CH619947A5

CH619947A5 -

Info

Publication number: CH619947A5
Application number: CH1063676A
Authority: CH
Inventors: Vernon V Younq; John Stanley Kosewicz; Frederick William Schmitz
Original assignee: Int Minerals & Chem Corp
Priority date: 1975-08-22
Filing date: 1976-08-20
Publication date: 1980-10-31
Also published as: PT65502A; SE7609237L; GR60367B; PH12835A; NO762878L; BE845377A; IE43505L; NO147878C; IL49934A; PT65502B; FI762388A; DE2631442A1; CA1057220A; ATA533876A; AU501843B2; IE43505B1; ZA763861B; ES450991A1; IL49934A0; NO147878B

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Isolierung von Zearalenon aus einer wässrigen Mischung, 50 die eine wässrige Phase sowie eine feste Phase enthält, wobei in der festen Phase Zearalenon und andere Feststoffe enthalten sind. Zearalenon kann die durch die folgende chemische Strukturformel dargestellt werden:

55

60 HO

OH O ÇH3

,C - O — CH — (CH2)3-

'CH = CH - (CH2) 3-

'C = O

Zearalenon ist ein natürliches Fermentationsprodukt, welches durch die Kultivierung von einem Zearalenon produzierenden Stamm des Mikroorganismus Gibberelia zeae auf einem 65 geeigneten wässrigen Nährmedium erhalten werden kann.

Verfahren zur Herstellung von Zearalenon durch Fermentation von Gibberelia zeae in einem wässrigen Nährmedium wurden z.B. von Andrews, F.N. et al., U.S. Patent Nr.

3

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3 196 019 vom 20. Juli 1965 und Keith, C.L., U.S. Patent Nr. 3 661 712 vom 9. Mai 1972 beschrieben.

Beim von Andrews et al. beschriebenen Fermentationsverfahren verwendet man vorzugsweise ein festes, poröses Substrat als Nährmedium. Der von Keith beschriebene Fer-mentationsprozess umfasst eine submerse Kultivierung einer submersen Zearalenon produzierenden Kultur von Gibberelia zeae in einem geeigneten, belüfteten Nährmedium flüssiger Phase, wie z.B. eine wässrige Lösung mit einer Kohlehydratquelle, einer organischen oder anorganischen Stickstoffquelle, Mineralien und anderen Nährstoffen.

Das fermentierte Medium, welches Zearalenon, Wasser und nicht gelöste Feststoffe enthält, wie z.B. das Gibberelia zeae-Mycel, wird hier im allgemeinen als Fermentationsbrühe bezeichnet. Zearalenon ist praktisch unlöslich in der Fermentationsbrühe und daher ist es nötig, ein Verfahren für dessen Isolierung aus der Fermentationsbrühe mit hoher Ausbeute und mit hoher Reinheit bereitzustellen.

Das vorliegende erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man a) Zearalenon mit einer zearalenon-selektiven Lösungs-Mischung in Berührung bringt, die im wesentlichen aus einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel und Wasser besteht, und zwar in solchen Mengen, die ausreichen, das Zearalenon selektiv aufzulösen und es von der festen Phase in die wässrige Phase zu übermitteln, damit eine pumpfähige Zearalenonlösung entsteht;

b) die nicht aufgelösten Feststoffe aus der Zearalenon-Lösung bei einer Temperatur, die genügend hoch ist, das Zearalenon in Lösung zu halten und genügend niedrig ist, um eine Auflösung der Feststoffe zu verhindern, entfernt, wobei sich eine geklärte Zearalenonlösung bildet;

c) das Verhältnis von Wasser zu den mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln in der geklärten Zearalenonlösung erhöht, um das Zearalenon auszufällen; und d) das ausgefällte Zearalenon aus seiner Mutterlauge bei einer Temperatur abtrennt, bei welcher das Zearalenon in der Mutterlauge praktisch unlöslich ist.

Das erfindungsgemäss erhaltene Zearalenon stellt ein Zwischenprodukt zur Herstellung wichtiger pharmazeutischer Mittel dar, hat aber selbst keinerlei pharmakologische Wirkungen.

Das vorliegende erfindungsgemässe Verfahren ist insbesondere nützlich zur Isolierung von Zearalenon aus einer wässrigen Mischung und es wird mit Vorteil zur Isolierung von Zearalenon aus einer Fermentationsbrühe verwendet. Das erfindungsgemässe Verfahren kann zur Isolierung von Zearalenon aus einer flüssigen Fermentationsbrühe eingesetzt werden, die durch Submers-Kultivierung erhalten wurde, wie es von Keith, C.L., supra beschrieben ist, man kann aber auch ein festes, poröses Substrat als Ausgangsprodukt einsetzen, wie es von Andrews, F. N. et al., supra angeführt wurde.

