CH646793A5 - In-vitro-verfahren zur diagnose von malignen tumoren. - Google Patents

Description

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PATENTANSPRUCH In-vitro-Verfahren zur Diagnose von malignen Tumoren, vorzugsweise beim Menschen, bei welchem Verfahren die Mobilitätsänderung von Leukozyten bestimmt wird, die mit einem Migrations-Inhibitionsfaktor, MIF genannt, in Kontakt kommen, der von Lymphozyten ausgeschieden wird, welche gegen Tumorgewebe sensibilisiert sind, wobei die Mobilitätsänderung in einem Migrations-Inhibitions-Test gemessen wird, in dessen Verlauf die Lymphozyten als Teil einer Leukozyten-Suspension mit einer zur Bildung von MIF anregenden Antigen-Lösung in Kontakt gebracht und anschliessend inkubiert werden, und nach einer festliegenden Inkubationszeit die Leukozytenwanderung inhibiert und fixiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe eine Antigen-Lösung nach Caspary und Field oder ein 3-m-KCl-Extrakt aus Tumorgewebe nach Meitzer im Verhältnis - Volumenprobe zur Antigen-Lösung - von 1:50 bis 1:10 und zusätzlich eine Transfer-Faktor-Lösung hinzugegeben wird.

Die Erfindung betrifft ein in-vitro-Verfahren zur Diagnose von malignen Tumoren, vorzugsweise beim Menschen, bei welchem Test die Mobilitätsänderung von Leukozyten bestimmt wird, die mit einem Migrations-Inhibitions-Faktor, MIF genannt, in Kontakt kommen, der von Lymphozyten ausgeschieden wird, welche gegen Tumorgewebe sensibilisiert sind, wobei die Mobilitätsänderung in einem Migrations-Inhibitions-Test gemessen wird, in dessen Verlauf die Lymphozyten als Teil einer Leukozyten-Suspension mit einer zur Bildung von MIF anregenden Antigen-Lösung in Kontakt gebracht und anschliessend inkubiert werden, und nach einer festliegenden Inkubationszeit die Leukozytenwanderung inhibiert und fixiert wird.

Es ist bekannt [Ax, W. und Tautz, C., Behring Inst. Mitt. 54(1974), S. 72 bis 80], einen Migrations-Inhibitions-Test unter Agarose durchzuführen, mit dem eine Migrationshemmung der Leukozyten von Krebspatienten nachgewiesen wurde. Allerdings waren bei Verwendung löslicher Tumor-Antigene (Tumor-Extrakte) keine reproduzierbaren Resultate zu erhalten.

Es stellt sich demnach die Aufgabe, den bekannten Migrations-Inhibitions-Test dahingehend zu verbessern, dass auch Tumor-Antigen-Lösungen damit zu untersuchen sind.

Diese Aufgabe wird gelöst bei einem Verfahren der eingangs genannten Art, bei dem der Probe, bestehend aus der Leukozyten-Suspension, eine Antigen-Lösung nach Caspary und Field oder ein 3-m-KCl-Extrakt aus Tumorgewebe nach Meitzer im Verhältnis (Volumenprobe zur Antigen-Lösung) 1:50 bis 1:10 und zusätzlich eine Transfer-Faktor-Lösung hinzugegeben wird.

Ein Test wird mit einer Probe mit aus Humanblut gewonnenem, leukozytenreichem Überstand («buffycoat») mit einer festliegenden Anzahl von Leukozytenzwischen 104 und 10' pro Probe durchgeführt. Bei diesen Standardwerten handelt es sich um erprobte Werte, die keine übermässige Blutentnahme bei den Patienten erfordern.

Der buffycoat-Probe wird eine Antigen-Lösung im Verhältnis 1:50 bis 1:10 hinzugegeben. Dabei können Antigen-Lösungen benutzt werden, die nach einem von Caspary und Field angegebenen Verfahren (Caspary, E.A. et al., Brit. Med. 1971, S. 613 bis 617, und weitere Veröffentlichungen; siehe Douwes, F.R. et al., Verh. Deutsche Ges. inn. Med. 82, J.F. Bergmann-Verlag, München 1976) oder mit Hilfe einer 3-m-KCl-Extraktion nach Meitzer et al. [Meitzer, M.S. et al., J. Nat. Cancer Inst. 47 (1971) S. 703 ff.] gewonnen wurden. Als Ausgangsmaterial dienen menschliche Malignomgewebe aus

Operationen oder menschliche Hirnsubstanz. Es ist jedoch auch möglich, Antigen-Lösung aus in vitro gezüchteten Tumorzellen zu gewinnen.

