的方法公开于韩国专利公开号92-8365。

已知GalP蛋白质是将多种糖类诸如半乳糖和葡萄糖运输到细胞内的通透酶(参阅如V.Hernandez-Montalvo F.Valle F.Bolivar G.Gosset，Appl Microbiol Biotechnol，57：186-191，2001)。GalR蛋白质在细胞中抑制galP的表达(参阅如Mark Geanacopoulos和Sankar Adhya，Journal of Bacteriology，179(1)，228-234，1997年1月)。

发明内容

本发明人在常规技术的基础上深入研究而选择了L-苏氨酸生产能力得到改进的菌株，现在发现了通过灭活galR基因促进L-苏氨酸生物合成。

发明概述

本发明提供了生成L-苏氨酸的能力得到改进的微生物。

本发明还提供了生成该微生物的方法。

本发明还提供了使用该微生物来高效生产L-苏氨酸的方法。

依照本发明的一个方面，提供了能够生成L-苏氨酸且具有灭活galR基因的微生物。

依照本发明的另一个方面，提供了生成L-苏氨酸生产微生物的方法，该方法包括：制备灭活galR基因或其DNA片段；将灭活galR基因或其DNA片段导入能够生成L-苏氨酸的微生物以引起与微生物染色体上存在的galR基因的重组；并选择具有灭活galR基因的微生物。

依照本发明的另一个方面，提供了生产L-苏氨酸的方法，该方法包括：培养上文所述微生物；并由培养物分离L-苏氨酸。

附图说明

通过参照附图而详细描述本发明的例示性实施方案，本发明的上述和其它特色和优势将变得更明显：

图1描绘了包含galR基因的重组质粒pTblue/galR的构建；和

图2描绘了由重组质粒pT7bluegalR::loxpKAN构建DNA片段ΔgalR::loxpKAN。

发明详述

本发明提供了能够生成L-苏氨酸且具有灭活galR基因的微生物。

在本发明中，微生物能够生成L-苏氨酸，而且包括具有灭活galR基因的原核和真核微生物。例如，可以包括属于埃希氏菌属(Escherichia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、Providencia属、棒状杆菌属(Corynebacterium)、和短杆菌属(Brevibacterium)的菌株。优选的是，微生物属于肠杆菌科，更优选的是，微生物属于埃希氏菌属。最优选的是，微生物选自由大肠杆菌FTR2541(KCCM-10539)、大肠杆菌FTR2537(KCCM-10540)、和大肠杆菌FTR2533(KCCM-10541)组成的组。

同样，微生物可以包括生产L-苏氨酸的突变体和天然微生物。突变体的实例包括属于耐受L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸且对甲硫氨酸具有营养需要、对异亮氨酸具有渗漏需要的L-苏氨酸生产大肠杆菌的微生物；除了内在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因以及苏氨酸操纵子中所含thrA、thrB、和thrC基因以外，染色体DNA中还插入了至少一个拷贝的ppc基因以及苏氨酸操纵子所含基因的突变微生物；具有灭活pckA基因的微生物，pckA基因参与草酰乙酸(OAA)转变成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，而OAA是L-苏氨酸生物合成的中间体；具有灭活pckA基因和aspA基因的突变微生物，aspA基因将天冬氨酸(Asp)转变成延胡索酸，而Asp是L-苏氨酸生物合成的另一种中间体；和具有灭活tyrR基因的微生物，tyrR基因抑制tyrB基因的表达，而tyrB基因是L-苏氨酸生物合成所必需的。L-甲硫氨酸类似物可以是至少一种选自由D，L-乙硫氨酸、正亮氨酸、α-甲基甲硫氨酸、和L-甲硫氨酸-D，L-sulfoxymine组成的组的化合物。L-苏氨酸类似物可以是至少一种选自由α-氨基-β-羟基戊酸和D，L-苏氨酸氧肟酸(D，L-Threoninehydroxamate)组成的组的化合物。L-赖氨酸类似物可以是至少一种选自由S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-赖氨酸组成的组的化合物。

在本发明中，galR蛋白质抑制编码半乳糖通透酶的galP基因的表达，而后者将半乳糖运输到细胞内。对于大肠杆菌而言，galR基因是已知的，而且可以由Blattner等人(Science，277，1453-1462，1997)发表的基因组序列获得(编号：AAC75876)。基因组序列还可以由美国国家生物技术信息中心(Nat ional Center for Biotechnology Informat ion，NCBI)和日本DNA数据库(DNA Data Bank of Japan，DDBJ)获得。galR基因还包括通过遗传密码衰减或突变而生成的等位基因。“灭活”在用于本文时指不表达有活性的galR蛋白质。由此，galR基因的灭活导致galB基因的表达提高。

