Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Präparate mit einem Gehalt an diesen Polypeptiden. Diese Verbindungen eignen sich als Arzneimittel, z.B. zur Behandlung von Somatostatin-Rezeptor-positiven Tumoren oder als in-vivo-diagnostische Abbildungsmittel.
In den vergangenen Jahren wurde bei einer Reihe von menschlichen Tumoren, z.B. Hypophysentumoren, Zentralnervensystemtumoren, Brusttumoren, gastro-enteropankreatischen Tumoren und ihren Metastasen, ein starkes Auftreten von Somatostatin-Rezeptoren nachgewiesen. Einige von diesen Tumoren sind kleine oder langsam wachsende Tumoren, bei denen eine präzise Lokalisation durch herkömmliche Diagnoseverfahren schwierig ist.
Eine in-vitro-Sichtbarmachung von Somatostatin-Rezeptoren wurde durch Autoradiographie von Tumorgeweben unter Verwendung von radiojodiertem Somatostatin oder Somatostatinanalogen, z.B. [<1><2><5>J-Tyr<1><1>]-Somatostatin-14 (Taylor, J.E. et al., Life Science, Bd. 43 (1988), Seite 421) oder [<1><2><5>J-Tyr<3>]-SMS 201-995, auch als [<1><2><5>J] 204-090 bezeichnet (Reubi, J.C. et al., Brain Res., Bd. 406 (1987), Seite 891; Reubi, J.C. et al., J. Clin. Endocr. Metab., Bd. 65 (1987), Seite 1127; Reubi, J.C. et al., Cancer Res., Bd. 47 (1987), Seite 551; Reubi, J.C. et al., Cancer Res., Bd. 47 (1987), Seite 5758).
Nunmehr wurden therapeutisch wertvolle, neue Somatostatinpeptide, die für in vivo-diagnostische und therapeutische Anwendungszwecke markiert werden können, aufgefunden.
Erfindungsgemäss wird ein Somatostatinpeptid bereitgestellt, das mindestens eine chelatbildende Gruppe für ein nachweisbares Element trägt, wobei diese chelatbildende Gruppe mit einer Aminogruppe des Peptids verknüpft ist und wobei diese Aminogruppe keine signifikante Bindungsaffinität für Somatostatin-Rezeptoren aufweist.
Diese Verbindungen werden nachstehend als "ERFINDUNGSGEMÄSSE LIGANDEN" bezeichnet. Sie besitzen eine chelatbildende Gruppe, die zur Reaktion mit einem nachweisbaren Element, z.B. einem Radionuklid, einem röntgenopaken Element oder einem paramagnetischen Ion, unter Bildung eines Komplexes in der Lage sind und die ferner in der Lage sind, eine Bindung mit Somatostatin-Rezeptoren, die beispielsweise von Tumoren oder Metastasen exprimiert oder überexprimiert werden, einzugehen.
Die chelatbildende Gruppe ist über eine kovalente Bindung mit der Aminogruppe des Peptids verknüpft.
Die chelatbildende Gruppe ist vorzugsweise an die terminale N-Aminogruppe des Somatostatinpeptids gebunden.
Erfindungsgemäss kann die chelatbildende Gruppe entweder direkt oder indirekt gebunden sein, z.B. über eine Zwischengruppe an die Aminogruppe des Somatostatinpeptids.
Eine Gruppe von LIGANDEN ist diejenige, bei der die chelatbildende Gruppe direkt an die Aminogruppe des Somatostatinpeptids gebunden ist.
Eine weitere Gruppe von LIGANDEN ist diejenige, bei der die chelatbildende Gruppe indirekt über eine Brücken- oder Zwischengruppe an die Aminogruppe des Somatostatinpeptids gebunden ist.
Vorzugsweise ist die chelatbildende Gruppe über eine Amidbindung an das Peptid gebunden.
Der Ausdruck "Somatostatinpeptide" umfasst natürlich auftretendes Somatostatin (Tetradecapeptid) und deren Analoge oder Derivate.
Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Derivate oder Analoge" sind beliebige geradkettige oder cyclische Polypeptide zu verstehen, die sich von dem natürlich vorkommenden Tetradecapeptid-Somatostatin ableiten, wobei eine oder mehrere Aminosäureeinheiten weggelassen und/oder durch eine oder mehrere Aminosäurereste ersetzt sind und/oder wobei eine oder mehrere funktionelle Gruppen durch eine oder mehrere andere funktionelle Gruppen ersetzt sind und/oder eine oder mehrere Gruppen durch eine oder mehrere andere isostere Gruppen ersetzt sind. Im allgemeinen umfasst der Ausdruck sämtliche modifizierten Derivate eines biologisch aktiven Peptids, das eine qualitativ ähnliche Wirkung wie die des unmodifizierten Somatostatinpeptids aufweist, die also beispielsweise eine Bindung mit Somatostatin-Rezeptoren eingehen und die Hormonausscheidung vermindern.
Cyclische, brückencyclische und geradkettige Somatostatinanaloge sind bekannte Verbindungen. Diese Verbindungen und ihre Herstellung sind beispielsweise in den europäischen Patentveröffentlichungen EP-A-1 295; 29 579; 215 171; 203 031; 214 872; 298 732; und 277 419 beschrieben.
Bevorzugte ERFINDUNGSGEMÄSSE LIGANDEN sind solche, die sich von folgenden Somatostatinanalogen ableiten:
A. Analoge der Formel I
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worin A C1-2-Alkyl, C7-10-Phenylalkyl oder eine Gruppe der Formel RCO- bedeutet, wobei
i) R Wasserstoff, C1-11-Alkyl, Phenyl oder C7-10-Phenylalkyl bedeutet, oder
ii) RCO-
a) einen L- oder D-Phenylalaninrest, der gegebenenfalls durch F, Cl, Br, NO2, NH2, OH, C1-3-Alkyl und/oder C1-3-Alkoxy ringsubstituiert ist;
;
b) den Rest einer natürlichen oder synthetischen alpha -Aminosäure, die von der vorstehenden Definition a) abweicht, oder einer entsprechenden D-Aminosäure oder
c) einen Dipeptidrest bedeutet, in dem die einzelnen Aminosäurereste gleich oder verschieden sind und aus den vorstehend unter a) und/oder b) definierten Aminosäureresten ausgewählt sind,
wobei die alpha -Aminogruppe der Aminosäurereste a) und b) und die N-terminale Aminogruppe der Dipeptidreste c) gegebenenfalls mono- oder di-C1-12-alkyliert oder durch C1-8-Alkanoyl substituiert sind,
A min Wasserstoff, C1-12-Alkyl oder C7-10-Phenylalkyl bedeutet,
Y1 und Y2 zusammen eine direkte Bindung bilden oder die Reste Y1 und Y2 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Rest der Formeln (1) bis (5) bedeuten
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worin
Ra Methyl oder Ethyl bedeutet,
Rb Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeutet,
m eine ganze Zahl von 1 bis 4 ist,
n eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist,
Rc (C1-6)-Alkyl bedeutet,
Rd den an das alpha -Kohlenstoffatom einer natürlichen oder synthetischen alpha -Aminosäure (unter Einschluss von Wasserstoff) gebundenen Substituenten bedeutet,
Re (C1-5)-Alkyl bedeutet,
Ra min und Rb min unabhängig voneinander Wasserstoff, Methyl oder Ethyl bedeuten,
R8 und R9 unabhängig voneinander Wasserstoff, Halogen, (C1-3)-Alkyl oder (C1-3)-Alkoxy bedeuten,
p 0 oder 1 ist,
q 0 oder 1 ist und
r 0, 1 oder 2 ist,
B -Phe-, das vorzugsweise durch Halogen, NO2, NH2, OH, C1-3-Alkyl und/oder C1-3-Alkoxy (unter Einschluss von Pentafluoralanin) ringsubstituiert ist, oder beta -Naphthyl-Ala bedeutet,
C (L)-Trp- oder (D)-Trp- bedeutet,
die gegebenenfalls alpha -N-methyliert und gegebenenfalls am Benzolring durch Halogen, NO2, NH2, OH, C1-3-Alkyl und/oder C1-3-Alkoxy substituiert sind,
D Lys, Lys, bei dem die Seitenkette in beta -Stellung O oder S enthält, gamma F-Lys oder delta F-Lys, gegebenenfalls alpha -N-methyliert, oder einen 4-AminocyclohexylAla- oder 4-AminocyclohexylGly-Rest bedeutet,
E Thr, Ser, Val, Phe, Ile oder einen Aminoisobuttersäure- oder Aminobuttersäurerest bedeutet,
G einen Rest der Formeln
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bedeutet, wobei
R7 Wasserstoff oder C1-3-Alkyl bedeutet,
R10 Wasserstoff oder den Rest eines physiologisch verträglichen, physiologisch hydrolysierbaren Esters bedeutet,
R11 Wasserstoff, C1-3-Alkyl, Phenyl oder C7-10-Phenylalkyl bedeutet,
R12 Wasserstoff, C1-3-Alkyl oder eine Gruppe der Formel -CH(R13)-X1 bedeutet,
R13 CH2OH, -(CH2)2-OH, -(CH2)3-OH oder -CH(CH3)OH bedeutet, oder den an das alpha -Kohlenstoffatom einer natürlichen oder synthetischen alpha -Amino säure gebundenen Substituenten (einschliesslich Wasserstoff) darstellt, und
X1 eine Gruppe der Formel -COOR7, -CH2OR10 oder
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bedeutet, worin
R7 und R10 die vorstehend definierte Bedeutung haben,
R14 Wasserstoff oder C1-3-Alkyl bedeutet und
R15 Wasserstoff, C1-3-Alkyl, Phenyl oder C7-10-Phenylalkyl bedeutet und
R16 Wasserstoff oder Hydroxy bedeutet,
mit der Massgabe, dass
wenn R12 -CH(R13)-X1 bedeutet, R11 Wasserstoff oder Methyl ist,
wobei die Reste B, D und E die L-Konfiguration aufweisen und die Reste in der 2- und 7-Stellung und beliebige Reste Y1 4) und Y2 4) jeweils unabhängig voneinander die (L)- oder (D)-Konfiguration aufweisen.
Die Bedeutungen von A und A min in der Formel I sind vorzugsweise so gewählt, dass die Verbindung eine terminale -NH-Gruppe enthält, die mit einem chelatbildenden Mittel verknüpft werden kann.
In den Verbindungen der Formel I werden die folgenden Bedeutungen entweder einzeln oder in beliebigen Kombinationen oder Unterkombinationen bevorzugt:
1. A bedeutet C7-10-Phenylalkyl, insbesondere Phenethyl, oder eine Gruppe der Formel RCO. Vorzugsweise bedeutet A eine Gruppe der Formel RCO.
1.1. Vorzugsweise bedeutet R C1-11-Alkyl oder C7-10-Phenylalkyl, insbesondere C7-10-Phenylalkyl, ganz besonders Phenethyl oder RCO hat die Bedeutungen a), b) oder c).
1.2. Wenn RCO die Bedeutungen a), b) oder c) hat, ist die alpha -Aminogruppe der Aminosäurereste a) und b) und die N-terminale Aminogruppe der Dipeptidreste c) vorzugsweise nicht-alkyliert oder mono-C1-12-alkyliert, insbesondere -C1-8-alkyliert und ganz besonders -methyliert. Insbesondere ist die N-Endgruppe nicht-alkyliert.
1.3. Wenn RCO die Bedeutung a) hat, handelt es sich vorzugsweise a min ) um einen L- oder D-Phenylalanin- oder -Tyrosin-Rest, der gegebenenfalls mono-N-C1-12-alkyliert ist. Vorzugsweise bedeutet a min ) einen L- oder D-Phenylalaninrest.