Unter Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Zearalenon mit einer zearalenon-selektiven Mischung in Berührung gebracht, die im wesentlichen aus einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und Wasser besteht; anschliessend wird diese Lösung manchmal als wässrige Lösungsmittelmischung bezeichnet. Die Menge der verwendeten wässrigen Lösungsmittelmischung muss ausreichend sein, um die Gesamtmenge von Zearalenon selektiv zu lösen und praktisch die ganze Menge aus der festen Phase in die wässrige Phase zu übermitteln. Die Menge an Wasser in der wässrigen Lösungsmittelmischung wird in gewissen Grenzen variieren, ebenso auch das besondere, mit Wasser mischbare verwendete organische Lösungsmittel. Die Menge an isoliertem Zearalenon wird verschieden sein, und ebenfalls können gewisse Temperaturunterschiede bestehen. Die Konzentration des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels in der wässrigen Lösungsmittelmischung wird sich in Abhängigkeit von dem verwendeten Lösungsmittel verändern. Der Grund für die Verwendung einer Mischung aus Wasser und dem mit Wasser mischbaren organischen^ 5 Lösungsmittel, eher als nur ein Lösungsmittel, beruht darauf, dass man eine minimale Menge des organischen benötigten Lösungsmittels einsetzen kann, damit eine Aufschlämmung besteht, die man bequem und sicher in üblichen Vorrichtungen für Flüssigkeiten verwenden kann, es entsteht nämlich io eine pumpbare Aufschlämmung. Um die minimale Konzentration des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, das in einer wässrigen Lösungsmittelmischung verwendet werden kann, zu bestimmen, muss man zuerst die Gesamtmenge der Flüssigkeit festlegen, die nötig ist, damit ein 15 Schlamm der gewünschten flüssigen Konsistenz entsteht. Basiert auf dieser Gesamtmenge der zu verwendenden wässrigen Lösungsmittelmischung ist das Verhältnis von Wasser zu dem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel vorzugsweise ein solches, dass die wässrige Lösungsmittelmi-20 schung das vorhandene Zearalenon auflösen wird. Man kann beliebige mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel verwenden, die die Eigenschaft haben, dass sie zearalenon-selektiv sind, man kann wässrige Lösungsmittelmischungen einsetzen, und mit Vorteil enthalten derartige Lösungsmittel 23 oder Lösungsmittelmischungen Sauerstoff enthaltende aliphatische Verbindungen, wie z.B. Aceton und Alkanole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie z.B. Methanol, Äthanol, Pro-panol und Butano], Wegen seiner Lösungsmitteleigenschaften wird im erfindungsgemässen Verfahren Aceton bevorzugt; 30 aber wegen der leichten Zugänglichkeit kann man Methanol ebenfalls als mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel einsetzen, weil es in der Regel viel weniger kostet als Aceton und ausserdem besitzt es einen niedrigeren Flammpunkt als Aceton und aus diesen Gründen ist es auch sicherer, 35 Methanol einzusetzen.

Das Volumen der wässrigen Lösungsmittelmischung, die verwendet werden kann, ist im allgemeinen ein solches, dass sie ausreicht, damit Aufschlämmungen entstehen, welche 10% bis 60 Gew.-% an Feststoffen enthalten, vorzugsweise 30 bis 4o 50 Gew.-% an Feststoffen. Derartige Aufschlämmungen sind im allgemeinen pumpbare Flüssigkeiten, welche man in üblichen! Vorrichtung für flüssige Reaktionslösungen einsetzen kann. Eine flüssige Fermentationsbrühe, erhalten aus einer Submers-Fermentation, hat im allgemeinen eine ent-45 sprechende flüssige Konsistenz für Verwendung in derartigen Vorrichtungen, so dass die wässrige Lösungsmittelmischung in situ hergestellt werden kann, indem man genug mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel zu der Fermentationsbrühe gibt, damit das Zearalenon darin löslich ist. 50 Es wird bevorzugt, die Feststoffe aus einer derartigen flüssigen Fermentationsbrühe zu entfernen, z.B. durch Filtration oder durch Zentrifugieren, bevor man das Zearalenon mit der zearalenon-selektiven Mischung in Berührung bringt. Eine derartige Abtrennung zur Entfernung der aufgelösten 55 Verunreinigungen bevor der Isolierung von Zearalenon kann erzielt werden, wenn man dann geringere Volumen der wässrigen Lösungsmittelmischung vor der Isolierung einsetzt. Wenn man eine derartige Isolierungsmethode verwendet, so werden die Feststoffe, nachfolgend manchmal als Filterkuchen be-60 zeichnet, welche das Zearalenon enthalten, in der Regel mit der wässrigen Lösungsmittelmischung aufgeschlämmt. Das Volumen der verwendeten wässrigen Lösungsmittelmischung sollte ausreichend sein, damit eine praktisch flüssige Aufschlämmung entsteht, die einen derartigen Feststoff-Gehalt 65 aufweist, wie weiter oben beschrieben, und vorzugsweise ist ihr Volumen demjenigen des Volumens der Fermentationsbrühe gleich, aus welcher die Feststoffe erhalten wurden.

