Przedmiotem wynalazku jest sposób przeprowadzania prób diagnostycznych in vitro w celu stwierdzenia nowo¬ tworów zlosliwych, zwlaszcza u ludzi, w którym to sposo¬ bie okresla sie zmiane ruchliwosci komórkowych skladników krwi, napotykajacych czynnik hamowania wedrówki (MIF), przy czym czynnik hamowania wedrówki jest wyodrebniony 2 limfocytów, uczulonych na tkanke nowotworowa. Czyn¬ nika hamowania wedrówki nie mozna wydzielic, jezeli limfocyty pochodza od pacjentów nie majacych nowotworu zlosliwego, poniewaz te limfocyty nie sa uczulone, a w zwiaz¬ ku z tym przy zetknieciu z antygenem nowotworu nie uwalniaja czynnika hamowania wedrówki.Znane jest z literatury (Donwes, F.R; Werh. Deutsche Monachium, 1976 r. — tam tez inne wskazówki), ze za po¬ moca tak zwanej próby ruchliwosci elektroforezy (EMT) mozliwe jest wczesne rozpoznanie chorób zlosliwych.Zasada próby ruchliwosci elektroforezy polega na tym, ze predkosc wedrówki (ruchliwosci) okreslonych cial (makro- fagów, granulocytów, innych krwinek), widocznych w polu •elektrycznym specjalnego mikroskopu (cytoferometru) zmienia sie jedynie wówczas, jezeli napotkaja one sród- chlonki w kanalach pólkolistych z uczulonych limfocytów.Zaklada sie przy tym, ze limfocyty, uczulone na okreslony antygen (tzw. limfocyty^ T), uwalniaja szereg czynników rozpuszczalnych, tak zwane sródchlonki w kanalach pól¬ kolistych. Sposród nich waznym czynnikiem jest czynnik hamowania wedrówki (MIF). Oddzialywuje on na zdol¬ nosc wedrówki krwinek, zwlaszcza makrofagów i granulo¬ cytów, oraz dazy do zatrzymania ich i nagromadzenia 10 15 20 25 30 w miejscu, w którym znajduje sie antygen, wywolujacy uczulenie. W rzeczywistosci oznacza to mozliwosc znisz¬ czenia nowotworu.Limfocyty pacjentów z nowotworem zlosliwym reaguja specyficznie, uwalniajac tzw. czynniki rozpuszczalne, jezeli napotykaja zasadowa proteine, pobrana z jednej strony z istoty mózgowej, a z drugiej strony — z tkanki rakowej. Zasadowe proteiny, wywolujace specyficzne, reakcje limfocytów, nazywane sa w literaturze czynnikiem pochodzacym T zapalenia mózgu (EF) natomiast zasadowa proteina z tkanki rakowej jest zwana (CaBP). Uzyskuje sie je w znany sposób (Caspary E.A et al, Brit. Med. 1971, str. 613—517 oraz inne publikacje, patrz Douwes, F.R.).Wyniki badan krwi za pomoca próby ruchliwosci elektro¬ forezy, opisane w literaturze, wykazuja, ze za pomoca tej próby moze nastapic 100%-owe zróznicowanie próbek, w zaleznosci od tego, czy pobrano je z organizmu, zaatako¬ wanego nowotworem zlosliwym, czy tez z organizmu zdrowego lub z organizmu, zaatakowanego^ nowotworem dobrotliwym. U wszystkich badanych pacjentów, zaatakowanych nowotworem zlosliwym, uzyskiwano po¬ zytywna odpowiedz limfocytów, to znaczy limfocyty od¬ dawaly czynnik, prowadzacy do wymierzalnej i charakterys¬ tycznej zmiany ruchliwosci komórek wskaznika (por.Douwes, F.R). W badaniach kontrolnych pacjentów, nieobciazonych chorobami zlosliwymi nie uzyskano takiej odpowiedzi limfocytów. Uzyskanie zlych wyników moglo byc spowodowane wieloma4 przyczynami. W zwiazku z tym próbe ruchliwosci elektroforezy mozna obecnie uwazac za najbardziej czula próbe rakowa. 112 675H2 3 Wada tej próby jest to, ze nalezy opanowac obsluge skomplikowanego instrumentu, jakim jest cytoferometr.Personel medyczny, obserwujacy predkosc wedrówki i wykonujacy pomiary, musi odebrac staranne wyksztalcenie i byc kontrolowany. W zwiazku z tym mozliwe jestjedynie ograniczone stosowanie tego instrumentu. Stosowanie próby ruchliwosci elektroforezowej organicza sie wiec do wyspecjalizowanych instytutów. Oceny próby mozna dokonac w czasie ruchu krwinek, a wiec w fazie dynamicz¬ nej. „Zatrzymanie" eksperymentu jest niemozliwe, ponie¬ waz nie mozna wówczas przeprowadzac pomiarów, Zadaniem wynalazku jest wiec opracowanie sposobu przeprowadzania prób diagnostycznych w celu stwierdzenia nowotworów zlosliwych, który zasygnalizuje z duza doklad¬ noscia obecnosc nowotwprów zlosliwych, w sposób mozli¬ wie ogólny i nie charakteryzujacy rodzaju nowotworów zlosliwych, który jednaK bedzie mógl byc stosowany lub przeprowadzany ^Ckazdym labolatorium medycznym i Tiadawalhnsie ^offitisywvch badan w realizacji profilak¬ tyki rakowej. Wynik próby powinien byc bez wiekszych problemów