1.4. Wenn RCO die Bedeutung b) oder c) hat, ist der definierte Rest vorzugsweise lipophil. Bevorzugte Reste b) sind somit b min ) alpha -Aminosäurereste mit einer Kohlenwasserstoffseitenkette, z.B. Alkyl mit 3, vorzugsweise 4 oder mehr C-Atomen, z.B. mit bis zu 7 C-Atomen, Naphthylmethyl oder Heteroaryl, z.B. ein 3-(2- oder 1-Naphthyl)-alanin-, Pyridylmethyl- oder Tryptophanrest, wobei diese Reste die L- oder D-Konfiguration aufweisen. Bevorzugte Reste c) sind Dipeptidreste, bei denen die einzelnen Aminosäurereste gleich oder verschieden sind und unter den vorstehend unter a min ) und b min ) definierten Resten ausgewählt sind.
Ein Beispiel für einen Rest c) ist der 3-(2-Naphthyl)-alaninrest.
1.5. Insbesondere weist RCO die Bedeutung a) und ganz besonders die Bedeutung a min ) auf.
2. B bedeutet B min , wobei B min Phe oder Tyr ist.
3. C bedeutet C min , wobei C min (D)Trp ist.
4. D bedeutet D min , wobei D min Lys, MeLys oder Lys( epsilon -Me), insbesondere Lys, bedeutet.
5. E bedeutet E min , wobei E min Val oder Thr, insbesondere Thr, bedeutet.
6. G bedeutet G min , wobei G min eine Gruppe der Formel
EMI9.1
und insbesondere eine Gruppe der Formel
EMI9.2
bedeutet (wobei in diesem Fall R11 = H oder CH3). Im letztgenannten Fall weist der Rest -CH(R13)-X1 vorzugsweise die L-Konfiguration auf.
6.1. R11 bedeutet vorzugsweise Wasserstoff.
6.2. Als an das alpha -Kohlenstoffatom einer natürlichen Aminosäure (d.h. der Formel H2N-CH(R13)-COOH) gebundener Substituent bedeutet R13 vorzugsweise -CH2OH, -CH(CH3)-OH, Isobutyl oder Butyl oder R13 bedeutet -(CH2)2-OH oder -(CH2)3-OH. Insbesondere weist es die Bedeutung -CH2OH oder -CH(CH3)OH auf.
6.3. X1 bedeutet vorzugsweise eine Gruppe der Formel
EMI9.3
oder -CH2-OR10, insbesondere der Formel -CH2-OR10, und R10 bedeutet vorzugsweise Wasserstoff oder hat die nachstehend unter 7 angegebene Bedeutung. Insbesondere bedeutet R10 Wasserstoff.
Die folgenden Einzelverbindungen dienen als Erläuterung für Verbindungen der Formel I:
EMI10.1
B. Analoge der Formel II
EMI10.2
[vgl. Vale et al., Metabolism, Bd. 27, Supp. 1, (1978) Seite 139]
EMI10.3
(vgl. EP-A 200 188).
Der Inhalt sämtlicher vorstehender Druckschriften unter Einschluss der speziellen Verbindungen werden zum Gegenstand der vorliegenden Beschreibung gemacht.
Besonders bevorzugt sind LIGANDEN, die sich ableiten von
EMI11.1
Geeignete chelatbildende Gruppen sind physiologisch verträgliche chelatbildende Gruppen, die zur Bildung eines Komplexes mit einem nachweisbaren Element in der Lage sind. Vorzugsweise weist die chelatbildende Gruppe einen im wesentlichen hydrophilen Charakter auf. Beispiele für chelatbildende Gruppen sind Iminodicarboxylgruppen, Polyaminopolycarboxylgruppen, z.B.
solche, die sich von nicht-cyclischen Liganden ableiten, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA), Ethylenglykol-O,O min -bis-(2-aminoethyl)-N,N,N min ,N min -tetraessigsäure (EGTA), N,N min -Bis-(hydroxybenzyl)-ethylendiamin-N,N min -diessigsäure (HBED) und Triethylentetraminhexaessigsäure (TTHA), solche, die sich von substituierter EDTA oder DPTA ableiten, wie p-Isothiocyanatobenzyl-EDTA oder DTPA, solche, die sich von makrocyclischen Liganden ableiten, wie 1,4,7,10-Tetra-azacyclododecan-N,N min ,N min min ,N min min min -tetraessigsäure (DOTA) und 1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecan-N,N min ,N min min ,N min min min -tetraessigsäure (TETA), solche die sich von N-substituierten oder C-substituierten makrocyclischen Aminen ableiten, auch unter Einschluss von Cyclamen, wie die in EP 304 780 A1 und in WO 89/01 476-A offenbarten Verbindungen,
Gruppen der Formel IV oder V
EMI11.2
worin
die Reste R1, R2 und R3 jeweils unabhängig voneinander C1-6-Alkyl, C6-8-Aryl oder C7-9-Arylalkyl bedeuten, die jeweils gegebenenfalls durch OH, C1-4-Alkoxy, COOH oder SO3H substituiert sind,
n min den Wert 1 oder 2 hat,
i eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist,
TT unabhängig voneinander alpha - oder beta -Aminosäuren bedeuten, die miteinander über Amidbindungen verknüpft sind,
Gruppen, die sich von Bisaminothiolderivaten ableiten, z.B. Verbindungen der Formel VI
EMI12.1
worin
die einzelnen Reste R20, R21, R22 und R23 jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder C1-4-Alkyl bedeuten,
X2 eine Gruppe bedeutet, die zur Reaktion mit der N-Aminogruppe des Peptids in der Lage ist, und
m min den Wert 2 oder 3 hat,
Gruppen, die sich von Dithiasemicarbazonderivaten ableiten, z.B. Verbindungen der Formel VII
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worin
X2 die vorstehend definierte Bedeutung hat,
Gruppen, die sich von Propylenaminoximderivaten ableiten, z.B. Verbindungen der Formel VIII
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worin
die einzelnen Reste R24, R25, R26, R27, R28 und R29 unabhängig voneinander Wasserstoff oder C1-4-Alkyl bedeuten, und
X2 und m min die vorstehend definierte Bedeutung haben,
Gruppen, die sich von Diamiddimercaptiden ableiten, z.B. Verbindungen der Formel IX
EMI13.2
worin
X3 einen divalenten Rest bedeutet, der gegebenenfalls substituiert ist und eine Gruppe aufweist, die zur Umsetzung mit der N-Aminogruppe des Peptids in der Lage ist, z.B. C1-4-Alkylen oder Phenylen mit einer Gruppe X2, und
Y5 Wasserstoff oder CO2R30 bedeutet, worin R30 C1-4-Alkyl bedeutet,
oder Gruppen, die sich von Phorphyrinen ableiten, z.B. N-Benzyl-5,10,15,20-tetrakis-(4-carboxyphenyl)-porphin oder TPP mit einer X2-Gruppe gemäss der vorstehenden Definition.
Aryl bedeutet vorzugsweise Phenyl. Arylalkyl bedeutet vorzugsweise Benzyl.
Beispiele für X2 umfassen Reste der Formel -(X4)n min min -X5, worin X4 C1-6-Alkylen oder C1-6-Alkylen, das gegebenenfalls über ein Sauerstoffatom oder -NH- an das Kohlenstoffatom gebunden ist, n min min 0 oder 1 und X5 -NCS, eine Carboxygruppe oder ein funktionelles Derivat davon bedeutet, z.B. ein Säurehalogenid, -anhydrid oder -hydrazid. X2 ist an eines der Kohlenstoffatome von -[CH2]m min - oder =CH-CH= unter Ersatz eines Wasserstoffatoms gebunden.
Die chelatbildende Gruppe kann entweder direkt oder indirekt an die N-Aminogruppe des Somatostatinpeptids gebunden sein. Wenn sie indirekt gebunden ist, ist sie vorzugsweise über eine Brücken- oder Zwischengruppe verknüpft, z.B. eine Gruppe der Formel ( alpha 1)
Z-R35-CO- ( alpha 1)
wobei
R35 C1-11-Alkylen, C2-11-Alkenylen oder -CH(R min )- bedeutet, wobei R min den in alpha -Stellung zum Rest einer natürlichen oder synthetischen alpha -Aminosäure gebundenen Rest bedeutet, z.B. Wasserstoff, C1-11-Alkyl, Benzyl, gegebenenfalls substituiertes Benzyl, Naphthylmethyl oder Pyridylmethyl, und
Z einen funktionellen Rest bedeutet, der zur kovalenten Reaktion mit dem chelatbildenden Mittel in der Lage ist.
Z kann beispielsweise einen Rest bedeuten, der mit der chelatbildenden Gruppe eine Ether-, Ester- oder Amidbindung bilden kann. Z bedeutet vorzugsweise Amino.
Die chelatbildenden Gruppen können, sofern sie Carboxy-, -SO3H- und/oder Aminogruppen enthalten, in freier Form oder in Salzform vorliegen.
Als chelatbildende Gruppen sind solche bevorzugt, die sich von Polyaminopolycarbonsäuren ableiten, z.B. solche, die sich von EDTA, DTPA, DOTA, TETA oder substituierter EDTA oder DTPA ableiten. Von DTPA abgeleitete chelatbildende Gruppen sind besonders bevorzugt.
In den ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN kann die chelatbildende Gruppe, wenn es sich um eine polyfunktionelle Gruppe handelt, entweder mit einem einzelnen Somatostatinpeptidmolekül oder mit mehr als einem Somatostatinpeptidmolekül, z.B. mit zwei Somatostatinpeptidmolekülen, verknüpft sein.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN können beispielsweise in freier Form oder in Salzform vorliegen. Unter die Salze fallen Säureadditionssalze, z.B. mit organischen Säuren, polymeren Säuren oder anorganischen Säuren, wie Hydrochloride und Acetate, sowie Salzformen, die mit in der chelatbildenden Gruppe vorliegenden Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen erhältlich sind, z.B. Alkalimetallsalze, wie Natrium- oder Kaliumsalze, oder substituierte oder unsubstituierte Ammoniumsalze.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Herstellung der ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN. Sie lassen sich in Analogie zu bekannten Verfahren herstellen.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN lassen sich beispielsweise folgendermassen herstellen:
a) indem man mindestens eine Schutzgruppe, die in einem eine chelatbildende Gruppe tragenden Somatostatinpeptid enthalten ist, entfernt, oder
b) indem man zwei Peptidfragmente miteinander verknüpft, wobei jedes der Peptidfragmente mindestens eine Aminosäure oder einen Aminoalkohol in geschützter oder ungeschützter Form enthält und eines der beiden Fragmente die chelatbildende Gruppe enthält, wobei die Amidbindung in solcher Weise vorliegt, dass die gewünschte Aminosäuresequenz erhalten wird, und indem man gegebenenfalls anschliessend die Stufe a) durchführt, oder
c) indem man eine chelatbildende Gruppe und das gewünschte Somatostatinpeptid in geschützter oder ungeschützter Form auf solche Weise miteinander verknüpft,
dass die chelatbildende Gruppe an der gewünschten N-Aminogruppe des Peptids fixiert wird, und indem man anschliessend gegebenenfalls die Stufe a) durchführt, oder
d) indem man eine funktionelle Gruppe eines eine chelatbildende Gruppe tragenden ungeschützten oder geschützten Peptids entfernt oder in eine andere funktionelle Gruppe umwandelt, so dass ein anderes, eine chelatbildende Gruppe tragendes ungeschütztes oder geschütztes Peptid erhalten wird, und indem man im letztgenannten Fall die Stufe a) durchführt, oder
e) indem man ein mit einer chelatbildenden Gruppe modifiziertes Somatostatinpeptid, bei dem die Mercaptogruppen von Cys-Resten in freier Form vorliegen, oxidiert, so dass ein Analoges gebildet wird, in dem zwei Cys-Reste über eine S-S-Brücke miteinander verbunden sind und
indem man den auf diese Weise erhaltenen LIGANDEN in freier Form oder in Salzform gewinnt.