Falls man das vorliegende efindungsgemässe Verfahren für

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4

die Isolierung von Zearalenon aus festen, porösen Substraten anwendet, so kann man die Auflösung von Zearalenon auf die gleiche Weise durchführen, wie bei der Gewinnung aus dem Filterkuchen aus einer flüssigen Fermentationsbrühe.

Eine bevorzugte wässrige Lösungsmittelmischung weist 40 bis 60% an Aceton auf, bezogen auf das Volumen; mit Erfolg kann man jedoch wässriges Aceton einsetzen, das 25% bis 50% Aceton aufweist, bezogen auf das Volumen. Wässriges Methanol und Äthanol sind äusserst wirksam mit einer Konzentration von 50 bis 75 Vol.-%; es besteht jedoch auch die Möglichkeit, Konzentrationen von 40% bis im wesentlichen von 100% einzusetzen, bezogen auf das Volumen. Propanol und Butanol sind bei Konzentrationen von 75 bis im wesentlichen von 100 Vol.-% wirksam, insbesondere bei Konzentrationen von 90 bis im wesentlichen von 100 Vol.-%.

Das sich in der wässrigen Mischung befindliche Zearalenon wird gewöhnlich mit dem wässrigen Lösungsmittel während einer Zeit in Berührung gebracht, die genügt, um praktisch die Gesamtmenge an vorhandenem Zearalenon selektiv zu lösen, wobei sich eine Zearalenon-Lösung bildet. Die benötigte Zeit wird von der eingesetzten wässrigen Lösungsmittelmischung sowie auch von der Temperatur der wässrigen Lösungsmittelmischung usw. abhängen, aber im allgemeinen braucht man 10 Minuten bis 5 Stunden, vorzugsweise 30 Minuten bis 2 Stunden, um die Gesamtmenge an Zearalenon aufzulösen. Nachdem das Zearalenon aufgelöst wurde, entfernt man die nicht aufgelösten Feststoffe aus der Zearalenonlösung z.B. durch Filtration oder durch Zentrifugieren, wobei eine geklärte Zearalenonlösung zurückbleibt. Die Temperatur des Lösungsmittels während der Abtrennung ist vorzugsweise hoch genug, damit das Zearalenon in Lösung bleibt und ausserdem ist die Temperatur vor allem niedrig genug, um zu vermeiden, dass die anderen Feststoffe gelöst werden. Im allgemeinen arbeitet man etwa bei Zimmertemperatur oder bei wenig erhöhter Temperatur, im wesentlichen unterhalb des Siedepunktes der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, und dabei erhält man zufriedenstellende Resultate. So kann man z.B. zwischen 10°C bis 60°C arbeiten, vorzugsweise in einem Bereich von 20 bis 40°C. Die verbrauchten Feststoffe können verworfen werden oder man kann sie auch wieder extrahieren, um Spuren von zurückgebliebenem Zearalenon zu entfernen.

Das Zearalenon, welches in der geklärten Zearalenon-Lösung niedergeschlagen wurde, wird vorzugsweise in quantitativer Menge ausgefällt, indem man das Verhältnis von Wasser in bezug auf das wasserlösliche organische Lösungsmittel erhöht. Diese Erhöhung kann insbesondere durchgeführt werden, indem man die gesamte Menge des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels aus der geklärten Zearalenonlösung durch geeignete Methoden entfernt, z.B. durch Verdampfung unter Verwendung eines Stromes von Luft oder durch Destillation bei atmosphärischem oder reduziertem Druck. Die Destillation bei reduziertem Druck wird vorzugsweise bei etwa 200 mm Hg oder weniger durchgeführt und sie stellt die bevorzugteste Methode zur Entfernung der mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel dar. Falls man diese Methode zur Entfernung des Lösungsmittels anwendet, so kann man die Abwesenheit des Lösungsmittels durch die Feststellung der Temperatur am Ende der Destillationskolonne feststellen. Ein Temperaturanstieg bis ungefähr zum Siedepunkt des Wassers beim verwendeten Druck zeigt an, dass praktisch die gesamte Menge an Lösungsmittel entfernt wurde.