Das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich nicht nur auf eine unspezifische Malignom-Untersuchung anwenden, sondern auch erweitern auf eine organspezifische Untersuchung. Werden Antigene verwendet, die aus Carcinomgewebe bestimmter Organe'gewonnen worden sind, so reagieren Lymphozyten von Patienten, die von den gleichen Organ-Carcinomen befallen sind, in der beschriebenen Weise. In der Literatur wird beschrieben, dass z.B. aus Mammacarcinom nach Caspary und Field oder Meitzer gewonnene Antigen-Lösung eine spezifische Reaktion ausschliesslich für Lymphozyten ergeben, die von Kranken mit Mammacarcinom stammen.

Es ist auch möglich, bei Vorliegen einer positiven Immunantwort bei einem allgemeinen Test, d.h. bei Verdacht auf ein Carcinom, eine Serie von Tests mit organspezifischen Antigenen-durchzuführen und damit in relativ kurzer Zeit herauszufinden, welche Organe von einem Carcinom befallen sein könnten.

Sehr wesentlich ist, dass die sog. Immunantwort, d.h. das Hervorrufen des Verlangsamungseffektes bei der Bewegung der Indikatorzellen in vorliegenden Tests, überraschenderweise dadurch reproduzierbar gemacht werden kann, dass der Probenlösung eine Lösung mit sogenanntem Transfer-Faktor beigefügt wird. Dieser Faktor ist aus der Immunologie bekannt [Schröder, I. et al., Z. Immun.-Forsch. 149 (1975), S. 365 bis 371], Der Transfer-Faktor kann nicht reaktive Lymphozyten so verändern, dass sie nach Inkubation mit dem betreffenden Antigen Mediatoren der zellulären Immunität freisetzen. Es konnte jedoch nicht erwartet werden, dass bei Verwendung von Transfer-Faktor mit Antigen-Lösungen reproduzierbare Resultate wie mit Kulturzellen als Antigen erhältlich sind. Es ist daher überraschend, dass ein in-vitro-Testverfahren zur Diagnose von malignen Tumoren möglich wird, wenn man zu der Antigen-Lösung zusätzlich eine Trans-fer-Faktor-Lösung hinzugibt.

Der Transfer-Faktor kann aus normalen Blutleukozyten hergestellt werden. Er stellt einen subzellulären, dialysierba-ren, nicht-immunogenen Leukozytenfaktor dar, der für die T-lymphozytenabhängige Reaktion verantwortlich ist. Es werden Transfer-Faktor-Präparate angeboten (Schura, Krefeld), die mittels Fraktionierung in flüssigem Sauerstoff und nachfolgender stufenweiser Ultrafraktionierung hergestellt sind. Eine im Handel erhältliche Einheit enthält Transfer-Faktor von ca. 5 x 1010 Leukozyten. Das Präparat ist mit l°/oiger Humanalbuminlösung stabilisiert.

Es zeigt sich, dass bei Zugabe von Transfer-Faktor eine Verstärkung der Immunantwort zu erreichen ist. Durch die Zugabe des Transfer-Faktors wird daher die Diskriminierung der einzelnen Probetests noch wesentlich verbessert.

Das Verfahren wird zweckmässigerweise mit einer Testplatte durchgeführt, die aus einer flachen Trägerplatte oder -schale aus inertem Material, z.B. Glas, besteht, auf das eine 2 bis 5 mm dicke erstarrte Agar-Schicht aufgebracht ist, wobei sich zwischen der Trägerplatte oder -schale und der Agar-Schicht eine kapillare Wanderungsschicht von 1 bis 20 um Dicke befindet und die Agar-Schicht zwei im wesentlichen kreisrunde Stanzlöcher mit einem Durchmesser zwischen 0,5 und 5 mm, vorzugsweise 2,5 mm aufweist. Jedes Stanzloch hat etwa ein Fassungsvermögen von 5 bis 20, vorzugsweise 8, ,ul Testsubstanz.