Die vorstehenden Reaktionen können in Analogie zu bekannten Verfahren durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in den folgenden Beispielen beschrieben sind, insbesondere die Verfahren a) und c). Wenn die chelatbildende Gruppe über eine Amidbindung gebunden wird, kann dies in analoger Weise zu den für die Amidbildung angewandten Verfahren durchgeführt werden. Sofern erwünscht, können bei diesen Reaktionen Schutzgruppen, die sich zur Verwendung in Peptiden oder für die gewünschten chelatbildenden Gruppen eignen, für funktionelle Gruppen verwendet werden, die an der Umsetzung nicht teilnehmen. Der Ausdruck "Schutzgruppe" umfasst auch ein Polymerharz mit funktionellen Gruppen.
Wenn es erwünscht ist, die chelatbildende Gruppe an die terminale N-Aminogruppe eines Peptids oder Peptidfragments, das als Ausgangsmaterial verwendet wird und das eine oder mehrere Seitenketten-Aminogruppen enthält, zu binden, können diese Seitenketten-Aminogruppen zweckmässigerweise mit einer Schutzgruppe, wie sie beispielsweise in der Peptidchemie eingesetzt werden, geschützt werden.
Wenn es erwünscht ist, die chelatbildende Gruppe an eine Seitenkette-Aminogruppe eines Peptids oder Peptidfragments, das als Ausgangsmaterial verwendet wird, zu binden und das Peptid eine freie terminale N-Aminogruppe aufweist, wird die letztgenannte Gruppe vorzugsweise mit einer Schutzgruppe geschützt.
Das Peptidfragment, das die chelatbildende Gruppe trägt und in Stufe b) eingesetzt wird, lässt sich herstellen, indem man das Peptidfragment, das mindestens eine Aminosäure oder einen Aminoalkohol in geschützter oder ungeschützter Form enthält, mit dem chelatbildenden Mittel umsetzt. Die Reaktion kann in Analogie zu Stufe c) durchgeführt werden.
Die chelatbildenden Gruppen der Formeln IV oder V können mit einem Peptid verknüpft werden, indem man ein chelatbildendes Mittel der Formeln IV min oder V min
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worin X eine zur Bildung einer Amidbindung fähige aktivierende Gruppe bedeutet, mit der N-Aminogruppe des Peptids umsetzt. Die Reaktion kann gemäss EP 247 866 A1 durchgeführt werden.
Das in Stufe c) verwendete chelatbildende Mittel kann bekannt sein oder in Analogie zu bekannten Verfahren hergestellt werden. Die verwendete Verbindung ist so beschaffen, dass sie die Einführung der gewünschten chelatbildenden Gruppe an das Somatostatinpeptid, z.B. einer Polyaminopolycarbonsäure gemäss den vorstehenden Angaben, eines Salzes oder Anhydrids davon, ermöglicht.
Wenn im vorstehenden Verfahren in den als Ausgangsmaterialien verwendeten Aminosäuren, Peptidfragmenten oder Peptiden die chelatbildende Gruppe über eine Brücken- oder Zwischengruppe an das Peptid gebunden ist, z.B. über einen Rest der Formel ( alpha 1) der vorstehenden Definition, lassen sich derartige Aminosäuren, Peptidfragmente oder Peptide herstellen, indem man auf herkömmliche Weise die entsprechenden Aminosäuren oder Peptide, die frei von Brücken- oder Zwischengruppen sind, mit einer entsprechenden Verbindung, die eine Brücke oder ein Zwischenstück ergibt, beispielsweise einer Säure oder einem reaktiven Säurederivat mit einem Gehalt an der Brücken- oder Zwischengruppe, z.B. einer Säure der Formel Z-R35-COOH oder einem reaktiven Säurederivat davon, wie einem aktiven Ester, umsetzt.
Beispiele für aktive Estergruppen oder Carboxylaktivierungsgruppen sind 4-Nitrophenyl, Pentachlorphenyl, Pentafluorphenyl, Succinimidyl oder 1-Hydroxybenzotriazolyl. Eine andere Möglichkeit besteht darin, das chelatbildende Mittel zuerst mit einer eine Brücken- oder Zwischengruppe ergebenden Verbindung umzusetzen, um die Brücken- oder Zwischengruppe einzuführen, und anschliessend auf herkömmliche Weise mit dem Peptid, dem Peptidfragment oder der Aminosäure umzusetzen.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN lassen sich auf herkömmliche Weise, z.B. durch Chromatographie, reinigen. Vorzugsweise enthalten die ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN weniger als 5 Gew.-% Peptide, die frei von chelatbildenden Gruppen sind.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN in freier Form oder in Form von pharmazeutisch verträglichen Salzen stellen wertvolle Verbindungen dar.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform lassen sich die ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN mit einem nachweisbaren Element komplexieren.
Demgemäss stellt die vorliegende Erfindung auch ERFINDUNGSGEMÄSSE LIGANDEN gemäss der vorstehenden Definition, die mit einem nachweisbaren Element komplexiert sind (nachstehend als ERFINDUNGSGEMÄSSE CHELATE bezeichnet) in freier Form oder in Salzform, sowie ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung für in vivo-diagnostische und therapeutische Behandlungen bereit.
Unter einem nachweisbaren Element ist ein beliebiges Element, vorzugsweise ein Metallion, zu verstehen, das eine Eigenschaft aufweist, die bei therapeutischen oder in vivo-diagnostischen Techniken nachweisbar ist, z.B. ein Metallion, das eine nachweisbare Strahlung aussendet oder ein Metallion, das zur Beeinflussung von NMR-Relaxationseigenschaften in der Lage ist.
Geeignete nachweisbare Metallionen sind beispielsweise Ionen von schweren Elementen und Seltenen Erdmetallen, wie sie beim CAT-Scanning (Computer axial tomography) verwendet werden, paramagnetische Ionen, z.B. Gd<3><+>, Fe<3><+>, Mn<2><+> und Cr<2><+>, fluoreszierende Metallionen, wie Eu<3><+>, und Radionuklide, z.B. gamma -emittierende Radionuklide, beta -emittierende Radionuklide, alpha -emittierende Radionuklide und Positronen-emittierende Radionuklide, z.B. <6><8>Ga.
Zu geeigneten gamma -emittierenden Radionukliden gehören solche, die sich für diagnostische Techniken eignen. Die gamma -emittierenden Radionuklide weisen vorteilhafterweise eine Halbwertszeit von 1 Stunde bis 40 Tagen, vorzugsweise von 5 Stunden bis 4 Tagen und insbesondere von 12 Stunden bis 3 Tagen auf. Beispiele hierfür sind von Gallium, Indium, Technetium, Ytterbium, Rhenium und Thallium abgeleitete Radionuklide, wie <6><7>Ga, <1><1><1>In, <99m>Tc, <1><6><9>Yb und <1><8><6>Re. Vorzugsweise wird das gamma -Radionuklid je nach dem Stoffwechsel des verwendeten ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN oder Somatostatinpeptids ausgewählt. Insbesondere wird der ERFINDUNGSGEMÄSSE LIGAND einer Chelatbildung mit einem gamma -Radionuklid unterzogen, dessen Halbwertszeit länger als die Halbwertszeit des Somatostatinpeptids am Tumor ist.
Weitere, für Abbildungszwecke geeignete Radionuklide sind Positronen emittierende Radionuklide, z.B. die vorstehend erwähnten.
Geeignete beta -emittierende Radionuklide sind solche, die sich für therapeutische Anwendungen eignen, z.B. <9><0>Y, <6><7>Cu, <1><8><6>Re, <1><8><8>Re, <1><6><9>Er, <1><2><1>Sn, <1><2><7>Te, <1><4><3>Pr, <1><9><8>Au, <1><0><9>Pd, <1><6><5>Dy, <3><2>p und <1><4><2>Pr. Das beta -Radionuklid weist vorteilhafterweise eine Halbwertszeit von 2,3 Stunden bis 14,3 Tagen und insbesondere von 2,3 bis 100 Stunden auf. Vorzugsweise wird das beta -emittierende Radionuklid so gewählt, dass seine Halbwertszeit länger als die Halbwertszeit des Somatostatinpeptids am Tumor ist.
Geeignete alpha -emittierende Radionuklide sind solche, wie sie für therapeutische Behandlungen verwendet werden, z.B. <2><1><1>At und <2><1><2>Bi.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE lassen sich herstellen, indem man den Liganden mit einer Verbindung, die ein entsprechendes nachweisbares Element ergibt, umsetzt, z.B. mit einem Metallsalz und vorzugsweise einem wasserlöslichen Salz. Die Reaktion kann in Analogie zu bekannten Verfahren durchgeführt werden, z.B. gemäss den Angaben von Perrin, Organic Ligand, Chemical Data, Series 22, NY Pergamon Press (1982); Krejcarit und Tucker, Biophys. Biochem. Res. Com., Bd. 77 (1977), Seite 581 und Wagner und Welch, J. Nucl. Med., Bd. 20 (1979), S. 428.
Vorzugsweise wird die Komplexierung des Liganden bei einem pH-Wert durchgeführt, bei dem der ERFINDUNGSGEMÄSSE LIGAND physiologisch stabil ist.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, das nachweisbare Element in der Lösung als einen Komplex mit einem intermediären chelatbildenden Mittel bereitzustellen, z.B. einem chelatbildenden Mittel, das einen Chelatkomplex bildet, der das Element beim physiologischen pH-Wert des LIGANDEN löslich macht, aber thermodynamisch weniger stabil als das Chelat ist.
Ein Beispiel für ein derartiges intermediäres chelatbildendes Mittel ist 4,5-Dihydroxy-1,3-benzol-disulfonsäure (Ti ron). In einem derartigen Verfahren tauscht das nachweisbare Element den Liganden aus.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE lassen sich auch herstellen, indem man ein mit dem nachweisbaren Element komplexiertes chelatbildendes Mittel und ein Somatostatinpeptid in geschützter oder ungeschützter Form miteinander verknüpft und gegebenenfalls mindestens eine vorhandene Schutzgruppe entfernt. Die gleiche Reaktion lässt sich mit einem chelatbildenden Mittel, das mit einem nicht-nachweisbaren Metallion komplexiert ist, durchführen, wobei dann im erhaltenen komplexierten Peptid das Metallion durch das gewünschte nachweisbare Element ersetzt werden kann.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE lassen sich auch herstellen, indem man ein mit dem nachweisbaren Element komplexiertes chelatbildendes Mittel und ein Somatostatinpeptidfragment, das mindestens eine Aminosäure in geschützter oder ungeschützter Form enthält, miteinander verknüpft und anschliessend die Peptidsynthese stufenweise fortsetzt, bis die endgültige Peptidsequenz erhalten ist, und gegebenenfalls mindestens eine Schutzgruppe, die vorliegt, entfernt. Statt mit dem nachweisbaren Element kann das chelatbildende Mittel mit einem nicht-nachweisbaren Metall komplexiert werden, und dieses Metall kann dann im erhaltenen komplexierten Somatostatinpeptid durch ein nachweisbares Element ersetzt werden.
Wenn die chelatbildende Gruppe über eine Brücken- oder Zwischengruppe an das Somatostatinpeptid gebunden ist, z.B. über einen Rest der vorstehend definierten Formel ( alpha 1), kann entweder das Somatostatinpeptid oder -peptidfragment oder das chelatbildende Mittel diese Brücken- oder Zwischengruppe tragen.
Die vorerwähnten Reaktionen können in Analogie zu bekannten Verfahren durchgeführt werden. Je nach der vorhandenen chelatbildenden Gruppe kann der Markierungswirkungsgrad 100% erreichen, so dass eine Reinigung nicht erforderlich ist. Radionuklide, z.B. Technetium-99m können in oxidierter Form verwendet werden, z.B. Tc-99m-Pertechnetat, das unter reduzierenden Verbindungen komplexiert werden kann.