Ein anderes bevorzugtes Verfahren, um das Verhältnis von Wasser zum mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel zu vergössern, beruht darauf, Wasser zu der geklärten Zearalenonlösung hinzuzufügen. Das Wasser wird dabei gewöhnlich solange hinzugegeben, bis das Zearalenon bei einer weiteren Zugabe von Wasser aufhört, sich niederzuschlagen. Eine einfache Methode festzustellen, wann genügend Wasser hinzugefügt wurde, sieht folgendermassen aus:

Ein kleiner entsprechender Bruchteil der Mischung wird in eine Teströhre filtriert. Falls Zearalenon durch die Zugabe von Wasser in die Teströhre nicht mehr ausfällt, so wurde eine quantitative Ausfällung erzielt.

Nach der Ausfällung kann das Zearalenon aus seiner Mutterlauge durch beliebige Methoden entfernt werden, wie z.B. durch Filtration oder durch Zentrifugieren. Während der Abtrennung wird die Temperatur vorzugsweise auf einem solchen Niveau gehalten, dass das Zearalenon praktisch in seiner Mutterlauge unlöslich ist. Im allgemeinen liegen die Temperaturen in einem Bereich von 0°C bis 40°C, und dieser Bereich wurde als sehr vorteilhaft befunden. Der bevorzugte Temperaturbereich befindet sich zwischen 15°C bis 25°C. Die erhaltenen Zearalenonkristalle können mit Wasser gewaschen und dann getrocknet werden.

Nach dem vorliegenden erfindungsgemässen Isolierungsverfahren erhält man in der Regel Ausbeuten von etwa 80% und die Reinheit des erhaltenen Produktes liegt in einem Bereich von 85 bis 95%. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens beruht darauf, dass das Filtrieren von Zearalenon enthaltenden Aufschlämmungen, wie z.B. flüssige Fermentationsbrühen, durch die Zugabe von mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln sehr erleichtert wird. Man muss keine oder nur sehr wenig Filterhilfsmittel verwenden, und auf diese Weise wird die Isolierung erleichtert und die Ausbeuten werden erhöht. Durch die Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens erzielt man ein wirksames Isolierungsverfahren, bei welchem minimale Mengen an organischen Lösungsmitteln benötigt werden, man kann übliche Vorrichtungen zur Anwendung mit Flüssigkeiten einsetzen, und ausserdem sind die Verfahrensbedingungen viel einfacher, verglichen mit der Verwendung von reinen, nicht mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln.

In den folgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens dargestellt, ohne dass durch die Angabe der genannten Beispiele die vorliegende Erfindung eingeschränkt wird.

Beispiel 1

Eine Zearalenon enthaltende Fermentationsbrühe wurde folgendermassen hergestellt: Die erste Stufe A der Fermentation begann man mit 100 ml einer Bennett-Brühe in einem Erlenmeyerkolben von 500 ml Inhalt mit 5 ml eines entsprechenden Teils einer Mycelsuspension eines eintauchbaren, Zearalenon produzierenden Stammes von Gibberelia zeae. Die Bennett-Brühe hatte die folgende Zusammensetzung:

Glukose

10

g/1

NZ Amin-Typ A

2

8/1

Weizen-Extrakt

1

g/1

Rinder-Extrakt

1

g/1

Natriumchlorid

2,5

g/1

H20 zum Auffüllen auf das gewünschte Volumen

NZ-Amin-Typ A ist ein Hydrolysat auf Pankreasbasis von Kasein, welches, in Form von gemischten Aminosäuren und Peptiden, alle Aminosäuren enthält, die ursprünglich im Kasein anwesend waren. Es kann von Sheffield Chemical Division of National Dairy Products, Norwich, New York erhalten werden.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

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Das Gefäss wurde bei einer Temperatur von 30°C in einem sich drehbaren Schüttelapparat 20 bis 24 Stunden lang inkubiert.

In jede der 6 Flaschen von Stufe B gab man 5 ml der Mischung von Stufe A und 100 ml der Bennett-Brühe. Man wendete die gleichen Fermentationsbedingungen wie in Stufe A der Fermentation an.