sprawdzalny. Próba powinna podlegac ocenie statystycznej i byc przechowywana w archiwum bez posre¬ dniego protokolowania.Zadanie to zostalo rozwiazane dzieki sposobowi przepro¬ wadzania prób wstepnie wymienionego rodzaju, w którym badane limfocyty, bedace czescia zawiesiny leukocytów, jako komórkowe skladniki krwi, sa poddawane znanej próbie hamowania wedrówki, w czasie trwania której lim¬ focyty napotykaja antygen, inicjujacy tworzenie czynnika hamujacego wedrówke (MIF) i nastepnie podlegaja inku¬ bacji, a po pewnym okreslonym czasie wedrówka leukocy¬ tów ulega zahamowaniu i ustaleniu.Znane sa rózne próby hamowania wedrówki, które mozna przeprowadzac zasadniczo w celu badania, wedlug postawionego zadania. Miedzy innymi znana jest tak zwana technika wlosniczek wedlug Soborga i Bendixena.Do realizacji istoty wynalazku konieczny jest pomiar ruchliwosci komórek wskaznika przez „zamrozenie" stanu wedrówki, uzyskanego po okreslonym czasie.Wedlug wynalazku, korzystnie mierzy sie rozszerzenie, wzglednie zmiany ruchliwosci leukocytów, w bardzo cienkiej, wynoszacej okolo 10 /mi, „otwartej" warstwie wlosniczek. Jako szczególnie korzystny okazal sie uklad do przeprowadzania prób, skladajacy sie z. elementu dwuwarst¬ wowego, a mianowicie z nosnika, stanowiacego srodek obojetny, na przyklad szklo, oraz agar, wzbogaconego .substancja odzywcza dla 4comórek krwi. Szczególnie ko¬ rzystne jest stosowanie agaru o nazwie handlowej. agaroza, produkowanego przez firme Behring-Werke, Marburg.Warstwa posrednia miedzy agarem a warstwa nosna jest wypelniona czesciowo korzystnie ciecza, a jej grubosc wynosi od 1 do 20 /im. Czas wylegania czynnika hamowania wedrówki wynosi korzystnie od 10 do 30 godzin.Próbe przeprowadza sie za pomoca doswiadczenia z bogatym w leukocyty supernatantem, („buffycoat"), uzyskanym z krwi czlowieka, o stalej liczbie leukocytów, lezacej w granicach miedzy 104 a 107 w kazdym doswiad¬ czeniu. W przypadku tych standardowych wartosci chodzi o wielkosci doswiadczalne, nie wymagajace pobierania nadmiernej ilosci krwi od pacjenta. % Do próby „buffycoat" dodaje sie roztwór antygenu w proporcji 1:50 do l:10v Mozna stosowac do tego celu roztwory antygenu, uzyskane metoda Casparay'a i Fielda lub za pomoca ekstrakcji 3 molowym roztworem KC1 wedlug metody Meltzera. Jako material wyjsciowy stosuje 675 4 sie tkanke nowotworu zlosliwego u czlowieka, pochodza¬ ca z operacji, lub istote mózgowa czlowieka. Mozliwe- jednak uzyskanie roztworu antygenów z komórek nowotwo¬ rowych, wyhodowanych w probówce. 5 Sposób przeprowadzania prób wedlug wynalazku mozna stosowac nie tylko w przypadku ogólnych badan nowotwo¬ rowych, lecz równiez w przypadku badan okreslonych narzadów. Jezeli zastosuje sie antygeny, uzyskane z tkanek rakowych okreslonych narzadów, wówczas limfocyty io pacjentów, zaatakowanych rakiem tych samych narzadów, reaguja w opisany sposób.W publikacjach o^iscino przykladowo, ze roztwór anty¬ genu, uzyskanego metoda Casparay'a i Fielda lub Meltzerar z raka gruczolu piersiowego daje charakterystyczna reakcje 15 wylacznie . w przypadku limfocytów, pochodzacych od chorych na raka gruczolu piersiowego.Mozliwe jest, równiez, w przypadku uzyskania pozytywnej odpowiedzi odpornosci w ogólnych próbach, to znaczy w przypadku podejrzewania o raka, wykonanie serii prób 20 z antygenem charakterystycznym dla danego narzadu i dzieki temu odnalezienie w przeciagu krótkiego okresu narzadu zaatakowanego rakiem.Bardzo istotna rzecza w niniejszych próbach jest mozli¬ wosc wzmocnienia w sposób nieoczekiwany tak zwanej 25 odpowiedzi odpornosci, to znaczy wywolania zjawiska zwalniania przy ruchu komórek wskaznika, dzieki temu, ze do roztworu doswiadczalnego dodaje sie roztwór z tak zwanym czynnikiem przenoszacym. Ten czynnik jest znany w immunologii (patrz np. M. Rosethal „Der Tansfer- 30 faktor und seine therapeutische Anwendung", Schweiz und Wschr., tom 104, 1974, str. 4501 1506). Czynnik przenoszacy mozna wytwarzac ze zwyklych leukocytów krwi. Jest to podkomórkowy czynnik leukocytowy, dajacy sie dializowac i nieimmunogenny, który jest odpowiedzialny 35 za reakcje zalezna od limfocytów T. Proponowane sa pre¬ paraty czynnika przenoszacego (np. Schura, Krefeld), wytwarzane za pomoca frakcji