Die vorerwähnten Reaktionen werden zweckmässigerweise unter Bedingungen durchgeführt, die eine Verunreinigung mit Spurenmetallen vermeiden. Vorzugsweise werden destilliertes, entionisiertes Wasser, ultrareine Reagentien, Radioaktivität von Chelatbildungsqualität und dgl. verwendet, um die Einflüsse von Spurenmetallen zu vermindern.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE können beispielsweise in freier Form oder in Salzform vorliegen. Zu den Salzen gehören Säureadditionssalze, z.B. mit organischen Säuren, polymeren Säuren oder anorganischen Säuren, wie Hydrochloride und Acetate, sowie Salzformen, die mit im Molekül vorliegenden Carbonsäuregruppen, die nicht an der Chelatbildung teilnehmen, erhältlich sind, z.B. Alkalimetallsalze, wie Natrium- oder Kaliumsalze oder substituierte oder unsubstituierte Ammoniumsalze.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze besitzen eine pharmazeutische Aktivität und eignen sich daher entweder als Abbildungsmittel, z.B. zur Sichtbarmachung von Somatostatin-Rezeptor-positiven Tumoren und Metastasen, wenn sie mit einem paramagnetischen, gamma -emittierenden Metallion oder einem Positronen emittierenden Radionuklid komplexiert sind, oder als Radiopharmazeutika zur in vivo-Behandlung von Somatostatin-Rezeptor-positiven Tumoren und Metastasen, wenn sie mit einem alpha - oder beta -Radionuklid komplexiert sind, wie durch Standardtests gezeigt.
Insbesondere besitzen die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE eine Affinität für Somatostatin-Rezeptoren, die durch Tumoren und Metastasen exprimiert oder überexprimiert werden, wie in Standard-in vitro-Bindungstests gezeigt.
Ein Somatostatin-Rezeptor-positiver Tumor aus dem menschlichen Magendarmtrakt wird einem Patienten entfernt, sofort auf Eis gelegt und innerhalb von maximal 30 Minuten auf -80 DEG C eingefroren. Zur späteren Autoradiographie wird dieses gefrorene Material in einem Kryostaten (Leitz 1720) in 10 mu m Schnitte aufgeschnitten, auf vorgereinigten Mikroskop-Objektträgern befestigt und mindestens 3 Tage bei -20 DEG C gelagert, um die Haftung des Gewebes am Objektträger zu verbessern. Die Schnitte werden in Tris-HCl-Puffer (50 millimolar, pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an CaCl2 (2 millimolar) und KCl (5 millimolar) mindestens 10 Minuten bei Umgebungstemperatur vorinkubiert und sodann 2 Minuten im gleichen Puffer ohne weitere Salzzugabe gewaschen.
Anschliessend werden die Schnitte 2 Stunden bei Umgebungstemperatur mit einem ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELAT in Tris-HCl-Puffer (170 millimolar, pH-Wert 7,4) mit einem Gehalt an Rinderserumalbumin (10 g/Liter), Bacitracin (40 mg/Liter) und MgCl2 (5 millimolar) zur Hemmung von endogenen Proteasen inkubiert. Die nichtspezifische Bindung wird bestimmt, indem man das entsprechende, nicht-markierte, nicht modifizierte Somatostatinpeptid in einer Konzentration von 1 mikromolar zusetzt. Inkubierte Schnitte werden zweimal 5 Minuten in kaltem Inkubationspuffer mit einem Gehalt an 0,25 g/Liter BSA gewaschen. Nach einer kurzen Eintauchzeit in destilliertes Wasser zur Entfernung von überschüssigen Salzen werden die Schnitte rasch getrocknet und auf [<3>H]-LKB-Filme gelegt.
Nach einer Belichtungszeit von etwa 1 Woche in Röntgenkassetten wird festgestellt, dass die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE, z.B. ein Radionuklid-CHELAT, zu sehr guten Ergebnissen bei der Markierung von Tumorgewebe ohne Markierung des umgebenden gesunden Gewebes führen, wenn sie in einer Konzentration von etwa 10<-><1><0> bis 10<-><3> m zugesetzt werden.
Die Affinität der ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE für Somatostatin-Rezeptoren lässt sich auch durch in vivo-Tests zeigen.
Ratten mit transplantierbaren exokrinen, pankreatischen Somatostatin-Rezeptor-positiven Tumoren werden mit einer intravenösen Injektion eines ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATS behandelt. Die Injektionsstelle ist die Penisvene. Unmittelbar nach der Verabreichung werden die Tiere auf den Kollimator einer gamma-Kamera gebracht. Die Radioaktivitätsverteilung wird zu verschiedenen Zeitpunkten aufgezeichnet. Die biologische Radioaktivitätsverteilung kann auch serienmässige Tötung einer Anzahl der auf diese Weise behandelten Ratten und durch Bestimmung der Organradioaktivität ermittelt werden.
Nach Verabreichung eines ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATS, z.B. Radionuklid-Chelats, z.B. eines gamma-emittierenden CHELATS, in einer Dosis von 1 bis 5 mu g/kg an mit 0,1 bis 2 mCi Radionuklid markiertem Liganden wird die Tumorstelle zusammen mit den Organen, in denen die Ausscheidung im wesentlichen stattfindet, nachweisbar.
Zum in vivo-Nachweis von Somatostatin-Rezeptor-positiven Tumoren oder Metastasen in einem Subjekt wird ein ERFINDUNGSGEMÄSSES CHELAT an das Subjekt verabreicht und die mit dem CHELAT markierten Rezeptoren lokalisiert.
ERFINDUNGSGEMÄSSE CHELATE zur Verwendung als in vivo-Nachweismittel sind CHELATE, die mit einem gamma-emittierenden Radionuklid, einem Positronen emittierenden Radionuklid oder einem paramagnetischen Metallion, wie beispielsweise vorstehend angegeben, komplexiert sind.
Die als Abbildungsmittel verwendeten ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE können parenteral, vorzugsweise intravenös, z.B. in Form von injizier baren Lösungen oder Suspensionen, vorzugsweise in einer einzelnen Injektion, verabreicht werden. Die geeignete Dosis hängt selbstverständlich beispielsweise von dem LIGANDEN und dem Typ des verwendeten nachweisbaren Elements, z.B. des Radionuklids, ab. Eine geeignete, zu injizierende Dosis liegt in dem Bereich, die eine Abbildung durch bekannte Photoscanning-Verfahren ermöglicht. Wird ein radioaktiv markiertes ERFINDUNGSGEMÄSSES CHELAT verwendet, kann es vorteilhaft sein, dieses in einer Dosis mit einer Radioaktivität von 0,1 bis 50 mCi, vorzugsweise von 0,1 bis 30 mCi und insbesondere von 0,1 bis 20 mCi zu verabreichen.
Ein indizierter Dosisbereich kann 1 bis 200 mu g LIGAND betragen, der mit 0,1 bis 50 mCi, vorzugsweise 0,1 bis 30 mCi, z.B. 3 bis 15 mCi, gamma -emittierendem Radionuklid, je nach dem verwendeten gamma -emittierenden Radionuklid, markiert ist. Beispielsweise ist es bei In bevorzugt, eine Radioaktivität im unteren Bereich zu verwenden, während bei Tc der Einsatz von Radioaktivität im oberen Bereich bevorzugt ist.
Der Anreicherung mit den CHELATEN an den Tumor erzeugenden Stellen können sich die entsprechenden Abbildungstechniken anschliessen, z.B. unter Verwendung einer nuklearmedizinischen Abbildungsausrüstung, z.B. einem Scanner, gamma -Kamera, rotierenden gamma -Kamera, die vorzugsweise jeweils mit einem Computer versehen sind; PET-Scanner (Positron emission tomography); MRI-Ausrüstung oder CAT-Scanning-Ausrüstung.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE, z.B. ein Grossteil der gamma -emittierenden Chelate werden im wesentlichen durch die Nieren ausgeschieden und reichern sich nicht in signifikantem Umfang in der Leber an.
Zur in vivo-Behandlung von Somatostatin-Rezeptor-positiven Tumoren und Metastasen bei einem Subjekt, das einer derartigen Behandlung bedarf, wird dem Sub jekt eine therapeutisch wirksame Menge eines ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATS verabreicht.
Bei den erfindungsgemässen Chelaten zur Verwendung für eine in vivo-Behandlung handelt es sich um die CHELATE, die mit einem alpha - oder beta -Radionuklid gemäss der vorstehenden Definition komplexiert sind.
Die für die Behandlung angewandten Dosen variieren selbstverständlich beispielsweise je nach dem zu behandelnden speziellen Zustand, z.B. dem Volumen des Tumors, dem verwendeten CHELAT, z.B. der Halbwertszeit des CHELATS im Tumor, und der gewünschten Therapie. Im allgemeinen wird die Dosis auf der Grundlage der Radioaktivitätsverteilung auf die einzelnen Organe und gemäss der beobachteten Zielaufnahme berechnet. Beispielsweise kann das CHELAT mit einem täglichen Dosisbereich mit einer Radioaktivität von 0,1 bis 3 mCi/kg Körpergewicht, z.B. 1 bis 3 mCi und vorzugsweise 1 bis 1,5 mCi/kg Körpergewicht verabreicht werden.
Ein indizierter täglicher Dosisbereich beträgt 1 bis 200 mu g LIGAND, markiert mit 0,1 bis 3 mCi/kg Körpergewicht, z.B. 0,1 bis 1,5 mCi/kg Körpergewicht an alpha - oder beta -emittierendem Radionuklid, zweckmässigerweise verabreicht in unterteilten Dosen bis zu 4 mal täglich.
Die alpha - oder beta -emittierenden ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE können auf beliebigen herkömmlichen Verabreichungswegen verabreicht werden, insbesondere parenteral, z.B. in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen. Sie können auch vorteilhafterweise durch Infusion verabreicht werden, z.B. durch eine Infusion von 30 bis 60 Minuten. Je nach der Tumorstelle werden sie so nahe wie möglich am Tumor verabreicht, z.B. mittels eines Katheters. Die gewählte Verabreichungsart kann von der Disso ziationsgeschwindigkeit des verwendeten CHELATS und der Ausscheidungsgeschwindigkeit abhängen.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE können in freier Form oder in pharmazeutisch verträglicher Form verabreicht werden. Derartige Salze lassen sich auf herkömmliche Weise herstellen und weisen eine Aktivität in der gleichen Grössenordnung wie die freien Verbindungen auf.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE können vorzugsweise kurz vor der Verabreichung an ein Subjekt hergestellt werden, d.h. die radioaktive Markierung mit dem gewünschten nachweisbaren Metallion, insbesondere mit dem gewünschten alpha -, beta - oder gamma -Radionuklid, kann kurz vor der Verabreichung durchgeführt werden.
Die ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE eignen sich zur Abbildung oder Behandlung von Tumoren, wie Hypophysentumoren, gastroenteropankreatischen Tumoren, Zentralnervensystemtumoren, Brusttumoren, Prostatatumoren, Ovarialtumoren oder Kolontumoren, kleinzelligem Lungenkrebs, Paragangliomen, Neuroblastomen, Pheochromocytomen, medullären Thyroidkarzinomen, Myelomen und dgl. sowie Metastasen davon.
Gemäss einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können die gamma -emittierenden ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE auch als Abbildungsmittel zur Bewertung der Nierenfunktion verwendet werden.
Es werden Gruppen von fünf Mäusen eingesetzt. Jede Maus erhält durch eine Schwanzvene eine intravenöse Injektion von 0,1 ml mit einem Gehalt an 1 mCi eines ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATS. Sodann werden die Mäuse zur Sammlung des ausgeschiedenen Urins in Stoffwechselkäfige gebracht. 10 oder 120 Minuten nach der Injektion werden die Harnröhren abgebunden und die Mäuse mit Chloroform betäubt. Die Abbildung des uro poetischen Systems wird unter Anwendung der üblichen Abbildungstechnik durchgeführt. Bei diesem Test verbessern die gamma -emittierenden ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATE die Abbildung der renalen Ausscheidung bei einer Verabreichung in einer Dosis von 0,1 bis 30 mCi.