Jede der 6 Flaschen von Stufe C enthielt 2 Liter der Bennett-Brühe in einem 6 Liter-Erlenmeyergefäss, das mit mit einem Seitenarm und einem Schlauch zur Überführung des Inoculums versehen war und dieser Kolben wurde mit dem gesamten Inhalt der Flasche von Stufe B inokuliert. Man inkubierte die Mischung 4 Stunden lang bei einer Temperatur von 30°C auf einem wechselweise arbeitenden Schüttelapparat.

In jedem der ca. 380 Liter-Saat-Fermentatoren bereitete ca. 190 Liter der Bennett-Brühe für die End-Innoculum-Stufe vor. Jeder dieser Fermentatoren wurde mit 3 Flaschen der Stufe C inokuliert. Die Mischungen wurden 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 28 bis 30°C inkubiert. Rühren und Belüftung jeder dieser Mischungen wurde durchgeführt, indem man einen Luftstrom durch einen kreisförmigen Auf-guss-Apparat mit einer Menge von etwa 140 bis 200 Liter pro Minute hindurchleitete.

Die Inhalte der beiden Saat-Fermentatoren wurden verwendet, um ca. 5110 Liter des Produktionsmediums (totales Volumen ca. 5490 Liter) zu inokulieren. Das Produktionsmedium hatte die folgende Zusammensetzung:

Glukose 330 g/1

Speck-Öl 600 ml

Kaliumchlorid 0,25 g/1

Magnesiumsulfat . 7H20 0,25 g/I

10

Kaliumphosphat,

dibasisch, wasserfrei 0,50 g/1

Harnstoff 4,10 g/1 NZ Amin-Typ AG

(Sheffield) 3,00 g/1

Zinksulfat . 7HzO 1,0 ppm destilliertes Wasser zum Auffüllen auf das gewünschte Volumen

Das Medium wurde bei einer Temperatur von 121°C 14 Minuten lang in einem Autoklaven gehalten und dann 15 schnell in ein vorgekühltes Kühlgefäss gepumpt. Anschliessend inokulierte man den Inhalt der Saat-Fermentatoren und inkubierte bei einer Temperatur von 21 bis 22°C etwa 21 Tage lang. Das Medium wurde mit Luft durch einen kreisförmigen Aufgussapparat belüftet, der mit einem Drei-Turbi-20 nen-Rührer mit einer Bewegung von 105 Umdrehungen pro Minute arbeitete.

Zu jeder der acht Portionen von 500 ml der Fermentationsbrühe gab man 5 g Filterhilfsmittel und 500 ml Aceton. Die Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und dann un-25 ter Vakuum filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 100 ml von 50%igem wässrigem Aceton gewaschen. Man vereinigte das Filtrat und die Waschlösungen, rührte und das Aceton wurde durch Verdampfen bei Zimmertemperatur unter einem Strom von trockener Luft verdampft. Man sammelte das aus-30 geschiedene Zearalenon auf einem rauhen Filter, der aus gesintertem Glas bestand, es wurde mit Wasser gespült und anschliessend getrocknet.

In jedem der acht Läufe wurden eine oder mehrere Proben der Fermentationsbrühe, des Filterkuchens, des Filtrâtes 35 und des isolierten Zearalenons auf den Zearalenon-Gehalt nach bekannten Methoden untersucht. Die Resultate der Proben sind in der nachfolgenden Tabelle I zusammengestellt.

TABELLE I

Lauf

Fermentationsbrühe Zearalenon Gewicht, g/1

Filterkuchen Gewicht Z-Gehalt g (1) Gew.-%

Volumen ml

Filtrat

Z-Gehaìt g/1

ausgefälltes Zearalenon Gewicht Reinheit Gewinnung g Gew.-% Gew.-%

1

8,1

43,5

0,35

510

Nil

4,25

94,9

99,5

2

8,1

44,1

0,06

514

Nil

4,50

90,6

Quan.

3

14,5

46,8

0,00

513

Nil

8,23

97,7 (2)

Quan.

4

14,5

46,7

0,21

509

Nil

7,60

94,5

98,0

5

11,6

—

6,10

90,3

95,0

6

11,6

—

6,25

91,0

98,0

7

17,0

—

9,45

92,4

Quan.

8

17,0

—

9,30

92,2

Quan.

(x) ungefähres Gewicht des Mycels etwa 10-15 g (2) die Reinheit der Probe kann hoch sein

Beispiel 2

65 In jedem von sechs Läufen stellte man 1500 ml Fermentationsbrühe nach dem Verfahren her, welches in Beispiel 1 beschrieben ist, und fügte 1500 ml Aceton hinzu. Dann gab man Kohle zu der Mischung, wie es in Tabelle II angegeben

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6

ist. Die Mischung wurde eine halbe Stunde lang gerührt, filtriert und dann spülte man den Filterkuchen mit 300 ml von 50%igem wässrigem Aceton. Das Filtrat und die gespülten Lösungen wurden vereinigt und man entfernte das Aceton folgendermassen:

Die Vorrichtung zur Entfernung des Acetons bestand aus einem 2-Liter Harz-Topf, der mit einem Rührer, einem Tropftrichter, einem Thermometer, einem Kühler und Mittel zur Kontrolle des Vakuums versehen war. Man gab in Harz-Topf 200 ml Wasser, erhitzte auf eine Temperatur von ungefähr 60°C und dann wurde das Acetonfiltrat während einer Periode von 4 Stunden langsam hinzugefügt. Das Verfahren war beendet, wenn die Temperatur des Gefässes bei einem Druck von 200 mm Hg auf 70°C angestiegen war. Die zurückgebliebene Wasser-Zearalenon-Aufschlämmung wurde auf eine Temperatur von 20°C abgekühlt und unter Verwendung eines rauhen, aus gesintertem Glas bestehenden Trichters filtriert. Die Zearalenonkristalle wurden mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Der Zearalenon-Gehalt wurde analytisch in der Fermentationsbrühe bestimmt, ebenfalls auch im Filterkuchen, im Filtrat und im isolierten Zearalenon. Die erhaltenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle II zusammengestellt.

TABELLE II

Lauf

Fermentationsbrühe Zearalenonprobe, g/1

Kohle g ausgefälltes Zearalenon Gewicht Reinheit Isolierung g Gew.-% Gew.-%

1

2

3

4

5

6

17,0 17,0 13,3 13,3 13,6 13,6

keine 20,0 15,0 15,0 15,0 15,0

27,30 26,80 20,80 20,35 21,00 20,70

91,0 91,4

94.6

94.7 92,2 94,0

97,4 96,1

98.4

96.5 94,4 95,3

Beispiel 3

Man wiederholte das Verfahren von Beispiel 2 in allen Einzelheiten, aber mit der Ausnahme, dass man 4500 ml Methanol für die 1500 ml Aceton ersetzte. Man konnte Zearalenon mit befriedigender Ausbeute erhalten.

Beispiel 4

Der Versuch von Beispiel 2 wurde in allen Einzelheiten wiederholt, aber mit der Ausnahme, dass man 4500 ml Äthanol für die 1500 ml Aceton ersetzte. Zearalenon konnte mit befriedigender Ausbeute erhalten werden.

Beispiel 5

1500 ml einer zearalenon-haltigen Fermentationsbrühe wurde hergestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben und dann filtriert. Man schlämmte den Filterkuchen bei Zimmertemperatur mit 300 ml 50%igem Aceton (Volumen) in Wasser während etwa einer Stunde auf. Die Aufschlämmung wurde dann filtriert und die erhaltenen Feststoffe mit 300 ml 50%-igem Aceton in Wasser, bezogen auf das Volumen, gewaschen. Man gab das erhaltene Filtrat in einen Vakuum-Destillationsapparat und dort destillierte man bei einem Druck von etwa 200 mm Hg so lange, bis die Temperatur am oberen Ende der Destillationskolonne 67°C erreichte. Das Filtrat wurde dann auf etwa 20°C abgekühlt und man entfernte das ausgeschiedene Zearalenon durch Filtration. Die Zearalenonkristalle wurden mit Wasser gewaschen und getrocknet.

Nach dem Verfahren erhielt man 87,5 Gew.-%, bezogen auf ein 100%iges Produkt, wobei das Material etwa 94 Gew.-% Zearalenon enthielt.

Beispiel 6

Eine Zearalenon enthaltende Fermentationsbrühe (1500 ml) wurde auf die gleiche Weise hergestellt wie es in Beispiel 1 beschrieben ist und dann filtriert. Man schlämmte den Filterkuchen bei Zimmertemperatur während etwa einer Stunde mit 1500 ml Methanol auf. Die Aufschlämmung wurde dann filtriert und die entstandenen Feststoffe wurden mit 300 ml Methanol gewaschen. Man gab das Filtrat in einen Vakuum-Destillationsapparat und verdünnte mit etwa 600 ml Wasser. Die Mischung wurde bei einem Druck von etwa 200 mm Hg solange destilliert, bis die Temperatur am Ende der Kolonne einen Wert von etwa 60°C erreicht hatte. Das Filtrat wurde dann auf eine Temperatur von etwa 20°C abgekühlt und schliesslich wurden die ausgeschiedenen Zearalenonkristalle mit Wasser gewaschen und getrocknet. Nach dem Verfahren erhielt man eine Ausbeute von etwa 98 Gew.-%, bezogen auf ein 100%iges Produkt und das erhaltene Material enthielt etwa 94 Gew.-% Zearalenon.

Beispiel 7

Man gab etwa 13 Pfund Diatomeenerde zu 156 Gallonen einer Zearalenon enthaltenden Fermentationsbrühe, die hergestellt wurde, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die er50

55

60

7

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haltene Mischung wurde dann filtriert. Der erhaltene Filterkuchen wurde mit etwa 146 Gallonen einer 72%igen Mischung von Aceton in Wasser, bezogen auf das Volumen, etwa eine Stunde lang aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde filtriert und man gab das Filtrat in ein Verdampfungs-gefäss. Man destillierte die Lösung bei einem Druck von etwa 100 mm Hg so lange ab, bis man eine Temperatur von etwa 53°C erreichte. Die Lösung wurde dann auf eine Temperatur von etwa 30 bis 35°C abgekühlt u. filtriert. Man gab das Filtrat in den Verdampfer zurück und destillierte nochmals bis zu einer Temperatur von 55°C und filtrierte. Die isolierten Zearalenonkristalle wurden gereinigt und getrocknet. Nach dem Verfahren erhielt man eine Ausbeute von etwa 84 Gew.-%, bezogen auf ein 100%iges Produkt, und das erhaltene Material hatte einen Gehalt an Zearalenon von etwa 85 Gew.-%.

Beispiel 8

Man wiederholte das Verfahren von Beispiel 6 in allen Einzelheiten, aber mit der Ausnahme, dass man Äthanol für Methanol ersetzte. Zearalenon wurde isoliert und mit annehmbarer Ausbeute und genügender Reinheit erhalten.

Beispiel 9

Man wiederholte das Verfahren von Beispiel 6 in allen Einzelheiten, aber mit der Ausnahme, dass man 2-Propanol für Methanol ersetzte. Zearalenon wurde mit annehmbarer Ausbeute und genügender Reinheit erhalten.

Beispiel. 10

5 Man wiederholte das Verfahren von Beispiel 5 in allen Einzelheiten, aber mit der Ausnahme, dass man eine 70%ige Volummischung von Methanol in Wasser für eine 50%ige Volummischung von Aceton in Wasser ersetzte. Zearalenon konnte mit zufriedenstellender Ausbeute und genügender io Reinheit isoliert werden.

Beispiel 11

Man stellte ein festes Fermentationssubstrat her, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist (U.S.-Patent Nr. 3 196 019 von 15 Andrews). 100 g des fermentierten Substrates wurden in 200 ml einer 60% igen wässrigen Acetonlösung, bezogen auf das Volumen, aufgeschlämmt. Die Aufschlämmung wurde bei Zimmertemperatur filtriert und dann wurde der Filter-kuchen mit einer zusätzlichen Menge von 50 ml 50%igem 20 wässrigem Aceton, bezogen auf das Volumen, gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösung wurden vereinigt und einen Destillationsapparat gegeben. Die Lösung destillierte bei einem Druck von 200 mm Hg bis die Temperatur am Ende der Destillationskolonne einen Wert von 67°C erreichte. Die 25 Destillationslösung wird dann auf etwa 20°C abgekühlt und man isolierte das ausgeschiedene Zearalenon mit zufriedenstellender Ausbeute und guter Reinheit.

v

Claims

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2

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Isolierung von Zearalenon aus einer wässrigen Mischung, die eine wässrige Phase und eine feste Phase aufweist, wobei in der festen Phase Zearalenon und andere Feststoffe enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, dass man a) Zearalenon mit einer zearalenon-selektiven Lösungs-Mischung in Berührung bringt, die im wesentlichen aus einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel und Wasser besteht, und zwar in solchen Mengen, die ausreichen, das Zearalenon selektiv aufzulösen und es von der festen Phase in die wässrige Phase zu übermitteln, damit eine pumpfähige Zearalenonlösung entsteht;

b) die nicht aufgelösten Feststoffe aus der Zearalenon-Lösung bei einer Temperatur, die genügend hoch ist, das Zearalenon in Lösung zu halten und genügend niedrig ist, um eine Auflösung der Feststoffe zu verhindern, entfernt, wobei sich eine geklärte Zearalenonlösung bildet;

c) das Verhältnis von Wasser zu den mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln in der geklärten Zearalenonlösung erhöht, um das Zearalenon auszufällen; und d) das ausgefällte Zearalenon aus seiner Mutterlauge bei einer Temperatur abtrennt, bei welcher das Zearalenon in der Mutterlauge praktisch unlöslich ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel aus der Gruppe Aceton, Methanol, Äthanol, Propanol und Buta-nol ausgewählt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel Aceton ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel Methanol ist.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung aus Wasser und Aceton das Aceton mit einer Konzentration von 25% bis im wesentlichen von 100% enthält, bezogen auf das Volumen.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung aus Wasser und Aceton das Aceton in einer Konzentration von 40% bis 60% enthält, bezogen auf das Volumen.
7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung aus Wasser und Methanol das Methanol in einer Konzentration von 40% bis 75% enthält, bezogen auf das Volumen.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung aus Wasser und Methanol das Methanol in einer Konzentration von 50% bis 75% enthält, bezogen auf das Volumen.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur, bei welcher die ungelösten Feststoffe aus der Zearalenonlösung entfernt werden, 10°C bis 60°C beträgt und die Temperatur, bei welcher das ausgefällte Zearalenon aus der Mutterlauge abgetrennt wird, in einem Bereich von 0°C bis 40°C liegt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur, bei welcher die ungelösten Feststoffe aus der Zearalenonlösung entfernt werden, 20°C bis 40°C beträgt und die Temperatur, bei welcher das ausgefällte Zearalenon aus der Mutterlauge abgetrennt wird, in einem Bereich von 15°C bis 25°C liegt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Wasser zum mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in der geklärten Zearalenonlösung durch Ab-destillation des mit Wasser mischbaren- organischen Lösungsmittels erhöht wird, bis das Zearalenon quantitativ ausgefällt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Wasser zum mit Wasser mischbaren Lösungsmittel in der geklärten Zearalenonlösung durch Zugabe von Wasser erhöht wird, bis das Zearalenon praktisch s quantitativ ausgefällt wird.
13. Anwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 auf eine zearalenonhaltige Fermentationsbrühe, die durch Kultivierung eines Zearalenon produzierenden Stammes des Mikroorganismus Gibberelia zeae in einem Nährmedium erhalten io wurde.
14. Anwendung gemäss Anspruch 13 zur Isolierung von Zearalenon aus einer wässrigen, flüssigen, Zearalenon enthaltenden Fermentationsbrühe, die durch submerse-Kultivie-rung eines Zearalenon produzierenden Stammes des Mikro-

15 Organismus Gibberelia zeae in einem Nährmedium erhalten wurde, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Stufen aufweist:

a) Abtrennung der Feststoffe aus der Fermentationsbrühe, wobei sich ein Zearalenon enthaltender Filterkuchen

20 bildet;

b) Aufschlämmung des Zearalenon enthaltenden Filterkuchens mit einer Zearalenon auflösenden Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wobei sich eine Zearalenonlösung bildet;

25 c) Entfernung der ungelösten Feststoffe aus der Zearalenonlösung bei einer Temperatur, wo sich Zearalenon auflöst, wobei sich eine geklärte Zearalenonlösung bildet;

d) Erhöhung des Verhältnisses von Wasser zum mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel in der geklärten

30 Zearalenonlösung, um das Zearalenon auszufällen; und e) Abtrennung des ausgeschiedenen Zearalenons aus einer Mutterlauge bei einer Temperatur, bei welcher das Zearalenon praktisch in seiner Mutterlauge unlöslich ist.
15. Anwendung gemäss Anspruch 13, dadurch gekenn-

35 zeichnet, dass die wässrige Mischung eine wässrige Phase sowie eine feste Phase aufweist und die feste Phase einen zearalenonhaltigen Feststoff darstellt, welcher ein poröses Substrat ist, das durch Kultivierung eines zearaIenonproduJ zierenden Stammes des Mikroorganismus Gibberelia zeae auf

40 einem festen, porösen Nährmedium erhalten wurde, und dass das Zearalenon im genannten Substrat durch Aufschlämmung mit einer zearalenonauflösenden Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel aufgelöst wird, wobei sich die Zearalenonlösung bildet.

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