CN100338010C - 脂酶－催化的海产品油的酯化 - Google Patents
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Abstract
在基本不含有机溶剂的条件下，在脂酶催化剂存在下，使含有游离酸或己酯形式EPA和DHA的海产品油与乙醇进行酯化，并进行蒸馏分离。
Description
本发明涉及脂酶催化的海产品油(marine oil)的酯化。
本领域公知可以借助脂酶催化剂来精制包括海产品油的各种油产品，在所用的精制条件下，该脂酶催化剂的特异性可提高对所需产品的回收。
为了开发由组合物，例如由含有较低量下述化合物的鱼油中分离商业上很重要的诸如EPA(二十碳五烯酸，C20:5)和DHA(二十二碳六烯酸，C22:6)的PUFA的脂酶-催化方法，人们进行了大范围的研究工作。
例如，在PCT/NO95/00050(WO95/24459)中公开了一种在基本无水条件下，在对饱和与单不饱和脂肪酸的酯交换有优先催化活性的脂酶存在下，用C1-6醇，例如乙醇处理含有甘油三酯形式饱和与不饱和脂肪酸的鱼油组合物的方法。使用优选的脂酶，假单胞菌属脂酶(PSL)和荧光假单胞菌脂酶(PFL)可由海产品油来源的浓缩物制备甘油酯形式的EPA和DHA，该海产品油来源的浓缩物含有70重量％以上的商业和治疗上很重要的Ω-3聚不饱和脂肪酸。
许多脂酶-催化的精制方法中都已使用甘油。
以举例的方式，可提及的有JP 62-91188(1987)；WO91/16443；Int.J.Food Sci.Technol.，(1992)，27，73-76，Lie和Molin；Myrnes等人的JAOCS，Vol.72，No.11(1995)，1339-1344；Moore等人的JAOCS，Vol.73，No.11(1996)，1409-1414；McNeill等人的JAOCS，Vol.73，No.11(1996)，1403-1407；WO96/3758和WO96/37587。
在PCT/NO00/00056(WO00/49117)中提供了一种酯化含有作为游离脂肪酸的EPA和DHA的海产品油组合物，以形成与起始组合物相比至少一种脂肪酸得到富集的游离脂肪酸馏分的方法，其包括以下步骤：在脂酶催化剂，米黑根毛酶(Rhizomucor miehei)脂酶(MML)存在下，在减压且基本不含有机溶剂的条件下使所述海产品油组合物与甘油反应，并回收富集了EPA和DHA中至少一种物质的游离脂肪酸馏分。优选将短程蒸馏用于从甘油酯混合物中分离剩余的游离脂肪酸。
但是，现在已很明显，基于短程蒸馏方法从甘油酯混合物中分离剩余游离脂肪酸的策略并不是非常可行。这是较短链甘油单酯的挥发性太大所导致的结果，该甘油单酯在很大程度上污染了馏出物。
我们现在已发现，脂酶-催化方法制备EPA和DHA浓缩物可提供高DHA浓缩物，该方法通过游离脂肪酸与甲醇或乙醇的直接酯化，或来自鱼油的Cn烷基酯(n＝2-18)与Cm醇(醇解)(m＝1-12；n＞m)的酯交换，和随后的短程蒸馏来进行。这些方法是快速简单的反应，其提供EPA和DHA之间优异的分离作用，而馏出物中不会产生不利的甘油单酯。该方法的主要特征定义在所附的权利要求中。
在本发明优选的实施方案中，C1-C12醇为乙醇(乙醇解)。在C2-C18烷基酯中，己基酯为优选的。
在直接酯化的起始原料中，甲醇或乙醇与游离脂肪酸的摩尔比为0.5-10.0，优选的摩尔比为0.5-3.0，最优选的摩尔比为1.0-2.0，甚至为1.0-1.5。
在酯交换中，Cm醇与Cn烷基酯的摩尔比为0.5-10.0，优选的摩尔比为0.5-3.0，最优选的摩尔比为2.0-3.0。
酯化在0℃-70℃下进行，并且优选在20℃-40℃下进行。
用在本发明中的脂酶催化剂固定在载体上。
在醇解过程中使用的一些脂酶确实具有这样的性质：其催化DHA醇解的速率要比催化相应的EPA醇解的速率慢得多。优选的具有此性质的脂酶为米黑根毛酶(MML)。其它脂酶具有这样的性质：其催化EPA和DHA醇解的速率要比催化相应的较短链和饱和度更大的脂肪酸醇解的速率慢得多。具有此性质的脂酶为假单胞菌属脂酶(PSL)和荧光假单胞菌脂酶(PFL)。