Vorteilhaft ist es, wenn die Stanzlöcher so zugeschnitten sind, dass die Uniformität der kapillaren Wanderungsschicht auch im Bereich des Überganges vom Stanzloch zur Schicht gegeben ist.

Die Erfindung wird anhand von Beispielen erläutert. Fer

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ner sind folgende Figuren beigefügt:

Fig. 1 zeigt eine Testplatte zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung in Draufsicht;

Fig. 2 zeigt eine Testplatte im Schnitt.

Beispiel 1

A. Gewinnung der Leukozytensuspension

30 ml Humanblut werden mit 300 USP-Einheiten Na-Heparinat heparinisiert. Das heparinisierte Humanblut (Patientenblut) wird in einem Kunststoffröhrchen mit 8 ml 6 Gew.-% Dextranlösung in physiologischer Kochsalzlösung (Molekulargewicht des Dextrans: 75000) unterschichtet. Danach lässt man die Erythrozyten bei 37 °C im Wärmeschrank für etwa 45 min sedimentieren. Der leukozytenreiche Überstand (buffycoat) wird abgehebert und mit gleichem Volumen 0,9 Gew.-%iger NaCl-Lösung gemischt, danach 15 min zentrifugiert mit einer Beschleunigung von 750 g. Das sich in der Zentrifuge abscheidende Pellet wird erneut noch zweimal in jeweils 10 ml Hank's-Lösung (pH 7,2) gewaschen und in einem Tc 199-Medium (Herst.: Serva, Heidelberg) suspendiert. Beim Waschen und Suspendieren werden die Zellen mit einer Pipette aufgewirbelt, bis makroskopisch keine Zellklumpen mehr zu erkennen sind. Die Leukozyten werden nach Färbung mit Türkscher Lösung in der Neubauerkammer gezählt und auf 2-105 Zellen/ul in Tc 199-Medium eingestellt. Im Mittel ergeben sich für die Probe 25% mono-nucleäre Zellen (Lymphozyten und Monozyten) sowie 75% Granulozyten. Die Erythrozytenkontamination ist geringer als 1 zu 1.

B. Herstellung der Antigenlösung

Zur Herstellung der Antigenlösung ist der encephalito-gene Faktor (EF) oder das basische Protein aus Karzinomgewebe (CaBP) zu isolieren.

Der Tumor bzw. das Gehirn werden unter sterilen Bedingungen so schnell wie möglich nach der operativen Entfernung bearbeitet. Bindegewebe und gesundes Gewebe werden vom Tumor entfernt. Danach wird das Tumor- bzw. Hirngewebe mit einer sterilen Schere (Skalpell) in kleine Stücke zerschnitten und im Homogenisator im Eisbad weiter zerkleinert. Das Tumorgewebe darf sich bei diesem Vorgang nicht erwärmen. Das Homogenat wird im vierfachen Volumen destillierten Wassers suspendiert und danach bei 23000 g zentrifugiert. Das entstehende Pellet wird erneut in dem vierfachen Volumen 0,9%iger NaCl-Lösung suspendiert, homogenisiert und 30 min bei 23000 g zentrifugiert. Das wiederum um vierfachen Volumen destillierten Wassers resuspendierte Pellet wird gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wird im Verhältnis 1:10 mit einem Chloroform/Methanol-Gemisch (2:1) versetzt und 30 min gerührt. Das Gemisch wird bei 600 g 10 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen.

Dieser Arbeitsgang wird zweimal wiederholt. Das Pellet wird luftgetrocknet. Das trockene Pellet wird im fünffachen Volumen einer 5%igen NaCl-Lösung in Wasser resuspendiert und 30 min bei 23000 g zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen. Unter Zugabe von n/100 NaCI wird das wiederum in dem fünffachen Volumen destillierten Wassers resuspendierte Pellet auf einen pH von 3,5 eingestellt. Die Suspension wird 30 min leicht geschüttelt, dann erneut 30 min zentrifugiert bei 23000 g. Der Überstand wird verworfen. Nochmals wird das Pellet resuspendiert in der fünffachen Menge destillierten Wassers, welches mit n/100 HCl auf einen pH von 2,6 eingestellt wird und für 3 bis 18 Stunden stehengelassen wird. Der pH-Wert darf sich während dieser Zeit nicht verändern. Die Suspension wird bei 23000 g 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird aufbewahrt, das Pellet wird erneut in n/ 100 NaCI bei pH 2,6 gewaschen, zentrifugiert. Der hier entstehende Überstand wird aufgehoben. Die beiden letztgenannten Überstände werden zusammengebracht und dann gegen destilliertes Wasser dialysiert. Danach erfolgt eine Gefriertrocknung.