w plynnym tlenie i nastepuja¬ cego stopniowego ultrafrakcjonowania. Dostepna w handlu jednostka zawiera czynnik przenoszacy w ilosci Ok. 5 • 10^ <0 leukocytów. Preparat stabilizuje sie 1 %-owym roztworem albuminy ludzkiej.Okazalo sie, ze po dodaniu czynnika przenoszacego- uzyskano spotegowana^ odpowiedz odpornosci. Dzieki dodaniu czynnika przenoszacego polepszylo sie istotnie- 45 rozróznianie poszczególnych prób doswiadczalnych.Przedmiotem wynalazku jest równiez plytka testowa da przeprowadzenia sposobu, skladajaca sie z plaskiej- plytki nosnej z materialu obojetnego, na przyklad szkla, na która nanosi sie warstwe zestalonego agaru o grubosci 0,5 da go 5 mm, majaca co najmniej dwa zasadniczo okragle wytlo¬ czone otwory o srednicy w granicach 0,5 i 5 mm, korzystnie 2,2 do 3,0 mm. Kazdy wytloczony otwór ma pojemnosc okolo 5 do 20,-korzystnie 8 fn substancji próbnej.Istotne jest uksztaltowanie otworów wytlaczanych w ten 55 sposób, aby zapewniona byla jednorodnosc wlosniczkowej warstwy wedrujacej równiez w obszarze przejscia z wytla¬ czanego otworu w warstwe.Przedmiot wynalazku jest wyjasniony w przykladach wykonania, a na zalaczonym rysunku fig. 1 przedstawia eo plytke testowa wedlug wynalazku, w widoku z góry, a fig. 2 — plytke testowa w przekroju.Przyklad I. A. Uzyskiwanie zawiesiny leukocytów^ 30 ml krwi ludzkiej heparynizuje sie 300 jednostkami wedlug USP heparynianu sodu. Heparynizowana krew 65 pacjenta osiada jako warstwa spodnia w rurce z tworzywa t112 675 6 sztucznego, zawierajacej 8.ml 6% wagowych roztworu dekstranu w roztworze soli fizjologicznej (waga czastecz¬ kowa dekstranu : 75,000). Nastepnie w szafie grzejnej, w temperaturze 37 °, osiadaja erytrocyty — w ciagu 15 mi¬ nut. Bogaty w leukocyty supernatant (buffycoat) odsysa 5 sie i miesza sie z ta sama iloscia 0,9% wagowych roztworu NaCl, a nastepnie odwirowuje przez 15 minut z przyspie¬ szeniem 750 g. Peletke oddzielajaca sie w wirówce przemywa sie jeszcze dwukrotnie, kazdorazowo w 10 ml roztworu Hank'a (ph 7,2) i zawiesza w srodku Tc 199 (producent: io Sefva, Heidelberg). Podczas przemywania i zawieszania komórki wzburza sie pipeta az do zanikniecia duzych skrzepów komórkowych. Po zabarwieniu roztworem tu¬ reckim, leukocyty zlicza sie w komorze Neubauera i ustala ich ilosc na 2 • 105 komórek/ //l w srodku Tc 199. Srednio 15 z doswiadczenia uzyskuje sie 25% kpmórek jednojadro- wych (limfocytów i monozytów), jak równiez 75 % granulo- zytów. Zanieczyszczenie erytrocytów jest nizsze niz 1 do 1.B. Wytwarzanie roztworu antygenów. W celu wytworze¬ nia roztworu antygenów nalezy wyizolowac z tkanki rako- 20 wej (Ca BP) czynnik pochodzacy z zapalenia mózgu (EP) oraz zasadowa proteine. Po operacyjnym usunieciu roztwo¬ ru lub mózgu, nalezy sie nimi jak najszybciej, w warunkach sterylnych, zajac. Od nowotworu nalezy oddzielic tkanke laczna i zdrowa tkanke. Nastepnie tkanke nowotworowa 25 lub mózgowa tnie sie sterylnym skalpelem na male czesci i dalej rozdrabnia w kapieli lodowej w homogenizatorze.Podczas tych czynnosci tkanka nowotworowa nie moze ulec ogrzaniu. Roztwór zhomogenizowany zawiesza sie w czterokrotnej ilosci wody destylowanej i odwirowuje 30 z predkoscia 23.000 g. Powstajaca peletke zawiesza sie po¬ nownie w czterokrotnej ilosci 0,9%-owego roztworu NaCl, homogenizuje i odwirowuje przez 30 minut przy predkosci 23.000 g. Peletka ponownie zawieszona w cztero¬ krotnej ilosci wody destylowanej, suszy sie przez zamrozenie. 35 Do osuszonego przez zamrozenie proszku dodaje sie w pro¬ porcji 1:10 mieszaniny chloroform-metanol i miesza sie wszystko 30 minut. Miszanine odwirowuje sie w przeciagu 10 minut z predkoscia 600 g. Odrzuca sie supernatant.Ten proces pracy powtarza sie dwukrotnie. Peletke susz^ sie 40 powietrzem. Sucha peletke ponownie zawiesza sie w piecio- krotiej ilosci 5%-ego roztworu NaCl w wodzie i odwiro¬ wuje 30 minut przy predkosci 23.000 g. Odrzuca sie su¬ pernatant. Peletke ponownie zawieszona w pieciokrotnej ilosci wody destylowanej z dodatkiem n/100 NaCl, ustala 45 ¦-sie na wartosc pH 3,5. Zawiesine lekko potrzasa sie przez 30 minut, a nastepnie odwirowuje przez 30 minut z pred¬ koscia 23.000 g. Odrzuca sie supernatant. Peletke zawiesza sie kolejny raz w pieciokrotnej ilosci wody