由G.G.Haraldsson和B.Kristinsson，J.Am.Oil Chem.Soc.，75：1551-1556(1998)中已经已知了使用MML进行鱼油游离脂肪酸和乙醇的直接酯化。
方案1.使用MML进行鱼油游离脂肪酸与乙醇的直接酯化
但是，人们不相信通过短程蒸馏技术可使DHA剩余游离脂肪酸和乙基酯进行满意的分离。现在，我们已惊奇地发现，可高度成功地使用短程蒸馏技术。从下面实施例所示的结果中很明显地得出该结论。
本发明进一步公开了用脂酶乙醇解鱼油己酯，随后再进行分子蒸馏，以分离剩余己基酯和挥发性更大的乙基酯。
方案2.用脂酶(MML)乙醇解鱼油己酯
为了进一步改进DHA回收率并提高其在产物中的浓度，在直接酯化之前可使用PCT/NO95/00050(WO95/24459)中描述的乙醇解反应作为预-步骤。
方案3.用脂酶(MML)乙醇解鱼油
在直接酯化之前，该甘油酯混合物需要进行水解。为了在水解前将起始原料的量减小一半，我们发现PCT/NO95/00050(WO95/24459)中的乙醇解反应是有用的。因此，本发明还公开了，作为可选择的方法，首先乙醇解随后直接酯化的两步-酶反应，每个步骤之后都用分子蒸馏法进行浓缩。该两步反应还适用于高度富含长链单不饱和物质的油，例如鲱鱼油。
当鱼油己酯为起始原料时也可使用该两步反应，而且该反应也是有利的。
借助下面实施例对本发明进行说明。
测试了类似沙丁鱼油(SO)、鱼油(AO)、鲱鱼油(HO)、鳕鱼肝油(CLO)、金枪鱼油(TO)和蓝鳕鱼油(Blue whiting oil)(BWO)的起始原料。
试验步骤
从Amano Enzyme Inc.购买来自假单胞菌属(PSL；脂酶AK)和荧光假单胞菌(PEL；脂酶PS)的细菌性脂酶。固定的米黑根毛酶(MML；Lipozyme RM IM)、Thermomyces lanuginosa(TLL；Lipozyme TM IM)和南极洲假丝酵母(Candida antarctica)(CAL；Novozym 435)脂酶由丹麦的Novozyme提供。沙丁鱼油(14％EPA和15％DHA)、鱼油(18％EPA和12％DHA)、鲱鱼油(6％EPA和8％DHA)、金枪鱼油(6％EPA和23％DHA)、鳕鱼肝油(9％EPA和9％DHA)和蓝鳕鱼油(11％EPA和7％DHA)都由Pronova Biocare提供。
使用装备有火焰电离检测器(FID)的Perkin-Elmer 8140气相色谱(GC)进行脂肪酸分析。毛细管柱为来自J&W Scientific的30米DB-225 30N，0.25μm的毛细管柱。短程蒸馏在Leybold KDL 4蒸馏釜内进行。在Bruker AC 250NMR光谱仪上记录核磁共振(NMR)谱图，氘代氯仿为溶剂。在来自Merck的硅胶板(Art 5721)上进行制备性薄层色谱(TLC)操作。用80∶20∶1的石油醚∶乙醚∶乙酸混合物进行洗脱。Rhodamin G(Merck)用于显示出随后被刮去并进行甲基化的光谱带。注入GC之前将C19:0甲基酯(Sigma)加入到试样中作为内标。
鱼油的水解
将鱼油(500g，0.55mol)加入到氢氧化钠(190g，4.75mol)、水(500ml)和96％乙醇(1.7L)的溶液中。不停搅拌过程中，使所得混合物回流30分钟(直至观察到清澈的有色液体)，然后冷却至室温。为了中和该溶液，向其中小心加入6.0M盐酸(870ml，10％过量)，并将所得混合物转移至分液漏斗中。用1∶1的石油醚和乙醚混合物(1.5L)洗涤游离脂肪酸两次。然后用水(1.5L)洗涤有机层三次，并在无水硫酸镁上干燥。滤去干燥剂并蒸发除去溶剂，50℃下高真空蒸发2小时结束蒸馏。在分析性TLC上进行分析，单个点表明为纯的游离脂肪酸。取决于鱼油的不同，产物颜色为黄色-深酒红色。
鱼油游离脂肪酸与乙醇的直接酯化
将固定的MML(15g)加入到鱼油游离脂肪酸(300g，约1.03mol)和无水乙醇(143g，3.10mol)的溶液中。在40℃的氮气氛下温和搅拌所得的酶悬浮液，直至达到希望的转化率。为了监测反应进程，在反应过程中抽取试样，用0.02M NaOH滴定剩余的游离脂肪酸量。用制备性TLC进行分级分离，随后对每种脂类成分进行定量，并用GC根据脂肪酸峰型进行分析。达到希望的转化率后，过滤除去酶并真空蒸除过量的乙醇。所得混合物经短程蒸馏后以剩余物形式得到高DHA浓缩物。