Gemäss einem weiteren Aspekt der Erfindung wird folgendes bereitgestellt:
i. eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an einem ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln hierfür;
ii. eine pharmazeutische Zusammensetzung mit einem Gehalt an einem CHELAT gemäss der Erfindung in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch verträglichen Salzes zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägerstoffen oder Verdünnungsmitteln hierfür.
Derartige Zusammensetzungen lassen sich auf herkömmliche Weise zubereiten.
Eine erfindungsgemässe Zusammensetzung kann auch in getrennter Verpackung zusammen mit Anweisungen zum Vermischen des LIGANDEN mit dem Metallion und zur Verabreichung des erhaltenen CHELATS dargereicht werden. Sie kann auch in Form einer Doppelpackung, d.h. einer einzelnen Packung, die getrennte Einheitsdosierungen des LlGANDEN und des nachweisba ren Metallions enthält, zusammen mit Anweisungen zu deren Vermischung und zur Verabreichung des CHELATS dargereicht werden. Ein Verdünnungsmittel oder Trägerstoff kann in den Einheitsdosierungsformen vorliegen.
In den folgenden Beispielen sind sämtliche Temperaturen in DEG C angegeben und die [ alpha ]<2><0>D-Werte sind unkorrigiert. Folgende Abkürzungen werden verwendet:
Boc: tert.-Butoxycarbonyl
TFA: Trifluoressigsäure
DTPA: Diethylentriamin-pentaessigsäure
Beispiel 1:
EMI30.1
1,1 g DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys( epsilon -Boc)-Thr-Cys-Thr-ol in Form der freien Base (1 millimolar) werden in 5 Liter Dioxan/H2O 1/1 (Vol./Vol.) gelöst und mit 5 g NaHCO3 behandelt. 520 mg DTPA-dianhydrid wird langsam unter Rühren zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird weitere 30 Minuten gerührt und gefriergetrocknet. Der Rückstand wird in 250 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit konzentrierter HCl auf 2,5 eingestellt. Das ausgefallene Produkt wird abfiltriert, gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Nach Chromatographie an einer Kieselgelsäule werden folgende Produkte isoliert: 230 mg
EMI30.2
und 500 mg entsprechend dimerem
EMI30.3
3 ml TFA werden mit 200 mg
EMI30.4
vermischt. Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur wird das Gemisch mit Diisopropylether gefällt, abfiltriert und getrocknet. Der Rückstand wird über Duolite entsalzt und lyophilisiert. Man erhält 150 mg der Titelverbindung: [ alpha ]<2><0>D = -26,6 DEG (c = 1,95, %AcOH).
Das Ausgangsmaterial kann folgendermassen hergestellt werden:
a)
EMI31.1
2,25 g Di-tert.-butylpyrocarbonat, gelöst in 30 ml DMF, werden langsam bei Raumtemperatur zu einer Lösung von 10 g
EMI31.2
in 100 ml DMF getropft. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt und der Rückstand mit 200 ml Diisopropylether versetzt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit Diisopropylether gewaschen und getrocknet. Das Rohprodukt wird durch Chromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel: CH2Cl2/MeOH 9/1) gereinigt und sodann als weisses amorphes Pulver isoliert. [ alpha ]<2><0>D = 29,8 DEG (c = 1,28 in DMF).
Beispiel 2:
EMI31.3
Die gemäss Beispiel 1 erhaltene, das Zwischenprodukt
EMI31.4
enthaltende Fraktion wird auf die vorstehend für die entsprechende monomere Form beschriebene Weise behandelt. Nach dem Entfernen der Boc-Schutzgruppen erhält man die Titelverbindung:
[ alpha ]<2><0>D = -24,5 DEG (c = 0,55, 95 %AcOH).
Beispiel 3:
EMI31.5
a. 0,56 g
EMI31.6
0,5 mMol Fmoc- epsilon -Aminocapronsäure und 115 mg Hydroxybenzotriazol werden in 10 ml DMF gelöst und auf -30 DEG C gekühlt. Diese Lösung wird mit einer Lösung von 115 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 5 ml DMF (auf -10 DEG C gekühlt) versetzt.
Nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden, wobei sich das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmt, wird der erhaltene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat mit Wasser auf das 10-fache seines Volumens verdünnt. Das ausgefällte Reaktionsprodukt wird abfiltriert, gewaschen und über Phosphorpentoxid getrocknet. Das rohe Produkt wird ohne weitere Reinigung für die nächste Stufe eingesetzt.
b. Fmoc-Abspaltung
0,5 g rohes Produkt der Kupplungsstufe (a) werden 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 ml DMF/Piperidin 4/1 Vol./Vol. behandelt (klare Lösung) und anschliessend mit 100 ml Diisopropylether vermischt. Das Reaktionsprodukt, das dabei ausfällt, wird abfiltriert, gewaschen und getrocknet. Dieses rohe Produkt wird ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.
c. BOC-Abspaltung
300 mg des in (1.b) erhaltenen rohen Produkts werden 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 5 ml 100% TFA behandelt (vollständig gelöst) und anschliessend mit 50 ml Diisopropylether vermischt. Nach Zugabe von 2 ml HCl/Diethylether wird der erhaltene Niederschlag abfiltriert, gewaschen und unter Hochvakuum getrocknet.
Das Endprodukt wird chromatographisch an Kieselgel (CHCl3/MeOH/H2O/AcOH 7/3/0,5/0,5) unter anschliessender Entsalzung über Duolite (Gradient: H2O/AcOH 95/5)--- H2O/Dioxan/AcOH 45/50/5) gereinigt. Man erhält die Titelverbindung als Acetat (weisses Lyophilisat).
[ alpha ]<2><0>D = -32 DEG (c = 0,5, 95 %AcOH).
Die erhaltene Verbindung kann gemäss dem Verfahren der Beispiele 1 und 2 zur Umsetzung mit DTPA verwendet werden.
Beispiel 4:
Gemäss dem in den Beispielen 1 und 3 beschriebenen Verfahren lässt sich der folgende LIGAND herstellen:
EMI33.1
[ alpha ]<2><0>D = -14,8 DEG (c = 0,5, 95 %AcOH)
Beispiel 5:
EMI33.2
1 mg
EMI33.3
wird in 5 ml 0,01 m Essigsäure gelöst. Die erhaltene Lösung wird durch ein 0,22 mu Millex-GV-Filter gegeben und in 0,1 ml-Anteile aufgeteilt und bei -20 DEG C gelagert. <1><1><1>InCl3 (Amersham, 1 mCi/100 mu l) wird mit einem gleichen Volumen an 0,5 m Natriumacetat vorverdünnt, und eine Markierung wird durchgeführt, indem man den Ligand mit der InCl3-Lösung vermischt und bei Raumteperatur mässig homogenisiert.
HEPES-Puffer vom pH-Wert 7,4 wird sodann zur Herstellung einer 10<-><6> m Lösung zugesetzt.
Beispiel 6:
EMI33.4
<9><0>Y wird aus einem <9><0>Sr-<9><0>Y-Radionuklid-Generator erhalten. Die Bauweise des Generators, dessen Elution und die Umwandlung des [<9><0>Y]EDTA in den Acetatkomplex werden gemäss dem von M. Chinol und D.J. Hnatowich in J. Nucl. Med., Bd. 28 (1987), Seiten 1465-1470 beschriebenen Verfahren durchgeführt. 1 mg
EMI33.5
gelöst in 5 ml 0,01 m Essigsäure wird auf Raumtemperatur erwärmt und mit 1,0 mCi <9><0>Y in 50 mu l sterilem 0,5 m Acetat versetzt. Man lässt das Gemisch 30 Minuten bis 1 Stunde stehen, um eine möglichst gute Chelatbildung zu erreichen.
Eine Gruppe von ERFINDUNGSGEMÄSSEN LIGANDEN sind Somatostatinpeptide, z.B. Somatostatinanaloge, die mindestens an einer der Aminosäureeinheiten eine chelatbildende Gruppe enthalten, die über eine Amidbindung an die Aminogruppe gebunden sind, in freier Form oder in Salzform.
Eine Gruppe von ERFINDUNGSGEMÄSSEN CHELATEN sind die unmittelbar vorher erwähnten LIGANDEN, die mit einem nachweisbaren Element, z.B. einem Metallion, komplexiert sind, in freier Form oder in Salzform.
The present invention relates to polypeptides, processes for their preparation and pharmaceutical preparations containing these polypeptides. These compounds are useful as drugs, e.g. for the treatment of somatostatin receptor positive tumors or as an in vivo diagnostic imaging agent.
In recent years, a number of human tumors, e.g. Pituitary tumors, central nervous system tumors, breast tumors, gastro-enteropancreatic tumors and their metastases, a strong occurrence of somatostatin receptors has been demonstrated. Some of these tumors are small or slow-growing tumors that are difficult to pinpoint using conventional diagnostic methods.
In vitro visualization of somatostatin receptors was accomplished by autoradiography of tumor tissues using radioiodinated somatostatin or somatostatin analogs, e.g. [ <1> <2> <5> J-Tyr <1> <1>] -Somatostatin-14 (Taylor, J.E. et al., Life Science, Vol. 43 (1988), page 421) or [ <1> <2> <5> J-Tyr <3>] -SMS 201-995, also as [ <1> <2> <5> J] 204-090 (Reubi, JC et al., Brain Res., Vol. 406 (1987), page 891; Reubi, JC et al., J. Clin. Endocr. Metab., Vol. 65 (1987), page 1127; Reubi, JC et al., Cancer Res., Vol. 47 (1987), page 551; Reubi, JC et al., Cancer Res., Vol. 47 (1987), page 5758).
Therapeutically valuable new somatostatin peptides that can be labeled for in vivo diagnostic and therapeutic applications have now been found.
According to the invention, a somatostatin peptide is provided which carries at least one chelating group for a detectable element, which chelating group is linked to an amino group of the peptide and which amino group has no significant binding affinity for somatostatin receptors.
These compounds are hereinafter referred to as "LIGANDS OF THE INVENTION". They have a chelating group which is suitable for reaction with a detectable element, e.g. a radionuclide, an X-ray opaque element or a paramagnetic ion, are able to form a complex and which are also able to bind with somatostatin receptors which are expressed or overexpressed by tumors or metastases, for example.
The chelating group is linked to the amino group of the peptide via a covalent bond.
The chelating group is preferably attached to the terminal N-amino group of the somatostatin peptide.
According to the invention the chelating group can be bound either directly or indirectly, e.g. via an intermediate group to the amino group of the somatostatin peptide.
One group of LIGANDS is the one in which the chelating group is directly attached to the amino group of the somatostatin peptide.
Another group of LIGANDS is the one in which the chelating group is linked indirectly to the amino group of the somatostatin peptide via a bridge or intermediate group.
The chelating group is preferably bound to the peptide via an amide bond.
The term "somatostatin peptides" encompasses naturally occurring somatostatin (tetradecapeptide) and their analogs or derivatives.
The term “derivatives or analogs” used here means any straight-chain or cyclic polypeptides which are derived from the naturally occurring tetradecapeptide somatostatin, one or more amino acid units being omitted and / or replaced by one or more amino acid residues and / or wherein one or more functional groups are replaced by one or more other functional groups and / or one or more groups are replaced by one or more other isosteric groups. In general, the expression encompasses all modified derivatives of a biologically active peptide which has a qualitatively similar effect to that of the unmodified somatostatin peptide, that is to say, for example, bind to somatostatin receptors and reduce hormone secretion.
Cyclic, bridge cyclic and straight chain somatostatin analogs are known compounds. These compounds and their preparation are described, for example, in European patent publications EP-A-1 295; 29,579; 215 171; 203 031; 214 872; 298 732; and 277,419.
