DE2441536C3

DE2441536C3 - Diagnostisches Verfahren

Info

Publication number: DE2441536C3
Application number: DE2441536A
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Prof. Dr. 3551 Wehrda Ax; Burkhard Dr. 3550 Marburg Enders; Franz Dr. 3551 Hachborn Porzsolt; Rudolf 3550 Marburg Schmidtberger; Christoph Dr. 7400 Tuebingen Tautz
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1974-08-30
Filing date: 1974-08-30
Publication date: 1980-09-11
Also published as: DE2659864C3; DE2441536B2; DE2441536A1; DE2659864A1; DE2659864B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1, welches sich insbesondere zur Erkennung maligner Tumoren durch Verwendung des enzephalitogenen Faktors als Antigen eignet.

Es ist bekannt, daß Lymphozyten von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen durch Antigene in der Weise stimulierbar sind, daß sie Substanzen freisetzen, durch die die Wanderungsgeschwindigkeit von Meerschweinchcn-Makrophagen im elektrischen Feld verändert wird. Dieses Prinzip wurde von Field und C a s ρ a ry für die Tumordiagnostik eingeführt. Inzwischen sind Möglichkeiten bekanntgeworden, diese Methode zur Erkennung und Differenzialdiagnose einer Reihe weiterer Erkrankungen einzusetzen, wie z. B. Asthma Bronchiale, degenerative neurologische Erkrankungen und Schilddrüsenerkrankungen. Die veränderte Wanderungsgeschwindigkeit der Makrophagen kann in handelsüblichen Zellelektrophoreseapparaturen (Zytopherometer) gemessen und für die klinische Diagnostik ausgewertet werden (Brit. J. Caneer, Vol. 27. 1973. S. I - 9 und Vol. 28,1973, Suppl. I, S. 215 - 218).

Der Methode von Field und Caspary liegt insbesondere die nachteilige Vorstellung zugrunde, notwendigerweise Makrophagen einsetzen zu müssen. Diese können nur durch eine aufwendige Technik von gesunden Versuchstieren wie Meerschweinchen gewonnen werden und sind nur kurze Zeit verwendbar. Bei der Präparation der Makrophagen von Meerschweinchen werden eine Reihe verschiedener Zellpopulationen erhalten, die im elektrischen Feld mit unterschiedlicher Geschwindigkeit wandern; daher ist zur Messung eine bestimmte Population auszuwählen, woraus sich ein weiteres Problem dieser Methode ableitet. Makrophagen von erkrankten Tieren sind im Testsystem von Field und Caspary nicht verwendbar.

Es bestand daher ein Bedürfnis, die Makrophagen durch geladene Indikatorpartikel weitgehend homogener Größe und Form zu ersetzen, die aufgrund ihrer Stabilität eine Verwendung über eine längere Zeitdauer und durch die Gleichmäßigkeit der elektrischen Ladung und des Aussehens eine vereinfachte Beurteilung der Messung in der elektrophonischen Wanderung ermöglichen.

Gegenstand der Erfindung ist ein diagnostisches Verfahren in vitro, bei dem Lymphozyten mit Antigenen inkubiert, das Inkubationsgemisch nach vorheriger Abtrennung der Lymphozyten zu Makrophagen als InJiaktorpartikeln gegeben und die Wanderungsgeschwindigkeit der Indikatorpartikel in einem elektrischen Feld gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Makrophagen eine Dispersion mikroskopisch beobachtbarer elektrisch geladener !ndikatorpartikel mit homogener Größenverteilung verwendet wird.

Eifindungsgemäß wird also anstelle von Makrophagen eine Dispersion mikroskopisch beobachtbarer elektrisch geladener Indikatorpartikel mit homogener Größenverteilung verwendet. Insbesondere sind mit denaturierenden Agenzien behandelte, beispielsweise Tannin- oder Sulfonsalizylsäure-behar.delte menschliche oder tierische Erythrozyten als Indikatorpartikel geeignet. Es können jedoch die Makrophagen auch durch geladene Kunststoffpartikel wie beispielsweise Latexteilchen ersetzt werden.

Die erfindungsgemäß verwendeten Indikatorpartikel gehen ebenso wie die gemäß dem Stand der Technik verwendeten Makrophagen Bindungen oder im weitestens Sinne Wechselwirkungen mit den im Überstand des Reaktionsgemische enthaltenen Faktoren dergestalt ein, daß das Verhalten der Partikeln im elektrischen Feld meßbar verändert wird. Die chemische Natur der in dem Überstand enthaltenden Faktoren, welche die Wechselwirkungen mit den Indikatorpartike! einzugehen vermögen, ist bis heute noch nicht bekannt.