用脂酶乙醇解鱼油
将固定的MML(20g)加入到鱼油(400g，约0.44mol)和无水乙醇(61g，1.32mol)的溶液中。在室温的氮气氛下温和搅拌所得的酶悬浮液，直至达到希望的转化率。然后过滤除去酶，并在短程蒸馏之前真空蒸除过量乙醇。用分析性TLC和1H-NMR监测反应进程。用制备性TLC进行分级分离，随后对每种脂类成分进行定量，并用GC根据脂肪酸峰型进行分析。
用脂酶己醇解鱼油
将固定的CAL(25g)加入到鱼油(500g，0.55mol)和1-己醇(338g，3.31mol)的溶液中。在65℃的氮气氛下温和搅拌所得的酶悬浮液，直至根据分析性TLC和/或1H-NMR得知三酰基甘油已完全转化为己酯。过滤除去酶，并且真空蒸除过量的己醇。
用脂酶乙醇解鱼油己酯
将固定的MML(15g)加入到鱼油己酯(300g，0.80mol)和无水乙醇(111g，2.41mol)的溶液中。在40℃的氮气氛下温和搅拌所得的酶悬浮液，直至根据1H-NMR得知达到希望的转化率。过滤除去酶，并真空蒸除过量乙醇。所得混合物经短程蒸馏后以剩余物形式得到高DHA浓缩物。通过在GC上单程分析确定了各酯基团的脂肪酸组分。
实施例1
鱼油游离脂肪酸与乙醇的直接酯化
沙丁鱼油(SO)
表1中显示了40℃下，在MML(基于游离脂肪酸重量，其为5％)存在下，含有14％EPA和15％DHA(14/15)的SO游离脂肪酸与3当量乙醇的直接酯化的进程。在这些条件下，脂酶对SO游离脂肪酸显示出极高的活性。仅仅2小时后就达到超过70％的转化率(％乙酯)。反应4小时后，剩余游离脂肪酸中含有49％DHA和6％EPA，回收率分别为73％和10％。就DHA浓度和回收率而言，最优的转化率显示为约75％。表1中，反应进行过程中制得的乙酯的重量百分数被直接作为转化程度的量度。
表1.使用MML，在40℃下，SO游离脂肪酸(14/15)与乙醇直接酯化的进程。
| 时间 | 转化率(mol％) | FA成分(FFA) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| 1h | 60 | 32 | 20 | 84 | 56 |
| 2h | 71 | 43 | 11 | 80 | 21 |
| 3h | 74 | 46 | 7 | 78 | 13 |
| 4h | 77 | 49 | 6 | 73 | 10 |
| 5h | 78 | 49 | 5 | 69 | 8 |
| 7h | 80 | 50 | 5 | 65 | 7 |
经短程蒸馏后，SO游离脂肪酸的直接酯化得到了优异的结果。40℃下，在MML存在下，SO游离脂肪酸与乙醇反应4小时达到78％的转化率。反应混合物的游离脂肪酸包括49％的DHA和6％EPA，DHA回收率为75％。在115℃下蒸馏后，剩余物包括69％DHA和9％EPA，其回收率分别为65％和10％(表2)。通过稍微降低蒸馏温度使DHA回收率得到改善(参见表3)。我们不能通过蒸馏从剩余游离脂肪酸中分离出所有的乙酯。尽管如此，115℃下短程蒸馏后，我们设法获得了约90％游离脂肪酸和10％乙酯的高DHA浓缩物。像游离脂肪酸一样，在剩余物中得到的乙酯高度富集了DHA。此外，蒸馏出更多饱和与较短链游离脂肪酸，导致剩余物中DHA浓度高于反应后游离脂肪酸馏分中的浓度。
表2.使用MML，在40℃下，SO游离脂肪酸(14/15)与乙醇直接酯化的结果，以及在115℃下蒸馏分离的结果。
| 试样 | Wt％ | 脂肪酸成分 | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| 乙酯(EE)游离脂肪酸(FFA) | 7822 | 449 | 196 | 2575 | 955 |
| 馏出物(D)115℃剩余物(R)115℃ | 8515 | 769 | 159 | 3565 | 9010 |
如表3所示，通过降低转化率和蒸馏温度使SO结果得到改善。反应4小时后得到75％的转化率。在111℃下进行蒸馏后，剩余物含有66％DHA，回收率为88％，DHA/EPA比例为4.7。在稍高的蒸馏温度下，剩余物包括74％DHA，回收率为75％，DHA/EPA比例近乎为7。应该指出的是，蒸馏后DHA的回收率基于DHA在原料油中的重量百分数。