destylowanej, która za pomoca n/100 HC1 ustala sie do wartosci pH 2,6 50 i pozostawia sie na okres czasu od 3 do 18 godzin. Wartosc pH nie powinna w tym czasie iilec zmianie. Zawiesine odwirowuje sie z predkoscia 23.000 g przez 30 minut.Supernatant pozostawia sie, peletke przemywa sie ponow¬ nie w n/100 NaCl przy wartosci pH 2,6, a nastepnie odwiro- 55 wuje. Powstajacy supernatant usuwa sie. Obydwa wymienio¬ ne wczesniej supernatanty laczy sie razem i poddaje dializie, by wyeliminowac wode destylowana. Po tych czynnosciach nastepuje suszenie przez zamrozenie.Próbna substancje antygenowa otrzymuje sie przez co rozpuszczenie 0,1 mg/ml wysuszonej przez zamrozenie substancji w wodzie destylowanej. W zasadzie takim samym sposobem wytwarza sie roztwór zasadowy proteiny z tkanki nowotworowej (CaBP),.C. Wytwarzanie plytki testowej (por. fig. 1 i fig 2). Ód- 61 waza sie 0,5 g specjalnego agaru czystych kultur (Agaroza); producent Behring-Werke, Marburg) w 50 ml kolbie stozkowej oraz dodaje sie 22,5 ml sterylnej wody podwójnie destylowanej. Do drugiej kolby stozkowej dodaje sie 22,5 ml podwójnie stezonego srodka Tc 199 i 5 ml plazmy, uzyskanej z krwi ludzkiej. Agaroza rozpuszcza sie pod wplywem kolowego potrzasania we wrzacej kapieli wodnej. Przy tym kolbe stozkowa zamyka sie folia lub zatyczka, aby nie wypa¬ rowala czesc wody. Po calkowitym rozpuszczeniu agarozy, kapiel wodna ochladza sie do 47 °C. W tej samej kapieli ogrzewa sie wstepnie mieszanine srodek-plazma i dodaje sie, podczas potrzasania, do agarozy, tak ze uzyskuje sie teraz 50 ml 1 %-owej agarozy w zwyklym srodku Tc 199 z 10%-ami plazmy. Za pomoca wstepnie ogrzanej pipety wylotowej umieszcza sie kazdorazowo 5 ml agaru na okra¬ glych plytkach 10 hodowli tkankowej (plytkach Petriego) o srednicy 50 mm przedstawionych na fig. 1 w widoku z góry. Po zestaleniu sie agaru, za pomoca teleskopowej rurki tlocznej (Behring-Werke, Marburg) wytlacza sie w agarze, przy uzyciu szablonu, otwory 11 o srednicy 2,5 mm, Przy watlaczaniu nalezy zwracac uwage na to, abjf w obszarze wytlaczania, warstwa agaru nie oddzielila sie od warstwy szkla, nie powiekszyla sie warstwa wlosni- czek, przez co uniemozliwilaby wedrówke leukocytów.Uklad otworów 11 jest przedstawiony na/fig. 1. Mozliwe sa oczywiscie inne uklady otworów. Fig. 2 przedstawia, w powiekszonym przekroju, dolna czesc plytki 10. Na fig 2 oznaczono, ze warstwa agaru 1 jest oddzielona od warstwy szklanej plytki 10 za pomoca cienkiej warstwy 3 wlosniczek.Poszczególne szeregi otworów sa przykladowo przeznaczone do:x A— kontroli (standard) B — zawiesiny próbnej, zawierajacej ogólny antygen C— zawiesiny próbnej, zawierajacej antygen chrakterys- tyczny dla danego narzadu D — zawiesiny próbnej, zawierajacej antygen danego narzadu i czynnik przenoszacy D. Reakcja, wyleganie i ustalanie. Do przeprowadzenia próby zastosowano nastepujacy sklad: 1. po 10 fA zawiesiny leukocytów wedlug A oraz 8 ^1 zawiesiny antygenów wedlug B, 2. po 100 fA zawiesiny leukocytów i 8 //l n/100 roztworu' NaCl (na wartosc odniesienia).Zmieszane zestawy 1 i 2 podlegaja inkubacji w okresie 60 minut w szafie iiagrzewczej, w temperaturze 37 °C, przy 100%-owej wilgotnosci powietrza. Nastepnie inkubo- wanym roztworem w ilosci 8//1 substancji, zawierajacej leukocyty i antygeny, lub substancji standardowej, napelnia sie kazdy otwór.Do oceny wedrówki leukocytówi oddzialywania czynników zwalniajacych wedrówke, wyprodukowanych przez limfo¬ cyty, mozna stosowac w zaleznosci od ukladu plytki testo¬ wej (ilosc wytloczonych otworów) 2—5 czynników po¬ miaru, oraz 2 do 5 wartosci odniesienia. Komórki, zawarte w zawiesinie, wprowadzone na poczatku doswiadczenia w otwory wytloczone wedruja do warstwy posredniej 3 miedzy agarem a powierzchnia górna plytki. Dzieki inku¬ bacji plytek w temperaturze 37 °C w szafie nagrzewczej w okresie 18 godzin, utrzymuje sie ta wedrówke w pewnym zdefiniowanym okresie czasu. Leukocyty nie przechodza do agaru, lecz pobieraja od niego jedynie substancje od¬ zywcze.Inkubacje przeprowadza sie przy wzglednej wilgotnosci powietrza, wynoszacej 100%,^w higrostacie. Po inkubacji,112 675 7 plytki przez 15 minut pokrywa sie warstwa metanolu, a nastepnie przez 10 minut roztworem formaliny (37% wagowych