Preferred ligands according to the invention are those which are derived from the following somatostatin analogs:
A. Analogs of Formula I.
EMI4.1
wherein A is C1-2-alkyl, C7-10-phenylalkyl or a group of the formula RCO-, where
i) R is hydrogen, C1-11-alkyl, phenyl or C7-10-phenylalkyl, or
ii) RCO-
a) an L- or D-phenylalanine residue which is optionally ring-substituted by F, Cl, Br, NO2, NH2, OH, C1-3-alkyl and / or C1-3-alkoxy;
;
b) the remainder of a natural or synthetic alpha-amino acid which deviates from the above definition a), or a corresponding D-amino acid or
c) denotes a dipeptide residue in which the individual amino acid residues are identical or different and are selected from the amino acid residues defined under a) and / or b) above,
where the alpha-amino group of amino acid residues a) and b) and the N-terminal amino group of dipeptide residues c) are optionally mono- or di-C1-12-alkylated or substituted by C1-8-alkanoyl,
A min is hydrogen, C1-12-alkyl or C7-10-phenylalkyl,
Y1 and Y2 together form a direct bond or the radicals Y1 and Y2 each independently represent hydrogen or a radical of the formulas (1) to (5)
EMI5.1
wherein
Ra means methyl or ethyl,
Rb represents hydrogen, methyl or ethyl,
m is an integer from 1 to 4,
n is an integer from 1 to 5,
Rc means (C1-6) alkyl,
Rd denotes the substituent bonded to the alpha carbon atom of a natural or synthetic alpha-amino acid (including hydrogen),
Re (C1-5) alkyl means
Ra min and Rb min independently of one another are hydrogen, methyl or ethyl,
R8 and R9 independently of one another are hydrogen, halogen, (C1-3) alkyl or (C1-3) alkoxy,
p is 0 or 1,
q is 0 or 1 and
r is 0, 1 or 2,
B denotes -Phe-, which is preferably ring-substituted by halogen, NO2, NH2, OH, C1-3-alkyl and / or C1-3-alkoxy (including pentafluoroalanine), or beta -naphthyl-Ala,
C (L) -Trp- or (D) -Trp- means
which are optionally alpha-N-methylated and optionally substituted on the benzene ring by halogen, NO2, NH2, OH, C1-3-alkyl and / or C1-3-alkoxy,
D Lys, Lys in which the side chain in the beta position contains O or S, gamma F-Lys or delta F-Lys, optionally alpha-N-methylated, or denotes a 4-aminocyclohexylAla or 4-aminocyclohexylGly radical,
E means Thr, Ser, Val, Phe, Ile or an aminoisobutyric acid or aminobutyric acid residue,
G a rest of the formulas
EMI6.1
means where
R7 represents hydrogen or C1-3 alkyl,
R10 denotes hydrogen or the rest of a physiologically compatible, physiologically hydrolyzable ester,
R11 denotes hydrogen, C1-3-alkyl, phenyl or C7-10-phenylalkyl,
R12 denotes hydrogen, C1-3-alkyl or a group of the formula -CH (R13) -X1,
R13 denotes CH2OH, - (CH2) 2-OH, - (CH2) 3-OH or -CH (CH3) OH, or represents the substituent (including hydrogen) bonded to the alpha carbon atom of a natural or synthetic alpha-amino acid, and
X1 is a group of the formula -COOR7, -CH2OR10 or
EMI7.1
means what
R7 and R10 have the meaning defined above,
R14 is hydrogen or C1-3 alkyl and
R15 is hydrogen, C1-3-alkyl, phenyl or C7-10-phenylalkyl and
R16 represents hydrogen or hydroxy,
with the proviso that
when R12 is -CH (R13) -X1, R11 is hydrogen or methyl,
wherein the residues B, D and E have the L configuration and the residues in the 2- and 7-position and any residues Y1 4) and Y2 4) each independently have the (L) or (D) configuration.
The meanings of A and A min in formula I are preferably chosen so that the compound contains a terminal -NH group which can be linked to a chelating agent.
In the compounds of the formula I, the following meanings are preferred, either individually or in any combination or sub-combination:
1. A is C7-10-phenylalkyl, especially phenethyl, or a group of the formula RCO. A is preferably a group of the formula RCO.
1.1. R is preferably C1-11-alkyl or C7-10-phenylalkyl, in particular C7-10-phenylalkyl, very particularly phenethyl or RCO has the meanings a), b) or c).
1.2. If RCO has the meanings a), b) or c), the alpha-amino group of the amino acid residues a) and b) and the N-terminal amino group of the dipeptide residues c) are preferably non-alkylated or mono-C1-12-alkylated, in particular -C1-8-alkylated and especially -methylated. In particular, the N-end group is not alkylated.
1.3. If RCO has the meaning a), it is preferably a min) an L- or D-phenylalanine or tyrosine residue, which is optionally mono-N-C1-12-alkylated. A min) is preferably an L- or D-phenylalanine radical.
1.4. If RCO has the meaning b) or c), the defined radical is preferably lipophilic. Preferred residues b) are thus b min) alpha-amino acid residues with a hydrocarbon side chain, e.g. Alkyl with 3, preferably 4 or more carbon atoms, e.g. with up to 7 carbon atoms, naphthylmethyl or heteroaryl, e.g. a 3- (2- or 1-naphthyl) alanine, pyridylmethyl or tryptophan residue, these residues having the L or D configuration. Preferred residues c) are dipeptide residues in which the individual amino acid residues are identical or different and are selected from the residues defined under a min) and b min) above.
An example of a radical c) is the 3- (2-naphthyl) alanine radical.
1.5. In particular, RCO has the meaning a) and very particularly the meaning a min).
2. B means B min, where B min is Phe or Tyr.
3. C means C min, where C min (D) is Trp.
4. D means D min, where D min means Lys, MeLys or Lys (epsilon -Me), in particular Lys.
5. E means E min, where E min means Val or Thr, in particular Thr.
6. G means G min, where G min is a group of the formula
EMI9.1
and in particular a group of the formula
EMI9.2
means (in which case R11 = H or CH3). In the latter case, the residue -CH (R13) -X1 preferably has the L configuration.
6.1. R11 is preferably hydrogen.
6.2. As a substituent attached to the alpha carbon atom of a natural amino acid (ie of the formula H2N-CH (R13) -COOH), R13 preferably denotes -CH2OH, -CH (CH3) -OH, isobutyl or butyl or R13 denotes - (CH2) 2- OH or - (CH2) 3-OH. In particular, it has the meaning -CH2OH or -CH (CH3) OH.
6.3. X1 preferably denotes a group of the formula
EMI9.3
or -CH2-OR10, in particular of the formula -CH2-OR10, and R10 preferably denotes hydrogen or has the meaning given below under 7. In particular, R10 means hydrogen.
The following individual compounds serve as explanations for compounds of the formula I:
EMI10.1
B. Analogs of Formula II
EMI10.2
[see. Vale et al., Metabolism, Vol. 27, Supp. 1, (1978) page 139]
EMI10.3
(see EP-A 200 188).
The content of all of the above documents, including the specific connections, are made the subject of the present description.
LIGANDS derived from are particularly preferred
EMI11.1
Suitable chelating groups are physiologically compatible chelating groups which are capable of forming a complex with a detectable element. The chelating group preferably has an essentially hydrophilic character. Examples of chelating groups are iminodicarboxyl groups, polyaminopolycarboxyl groups, e.g.
those derived from non-cyclic ligands, such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA), ethylene glycol-O, O min -bis- (2-aminoethyl) -N, N, N min, N min -tetraacetic acid (EGTA ), N, N min-bis (hydroxybenzyl) ethylenediamine-N, N min -diacetic acid (HBED) and triethylenetetramine hexaacetic acid (TTHA), those derived from substituted EDTA or DPTA, such as p-isothiocyanatobenzyl-EDTA or DTPA, those derived from macrocyclic ligands such as 1,4,7,10-tetra-azacyclododecane-N, N min, N min min, N min min min -tetraacetic acid (DOTA) and 1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane -N, N min, N min min, N min min min -tetraacetic acid (TETA), those which are derived from N-substituted or C-substituted macrocyclic amines, including cyclams, such as those in EP 304 780 A1 and in Compounds disclosed in WO 89/01 476-A,
Groups of formula IV or V
EMI11.2
wherein
the radicals R1, R2 and R3 each independently represent C1-6-alkyl, C6-8-aryl or C7-9-arylalkyl, which are each optionally substituted by OH, C1-4-alkoxy, COOH or SO3H,
n min has the value 1 or 2,
i is an integer from 2 to 6,
TT independently of one another denote alpha or beta amino acids which are linked to one another via amide bonds,
Groups derived from bisaminothiol derivatives, e.g. Compounds of formula VI
EMI12.1
wherein
the individual radicals R20, R21, R22 and R23 each independently represent hydrogen or C1-4-alkyl,
X2 represents a group capable of reacting with the N-amino group of the peptide, and
m min has the value 2 or 3,
Groups derived from dithiasemicarbazone derivatives, e.g. Compounds of formula VII
EMI12.2
wherein
X2 has the meaning defined above,
Groups derived from propylene amine oxime derivatives, e.g. Compounds of formula VIII
EMI13.1
wherein
the individual radicals R24, R25, R26, R27, R28 and R29 independently of one another are hydrogen or C1-4-alkyl, and
X2 and m min have the meaning defined above,
Groups derived from diamide dimercaptides, e.g. Compounds of formula IX
EMI13.2
wherein
X3 represents a divalent radical which is optionally substituted and has a group which is capable of reacting with the N-amino group of the peptide, e.g. C1-4 alkylene or phenylene with a group X2, and
Y5 is hydrogen or CO2R30, where R30 is C1-4 alkyl,
or groups derived from phorphyrins, e.g. N-Benzyl-5,10,15,20-tetrakis (4-carboxyphenyl) porphine or TPP with an X2 group as defined above.
Aryl preferably means phenyl. Arylalkyl preferably means benzyl.
Examples of X2 include radicals of the formula - (X4) n min min -X5, where X4 is C1-6 alkylene or C1-6 alkylene, which is optionally bonded to the carbon atom via an oxygen atom or -NH-, n min min 0 or 1 and X5 -NCS, a carboxy group or a functional derivative thereof, for example an acid halide, anhydride or hydrazide. X2 is bound to one of the carbon atoms of - [CH2] m min - or = CH-CH = with the replacement of a hydrogen atom.
The chelating group can be either directly or indirectly linked to the N-amino group of the somatostatin peptide. If bound indirectly, it is preferably linked via a bridge or intermediate group, e.g. a group of the formula (alpha 1)
Z-R35-CO- (alpha 1)
in which
R35 means C1-11-alkylene, C2-11-alkenylene or -CH (R min) -, where R min means the residue bound in alpha to the residue of a natural or synthetic alpha-amino acid, e.g. Hydrogen, C1-11 alkyl, benzyl, optionally substituted benzyl, naphthylmethyl or pyridylmethyl, and
Z represents a functional radical which is capable of covalent reaction with the chelating agent.
Z can mean, for example, a radical which can form an ether, ester or amide bond with the chelating group. Z is preferably amino.
The chelating groups, if they contain carboxy, -SO3H and / or amino groups, can be in free form or in salt form.
Preferred chelating groups are those derived from polyaminopolycarboxylic acids, e.g. those derived from EDTA, DTPA, DOTA, TETA or substituted EDTA or DTPA. Chelating groups derived from DTPA are particularly preferred.
In the LIGANDS OF THE INVENTION, if the chelating group is a polyfunctional group, it can be either with a single somatostatin peptide molecule or with more than one somatostatin peptide molecule, e.g. with two somatostatin peptide molecules.
The ligands of the invention can be present, for example, in free form or in salt form. Acid addition salts, e.g. with organic acids, polymeric acids or inorganic acids such as hydrochlorides and acetates, as well as salt forms which are obtainable with carboxylic acid or sulfonic acid groups present in the chelating group, e.g. Alkali metal salts such as sodium or potassium salts, or substituted or unsubstituted ammonium salts.
The present invention also encompasses a method for producing the ligands of the invention. They can be produced in analogy to known processes.