Eine Antigen-Testlösung wird durch Auflösen von 0,1 mg/ml der gefriergetrockneten Substanz in destilliertem Wasser erhalten. Das im Prinzip gleiche Herstellungsverfahren gilt auch für eine Lösung des basischen Proteins aus Tumorgewebe (CaBP).

C. Herstellung der Testplatte (vgl. auch Fig. 1 und 2)

0.5.g eines speziellen Kultur-Agars (Agarose; Hersteller Behring-Werke, Marburg) werden in 50 ml Erlenmeyerkolben eingewogen. Hierzu werden 22,5 ml steriles aqua bidestillata zugegeben.

In einen zweiten Erlenmeyerkolben werden 22,5 ml des doppelt konzentrierten Tc 199-Medium und 5 ml aus Humanblut gewonnenes Plasma gegeben. In einer Halterung wird die Agarose unter leichtem kreisenden Schütteln im siedenden Wasserbad gelöst. Der Erlenmeyerkolben wird dabei mit einer Folie oder einem Stopfen verschlossen, da sonst ein Teil des Wassers verdampfen würde.

Nach vollständiger Lösung der Agarose lässt man sie im Wasserbad auf 47 °C abkühlen. Im gleichen Bad wird dann das Medium-Plasma-Gemisch vorgewärmt und unter Schütteln der Agarose zugesetzt, so dass jetzt 50 ml einer I%igen Agarose in einfachem Tc 199-Medium mit 10% Plasma vorliegen.

Mit einer vorgewärmten Auslaufpipette werden jeweils 5 ml des Agars in runde Gewebekulturschalen (Petrischalen) 10 mit 50 mm Durchmesser gefüllt, die in Fig. 1 in Draufsicht dargestellt sind. Nach Erstarren des Agars werden mit einer Teleskopstanzkanüle (Behring-Werke, Marburg) unter Zuhilfenahme einer Schablone Löcher 11 mit 2,5 mm Durchmesser in den Agar gestanzt. Dabei ist bei dem Ausstanzen darauf zu achten, dass im Stanzbereich die Agarschicht nicht von der Glasschicht abgelöst wird, damit sich die Kapillarschicht nicht vergrössert und so die Wanderung der Leukozyten nicht mehr gewährleistet ist.

Die Anordnung der Löcher 11 ergibt sich aus der Fig. I. Selbstverständlich sind weitere Figurationen denkbar. Die Figur 2 zeigt einen vergrösserten Schnitt durch den unteren Teil der Schale 10. Es ist angedeutet, dass die Agarschicht 1 von der Glasschicht der Schale 10 durch eine dünne Kapillarschicht 3 getrennt ist. Die einzelnen Reihen der Löcher sind beispielsweise vorgesehen für:

A Kontrolle (Standard)

B Testsuspension mit allgemeinem Antigen

C Testsuspension mit organspezifischem Antigen

D Testsuspension mit organspezifischem Antigen und Transfer-Faktor.

D. Reaktion, Inkubation und Fixierung

Für einen Test wurden folgende Ansätze gemacht bzw. gemischt:

1. je 100 jil Leukozytensuspension + 8 (il Antigenlösung.

2. 100 llI Leukozytensuspension + 8 jil Antigenlösung + 20 u.1 Lösung Transfer-Faktor (Präparat Schura; 1 u.1 entspricht etwa dem Transfer-Faktor von 5 x 105 Leukozyten).

3. 100 |il Leukozytensuspension.

4. 100 ul Leukozytensuspension + 20 |i.l Transfer-Faktor-Lösung wie bei Ansatz 2.

Die gemischten Ansätze 1 bis 4 werden für 60 min bei 37 °C im Wärmeschrank bei 100% Luftfeuchte inkubiert.