表3.使用MML，在40℃下，SO游离脂肪酸(14/15)与乙醇直接酯化的结果，以及在111和113℃下蒸馏分离的结果。
| 试样 | Wt％ | 脂肪酸成分 | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| EEFFA | 7525 | 347 | 177 | 2377 | 8713 |
| D111℃R111℃ | 7921 | 366 | 1314 | 1288 | 7624 |
| D113℃R113℃ | 8416 | 574 | 1511 | 2575 | 8911 |
可将乙醇含量降低至1当量，导致反应时间增加(表4)。还可以引入更少的脂酶，导致反应速率大幅度降低。
表4.使用MML，在40℃下，SO游离脂肪酸(14/15)与乙醇直接酯化的进程。
| 时间 | 转化率(mol％) | FA成分(FFA) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| 5h | 71 | 35 | 12 | 80 | 28 |
| 6h | 73 | 41 | 11 | 79 | 26 |
| 7h | 74 | 44 | 10 | 78 | 24 |
| 11h | 77 | 45 | 7 | 76 | 18 |
鳀鱼油(AO)
表5显示了在与SO相同的条件下，包括18％EPA和12％DHA(18/12)的AO游离脂肪酸进行直接酯化的进程。正如能够看到的，反应24小时后，以82％的转化率得到约6∶1比例的DHA/EPA，包括8％的EPA和50％的DHA。DHA回收率刚刚低于80％。而且，11小时后，在79％的转化率下，DHA/EPA比例为5∶1，DHA回收率高达84％。因此，AO和SO都是制备高DHA含量的极具潜力的起始原料，而且，如果需要的话，还可以从乙酯馏分中制备高EPA含量的浓缩物。
表5.使用MML，在40℃下，AO游离脂肪酸(18/12)与乙醇直接酯化的进程。
| 时间 | 转化率(mol％) | FA成分(FFA) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| 2h | 56 | 27 | 29 | 100 | 67 |
| 5h | 73 | 37 | 19 | 93 | 27 |
| 8h | 76 | 45 | 13 | 90 | 16 |
| 11h | 79 | 50 | 9 | 84 | 10 |
| 24h | 82 | 50 | 8 | 78 | 8 |
如表6所示，就DHA浓度和DHA/EPA比例而言，AO的结果很好。使AO游离脂肪酸(19/12)按前述方式反应，从而在11小时内达到76％的转化率。在121℃下蒸馏后，剩余物包括61％DHA，回收率只有64％，DHA/EPA比例为5.5。馏出物在低温下重复蒸馏，则可用于制备EPA的高度浓缩物。作为例子，45％EPA和10％DHA的浓缩物被认为是希望的组合物，其可用作有潜力的商业产品。
表6.使用MML，在40℃下，AO游离脂肪酸(19/12)与乙醇直接酯化的结果，以及在121℃下蒸馏分离的结果。
| 试样 | Wt％ | 脂肪酸成分 | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| EEFFA | 7624 | 245 | 2113 | 1090 | 8416 |
| D121℃R121℃ | 8713 | 561 | 2011 | 3664 | 937 |
鲱鱼油(HO)
类似地，按照上述方式，在直接酯化条件下处理包括6％EPA和8％DHA(6/8)的来自鲱鱼油的游离脂肪酸。反应进程如表7所示。反应12小时后，剩余游离脂肪酸含有37％DHA和6％EPA，回收率分别为90％和18％。
表7.使用MML，在40℃下，HO游离脂肪酸(6/8)与乙醇直接酯化的进程。
| 时间 | 转化率(mol％) | FA成分(FFA) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| 4h | 62 | 20 | 12 | 97 | 71 |