The ligands according to the invention can be produced, for example, as follows:
a) by removing at least one protective group contained in a somatostatin peptide carrying a chelating group, or
b) by linking two peptide fragments to one another, each of the peptide fragments containing at least one amino acid or an amino alcohol in protected or unprotected form and one of the two fragments containing the chelating group, the amide bond being present in such a way that the desired amino acid sequence is obtained, and by subsequently carrying out step a), or
c) by linking a chelating group and the desired somatostatin peptide in protected or unprotected form in such a way,
that the chelating group is fixed to the desired N-amino group of the peptide, and by then optionally carrying out step a), or
d) by removing a functional group of an unprotected or protected peptide carrying a chelating group or converting it into another functional group so that another unprotected or protected peptide carrying a chelating group is obtained, and by in the latter case step a ) performs, or
e) by oxidizing a somatostatin peptide modified with a chelating group, in which the mercapto groups of Cys residues are in free form, so that an analog is formed in which two Cys residues are connected to one another via an S-S bridge, and
by obtaining the LIGANDEN obtained in this way in free form or in salt form.
The above reactions can be carried out in analogy to known methods, such as are described, for example, in the examples below, in particular methods a) and c). If the chelating group is bound via an amide bond, this can be carried out in a manner analogous to the processes used for the amide formation. If desired, protective groups which are suitable for use in peptides or for the desired chelating groups can be used for functional groups which do not participate in the reaction in these reactions. The term "protecting group" also includes a polymer resin with functional groups.
If it is desired to bind the chelating group to the terminal N-amino group of a peptide or peptide fragment which is used as a starting material and which contains one or more side chain amino groups, these side chain amino groups can conveniently be provided with a protective group such as, for example used in peptide chemistry are protected.
If it is desired to bind the chelating group to a side chain amino group of a peptide or peptide fragment used as a starting material and the peptide has a free terminal N-amino group, the latter group is preferably protected with a protecting group.
The peptide fragment which carries the chelating group and is used in step b) can be prepared by reacting the peptide fragment which contains at least one amino acid or an amino alcohol in protected or unprotected form with the chelating agent. The reaction can be carried out in analogy to step c).
The chelating groups of formulas IV or V can be linked to a peptide by using a chelating agent of formulas IV min or V min
EMI18.1
wherein X represents an activating group capable of forming an amide bond with the N-amino group of the peptide. The reaction can be carried out in accordance with EP 247 866 A1.
The chelating agent used in step c) can be known or can be prepared in analogy to known processes. The compound used is designed to introduce the desired chelating group to the somatostatin peptide, e.g. a polyaminopolycarboxylic acid as described above, a salt or anhydride thereof.
In the above process, in the amino acids, peptide fragments or peptides used as starting materials, the chelating group is linked to the peptide via a bridge or intermediate group, e.g. Via a residue of the formula (alpha 1) of the above definition, such amino acids, peptide fragments or peptides can be prepared by conventionally reacting the corresponding amino acids or peptides which are free of bridging or intermediate groups with a corresponding compound which is a Bridge or an intermediate piece results, for example an acid or a reactive acid derivative containing the bridge or intermediate group, for example an acid of the formula Z-R35-COOH or a reactive acid derivative thereof, such as an active ester.
Examples of active ester groups or carboxy activation groups are 4-nitrophenyl, pentachlorophenyl, pentafluorophenyl, succinimidyl or 1-hydroxybenzotriazolyl. Another possibility is to first react the chelating agent with a bridging or intermediate group to introduce the bridging or intermediate group, and then to react with the peptide, peptide fragment or amino acid in a conventional manner.
The ligands of the invention can be prepared in a conventional manner, e.g. by chromatography. The ligands according to the invention preferably contain less than 5% by weight of peptides which are free of chelating groups.
The LIGANDS OF THE INVENTION in free form or in the form of pharmaceutically acceptable salts are valuable compounds.
According to a further embodiment, the LIGANDS OF THE INVENTION can be complexed with a detectable element.
Accordingly, the present invention also provides inventive ligands as defined above, which are complexed with a detectable element (hereinafter referred to as inventive chelates) in free form or in salt form, as well as a method for their preparation and their use for in vivo diagnostic and therapeutic Treatments ready.
A detectable element is to be understood to mean any element, preferably a metal ion, which has a property which is detectable in therapeutic or in vivo diagnostic techniques, e.g. a metal ion that emits detectable radiation or a metal ion that is capable of influencing NMR relaxation properties.
Suitable detectable metal ions are, for example, ions of heavy elements and rare earth metals as used in CAT scanning (computer axial tomography), paramagnetic ions, e.g. DG <3> <+>, Fe <3> <+>, Mn <2> <+> and Cr <2> <+>, fluorescent metal ions, such as Eu <3> <+>, and radionuclides, e.g. gamma-emitting radionuclides, beta-emitting radionuclides, alpha-emitting radionuclides and positron-emitting radionuclides, e.g. <6> <8> Ga.
Suitable gamma-emitting radionuclides include those that are suitable for diagnostic techniques. The gamma-emitting radionuclides advantageously have a half-life of 1 hour to 40 days, preferably 5 hours to 4 days and in particular 12 hours to 3 days. Examples of these are radionuclides derived from gallium, indium, technetium, ytterbium, rhenium and thallium, such as <6> <7> Ga, <1> <1> <1> In, <99m> Tc, <1> <6> <9> Yb and <1> <8> <6> Re. The gamma radionuclide is preferably selected depending on the metabolism of the ligand or somatostatin peptide used according to the invention. In particular, the ligand according to the invention is subjected to chelation with a gamma -radionuclide, the half-life of which is longer than the half-life of the somatostatin peptide on the tumor.
Other radionuclides suitable for imaging purposes are positron emitting radionuclides, e.g. those mentioned above.
Suitable beta-emitting radionuclides are those which are suitable for therapeutic applications, e.g. <9> <0> Y, <6> <7> Cu, <1> <8> <6> Re, <1> <8> <8> Re, <1> <6> <9> He <1> <2> <1> Sn, <1> <2> <7> Te, <1> <4> <3> Pr, <1> <9> <8> Au, <1> <0> <9> Pd, <1> <6> <5> Dy, <3> <2> p and <1> <4> <2> Pr. The beta radionuclide advantageously has a half-life of 2.3 hours to 14.3 days and in particular of 2.3 to 100 hours. The beta-emitting radionuclide is preferably selected such that its half-life is longer than the half-life of the somatostatin peptide on the tumor.
Suitable alpha-emitting radionuclides are those used for therapeutic treatments, e.g. <2> <1> <1> At and <2> <1> <2> Bi.
The chelates according to the invention can be prepared by reacting the ligand with a compound which gives a corresponding detectable element, e.g. with a metal salt and preferably a water soluble salt. The reaction can be carried out in analogy to known methods, e.g. according to Perrin, Organic Ligand, Chemical Data, Series 22, NY Pergamon Press (1982); Krejcarit and Tucker, Biophys. Biochem. Res. Com., Vol. 77 (1977), page 581 and Wagner and Welch, J. Nucl. Med., Vol. 20 (1979), p. 428.
The complexation of the ligand is preferably carried out at a pH value at which the ligand according to the invention is physiologically stable.
Another possibility is to provide the detectable element in the solution as a complex with an intermediate chelating agent, e.g. a chelating agent that forms a chelate complex that solubilizes the element at the physiological pH of the LIGAND, but is less thermodynamically stable than the chelate.
An example of such an intermediate chelating agent is 4,5-dihydroxy-1,3-benzene-disulfonic acid (Ti ron). In such a method, the detectable element exchanges the ligand.
The CHELATES OF THE INVENTION can also be produced by linking a chelating agent complexed with the detectable element and a somatostatin peptide in protected or unprotected form and, if appropriate, removing at least one protective group present. The same reaction can be carried out with a chelating agent complexed with an undetectable metal ion, in which case the metal ion in the complexed peptide obtained can be replaced by the desired detectable element.
The CHELATES OF THE INVENTION can also be prepared by linking a chelating agent complexed with the detectable element and a somatostatin peptide fragment which contains at least one amino acid in protected or unprotected form, and then continuing the peptide synthesis step by step until the final peptide sequence is obtained, and optionally at least one protecting group present is removed. Instead of the detectable element, the chelating agent can be complexed with an undetectable metal, and this metal can then be replaced by a detectable element in the complexed somatostatin peptide obtained.
When the chelating group is linked to the somatostatin peptide via a bridge or intermediate group, e.g. Via a residue of the formula (alpha 1) defined above, either the somatostatin peptide or peptide fragment or the chelating agent can carry this bridging or intermediate group.
The aforementioned reactions can be carried out in analogy to known methods. Depending on the chelating group present, the labeling efficiency can reach 100%, so that cleaning is not necessary. Radionuclides, e.g. Technetium-99m can be used in oxidized form, e.g. Tc-99m pertechnetate that can be complexed with reducing compounds.
The above-mentioned reactions are expediently carried out under conditions which avoid contamination with trace metals. Preferably, distilled, deionized water, ultrapure reagents, chelating quality radioactivity and the like are used to reduce the effects of trace metals.
The CHELATES OF THE INVENTION can be present, for example, in free form or in salt form. The salts include acid addition salts, e.g. with organic acids, polymeric acids or inorganic acids such as hydrochlorides and acetates, as well as salt forms which are obtainable with carboxylic acid groups present in the molecule which do not participate in the chelation, e.g. Alkali metal salts, such as sodium or potassium salts or substituted or unsubstituted ammonium salts.
The chelates according to the invention and their pharmaceutically acceptable salts have a pharmaceutical activity and are therefore suitable either as imaging agents, e.g. to visualize somatostatin receptor-positive tumors and metastases when complexed with a paramagnetic, gamma-emitting metal ion or a positron-emitting radionuclide, or as radiopharmaceuticals for in vivo treatment of somatostatin receptor-positive tumors and metastases if they are complexed with an alpha or beta radionuclide as shown by standard tests.
In particular, the CHELATES OF THE INVENTION have an affinity for somatostatin receptors which are expressed or overexpressed by tumors and metastases, as shown in standard in vitro binding tests.
A somatostatin receptor positive tumor from the human gastrointestinal tract is removed from a patient, immediately placed on ice and frozen to -80 ° C within a maximum of 30 minutes. For later autoradiography, this frozen material is cut into 10 μm sections in a cryostat (Leitz 1720), attached to pre-cleaned microscope slides and stored at -20 ° C. for at least 3 days in order to improve the adhesion of the tissue to the slide. The sections are preincubated in Tris-HCl buffer (50 millimolar, pH 7.4) containing CaCl2 (2 millimolar) and KCl (5 millimolar) at ambient temperature for at least 10 minutes and then in the same buffer for 2 minutes without further Added salt washed.
The sections are then carried out for 2 hours at ambient temperature using a CHELATE OF THE INVENTION in Tris-HCl buffer (170 millimolar, pH 7.4) containing bovine serum albumin (10 g / liter), bacitracin (40 mg / liter) and MgCl2 (5 millimolar) to inhibit endogenous proteases. Non-specific binding is determined by adding the corresponding, unlabeled, unmodified somatostatin peptide in a concentration of 1 micromolar. Incubated sections are washed twice in cold incubation buffer containing 0.25 g / liter BSA for 5 minutes. After a short immersion in distilled water to remove excess salts, the sections are quickly dried and placed on [ <3> H] -LKB films laid.
After an exposure time of approximately 1 week in X-ray cassettes, it is found that the CHELATES OF THE INVENTION, e.g. a radionuclide CHELATE, to give very good results when labeling tumor tissue without labeling the surrounding healthy tissue when at a concentration of about 10 <-> <1> <0> to 10 <-> <3> m can be added.
The affinity of the CHELATES OF THE INVENTION for somatostatin receptors can also be demonstrated by in vivo tests.