metanolu). Nastepnie usuwa sie ostroznie agar w postaci warstewki z dna plytki. Komórki, które przewedro¬ waly do warstwy posredniej, ustalaja sie obecnie na powierz¬ chni górnej plytki. Po wysuszeniu, komórki barwi sie me¬ toda Pappenheima, przy czym na powierzchni górnej plytki powstaja ciemnofioletowe otoczki 1 (por. fig. 1).E. Dokonanie pomiarów i zestawienie wyników. Za po¬ moca lupy mierniczej dokonuje sie pomiaru otoczki we¬ drujacej. Nalezy przy tym uwzglednic komórki o wielo- postaciowym jadrze, lezace pojedynczo na krawedzi. Z wielu pomiarów uzyskuje sie arytmetyczny obraz.Iloraz powierzchni wedrówki Fi, zawierajacej antygen oraz powierzchni wedrówki F2 bez antygenu ujmuje sie ,,wskaznikiem wedrówki:" MI: MI = Fi/F2.- Wskaznik wedrówki <0,85 oznacza zahamowanie leuko¬ cytów w znacznej mierze, a tym samym oznacza pozytywna odpowiedz komórki Tabela I przedstawia przyklad, po¬ miarów. 8 Sporzadzono nastepujace skladniki próby: 1. 100 ju\ zawiesiny leukocytów +8 fi\ roztworu antyge¬ nów 2. 100 jA zawiesiny leukocytów +8 //l roztworu antyge- 5 nów + 20 ju\ roztworu czynnika przenoszacego (preparat Schura, 1 //l odpowiada w przyblizeniu czynnikowi prze¬ noszacemu, wynoszacemu 5 • 105 leukocytów) 3. 100 jA zawiesiny leukocytów 4. 100//l zawiesiny leukocytów +20 fn roztworu czyn- 10 nika przenoszacego jak w przypadku skladu 2.Inkubacja i przygotowanie miski (plytki) odbywa sie tak jak w przykladzie I. Stosuje sie miske z czterema szere¬ gami po 5 wytlocionych otworów o srednicy 2,5 mm.Kazdy z szeregów o 5 otworach pokrywa sie 10 //l skladni- 15 ków próby 1 do 4.Wyniki obejmujace w kazdym przypadku 5 wartosci przedstawia tabela III.Tabela III Sklad 1 2 3 4 Sze¬ reg B C A D Srednica (mm) 6,90 6,05 7,75 7,70 F (mm*) 37,4 28,7 47,2 46,6 MI 0,79 0,61 (lacznie f z czynnikiem przenoszacym 1,0 Standard! 0,99 [ Tabela I Szereg B A Srednica (mm) 6,75 7,55 F (mm2) Fi = 35,8 F2 = 44,75 MI 0,80 Pierwsze badania ogólem 97 pacjentek powinny wykazac skutecznosc próby hamowania wedrówki w przypadku raka gruczolu piersiowego. 27 sposród 46 badanych pacjen¬ tek z rakiem gruczolu piersiowego wykazywalo zahamowanie wieksze od 15%, wynoszace 58,7%, to znaczy ze wskaznik wedrówki MI lezy ponizej 0,85.W przypadku 23 przebadanych pacjentek zaatakowa¬ nych mastopatia, tylko u 4 pacjentek zaobserwowano takze zahamowanie, wynoszace 17%, w przypadku pacjen¬ tek z wlókniakogruczolakiem tylko u jednej pacjentki z pieciu stwierdzono zahamowanie, wynoszace 20%.Tabela II przedstawia ogólny obraz: Tabela II Diagnoza kontrole mastopatia pecherza wlókniakogru- czolak cysty gruczolu piersiowego inne choroby nowotworowe rak gruczolu | piersiowego Liczba pacjentek (n) 20 ' 23 5 4 9 46 Wskaznik wedrówki zahamowany 0(0%) 4(17%) 1 (20%) 0 (0%) 3(33%) 27 (58,7%) normalny 20(100%) , 19(83%) 4 (80%) 4(100%) 6 (67%) 19 (41,3%) | Przyklad II. Zastosowanie .czynnika przenoszacego wcelu wzmocnienia odpowiedzi odpornosciowej. Zwrócono juz wczesniej uwage na to, ze dodanie roztworu, zawiera¬ jacego czynnik przenoszacy (producent: Schura, Krefeld) powoduje wzmocnienie odpowiedzi odpornosciowej. Oka¬ zuje sie, ze pó dodaniu powyzszego roztworu czynnik MI jest silniej uzewnetrzniony niz w przypadku próby z przy¬ kladu I.IB 6,90 37,4 0,79 2 C 6,05 28,7 0,61 (lacznie [ z czynnikiem przenoszacym ¦ 3 A 7,75 47,2 1,0 Standard! | 4 | D | 7,70 | 46,6 | 0,99 | Niska wartosc MI szeregów B/C oznacza przypadek 30 nowotworu zlosliwego.Wyniki próby hamowania wedrówki przy zastosowaniu czynnika przenoszacego podczas stwierdzenia nowotworów zoladkowo-jelitowych.Przeprowadzono pomiary zgodnie z zasadami pomiaru 35 z przykladu II. W grupie kontrolnej zdrowych pacjentów nie zaobserwowano znacznego zahamowania „wskaznik wedrówki" wynosil 1,02 ±0,1. Czynnik przenoszacy nie mial wplywu na te wyniki. W grupie pacjentów, zaatako¬ wanych rakiem okraznicy, wskaznik wedrówki wynosil 40 0,65 ±0,2. Sposród przebadanych 15-tu pacjentów, jede¬ nastu wykazywalo wskaznik wedrówki mniejszy od 0,85.Po dodaniu czynnika przenoszacego wskaznik wedrówki wynosil 0,61 ±0,09. Poza tym, w przypadku czternastu na pietnastu pacjentów wartosc wskaznika wedrówki MI 45 po dodaniu czynnika przenoszacego, lezala ponizej 0,85, tak ze równiez tutaj uzyskano