可以通过灭活能够生成L-苏氨酸的微生物染色体上存在的galR基因来生成本发明的微生物。灭活方法可以包括通过光照诸如紫外线或化学品引起突变，并由突变体分离具有灭活galR基因的菌株。灭活方法还包括DNA重组技术。可以通过例如将与galR基因同源的核苷酸序列或包含该核苷酸序列的载体注入微生物以引起同源重组来实现DNA重组。注入的核苷酸序列和载体可以包含显性选择标记。

本发明还提供了生成L-苏氨酸生产微生物的方法，包括：制备灭活galR基因或其DNA片段；将灭活galR基因或其DNA片段导入能够生成L-苏氨酸的微生物以引起与微生物染色体上存在的galR基因的重组；并选择具有灭活galR基因的微生物。

“灭活galR基因或其DNA片段”在用于本文时指与宿主中的galR基因具有序列同源性但由于丢失、置换、和倒位而不能表达活性galR蛋白质的多核苷酸序列。将灭活galR基因或其DNA片段导入宿主细胞可以通过但不限于例如转化、缀合、转导、或电穿孔来实现。

在通过转化将灭活galR基因或其DNA片段导入宿主细胞时，灭活流程可以通过混合多核苷酸序列与菌株的培养物来进行。虽然菌株天然胜任待转化DNA的摄取，但是优选预先通过任何合适方法使得菌株胜任DNA摄取(参阅如LeBlanc等人，Plasmid，28，130-145，1992；Pozzi等人，J.Bacteriol.，178，6087-6090，1996)。灭活galR基因或其DNA片段具有导入基因组DNA片段的外源DNA片段，并且用灭活状态的拷贝替换序列的野生型染色体拷贝。在本发明的一个实施方案中，灭活多核苷酸序列所包含的“尾部”包含在其5’和3’端的部分靶位点DNA。尾部应当是至少50个碱基对，而且为了有效重组和/或基因转换优选超过200-500个碱基对。为了方便，灭活多核苷酸序列可以包含选择标记，例如抗生素抗性基因。在用抗生素抗性基因切断靶DNA后，在含适当水平的合适抗生素的琼脂板上进行对转化子的选择。转化后，导入宿主细胞的灭活多核苷酸序列与基因组DNA尾部发生同源重组，导致野生型基因组序列的灭活。灭活重组事件易于通过例如Southern印迹来确认，或者通过更加方便的聚合酶链式反应(PCR)确认。

在本发明的一个实施方案中，生成本发明的L-苏氨酸生产微生物的方法包括下列流程。

首先，由能够生成L-苏氨酸的菌株分离基因组DNA，并使用它作为模板通过常规技术进行PCR以扩增galR基因。

接着，将得到的galR基因克隆到合适的质粒或其它载体中。通过转导将重组载体导入宿主细胞，诸如大肠杆菌。在培养转化子并分离细胞后，提取具有galR基因的重组载体。然后将抗生素抗性基因片段插入提取的重组载体的galR基因以形成包含灭活galR基因的重组载体。通过转化将该重组载体导入宿主细胞，并培养宿主细胞。然后，由产生的转化子分离繁殖的重组载体，并通过合适的限制酶消化获得具有灭活galR基因的多核苷酸序列。此后，通过常规技术诸如电穿孔将该多核苷酸序列导入能够生成L-苏氨酸的宿主。选择具有抗生素抗性的微生物以分离具有灭活galR基因的微生物。

熟练技术人员将认识到，本发明的灭活多核苷酸序列可以通过常规克隆方法来生成。例如，可以使用靶向galR基因的寡核苷酸引物的PCR扩增方法。PCR扩增方法在本领域是众所周知的(参阅如PCR Protocols：AGuide to Method and Application，M.Innis等人编，Academic出版社，1990)。PCR包括基因组DNA、合适的酶、引物、和缓冲液，而且可以在DNA热循环仪(Perkin Elmer Cetus，诺沃克，康涅狄格州，美国)中方便的进行。通过例如在琼脂糖凝胶电泳后检测合适大小的DNA片段来确定阳性PCR结果。