Bei Verwendung von krankheitsspezifischen Antigenen werden die Lymphozyten eines mit diesem Antigen

Ϊ5 sensibilisierten Probanden stimuliert. Die in die überstehende Lösung abgegebenen Substanzen verändern die ÜbTSchußladung der Indikatorpar'ikel im Vergleich zu Indikatorpartikeln, die mit den Überständen aus Inkubationen von Lymphozyten gesunder Personen und dem gleichen Antigen erhalten wurden. Als krankheitsspezifische Antigene sind beispielsweise von Mikroorganismen stammende Antigene wie Tuberkulin, Tetanus-Toxoid und Streptokokken-Anligene zu nennen. Daneben sind einige weniger spezifische Antigene bekannt, deren Nachweis auf das Vorliegen von krankhaften Entgleisungen des Körpers allgemeiner Art hinweist. Beispielsweise besteht ein Zusammenhang zwischen enzephalitogenem Faktor (EF) und Krebs.

so Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung werden Lymphozyten von Probanden aus Blut oder Lymphe oder Gewebe aus lymphoiden Organen gewonnen. Bei Verwendung von Blut wird das Blut ungerinnbar gemacht, wie dies durch Zusatz von beispielsweise Heparin erreicht werden kann. Die Lymphozyten werden nach einem bekannten Verfahren gewonnen. Beispielsweise wird die Blutprobe auf eine mit Glasperlen gefüllte Säule gegeben, auf der adhärente Zellen haften bleiben. Aus dem Eluat können durch Gradientenzentrifugation die Lymphozyten gewonnen werden, die anschließend mit dem diagnostischen Antigen in einem während des Versuchs konstanten Verhältnis von Antigen zu Lymphozyten über 90 Min. bis 24 Stunden bei 20-37⁰C inkubiert werden. Die Lymphozyten werden vom Überstand abgetrennt und der Überstand zur Beladung der Indikatorpartikel, die statt Makrophagen eingesetzt werden, verwendet. Dazu werden IndikatorDartikel.

IO

vorzugsweise tannierte Erythrozyten, insbesondere die nach dem Verfahren von B e c h t [J. Immunol. 101,18-22 (1968)] stabilisierten Erythrozyten in einer Suspension von 1 χ 10⁷ bis 5xl0⁷ pro ml mit dem Überstand behandelt und 30 -120 Min. bei 20 - 40° C inkubiert

Als Latexpartikel, die im Sinne der Erfindung als Indikatorpartikel eingesetzt werden können, eignen sich ganz allgemein solche aus einem natürlichen oder künstlichen Latex, sofern dieser die genannten elektrophoretischen Eigenschaften aufweist Die Größe der Partikel sollte in etwa der Größe denaturierter Erythrozyten entsprechen, also etwa 5 — 9- 10~⁴cm betragen. Die Konzentration der Partikel im Latex lieg¹, zweckmäßig bei 1—5- 10⁷/ml im Falle die Elektrophorese wird mit einem Zytopherometer der '5 Firma Carl Zeiss ausgeführt Wenn andere Elektrophorese-Apparaturen verwendet werden, sollte die Partikelkonzentration den für das jeweils verwendete Gerät opHmalen Werten angepaßt werden. Derartige Abweichungen von dem genannten Konzentrationswert können unter Umständen einige Zehnerpotenzen betragen. Als Latexmaterial eignen sich insbesondere Kunststofflatizes und unter diesen wiederum vorzugsweise solche aus Polystyrol oder Copolymerisaten des Polystyrols mit geeigneten Comonomeren. Als Beispiel für ein Comonomeres sei Divinylbenzol genannt. Der chemische Charakter der Latexpartikel ist aber bei den erfindungsgemäßen Verfahren nicht kritisch.

Die danach erhaltene Suspension der behandelten Indikatorpartikel wird einem Zellelektrophoresesystern zugeführt, das die Registrierung der Wanderungsgeschwindigkeit gestattet Die Auswertung erfolgt durch Feststellung der Abweichung der elektrophoretischen Wanderungsgeschwindigkeit vom Nullwert und dem Wert von gesunden Personen. Wird beispielsweise als Antigen enzephalitogener Faktor (EF) mit Lymphozyten eines tumorverdächtigen Patienten inkubiert und bewirkt der Inkubationsüberstand eine Verlangsamung der elektrophoretischen Beweglichkeit der damit beladenen Erythrozyten gegenüber Erythrozyten, die nur mit einem physiologisch verträglichen Inkubationsmedium (Nullwert), und gegenüber Erythrozyten, die mit Überstand der nach Inkubation von EF mit Lymphozyten gesunder Personen gewonnen wurde, inkubiert waren (Normalwert), so wird die Diagnose pathologisch bewertet.