Rats with transplantable exocrine, pancreatic somatostatin receptor positive tumors are treated with an intravenous injection of a chelate according to the invention. The injection site is the penile vein. Immediately after administration, the animals are placed on the collimator of a gamma camera. The radioactivity distribution is recorded at different times. The biological radioactivity distribution can also be determined by serial killing of a number of the rats treated in this way and by determining the organ radioactivity.
After administration of a CHELATE OF THE INVENTION, e.g. Radionuclide chelates, e.g. a gamma-emitting CHELATS, in a dose of 1 to 5 mu g / kg of ligand labeled with 0.1 to 2 mCi radionuclide, the tumor site can be detected together with the organs in which the excretion essentially takes place.
For the in vivo detection of somatostatin receptor-positive tumors or metastases in a subject, a CHELATE OF THE INVENTION is administered to the subject and the receptors labeled with the CHELATE are localized.
CHELATES OF THE INVENTION for use as in vivo detection agents are CHELATES complexed with a gamma-emitting radionuclide, a positron-emitting radionuclide or a paramagnetic metal ion, such as those given above.
The CHELATES OF THE INVENTION used as imaging agents can be parenterally, preferably intravenously, e.g. in the form of injectable solutions or suspensions, preferably in a single injection. The appropriate dose will of course depend, for example, on the LIGAND and the type of detectable element used, e.g. of radionuclide. A suitable dose to be injected is in the range which enables imaging by known photoscanning methods. If a radioactively labeled CHELATE OF THE INVENTION is used, it may be advantageous to administer it in a dose with a radioactivity of 0.1 to 50 mCi, preferably 0.1 to 30 mCi and in particular 0.1 to 20 mCi.
An indexed dose range can be 1 to 200 µg LIGAND, which is 0.1 to 50 mCi, preferably 0.1 to 30 mCi, e.g. 3 to 15 mCi, gamma-emitting radionuclide, depending on the gamma-emitting radionuclide used, is marked. For example, in In it is preferred to use radioactivity in the lower range, while in Tc it is preferred to use radioactivity in the upper range.
The corresponding imaging techniques can be followed by the enrichment with the CHELATES at the tumor-producing sites, e.g. using nuclear medical imaging equipment, e.g. a scanner, gamma camera, rotating gamma camera, which are preferably each provided with a computer; PET scanner (positron emission tomography); MRI equipment or CAT scanning equipment.
The CHELATES OF THE INVENTION, e.g. A large part of the gamma-emitting chelates are essentially excreted by the kidneys and do not accumulate significantly in the liver.
For the in vivo treatment of somatostatin receptor-positive tumors and metastases in a subject in need of such treatment, the subject is administered a therapeutically effective amount of an inventive chelate.
The chelates according to the invention for use in an in vivo treatment are the CHELATES which are complexed with an alpha or beta radionuclide as defined above.
The doses used for the treatment of course vary, for example, depending on the particular condition to be treated, e.g. the volume of the tumor, the CHELATE used, e.g. the half-life of the CHELATS in the tumor, and the desired therapy. In general, the dose is calculated based on the radioactivity distribution among the individual organs and according to the observed target uptake. For example, the CHELATE can be administered in a daily dose range with a radioactivity of 0.1 to 3 mCi / kg body weight, e.g. 1 to 3 mCi and preferably 1 to 1.5 mCi / kg body weight are administered.
An indicated daily dose range is 1 to 200 mu g LIGAND, marked with 0.1 to 3 mCi / kg body weight, e.g. 0.1 to 1.5 mCi / kg body weight of alpha or beta emitting radionuclide, conveniently administered in divided doses up to 4 times a day.
The alpha or beta emitting CHELATES OF THE INVENTION can be administered by any conventional route of administration, particularly parenterally, e.g. in the form of injectable solutions or suspensions. They can also advantageously be administered by infusion, e.g. by an infusion of 30 to 60 minutes. Depending on the tumor site, they are administered as close as possible to the tumor, e.g. using a catheter. The mode of administration chosen may depend on the rate of dissociation of the CHELATS used and the rate of excretion.
The chelates according to the invention can be administered in free form or in pharmaceutically acceptable form. Such salts can be prepared in a conventional manner and have an activity of the same order of magnitude as the free compounds.
The chelates of the invention may preferably be prepared just prior to administration to a subject, i.e. the radioactive labeling with the desired detectable metal ion, in particular with the desired alpha, beta or gamma radionuclide, can be carried out shortly before the administration.
The CHELATES OF THE INVENTION are suitable for imaging or treatment of tumors such as pituitary tumors, gastroenteropancreatic tumors, central nervous system tumors, breast tumors, prostate tumors, ovarian tumors or colon tumors, small-cell lung cancer, paragangliomas, neuroblastomas, meta-tumors, and pheochromomenomyroidomas thereof.
According to a further embodiment of the invention, the gamma-emitting CHELATES OF THE INVENTION can also be used as imaging agents for evaluating kidney function.
Groups of five mice are used. Each mouse receives an intravenous injection of 0.1 ml containing 1 mCi of an inventive chelate through a tail vein. The mice are then placed in metabolic cages to collect the excreted urine. 10 or 120 minutes after the injection, the urethra is tied off and the mice are anesthetized with chloroform. The mapping of the uro-poetic system is carried out using the usual mapping technique. In this test, the gamma-emitting CHELATES OF THE INVENTION improve the imaging of renal excretion when administered in a dose of 0.1 to 30 mCi.
According to a further aspect of the invention, the following is provided:
i. a pharmaceutical composition containing a ligand of the invention in free form or in the form of a pharmaceutically acceptable salt together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents therefor;
ii. a pharmaceutical composition containing a CHELATE according to the invention in free form or in the form of a pharmaceutically acceptable salt together with one or more pharmaceutically acceptable carriers or diluents therefor.
Such compositions can be prepared in a conventional manner.
A composition according to the invention can also be presented in separate packaging together with instructions for mixing the LIGAND with the metal ion and for administration of the CHELATE obtained. It can also be in the form of a double pack, i.e. a single pack containing separate unit doses of the LlGANDEN and the detectable metal ion, along with instructions on how to mix and administer the CHELATE. A diluent or carrier can be in unit dosage forms.
In the following examples all temperatures are given in DEG C and the [alpha] <2> <0> D values are uncorrected. The following abbreviations are used:
Boc: tert-butoxycarbonyl
TFA: trifluoroacetic acid
DTPA: diethylenetriamine-pentaacetic acid
Example 1:
EMI30.1
1.1 g DPhe-Cys-Phe-DTrp-Lys (epsilon-Boc) -Thr-Cys-Thr-ol in the form of the free base (1 millimolar) are dissolved in 5 liters of dioxane / H2O 1/1 (v / v .) dissolved and treated with 5 g NaHCO3. 520 mg of DTPA dianhydride is slowly added with stirring. The reaction mixture is stirred for a further 30 minutes and freeze-dried. The residue is dissolved in 250 ml of water and the pH is adjusted to 2.5 with concentrated HCl. The precipitated product is filtered off, washed and dried over phosphorus pentoxide. After chromatography on a silica gel column, the following products are isolated: 230 mg
EMI30.2
and 500 mg corresponding to dimeric
EMI30.3
3 ml of TFA are mixed with 200 mg
EMI30.4
mixed. After 5 minutes at room temperature, the mixture is precipitated with diisopropyl ether, filtered off and dried. The residue is desalted over Duolite and lyophilized. 150 mg of the title compound are obtained: [alpha] <2> <0> D = -26.6 ° (c = 1.95,% AcOH).
The starting material can be produced as follows:
a)
EMI31.1
2.25 g of di-tert-butylpyrocarbonate, dissolved in 30 ml of DMF, slowly become a solution of 10 g at room temperature
EMI31.2
dropped in 100 ml of DMF. After 2 hours at room temperature, the solvent is removed under vacuum and 200 ml of diisopropyl ether are added to the residue. The precipitate formed is filtered off, washed with diisopropyl ether and dried. The crude product is purified by chromatography on silica gel (eluent: CH2Cl2 / MeOH 9/1) and then isolated as a white amorphous powder. [alpha] <2> <0> D = 29.8 ° (c = 1.28 in DMF).
Example 2:
EMI31.3
The intermediate product obtained according to Example 1
EMI31.4
containing fraction is treated in the manner described above for the corresponding monomeric form. After removing the Boc protective groups, the title compound is obtained:
[alpha] <2> <0> D = -24.5 ° (c = 0.55, 95% AcOH).
Example 3:
EMI31.5
a. 0.56 g
EMI31.6
0.5 mmol Fmoc-epsilon-amino caproic acid and 115 mg hydroxybenzotriazole are dissolved in 10 ml DMF and cooled to -30 ° C. A solution of 115 mg of dicyclohexylcarbodiimide in 5 ml of DMF (cooled to -10 ° C.) is added to this solution.
After a reaction time of 24 hours, during which the mixture warms to room temperature, the dicyclohexylurea obtained is filtered off and the filtrate is diluted with water to 10 times its volume. The precipitated reaction product is filtered off, washed and dried over phosphorus pentoxide. The raw product is used for the next stage without further purification.
b. Fmoc cleavage
0.5 g of crude product of coupling step (a) are mixed with 5 ml of DMF / piperidine 4/1 vol./vol. At room temperature for 10 minutes. treated (clear solution) and then mixed with 100 ml of diisopropyl ether. The reaction product that precipitates is filtered off, washed and dried. This raw product is used in the next stage without further purification.
c. BOC release
300 mg of the crude product obtained in (1.b) are treated for 5 minutes at room temperature with 5 ml of 100% TFA (completely dissolved) and then mixed with 50 ml of diisopropyl ether. After adding 2 ml of HCl / diethyl ether, the precipitate obtained is filtered off, washed and dried under high vacuum.
The end product is chromatographed on silica gel (CHCl3 / MeOH / H2O / AcOH 7/3 / 0.5 / 0.5) with subsequent desalting over Duolite (gradient: H2O / AcOH 95/5) --- H2O / dioxane / AcOH 45 / 50/5) cleaned. The title compound is obtained as acetate (white lyophilisate).
[alpha] <2> <0> D = -32 ° (c = 0.5, 95% AcOH).
The compound obtained can be used according to the procedure of Examples 1 and 2 for reaction with DTPA.
Example 4:
The following LIGAND can be produced according to the process described in Examples 1 and 3:
EMI33.1
[alpha] <2> <0> D = -14.8 ° (c = 0.5, 95% AcOH)
Example 5:
EMI33.2
1 mg
EMI33.3
is dissolved in 5 ml of 0.01 M acetic acid. The solution obtained is passed through a 0.22 .mu.m Millex GV filter and divided into 0.1 ml portions and stored at -20.degree. <1> <1> <1> InCl3 (Amersham, 1 mCi / 100 mu l) is prediluted with an equal volume of 0.5 M sodium acetate, and labeling is carried out by mixing the ligand with the InCl3 solution and homogenizing moderately at room temperature.
HEPES buffer pH 7.4 is then used to make a 10th <-> <6> added in solution.
Example 6:
EMI33.4
<9> <0> Y becomes one <9> <0> Sr- <9> <0> Y radionuclide generator obtained. The construction of the generator, its elution and the conversion of the [ <9> <0> Y] EDTA in the acetate complex are prepared according to the method described by M. Chinol and D.J. Hnatowich in J. Nucl. Med., Vol. 28 (1987), pages 1465-1470. 1 mg
EMI33.5
dissolved in 5 ml of 0.01 M acetic acid is warmed to room temperature and with 1.0 mCi <9> <0> Y added to 50 ml sterile 0.5 m acetate. The mixture is left to stand for 30 minutes to 1 hour in order to achieve the best possible chelation.
A group of ligands according to the invention are somatostatin peptides, e.g. Somatostatin analogs which contain a chelating group at least on one of the amino acid units and which are bonded to the amino group via an amide bond, in free form or in salt form.
A group of chelates according to the invention are the ligands just mentioned which are associated with a detectable element, e.g. a metal ion, complexed, in free form or in salt form.