在本发明的一个实施方案中，制备了重组质粒pT7blue/galR和pT7bluegalR::loxpKAN，并由它们获得了灭活多核苷酸序列ΔgalR::loxpKAN。然后，通过电穿孔用灭活多核苷酸序列ΔgalR::loxpKAN转化耐受L-甲硫氨酸、L-苏氨酸、和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸且对甲硫氨酸具有营养需要、对异亮氨酸具有渗漏需要的大肠杆菌菌株即大肠杆菌编号KCCM 10236；具有灭活pckA基因的大肠杆菌FTR2717；具有灭活pckA基因和aspA基因的大肠杆菌FTR8625(编号KCCM 10544)；和具有灭活tyrR基因的大肠杆菌FTR7624(编号KCCM 10538)，tyrR基因抑制L-苏氨酸生物合成所必需的tyrB基因的表达。结果是，野生型galR基因得到灭活而生成能够比原型菌株生成更高浓度L-苏氨酸的三类新菌株。将新菌株命名为大肠杆菌FTR2541、大肠杆菌FTR2537、和大肠杆菌FTR2533，而且根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)于2003年12月4日保藏于韩国微生物培养物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)，编号KCCM-10539、KCCM-10540、和、KCCM-10541。

大肠杆菌FTR2541衍生自大肠杆菌编号KCCM 10236，后者又衍生自大肠杆菌TF4076。大肠杆菌TF4076(KFCC10718)需要甲硫氨酸且耐受苏氨酸类似物(例如α-氨基-β-羟基戊酸，AHV)、赖氨酸类似物(例如S-(2-氨基乙基-L-半胱氨酸，AEC)、异亮氨酸类似物(例如α-氨基丁酸)、甲硫氨酸类似物(例如乙硫氨酸)、诸如此类。大肠杆菌编号KCCM TF4076描述于韩国专利公开号92-8365其全文结合于此作为参考。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是草酰乙酸的前体，它是L-苏氨酸生物合成途径的中间体。通过PCR扩增源自大肠杆菌编号KCCM TF4076染色体的ppc基因和苏氨酸操纵子，并额外整合到大肠杆菌编号KCCM TF4076的染色体中以生成大肠杆菌编号KCCM 10236。由此，大肠杆菌编号KCCM 10236具有两个ppc基因和两个苏氨酸操纵子。因此，大肠杆菌编号KCCM 10236能够以更高水平表达催化PEP形成草酰乙酸的ppc基因和由天冬氨酸生物合成苏氨酸所必需的酶(thrA：天冬氨酸激酶I-高丝氨酸脱氢酶，thrB：高丝氨酸激酶，thrC：苏氨酸合酶)，从而能够提高L-苏氨酸产量。大肠杆菌FTR2537衍生自大肠杆菌TFR8625，后者又衍生自大肠杆菌KCCM 10236。大肠杆菌编号KCCM 10236染色体中的pckA基因和aspA基因得到灭活以提高L-苏氨酸产量。大肠杆菌FTR2533衍生自大肠杆菌TFR7624，后者又衍生自大肠杆菌编号KCCM 10236。大肠杆菌编号KCCM 10236染色体中的tyrR基因得到灭活以提高L-苏氨酸产量。

本发明还提供了生产L-苏氨酸的方法，包括：培养能够生成L-苏氨酸且具有灭活galR基因的微生物；并由培养物分离L-苏氨酸。

在L-苏氨酸的生产方法中，可以在本领域知道的合适培养基中在合适培养条件下进行培养，而且本领域熟练技术人员可以根据选择的菌株类型容易的进行调整。可以通过分批操作、连续操作、或补料-分批操作进行培养(参阅如“Biochemical Engineering”，James M.Lee著，Prentice-Hall International Editions，第138-176页)。

根据选择的菌株，培养基应当完全达到要求。文献中公开了多种培养基(参阅如“Manual of Methods for General Bacteriology”，美国细菌学学会，华盛顿特区，美国，1981)。培养基包括碳源、氮源、和痕量成分。碳源的实例包括碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖(moltose)、淀粉、纤维素；脂肪，诸如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油；脂肪酸，诸如棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；醇类，诸如甘油和乙醇；以及有机酸，诸如醋酸。这些碳源可以单独或联合使用。氮源的实例包括有机物，诸如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆(CSL)、和大豆粉(soybean meal)；以及无机物，诸如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵、和硝酸铵。这些氮源可以单独或联合使用。在培养基中可以包括磷酸来源，诸如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、和相应的钠盐。同样，培养基可以包括金属盐类，诸如硫酸镁或硫酸亚铁。另外，可以包括氨基酸、维生素、和合适前体。培养基或前体可以以分批或连续方式添加到培养物中。