| 6h | 70 | 24 | 12 | 96 | 61 |
| 8h | 74 | 26 | 11 | 96 | 52 |
| 12h | 80 | 37 | 6 | 90 | 18 |
| 24h | 82 | 37 | 7 | 84 | 10 |
按照前面的方式，使来自HO、包括9％EPA和9％DHA(9/9)的游离脂肪酸反应12小时，达到84％的转化率，反应混合物的游离脂肪酸包括39％DHA和8％EPA，DHA转化率为76％。在110℃下蒸馏后，剩余物含有40％DHA和7％EPA，DHA回收率为68％，DHA/EPA比例几乎为6∶1(表8)。低DHA浓度是由于20∶1(4％)和22∶1(37％)的长链单不饱和脂肪酸的含量高造成的。长链单不饱和脂肪酸在HO和毛鳞鱼油中的高含量使其不太可能作为所述方法的起始原料。在剩余油中加入简单的尿素可用来除去大部分的单不饱和脂肪酸，产生有价值的DHA浓缩物。应该补充的是，具有低EPA含量的HO比SO和AO更适合用来获得高DHA/EPA比例。
表8.使用MML，在40℃下，HO游离脂肪酸(9/9)与乙醇直接酯化的结果，以及在110℃下蒸馏分离的结果。
| 试样 | Wt％ | 脂肪酸成分 | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| EEFFA | 8416 | 231 | 813 | 3466 | 7624 |
| D110℃R110℃ | 8218 | 440 | 107 | 3268 | 8812 |
金枪鱼油(TO)
下表9中显示了在与上述SO相同的条件下，包括6％EPA和23％DHA(6/23)的TO游离脂肪酸进行直接酯化的进程。8小时后得到68％的反应转化率，剩余游离脂肪酸包括74％DHA和3％EPA，DHA转化率为83％，DHA/EPA比例为25∶1(表9)。明显地，将原料油的该类型初始EPA/DHA组合物用于浓缩DHA是理想的。
表9.使用MML，在40℃下，TO游离脂肪酸(6/23)与乙醇直接酯化的进程。
| 时间 | 转化率(mol％) | FA成分(FFA) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| 1h | 43 | 47 | 9 | 98 | 78 |
| 2h | 52 | 69 | 9 | 97 | 65 |
| 3h | 62 | 68 | 9 | 96 | 50 |
| 5h | 65 | 70 | 6 | 92 | 47 |
| 8h | 68 | 74 | 3 | 83 | 14 |
| 11h | 70 | 77 | 2 | 78 | 11 |
| 24h | 73 | 74 | 2 | 71 | 8 |
鳕鱼肝油(CLO)
表10显示了在上述类似的条件下，包括9％EPA和9％DHA(9/9)的CLO游离脂肪酸进行直接酯化的进程。得到了约79％的转化率，DHA/EPA比例为5∶1，剩余游离脂肪酸具有50％的DHA浓度，且回收率大于80％。这些结果甚至优于被认为是具有潜力的DHA回收物的SO和AO。但是就成本而言，SO和AO要有利于CLO。考虑到CLO含有少得多的长链单不饱和物质(20∶1和22∶1)，将CLO(9/9)结果与HO(9/9)进行比较可能会有用。
表10.使用MML，在40℃下，CLO游离脂肪酸(9/9)与乙醇直接酯化的进程。
| 时间 | 转化率(mol％) | FA成分(FFA) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| 2h | 65 | 37 | 20 | 96 | 62 |
| 3h | 71 | 42 | 17 | 94 | 43 |
| 5h | 75 | 46 | 13 | 91 | 27 |
| 8h | 79 | 48 | 10 | 86 | 17 |
| 11h | 80 | 50 | 7 | 76 | 12 |
| 24h | 82 | 53 | 5 | 76 | 8 |
蓝鳕鱼油(BWO)