znaczne polepszenie wy¬ ników prób. W innych przebadanych grupach pacjentów nie stwierdzono znacznego zahamowania.Przyklad III. Roztwór antygenów mozna równiez 50 ekstrahowac z komórek nowotworowych, wyhodowanych w kulturze fermentacyjnej in vitro, za pomoca neutralnego bufora na drodze wielokrotnego dtwarcia tkanki.Komórki raka mózgu hoduje sie in vitro w nastepujacy sposób: Nalezy szczególnie zwrócic uwage na calkowicie 55 sterylny sposób pracy, komórki przemywa sie korzystnie w roztworze wyrównawczym Hank'a w czasie 30 sekund.Nalezy unikac mieszania. Wszystkie scianki i powierzchnie górne kolby, korzystnie szklanej kolby o pojemnosci 250 ml, powinny byc dokladnie wymyte. Roztwór oczyszcza sie go z komórek za pomoca odwirowania w niskiej temperaturze w przeciagu 10 minut. Srodek wlewa sie do zlewki. Dodaje sie niewielka ilosc zbuforowanego roztworu enzymu pro- teinazy i szybko plucze, aby uniknac zanikania komórek.W korzystnej postaci sposobu do kolby dodaje sie do dwóch 65 ml roztworu trypsyny (EDTA). Roztwór trypsyny zlewa.B C A D 6,90 6,05 7,75 7,70 37,4 28,7 47,2 46,6/ / 112 6 9 sie po plukaniu po uplywie 10 sekund. Nastepnie dodaje sie jednakowa ilosc swiezego roztworu trypsyny. Podlega on inkubacji do momentu, gdy na podstawie badan mikrosko¬ powych widoczne jest oddzielenie sie komórek od scianek komoryv Nastepuje to zazwyczaj po uplywie 5—10 minut. 5 Dodaje sie odpowiedni srodek wzrostowy na przyklad 50 ml roztworu 7—10%-ego roztworu surowicy z plcdu cielecia w 100 ml srodka odzywczego F — 10. 25 ml swie¬ zego srodka wraz z komórkami przenosi sie do nowej komory wzrostu (kolby) w celu dalszego rozmnazania. 10 Obydwie komory umieszcza sie na okres okolo 7 dni w in¬ kubatorze w którym panuje temperatura 35 °C.Wedlug sposobu postepowania w tym przykladzie az do tego momentu, kultura sztucznych komórek nowo¬ tworowych dzieli sie na dwie swieze kultury w przyblizeniu 15 co 7 dni. Sposób postepowania mozna powtarzac z przer¬ wami siedmiodniowymi. Liczba komórek wyhodowanych v in vitro podwaja sie wiec co siedem dni.Srodek, zawierajacy komórki, wprowadza sie do rury wirówki i odwirowuje w niskiej temperaturze w czasie 20 . 10 minut z predkoscia 3000 obrotów na minute (d ok. 2200 g). Srodek usuwa sie. Komórki pozostale w komorze wzrostowej oddziela sie od scianek komórki i wplukuje wraz z neutralnym roztworem buforowym do rury wirów¬ ki. Komórki prz^rrywa sie dwukiotnie neuti a'nym roztw orem 25 buforowym i ponownie odwirowije w niskiej tempera¬ turze przy predkosci 3000 obrotów/min. (A ok. 2200 g).Srodek usuwa sie. Przemyte komórki zawiesza sie w 10 ml neutralnego buforu fosforanowego do mementu, gdy gotowe sa one do ekstrakcji. Nastepnie przemyte komórki 30 wprowadza sie w niskiej temperaturze na okres 20 sekund do urzadzenia ultradzwiekowego w celu ich rozbicia. Jed¬ nakze nalezy unikac denaturowania1 protein. Po obróbce ultradzwiekami odwirowuje sie reszte komórek przez 30 minut z szybkoscia 30 000 obrotów/min (A ok. 220 CC0 g). 35 Pozostaly produkt dekantuje sie. Do przemywania pozosta¬ lej reszty komórek stosuje sie 10 ml roztworu buforowego.Nastepnie powtórnie przeprowadza sie obróbke ultradzwie¬ kami i odwirowanie, i zestawia sie pozostale predukty.Proces ten powtarza sie jeszcze raz. Zestawiony pozostaly w produkt odparowuje sie wstepnie, aby zmniejszyc jego ilosc z okolo 30 ml do okolo c—7 ml. Odpowiednia czesc pobiera sie do calkowitej analizy proteinowej.Za pomoca chromatografii kolumnowej i saczenia przez miliporowate filtry, preparat zostaje pozbawiony zanie- 45 czyszczen. Szczególy tego procesu znane sa z niemieckiego opisu ogloszeniowego 26 06 257, przyklad 2. Uzyskuje sie polipeptyd o ciezarze czasteczkowym okolo 10 000. Wytwa¬ rza isie roztwór antygenów, zawierajacy stezenie 100 mg antygenu w 1litrze. 50 Doswiadczenia wedlug przykladów 1 i 2 przeprowadza sie ze sztucznie uzyskanym antygenem. Okazalo sie, ze sztucznie uzyskany antygen wywoluje takie samo dzialanie, jak antygen uzyskany z tkanki ludzkiej.Przyklad IV. Zastosowanie antygenu,, charakterys- 55 tycznego dla danego narzadu.A — Uzyskanie zawiesiny leukocytów—jak w przykladzie 1A B — Wytworzenie roztworu antygenów, charakterystycz¬ nych dla danegonarzadu. 