Wird beispielsweise als Antigen Tetanus-Toxoid oder gereinigtes Tuberkulin mit Lymphozyten inkubiert und bewirkt der Inkubationsüberstand eine Verlangsamung der elektrophoretischen Beweglichkeit der damit beladenen Erythrozyten gegenüber Erythrozyten, die mit Überstand einer antigenfreien Lymphozytenkultur inkubiert wurden, so liegt eine Sensibilisierung des Spenders gegen das verwendete Antigen vor. Bei nichtsensibilisierten Spendern zeigt sich bei gleicher Versuchsanordnung an Stelle der Verlangsamung eine Beschleunigung der Wanderungsgeschwindigkeit.

Die Erfindung wird an nachstehend angegebenen Beispielen verdeutlicht

Beispiel 1

In einer Spritze mit 0,5 ml Heparin werden dem Probanden 23 ml venöses Blut abgenommen. Die

35

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50

60 Blutprobe wird auf eine Säule (2 cm 0, 30 cm Höhe), gefüllt mit Glasperlen (2 mm 0), gegeben und im Brutschrank bei 37° C über 90 Min. stehengelassen. Anschließend wird das Eluat der Säu'e im Verhältnis 1 :4 mit Hanks' Lösung mit einem Gehalt von 0,05% an dem Na2-Salz der Äthylendiamin-tetraessigsäure (EDTA) verdünnt Das verdünnte Eluat wird über ¹A des Volumens einer Lösung bestehend aus Natrium-, Calcium-, Magnesium- und Methylglukaminsalzen der Metrizoesäure und einem hochmolekularen Copolymeren von Saccharose und Epichlorhydrin mit der Dichte 1,074 geschichtet und über 15 Min. bei 250 g zentrifugiert. Der über dem Dichtegradienten liegende Lymphozytenring wird abgehebert und einmal mit Hanks' + EDTA Lösung gewaschen, anschließend zweimal mit Hanks' Lösung gewaschen. Die Zellen werden abzentrifugiert und in 0,5 ml Dulbecco-Medium ohne Serum aufgenommen.

Dulbecco's Medium ist ein Kulturmedium für das Zellwachstum und besteht aus einer Mischung von Aminosäuren, Vitaminen, anorganischen Salzen, Puffersubstanzen und Antibiotika. Es ist im Handel erhältlich.

Die Zellzahl wird im Coulter-Counter bestimmt und die Lymphozyten-Suspension auf 1 χ 10⁷ Zellen mit Dulbecco-Medium eingestellt. Pro 0,7 ml dieser Zellsuspension werden 3 ml der Lösung des enzephalitogenen Faktors (EF) (0,3 mg EF pro 1 ml Hanks') hinzugefügt und über 24 Stunden inkubiert. Danach werden die Lymphozyten abzentrifugiert und 3 ml des Überstandes mit 1 ml einer Zellsuspension (5x10' stabile und tannierte Erythrozyten pro ml Hanks') I -2 Stunden inkubiert. Anschließend wird diese Zellsuspension zur Messung in ein Zytopherometer gegeben und die elektrophoretische Wanderung der Partikel diagnostisch auf das Vorliegen einer Krebserkrankung ausgewertet.

Ein Zytopherometer ist ein Mikroskop, das zur Bestimmung der elektrischen Oberflächenladung suspendierter mikroskopischer Teilchen aufgrund ihrer Wanderungspeschwindigkeit im elektrischen Feld (Elektrophorese) dient. Die dazu benutzte Suspension befindet sich in der Meßkammer eines sogenannten Elektrophoresesystems. Die optische Achse des Mikroskops ist horizontal angeordnet, da die Meßkammer senkrecht stehen muß. Dadurch werden Einflüsse ausgeschaltet, welche die Messung der Wanderungsgeschwindigkeit verfälschen können.

Beispiel 2

Werden wie in Beispiel 1 anstelle des EF 3 ml einer Lösung von gereinigtem Tuberkulin (150 000 E/ml) verwendet, erlaubt die Messung der elektrophoretischen Wanderung der Partikel die Diagnose einer Sensibilisierung des Probanden gegen Tuberkuloprotein.

Beispiel 3

Werden wie in Beispiel 1 anstelle des EF 3 ml einer Lösung von Tetanus-Toxoid (20 Lf/ml) verwendet, erlaubt die Messung der elektrophoretischen Wanderung der Partikeln die Diagnose einer Sensibilisierung des Probanden gegen Tetanus-Toxoid bzw. Toxin.

Claims

Patentansprüche:

1. Diagnostisches Verfahren in vitro, bei dem Lymphozyten mit Antigenen inkubiert, das Inkubationsgemisch nach \orheriger Abtrennung der Lymphozyten zu Makrophagen als Indikatcrpartikeln gegeben und die Wanderungsgeschwindigkeit der Indikatorpartikel in einem elektrischen Feld gemessen wird, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle von Makrophagen eine Dispersion mikroskopisch beobachtbarer elektrisch geladener Indikatorpartikel mit homogener Größenverteilung verwendet wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikatorpartikel denaturierte Erythrozyten verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Indikatorpartikel Latex-Partikel verwendet werden.