Dann wird von der inkubierten Lösung in jedes Stanzloch 8 u.1 leukozyten- und antigenhaltige Substanz bzw. Standardsubstanz eingefüllt. Für die Auswertung der Leukozytenmi5

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gration und der Beeinflussung durch die von den Lymphozyten produzierten, die Migration verlangsamenden Faktoren stehen je nach Konfiguration der Testplatte (Anzahl der Stanzlöcher) 2-5 Messergebnisse sowie 2-5 Bezugswerte zur Verfügung. Die in der Suspension enthaltenen Zellen, die zu Versuchsbeginn in die Stanzlöcher eingeführt sind, wandern in die Zwischenschicht 3 zwischen Agar und Oberfläche der Schale. Dur^h eine Inkubation der Platten bei 37 °C im Wärmeschrank aber 18 Stunden wird diese Wanderung über eine definierte Spanne aufrechterhalten. Die Leukozyten wandern nicht in den Agar hinein, sondern beziehen aus ihm lediglich die Nährstoffe. Die Inkubation wird bei einer relativen Luftfeuchte von 100% in einem Feuchteschrank durchgeführt.

Nach der Inkubation werden die Platten 15 min lang mit Methanol und anschliessend 10 min mit Formalinlösung (37 Gew.-% Methanal) überschichtet. Anschliessend wird der Agar vorsichtig als Haut vom Schalenboden abgezogen. Die in der Zwischenschicht gewanderten Zellen sind jetzt an der Oberfläche der Schale fixiert. Nach dem Trocknen werden die Zellen nach Pappenheim eingefärbt, wobei sich dunkelviolette Halos 4 (Wanderungshöfe) auf der Plattenoberfläche ergeben (vgl. Fig. 1).

E. Ausmessen und Ermitteln der Ergebnisse

Mit einer Messlupe (Bausch & Lomb) wird der Durchmesser des Wanderungshalo gemessen. Dabei sind die in der Peripherie vereinzelt liegenden polymorphkernigen Zellen mit zu erfassen. Aus jeweils mehreren Messungen wird das arithmetische Mittel gebildet.

Der Quotient aus der Migrationsfläche Fi mit Antigen und der Migrationsfläche F2 ohne Antigen ergibt einen «Migrationsindex» MI:

MI = Ft/F 2-

Ein Migrationsindex < 0,85 bedeutet Hemmung der Leukozyten in signifikantem Masse und somit eine positive Zellantwort. Die folgende Tabelle zeigt ein Messbeispiel:

Reihe

0 (mm)

F (mm2)

MI

B

6,75

Fi =35,8

0,80

A

7,55

Fi = 44,75

(1)

Beispiel 2

Verwendung eines organspezifischen Antigens.

A. Die Gewinnung der Leukozytensuspension erfolgt wie in Beispiel 1A.

B. Herstellung einer organspezifischen Antigenlösung

Möglichst frisch gewonnenes Tumorgewebe eines Mammakarzinoms wird vom Blut, Fettgewebe und Bindegewebe befreit und in kleine Würfel oder Streifen zerschnitten. Alle nachfolgenden Schritte werden bei 4 °C durchgeführt. Die Gewebestückchen werden in einem dreifachen Volumen einer 3-molaren-Kaliumchloridlösung in ca. erbsgrosse Stücke zerkleinert. DerpH-Wert dieser groben Suspension wird auf 7,4 eingestellt. Anschliessend wird das Gewebe mit einem Ultra-turrax®-Homogenisator (20000 Upm) zerkleinert. Das Homogenisat wird für 24 Stunden stehen gelassen. Anschliessend wird es zentrifugiert. Den nach 60minütiger Zentrifugation bei 4000 g gewonnene Überstand wird für 2 Stunden gegen ein lOfaches Volumen Aqua destillata und dann für weitere 24 Stunden gegen das 50fache Volumen 0,9%iger NaCl-Lösung dialysiert. Aus dem Dialysat werden durch Zugabe von 2 molarem Ammoniumsulfat über einen

Zeitraum von 1 Stunde die Proteine ausgefällt und durch : 20minütige Zentrifugation bei 4000 g abgetrennt. Nach Suspension der Proteine in einer 0,9%igen NaCl-Lösung erfolgt eine einstündige Dialyse gegen das 5fache Volumen Aqua destillata und eine weitere Dialyse gegen das 50fache Volumen 0,9%iger NaCI. Nach Sterilfiltration durch einen 0,45 Milipore-Micropore-Filter wird der Antigenextrakt in kleine Ampullen abgefüllt und bei — 20 °C gelagert. Vor Gebrauch wird der Proteingehalt einer jeden Charge mit der Biuretmethode nach vorangegangener TCA-Fällung bestimmt.

C. Es wird die gleiche Testplatte wie bei Beispiel 1 verwendet.

Für den Test werden drei Ansätze hergestellt:

1. mit je 100 u.1 Leukozytensuspension aus Patientenblut gemäss Beispiel 1A + 8 ,ul n/100 NaCl-Lösung (für Reihe A, Standardwert);

2. mit je 100 |il Leukozytensuspension + 8 u.1 Antigensus-pension nach Beispiel 1B,

3. mit je 100 ul Leukozytensuspension + 8 u.1 Antigensu-spension gemäss Beispiel 1B+15 ixl Transferfaktor-Lösung.

Die Testplatte mit einem Lochdurchmesser von 2,5 mm wird mit je 8 ul der gemäss Beispiel 1 inkubierten Testsubstanz 1-3 beschickt. Die Ergebnisse, jeweils aus fünf Werten ermittelt, sind:

«V

Ansatz

Reihe

0

F (mm2)

MI

1

A

7,00

46,5

1,00

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C

7,70

38,1

0,82

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D

6,10

29,3

0,63

Das Ergebnis deutet auf ein Mammakarzinom hin, da der MI deutlich unter 0,8 liegt und das Ergebnis bei Anwendung des Transferfaktors noch verstärkt wird.

Patientinnen mit Mammakarzinom zeigen bei Anwendung der Methode unter Zuhilfenahme des Transferfaktors bei über 90% einen Migrationsindex, der kleiner ist als 0,80. Nur bei 10% der Patientinnen mit Mammakarzinom ist der Migrationsindex grösser als 0,85.

Beispiel 3

Es wird die Mobilitätsänderung von Lymphozyten, Fremdmakrophagen und anderen Indikatorzellen in einem Kapillartest nach Soborg und Bendixen gemessen. Es wird hierbei eine 10 um dicke offene Kapillare benutzt. Die Ergebnisse entsprechen denen des Beispiels 1, wobei im Prinzip gleiche Ansätze verwendet werden.

Schlussbemerkungen

Das Testverfahren ist für bestimmte Krankheitsbilder nicht anzuwenden. Falsch negative Ergebnisse ergaben sich bei allen sogenannten Leukosen. Eine Erklärung kann hierfür zurzeit nicht gegeben werden, da gerade leukämische Zellen sehr reichlich basische Proteine enthalten. Auch ist die zelluläre Immunität bei diesen Patienten nicht so auffällig gestört, dass dies Ergebnis mit einer Störung des Immunsystems zu erklären wäre. Auffällig ist daher auch, dass die chronische lymphatische Leukämie, ebenso wie die akute lymphatische Leukämie keine Reaktion zeigen, während die Lymphosarkome und die Lymphogranulomatosen sich verhalten wie die anderen Malignome auch. Vor der Chemotherapie wiesen jedoch Patienten eine deutliche Hemmung auf. Bereits nach dem ersten Chemotherapie-Zyklus wird diese Hemmung jedoch aufgehoben und im zweiten Zyklus in einen falsch positiven Wert verwandelt. Weiterhin ergeben sich falsche Ergebnisse bei Patienten in Tumorkachexie. Patienten mit

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rasch progredient wachsenden Tumoren oder Patienten in der Tumorkachexie zeigen zum Teil falsche Ergebnisse, da hier eine Störung der zellulären Immunität vorliegt. Versuche zur Beantwortung dieser Frage sind noch im Gange.

Falsch positive Ergebnisse wurden in erster Linie bei ent- 5 zündlichen und degenerativen neurologischen Erkrankungen, beispielsweise multiple Sklerose gefunden. Die Erklärung hierfür wurde von Caspary und Field in einer Kreuzreaktion zwischen dem EF und der Sensibilisierung der Lymphozyten mit Hirngewebe gesehen.

Die falschen Ergebnisse sind jedoch leicht durch eine Voruntersuchung auszuscheiden, so dass die genannten Krankheiten keinen Hinderungsgrund für die Anwendung des Tests bieten.

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1 Blatt Zeichnungen