60 Z mozliwie swiezo uzyskanej tkanki nowotworowej raka gruczolu piersiowego usuwa sie krew, tkanke tluszczowa i tkanke laczna, a nastepnie kroi sie ja na male kostki i pasma.Wszystkie nastepne kroki postepowania przeprowadza sie w temperaturze 4°C. Kawalki tkanki rozdrabnia sie w po- 65 10 trójnej ilosci 3 molowego roztworu chloiku potasowego na elementy wielkosci grochu. Wartosc pH tej gestej zawiesiny ustala sie na 7,4. Nastepnie tkanke rozdrabnia sie za pomoca homogenizatora UltraturraxR (20 000 Upm).Produkt homogenizacji odstawia sie na 24 godziny. Naste- . pnie poddaje sie go odwirowaniu. Warstwa ochronna, uzyskana po 60-minutcwym odwirowaniu i predkoscia 4 000 g, jest poddawana dializie przez 2. godziny wobec 10-ciokrotnej ilosci wody destylowanej, i przez nastepne 24 godziny wobec 50-ciokrotnej ilosci 0,9%-ego roztworu NaCl. Z produktu dializy, przez dodanie 2 molowego siarczanu amonowego w przeciagu 1 godziny wytracaja sie proteiny i oddzielaja sie na skutek 20-minutowego odwiro¬ wywania z predkoscia 4 000 g. Po zawieszeniu protein w 0,9%-owym roztworze NaCl nastepuje jednogodzinna dializa wobec 5-ciokrotnej ilosci wody destylowanej, oraz nastepna dializa wobec 50-ciokrotnej ilosci 0,9%-owego NaCl. Po sterylnym saczeniu przez filtr 0,95 miliporowaty- makroporowaty ekstrakt antygenów umieszcza sie w ma¬ lych ampulkach i przechowuje w temperaturze —20 °C.Przed uzyciem okresla sie zawartosc protein kazdej ilosci r produktu metoda biuretowa po uprzednim straceniu TCA.C. Stosuje sie taka sama plytke testowa, jak w przykla¬ dzie I. Do przeprowadzenia próby stosuje sie trzy sklady: 1. po 1C0 /l\ zawiesiny leukocytów z krwi pacjenta wedlug przykladu l-A+8 /A roztworu n/100 NaCl (dla szeregu A, standard), 2. po 1C0 fA zawiesiny leukocytów +8 jul zawiesiny antygenów wedlug przykladu 4-B, 3. po 1C0 /ii zawiesiny leukocytów H-8 pt\ zawiesiny anty¬ genów wedlug przykladu 4-B H-15//1 roztworu czynnika przenoszacego.Plytke testowa o srednicy otworu 2,5 mm pokrywa sie 8 ju\ substancji próbnej 1—3, inkubowanej wedlug przykladu 1. Wyniki, uzyskane kazdorazowo z pieciu wartosci sa nastepujace: Tabela IV Sklad 1 2 3 Szereg A C D Srednica 7,70 7,C0 6,10 F (mm2) 46,5 , 38,1 29,3 MI 1,0 0,82 0,63 Wynik swiadczy o obecnosci raka gruczolu piersiowego poniewaz wskaznik wedrówki MI lezy znacznie nizej od 0,8, a wynik znacznie polepsza sie po zastosowaniu czynnika przenoszacego.Dalsze badania wykazuja, ze wyniki uzyskane u pacjentek, wymienione w przykladzie 1, ulegaja znacznym zmianom.Pacjentki z rakiem gruczolu piersiowego, stosujac metode uwzgledniajaca czynnik przenoszacy, wykazywaly w ponad 90% wskaznik wedrówki mniejszy od 0,80. Tylko w przy¬ padku 10 % pacjentek chorych na raka gruczolu piersiowego, wskaznik wedrówki byl wiekszy od 0,85.Przyklad V. Zmiany ruchliwosci limfocytów obcych makrofagów i innych komórek wskaznikowych mierzy sie za pomoca próby wlosniczkowej wedlug Sobórga i Bendi- xena. Do tego celu stosuje sie otwarta rurke kapilarna o grubosci 10 jum. Wyniki sa zgodne z wynikami przykla¬ dów 1 i 2, przy czym zasadniczo stosuje sie jednakowe sklady doswiadczen. - Uwagi koncowe. Sposobu przeprowadzania prób nie stosuje sie w przypadku okreslonych obrazów klinicznych choroby. Falszywie negatywne wyniki uzyskano w przypada ku wszystkich tak zwanych leukoz. Faktu tego nie mozna11 na razie wyjasnic, poniewaz wlasnie komórki bialaczkowe zawieraja bardzo duzo zasadowych protein. Równiez odpornosc komórkowa u tych pacjentów nie jest naruszona w sposób widoczny, aby wynik ten mozna bylo wyjasnic naruszeniem systemu odpornosciowego. Uderzajace jest równiez to, ze chroniczna bialaczka limfatyczna, jak i ostra bialaczka limfatyczna, nie daje reakcji, podczas gdy miesak limfatyczny i ziarnice zlosliwe daja reakcje jak inne nowo¬ twory.Pacjenci wykazuja duze zahamowania przed chemotera¬ pia. Juz po pierwszym cyklu chemoterapii zahamowania te zanikaja, a w drugim cyklu zamieniaja sie w falszywie pozytywna wartosc. Poza tym uzyskuje si,e zle wyniki u pacjentów z wyniszczeniem nowotworowym. Badania u pacjentów z szybko postepujacym wzrostem nowotworu lub u pacjentów z wastepujacym wyniszczeniem nowotwo¬ rowym wykazuja czesciowo zle wyniki, poniewaz zachodzi tutaj naruszenie komórkowej odpornosci.Doswiadczenia prowadzace do uzyskania odpowiedzi na te pytania trwaja. Falszywie pozytywne wyniki uzyskano przede wszystkim w przypadku zapalen i zwyrodnialych schorzen neurologicznych, na przyklad przy stwardnieniu rozsianym. Wyjasnienie tej sytuacji widzi Caspary i Field* w reakcji krzyzowej miedzy EF a uczuleniem limfocytów tkanka mózgowa.Falszywe wyniki mozna z latwoscia wylaczyc przez przeprowadzenie wstepnego badania, talf ze wymienione schorzenia nie stanowia przeszkody do stosowania próby.