在培养过程中向培养物中适当添加氢氧化铵、氢氧化钾、氨水、磷酸或硫酸、等以调节培养物的pH。同样，向培养物中添加消泡剂诸如脂肪酸聚乙二醇酯以预防泡沫形成。通过向培养物中注入氧气或含氧气体(如空气)而在有氧条件下进行培养。培养温度处于20-45℃范围内，优选25-40℃。可以继续培养直至获得期望数量的L-苏氨酸，优选10-160小时。

可以通过本领域知道的常规方法由培养物分离L-苏氨酸。分离方法包括离心、过滤、离子交换层析、和结晶等。例如，可以将培养物低速离心以除去生物量而得到上清液，并通过离子交换层析进一步分离。

下面将通过实施例更加具体的描述本发明。但是，提供下列实施例只是为了举例说明，因此本发明并不限于此或由此而受到限制。

具体实施方式

实施例

实施例1：重组质粒的构建和galR基因的敲除

在此实施例中，通过同源重组敲除了大肠杆菌染色体中的galR基因。

为此，制备了包含部分galR基因的载体，然后转化到大肠杆菌宿主细胞中，随后选择具有galR基因敲除的菌株。

使用QIAGEN Genomic-tip System由L-苏氨酸生产大肠杆菌菌株编号KCCM 10236提取基因组DNA。使用提取的基因组DNA作为模板，通过PCR扩增包含galR基因ORF(开放读码框)的DNA片段(大约850bp)。

所用引物是一对寡核苷酸(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。PCR进行30个循环，每个循环依次包括于94℃变性30秒、于60℃退火30秒、并于72℃延伸60秒。

将PCR产物施加到1.0％琼脂糖凝胶上并进行电泳。由856bp galR基因条带纯化DNA。于16℃过夜，将纯化的DNA连接到克隆载体pT7Blue(Novagen公司，美国)的EcoR V位点中，以构建重组质粒pT7Blue/galR(见图1)。将由此产生的质粒构建体转化到大肠杆菌NM522中。将转化菌株涂布在含50mg/L羧苄青霉素的固体培养基上，并于37℃培养过夜。

用铂丝接种环挑取形成的菌落，并接种3ml含羧苄青霉素的液体LB培养基。培养过夜后，使用QIAGEN Mini Prep Kit由培养物提取质粒DNA。用限制酶Mlu I消化质粒DNA提取物，并确认galR基因的克隆。用限制酶Hinc II切割得到确认的质粒pT7Blue/galR，并由0.8％琼脂糖凝胶中大约3.8kb的条带纯化DNA。通过Klenow酶处理将纯化的DNA补平末端。将由此产生的DNA片段平端连接包含loxp区的卡那霉素抗性基因的大约1.5kb片段，它是通过用Hinc II限制酶和EcoR V消化质粒pUG6(U.Guldenre等人，Nucleic Acid Research，24(13)，2519-2524，1996)得到的，从而构建大约5.3kb的重组质粒pT7ΔgalR::loxpKAN(见图2)。

用重组质粒pT7ΔgalR::loxpKAN转化大肠杆菌NM522。将由此产生的转化子在含50mg/L羧苄青霉素和50mg/L卡那霉素的固体LB培养基平板上划线，并于32℃培养过夜。用铂丝接种环挑取形成的菌落，并接种3ml含羧苄青霉素和卡那霉素的液体LB培养基。培养过夜后，使用QIAGENMini Prep Kit提取质粒DNA。使用提取的质粒DNA作为模板，通过PCR扩增包含galR基因ORF和loxpKAN位点的DNA片段(大约2.3kb)。所用引物是一对寡核苷酸(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)。PCR进行30个循环，每个循环依次包括于94℃变性30秒、于60℃退火30秒、并于72℃延伸60秒。

通过电穿孔将由此产生的DNA片段ΔgalR::loxpKAN转化到生产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株编号KCCM 10236、大肠杆菌FTR8625、和大肠杆菌FTR7624中，并将由此产生的转化子在含卡那霉素的固体LB培养基上划线以选择具有galR基因敲除的菌落。对选择的菌落测试它们在摇瓶培养物中的L-苏氨酸产量。

实施例2：锥形瓶中使用选择菌株的L-苏氨酸产量

在含有下文表1所列苏氨酸滴定培养基的锥形瓶中培养实施例1中选择的30个菌落，并比较L-苏氨酸产量。

表1

苏氨酸滴定培养基

将每个菌落在LB固体培养基上在32℃温箱中培养过夜。然后，将一铂丝环培养物接种25ml滴定培养基，并于32℃以250rpm培养42-48小时。

通过高效液相层析(HPLC)分析来自培养物的L-苏氨酸。下文表2列出了分析结果。可以由结果看出，原型菌株编号KCCM 10236在48小时内生成23g/L L-苏氨酸，而本发明的敲除了galR基因的大肠杆菌FTR2541在44小时内生成25g/L L-苏氨酸。原型菌株大肠杆菌FTR8625和FTR7624在48小时内生成26g/L L-苏氨酸，而本发明的敲除了galR基因的大肠杆菌FTR2537和FTR2533分别在44小时和42小时内生成28g/L L-苏氨酸。因此，观察到本发明的转化微生物将发酵时间和L-苏氨酸浓度与原型菌株相比提高了高达大约7-9％，并将L-苏氨酸产量提高了高达大约18-25％。选择的大肠杆菌FTR2541、大肠杆菌FTR2537、和大肠杆菌FTR2533于2003年12月4日保藏于韩国微生物培养物保藏中心(KoreanCulture Center of Microorganisms)，编号KCCM-10539、KCCM-10540、和KCCM-10541。同样，原型菌株大肠杆菌FTR8625和大肠杆菌FTR7624于2003年12月4日保藏于韩国微生物培养物保藏中心，编号KCCM-10544和KCCM-10538。

表2

菌株的摇瓶滴定测试结果

菌株

KCCM10236

FTR7624(KCCM10539)

FTR8625(KCCM10544)

FTR2537(KCCM10540)

FTR7624(KCCM10538)

FTR2533(KCCM10541)

L-苏氨酸(g/L)	23	25	26	28	26	28
							时间(小时)	48	44	48	44	48	42
产量(g/L/hr)	0.48	0.57	0.54	0.64	0.54	0.67

通过实施例证明，微生物的L-苏氨酸生物合成能力通过galR基因的敲除得到了改进。这可能是因为galP基因的表达通过galR基因的敲除得到提高，从而提高菌株内糖类的供应速率，这提高了L-苏氨酸生产菌株的比生长速率。然而，微生物生产力的改进并非只是基于这种机制。

如上所述，本发明具有灭活galR基因的微生物通过发酵高产率生产L-苏氨酸。

同样，依照生成微生物的方法，可生成能够高产率生成L-苏氨酸的微生物。

同样，依照本发明的L-苏氨酸生产方法，可以生产高产率的L-苏氨酸。

尽管已经参照本发明的例示性实施方案而具体显示并描述了本发明，本领域普通技术人员可以理解，在未脱离由后附的权利要求定义的本发明的精神和范围条件下，其中的形式和细节可以进行多种变化。

IA050589-序列表

<110>CJ株式会社

<120>生成L-苏氨酸的微生物、生产其的方法、及使用其生产L-苏氨酸的方法

<130>PN052460

<160>2

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>1

ctcccgacac gctcaaccca gatt                                       24

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>2

tgcccgccag aaaaagtcag c                                          21

Claims (8)

1.一种生产L-苏氨酸的方法，其包括：

培养能够产生L-苏氨酸并且具有失活的ga1R基因的微生物；和

由培养物分离L-苏氨酸。

2.权利要求1的方法，其中所述微生物属于肠杆菌科。

3.权利要求2的方法，其中所述微生物是大肠杆菌(Escherichiacoli)。

4.权利要求3的方法，其中所述大肠杆菌耐受L-甲硫氨酸，L-苏氨酸和L-赖氨酸类似物以及α-氨基丁酸，且对甲硫氨酸具有营养需要，对异亮氨酸具有渗漏需要，其中所述L-甲硫氨酸类似物是D，L-乙硫氨酸，正亮氨酸，α-甲基甲硫氨酸或L-甲硫氨酸-D，L-su1foxymine，L-苏氨酸类似物是α-氨基-β-羟基戊酸或D，L-苏氨酸氧肟酸，和L-赖氨酸类似物是S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸或δ-甲基-L-赖氨酸。

5.权利要求1的方法，其中所述微生物是在其染色体上具有失活的pckA基因的微生物。

6.权利要求1的方法，其中所述微生物是在其染色体上具有失活的pckA和aspA基因的微生物。

7.权利要求1的方法，其中所述微生物具有的染色体DNA除了具有内在ppc基因以及thrA，thrB和thrC基因以外，还具有插入其中的至少一个拷贝的磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因以及thrA，thrB和thrC基因。

8.权利要求1的方法，其中所述微生物选自由保藏号是KCCM-10539的大肠杆菌FTR2541，保藏号是KCCM-10540的大肠杆菌FTR2537和保藏号是KCCM-10541的大肠杆菌FTR2533组成的组。

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