表11显示了在上述条件下，包括11％EPA和7％DHA(11/7)的BWO游离脂肪酸进行直接酯化的进程。约73％的转化率下，剩余游离脂肪酸包括24％的DHA浓度，回收率为95％。EPA并没有按照预期情况转化为乙酯。有趣的是，不同于HO，长链单不饱和游离脂肪酸以远远高出的程度被转化为乙酯。需要更高的转化率来获得更好的EPA和DHA分离效果。BWO的低转化率的原因并不清楚，但是进行了若干尝试均没有产生更高的转化率。
表11.使用MML，在40℃下，BWO游离脂肪酸(11/7)与乙醇直接酯化的进程。
| 时间 | 转化率(mol％) | FA成分(FFA) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| 4h | 70 | 22 | 23 | 95 | 51 |
| 7h | 71 | 23 | 23 | 95 | 50 |
| 9h | 72 | 23 | 23 | 95 | 49 |
| 24h | 73 | 24 | 21 | 95 | 44 |
实施例2
鱼油的联合乙醇解和直接酯化
可将两步反应用于改善DHA的回收率和产物浓度，该两步反应中首先进行乙醇解，随后再进行直接酯化。在直接酯化之前，由乙醇解反应得到的甘油酯混合物需要进行水解。因此，乙醇解反应可作为预-步骤，用于在水解前将起始原料的量减小一半。应注意，蒸馏分离后40℃下乙醇解反应中获得的高回收率(表12)。如上面所讨论的，在室温下得到了更好的结果，并列于表13和14中。室温反应获得的剩余物包括23％DHA和25％EPA，回收率分别为97％和65％(表13)。这些结果表明，通过两步方法可显著提高DHA回收率。而且，显著降低了水解的膨松度。最后，该方法可能适于富含长链但不饱和物质的油，例如HO。
表12.AO的联合乙醇解和直接酯化的结果。使用MML，在40℃下，AO(19/12)与乙醇进行乙醇解反应，并在125℃下进行蒸馏分离，之后使用MML，在40℃下使所得游离脂肪酸与乙醇进行直接酯化，并在115℃下进行蒸馏分离。
| 试样 | Wt％ | 脂肪酸成分 | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| D125℃R125℃ | 4159 | 118 | 1424 | 397 | 2773 |
| D115℃R115℃ | 6634 | 454 | 2222 | 1288 | 6931 |
表13.使用MML，室温下AO(18/12)与乙醇进行乙醇解反应的结果，以及125℃下蒸馏分离的结果。
| 试样 | Wt％ | 脂肪酸成分 | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| D125℃R125℃ | 4753 | 223 | 1525 | 397 | 3565 |
表14.使用MML，在40℃下，AO(18/12)与乙醇进行乙醇解反应的结果，以及在125℃下蒸馏分离的结果。
| 试样 | Wt％ | 脂肪酸成分 | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| D125℃R125℃ | 4159 | 118 | 1424 | 397 | 2773 |
实施例3
鱼油己酯的乙醇解
鱼油己酯(HE)的乙醇解反应是上述鱼油甘油三酯乙醇解反应(方案2)的替代方案。该结果表明，包括米黑根毛酶脂酶(MML)和假单胞菌脂酶(PSL和PFL)的各种脂酶都可像近来商业化的来源于Novozyme的Thermomyces lanuginosa脂酶(TLL)一样使用。而且，已确信分子蒸馏非常适于分离剩余的己酯和挥发性更大的乙酯。
用己醇处理AO甘油三酯时，南极洲假丝酵母脂酶(CAL)用来将其转化为相应的己酯。在单个或两个酶步骤中，用乙醇和PSL处理所得的己酯，之后对反应混合物进行分子蒸馏，则可以得到含有约80％EPA和DHA的剩余己酯。在己酯中浓缩DHA不仅能够从己酯中分离出乙酯，还能蒸馏除去更多的饱和乙酯。使用CAL可以以化学或酶方式将己酯转化为乙酯。可选择地，在单一的酶步骤中使用MML的乙醇解反应处理鳀鱼油，其可提供70％的作为己酯的DHA。还可通过额外的MML处理来进一步浓缩。从含有大部分EPA的乙酯松散材料中可将EPA纯化至≥95％的水平。
一种可选择的两步方法是基于沙丁鱼油的乙醇解反应，该反应在分子蒸馏后生产出作为甘油酯混合物的50％的EPA+DHA(30/20)浓缩物。用己醇和CAL处理剩余的甘油酯则得到相同组分的己酯。可用乙醇和PSL对其进行处理以得到含有约80％EPA和DHA的己酯，还可用乙醇和MML进行处理以将DHA从EPA中分离出来，之后再进一步浓缩EPA和DHA。该方法可能具有优越性，因为从工业角度考虑，用乙醇代替己醇对大量鱼油进行处理的方法更简单、量更小且更可行。还应该想到的是，使用该方法可预计达到非常高的优异的EPA和DHA回收率。
鳀鱼油(AO)
与鱼油甘油三酯的乙醇解类似，MML的脂肪酸选择性和活性会受到温度的显著影响。因此，MML可用于在20℃或更低的温度下浓缩EPA和DHA，而在40℃下，EPA则从DHA中分离出来，得到DHA的高度浓缩物。40℃下，在MML(10％重量的己酯)存在下，包括18％EPA和12％DHA的鳀鱼油己酯与2当量乙醇反应24小时，达到59％的转化率。除去脂酶后，蒸除过量乙醇并在135℃，3×10-3mbar下蒸馏乙酯/己酯(EE/HE)混合物。剩余物(26％重量)包括43％DHA，回收率仅为65％。DHA/EPA比例仅为2.2(表15)。
表15.使用MML，在40℃下，AO己酯(18/12)与乙醇进行乙醇解反应的结果，以及在135℃下蒸馏分离的结果。
| 试样 | Wt％a | FA成分(HE) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| EEHER135℃ | 594126 | 62143 | 181320 | 307065 | 623828 |
a在表15和16中，脂酶催化的反应转化率基于摩尔百分数，而蒸馏结果基于重量。
在鳀鱼油己酯(18/13)的类似反应中，当反应温度降低至20℃时得到了有趣的结果。在135℃下蒸馏后，剩余物包括45％DHA和30％EPA，转化率分别为85％和55％(表16)。
表16.使用MML，在20℃下，AO己酯与乙醇进行乙醇解反应的结果，以及在135℃下分子蒸馏分离的结果。
| 试样 | Wt％ | FA成分(HE) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| EEHER135℃ | 505032 | 12345 | 92530 | 49687 | 267453 |
小规模测试假单胞菌脂酶具有良好的结果，得到了很高的EPA回收率，但是DHA回收率非常低，尤其反应转化率超过50％时更是如此。室温下，在PSL和PFL存在下，AO(18/12)与2当量乙醇的乙醇解反应结果如表16所示。对于PFL，经24小时沙丁鱼油己酯转化率仅为44％之后，得到了28％EPA和21％DHA的含量，而对于PSL，经24小时57％的转化率时得到了33％的EPA和17％的DHA。
表17.使用PFL和PSL，在室温下，AO己酯(18/12)与乙醇进行乙醇解反应的结果。
| 试样 | 转化率(mol％) | FA成分(HE) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| PFLPSL | 4457 | 2117 | 2833 | 8153 | 8979 |
将固定在硅胶颗粒上的新型Novozyme脂酶(TLL)与MML进行比较。发现新的脂酶对乙醇非常敏感，而且活性随温度升高迅速降低。20℃下，两种脂酶都具有活性，而且经24小时MML得到54％的转化率，而TLL仅得到43％的转化率。包括6％EPA和28％DHA(6/28)的剩余TO己酯经TLL反应后含有8％EPA和45％DHA。MML反应导致剩余的己酯含有7％EPA和54％DHA(表18)。这些脂酶的脂肪酸选择性显然很相似，但是TLL对乙醇浓度更敏感，这就使其不如MML。
表18.使用MML和TLL，在室温下，TO己酯(6/28)与乙醇进行乙醇解反应的结果。
| 试样 | 转化率(mol％) | FA成分(HE) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| MMLTLL | 5442 | 5445 | 78 | 8993 | 5477 |
40℃下，TO己酯(6/28)与乙醇进行乙醇解反应的结果列于表19中。有趣的是，40℃下，TLL只得到15％的转化率，而MML为47％的转化率。人们认为更高的温度下脂酶对极性乙醇及其损害效应更敏感。对于MML，经24小时47％的转化率后，己酯包括9％EPA和49％DHA，而TLL经24小时只有15％的转化率，得到33％EPA和17％DHA。
表19.使用MML和TLL，在40℃下，TO己酯(6/28)与乙醇进行乙醇解反应的结果。
| 试样 | 转化率(mol％) | FA成分(HE) | 回收率 | ||
| DHA％ | EPA％ | DHA％ | EPA％ | ||
| MMLTLL | 4715 | 4930 | 97 | 9397 | 7995 |
通过本发明，在脂酶存在下，成功地通过鱼油游离脂肪酸或鱼油己酯与乙醇的无溶剂直接酯化来分离EPA和DHA。根据本发明的方法避免了在馏出物中含有甘油单酯的问题。
Claims (17)
1.一种通过分子蒸馏分离富含二十碳五烯酸，C20:5的乙酯或甲酯馏分和富含二十二碳六烯酸，C22:6的游离脂肪酸馏分的方法，所述乙酯或甲酯馏分和游离脂肪酸馏分通过使用脂酶的鱼油游离脂肪酸与乙醇或甲醇的直接酯化得到，其中所述脂酶为米黑根毛酶脂酶或Thermomyces lanuginosa脂酶。
2.根据权利要求1的方法，其中鱼油游离脂肪酸起始原料通过脂酶催化的鱼油甘油三酯的醇解、随后的分子蒸馏和剩余甘油酯混合物的水解而获得。
3.一种酯化含有二十碳五烯酸，C20:5和二十二碳六烯酸，C22:6的海产品油组合物的方法，其中二十碳五烯酸，C20:5和二十二碳六烯酸，C22:6为脂肪酸Cn烷基酯形式，其中n＝2-18，该方法用以形成(1)：与起始原料相比富集了二十二碳六烯酸，C22:6的脂肪酸Cn烷基酯馏分，其中n＝2-18，以及与起始原料相比富集了二十碳五烯酸，C20:5的脂肪酸Cm烷基酯馏分，其中m＝1-12；n＞m，或者(2)：与起始原料相比富集了二十二碳六烯酸，C22:6和二十碳五烯酸，C20:5的脂肪酸Cn烷基酯馏分，其中n＝2-18，以及与起始原料相比二十二碳六烯酸，C22:6和二十碳五烯酸，C20:5都降低的脂肪酸Cm烷基酯馏分，其中m＝1-12；n＞m，该方法包括以下步骤：在不含有机溶剂的条件下，在脂酶催化剂存在下，使所述海产品油组合物与Cm醇反应，其中m＝1-12；n＞m，并通过分子蒸馏来分离馏分，其中所述脂酶催化剂为米黑根毛酶脂酶、Thermomyces lanuginosa脂酶、假单胞菌属脂酶或荧光假单胞菌脂酶。
4.根据权利要求3的方法，其中起始原料，C2-C18烷基酯是通过脂酶催化的鱼油甘油三酯的醇解、随后的分子蒸馏，以及剩余甘油酯混合物与C2-C18烷基醇的醇解反应获得的。
5.根据权利要求3或4的方法，其中C2-C18烷基酯为己酯。
6.根据权利要求3的方法，其中C1-C12醇为乙醇。
7.根据权利要求1的方法，其中在起始组合物中甲醇或乙醇与游离脂肪酸的摩尔比为0.5-10.0。
8.根据权利要求7的方法，其中摩尔比为0.5-3.0。
9.根据权利要求7的方法，其中摩尔比为1.0-2.0。
10.根据权利要求7的方法，其中摩尔比为0.5-1.5。
11.根据权利要求3的方法，其中C1-C12醇与C2-C18烷基酯的摩尔比为0.5-10.0。
12.根据权利要求11的方法，其中摩尔比为0.5-3.0。
13.根据权利要求11的方法，其中摩尔比为2.0-3.0。
14.根据权利要求1或3的方法，其中酯化反应在0℃-70℃的温度下进行。
15.根据权利要求14的方法，其中酯化反应在20℃-40℃的温度下进行。
16.根据权利要求1或3的方法，其中所述脂酶催化剂固定在载体上。
17.根据权利要求1的方法，其中所述脂酶催化二十二碳六烯酸，C22:6醇解的速率低于催化相应的二十碳五烯酸，C20:5醇解的速率。
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Owner name: PRONOVA BIOPHARMACEUTICAL NORWAY CO., LTD. Free format text: FORMER NAME OR ADDRESS: PRONOVA BIOCARE AS |
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