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób przeprowadzania prób diagnostycznych in vitro w celu stwierdzenia nowotworów zlosliwych, zwlasz¬ cza u ludzi, w którym okresla sie zmiana ruchliwosci komórkowych skladników krwi, napotykajacych czynnik hamowania wedrówki (MIF), przy czym czynnik hamo¬ wania wedrówki jest wyodrebniony z limfocytów, uczulo¬ nych na tkanke nowotworowa, znamienny tym, ze badane limfocyty, bodace czescia zawiesiny leukocytów, jako ko¬ mórkowe skladniki krwi, poddaje sie próbie hamowania wedrówki, w czasie trwania której limfocyty napotykaja antygen, inicjujacy tworzenie cz/nnika hamujacego we¬ drówke (MIF) i nastepnie podlegaja inkubacji, a po pewnym okreslonym czasie wedrówka leukocytów ulega zahamowaniu i ustaleniu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze pred¬ kosc wedrówki leukocytów mierzy sie we wlosniczkowej warstwie . posredniej o grubosci 1—20 urn, wypelnionej co najmniej czesciowo ciecza. 3. Sposób wedlug zastrz, 2, znamienny tym, ze warstwe 675 12 posrednia ogranicza sie z jednej strony przez srodek obo¬ jetny (np. szklo), a z drugiej strony przez warstwe agaru, wzbogacona substancjami odzywczymi. 4. Sposób wedlug zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, ze 5 próbe przeprowadza sie za pomaca doswiadczenia z boga¬ tym w leukocyty supernatantem („buffycoat"), uzyskanym z krwi czlowieka, o stalej liczbie leukocytów, lezacej w gra¬ nicach miedzy 105 a 107 w kazdym doswiadczeniu. 5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze do 0 próby dodaje sie roztwór antygenu wedlug Caspary'ego " i Fielda lub ekstrakt 3 m KC1 z tkanki nowotworowej wedlug Mettzera w proporcji od-1:6Q do 1:10 (próba ilosciowa do roztworu antygenu). 6. Sposób wedlug zastrz. 5, znamienny tym, ze do 5 próbki dodaje sie roztwór antygenu, charakterystyczny dla danego narzadu. ¦7. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym,, ze do doswiadczenia wprowadza sie roztwór antygenu, uzyskany z komórek nowotworowych, wyhodowanych w probówce 1 (in vitro), zawierajacy od 50 do 200 mg antygenu na 1.000 ml odpowiedniego do tego celu wodnego rozpuszczalnika. 8. Sposób wedlug zastrz. 4 do 7, znamienny tym, ze do doswiadczenia poza roztworem antygenu stosuje sie do¬ datkowo roztwór czynnika przenoszacego. 1 9. Sposób wedlug zastrz. 8, znamienny tym, ze stosuje sie liczbe leukocytów, z których uzyskuje sie dodatkowa ilosc czynnika przenoszacego w stosunku do liczby leuko¬ cytów, obecnych w doswiadczeniu, w proporcji od 1:1 do 1:103. x 10. Sposób wedlug zastrz. 1 do 9, znamienny tym, ze czas inkubacji w próbie hamowania wedrówki ustala sie w granicach miedzy 10 a 30 godzin, a inkubacja odbywa sie w temperaturze od 35 do 37,5°C, przy wzglednej wilgot¬ nosci powietrza od 90 do 100%. 11. Plytka testowa do przeprowadzania prób diagnostycz¬ nych in vitro w celu stwierdzenia nowotworów zlosliwych, zwlaszcza u ludzi, znamienna tym, ze posiada plaska plytke lub miske nosna (10) z materialu obojetnego, korzyst¬ nie szkla, na której jest naniesiona zestalona warstwa agaru 1 o gruboscr2—5 mm, przy czym miedzy plytka lub miska nosna (10) a warstwa agaru znajduje sie wlosniczkowa warstwa wedrujaca o grubosci 1—20 //m, a warstwa agaru jest zaopatrzona w co najmniej dwa, zasadniczo kolowe otwory wytlaczane (11) o srednicy miedzy 0,5 a 5 mm, korzystnie 2,5 mm. 12. Plytka wedlug zastrz. 11, znamienna tym, ze wytlaczane otwory sa tak uksztaltowane, aby równiez w obszarze przejsciowym od otworu tloczonego do warstwy kapilarnej zagwarantowana byla jednorodnosc wlosniczko¬ wej warstwy wedrujacej.112 675 ® ® © (5) Fig.l 10 1 n Wjl.nii.'i.'i)i';jjlij.ij,i).i;i|i;.i;i|..jji.i|.iiu'.Fig. 2 PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL