CH541622A - Verfahren zur Herstellung eines neuen fungiziden Antibiotikums - Google Patents

Description

  
 



   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen fungiziden Antibiotikums aus der Ba  sldiomycete    Oudemansiella mucida (Schrad. ex Fr.



  Höhn). Das erfindungsgemäss erhältliche Antibiotikum wurde bisher nicht in reinem Zustand isoliert.



   Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des neuen fungiziden Antibiotikums ist dadurch gekennzeichnet, dass Oudemansiella mucida (Schrad. ex Fr.



  Höhn) in einem flüssigen Nährmedium, das assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff, sowie Mineralsalze enthält, gezüchtet wird, dass das Fermentationsmedium od.



  Myzelium mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, woraufhin der Rohextrakt konzentriert und von den Resten des Lösungsmittels befreit wird, und dass das Antibiotikum aus dem Konzentrat vorzugsweise durch Chromatographie an Aluminiumoxyd oder Silikagel, isoliert wird.



   Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Eindampfen des   Rohextraktes    im Vakuum vorgenommen. Bevorzugte organische Lösungsmittel als Extraktionsmittel sind beispielsweise aliphatische Alkohole mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Ester der Essigsäure mit diesen aliphatischen Alkoholen, aliPhatische oder cycloaliphatische Kohlenwasserstoffe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, chlorierte, aliphatische Kohlenwasserstoffe mit 1-2 Kohlenstoffatomen, aromatische Kohlenwasserstoffe mit 6-7 Kohlenstoffatomen oder aliphatische Ketone mit 3-7 Kohlenstoffatomen.



   Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass das reine Antibiotikum aus dem Konzentrat durch Destillation gewonnen wird. Ferner kann das reine Antibiotikum vorzugsweise durch eine Kombination der Destillation mit chromatographischer Adsorption aus dem Konzentrat gewonnen werden. Die Isolierung des neuen, fungiziden Antibiotikums aus dem Nährmedium, wo es zum Teil zu etwa 1/50 in Lösung vorhanden ist, vorwiegend aber an das Myzelium gebunden ist, wird so durchgeführt, dass zuerst ein Konzentrat bereitet wird, das vorzugsweise nach dem Abfiltern des Myzeliums aus dem Filtrat durch mehrfache Extraktion auf einem Gegenstromextraktor durch ein geeignetes organisches, vorzugsweise ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel ohne vorherige pH-Aufbereitung gewonnen wird. Als Lösungsmittel kann z.B.

   Butylacetat, Chloroform, Butanol u.ä.



  verwendet werden. Aus dem abfiltrierten Myzel wird der aktive Stoff, am besten nach vorangehender Trocknung des   Myzel.    durch Extrahieren mit einem organischen Lösungsmittel gewonnen, wozu verschiedene Äther, Ester, chlorierte Kohlenwasserstoffe, niedere Alkohole oder aromatische Kohlenwasserstoffe verwendet werden können. Die Extraktion kann durch blosses Verrühren und Absaugen oder besser bei höherer Temperatur in einem geeigneten Extraktor durchgeführt werden. Die Extraktion mittels mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln kann auch aus dem Myzelium in nassem Zustand durchgeführt werden. Die Extraktion mittels mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln bei höherer Temperatur kann vorteilhaft mit vorausgehender Entwässerung des feuchten Myzeliums durch azotrope Destillation verbunden werden.

   Durch Verdampfung des nach irgendeinem der angeführten Verfahren gewonnenen Extraktes im Vakuum wird ein öliges gewöhnlich braun gefärbtes   ca.    15 bis   29%    des wirksamen Stoffes enthaltendes Produkt gewonnen.



   Zur Gewinnung des reinen, für die weitere Verwendung geeigneten Stoffes (hierfür kann auch schon das Konzentrat verwendet werden) können allgemein bekannte Verfahren angewendet werden. Das durch Extraktion gewonnene Konzentrat kann beispielsweise von einem bestimmten Teil der Ballaststoffe durch Auflösen in Chloroform und Verdünnung der Lösung mit Petroläther befreit werden. Beim Stehenlassen scheidet sich ein dickflüssiges dunkles öl aus, das durch weiteres Stehenlassen nach der Trennung verdickt. Der gesamte wirksame Stoff verbleibt in der Lösung. Ähnlich kann zur teilweisen Reinigung der Rohextrakte das Schütteln in ca. 15 Vol.-% Wasser angewandt werden, wobei die bei achtzehn Stunden langem Stehenlassen entstandene Suspension bei normaler Temperatur fast erstarrt.

   Durch Absaugen des ausgeschiedenen unwirksamen Stoffes kann ein schon ziemlich reines nur schwach gelbliches Konzentrat gewonnen werden.



   Praktisch reinen wirksamen Stoff kann man unmittelbar aus dem Rohkonzentrat durch Chromatographie, vorzugsweise an Aluminiumoxyd oder Silikagel gewinnen. Zur Entwicklung des Chromatogramms ist Petrol äther, Benzol, Äther, Chloroform oder ein Gemisch dieser Lösungsmittel geeignet. Die Chromatographie kann in einfacher Weise durch Beobachtung einer Flüssigkeitssäule oder der Eluate in ultraviolettem Licht verfolgt werden. Der wirksame Stoff weist zum Unterschied von den unwirksamen Begleitstoffen eine spezifische dunkle Fluoreszenz (Verlöschen) auf. Eine Kontrolle der Chromatographie kann sehr leicht durch Dünnschichtchromatographie mit Detektion in ultraviolettem Licht mit ammoniakalischer Silbernitratlösung, die eine dunkle Reduktionszone ergibt, durchgeführt werden. Die chromatographische Reinigung kann gegebenenfalls wiederholt werden.

   Falls die Chromatographie gut durchgeführt und der wirksame Stoff von den   Ballaststoffen    getrennt wur  de,    bei vorsichtigem Eindampfen des Lösungsmittels kann aus der entsprechenden Fraktion kristallines Antibiotikum erhalten werden.



   Schliesslich wurde festgestellt, dass das Rohkonzentrat bei genügend hohem Vakuum ohne Verlust der biologischen Wirksamkeit destilliert werden kann. Bei einem Druck von 0,01 bis 0,005 Torr kann man ca.   759    des Rohkonzentrats destillieren. Nach allfälliger Redestillation kann das gewonnene Destillat unmittelbar durch   Eindampfen    mit reinem Antibiotikum kristallisiert werden.



   Im weiteren sind die Konstanten des reinen Antibiotikums angeführt. Das reine Antibiotikum ist ein weisser kristalliner Stoff neutral reagierend mit einem Schmelzpunkt von 51 bis   58 C,    der in der Mehrzahl organischer Lösungsmittel löslich, in Wasser schwach löslich ist. Die optische Aktivität (gemessen in Benzol) ist   + 330    (c = 10) bei 546 nm. In ultraviolettem und infrarotem Licht gibt es ein charakteristisches Spektrum. In der beiliegenden Abb. 2 ist das UV-Spektrum des reinen Antibiotikums in Methylalkohol dargestellt. Abb. 1 zeigt das IR-Spektrum des reinen Antibiotikums in KBr. Abb. 3 zeigt ein Dünnschichtchromatogramm eines eingedickten Rohextraktes des filtrierten Myzeliums auf Aluminiumoxyd im System Petroläther-Äther-Essigsäure   90:10:1.   



  Abb. 3a zeigt 1 = Start, 2 = Lösungsmittelfront, 3 = wirksamer Stoff. Abb. 3b zeigt 1 = Start, 2 = Lösungsmittelfront, 3 = Dämpfungszone bei Autobiographie von Saccharomyces cerevisiae. Der Stoff enthält Kohlenstoff, Wasserstoff und Sauerstoff. Das durch Massenspektrographie festgestellte Molekulargewicht beträgt 258. Das   Ergebnis der Elementaranalyse   73,92wo    C, 7,26% H und 18,82% 0 stimmt am besten mit der Zusammensetzung   C.HlR03    überein. Das Antibiotikum ist sehr stabil, verträgt die Destillation in hohem Vakuum und seine Wirksamkeit ändert sich durch lange Lagerung bei Temperaturen von 4-300C unter Stickstoff nicht.



   Das Antibiotikum ist gegen zahlreiche Pilzarten einschliesslich Dermatophyten von Phytomycetes über Fungi imperfecti bis Ascomycetes wirksam, ist aber gegen Bakterien völlig unwirksam.



     Antifungab    Wirkung des reinen   An tibiotikunipräparnis   
Minimale   Inhibi-    tionskonzentration des Antibiotikums bei dem Testen mittels Agar
Diffusionstechnik Mikroorganismen   s,g/ml    Candida albicans 10 Candida tropicalis 10 Candida pseudotropicalis 10 Candida parapsilopsis 10 Candida zeilano 10   Candida guillermondi    10 Candida crusei 10   Aspergillusnliger    10 Aspergillus oryzae 10   Aspergillus      furnigatus    10   Penicillium    sp. 100 Mucor sp. 100 Saccharomyces cerevisiae 1 Geotrichum sp.

     0    Trichophyton rubrum 300 Trichophyton mentagrophytes 100 Trichophyton astero 10 Trichophyton   resaceum    100 Microsporum canis 300 Sporotrichum   schenckii    200   Coccidioides immitis    100   Blastomyces dermatitis    100 Torula utilis 100
Durchführung des Tests: Filterpapierscheiben mit einem   Durchmesser    von 6 mm wurden mit verschieden verdünnten Lösungen des Antibiotikums in einem Gemisch von   Äthylalkohol-Äther    (1:1) getränkt und nach dem Verdampfen des Lösungsmittels auf die Oberfläche eines Agar-Nährbodens gelegt, dem entsprechende Test Mikroorganismen eingeimpft worden waren. Nach der Inkubation bei entsprechender Temperatur wurde das Vorkommen von Inhibitionszonen festgestellt.



   Die Toxizität bei intraperitonealer Applikation von   1 %Der    wässriger Suspension ist bei Mäusen 250 mg/kg Gewicht, bei Verabreichung per os 500 mg/kg.



   Nach intramuskulärer und oberflächlicher Applikation bei Kaninchen wurde kein Aufsaugen des Antibiotikums in den Blutkreislauf festgestellt. Die Blutabnahme in der 2. und 5. Stunde nach Applikation des Antibiotikums durch   Kardialpunktion    wies nicht einmal Spuren antibiotischer Wirkung im Serum auf. Das Testen wurde mittels Agar-Diffusionstechnik mit Test-Mikroben Saccharomyces cerevisiae Se-2/V durchgeführt.



   Bei Applikation auf der Haut und in das Bindegewebe von Kaninchen zeigte das Antibiotikum keinerlei Reizwirkung.



   Das Antibiotikum ist auf Grund seiner Eigenschaften für oberflächliche Applikation am besten in Form von Salben oder in zerstäubter Form oder in alkoholischer Lösung verwendbar.



   Im folgenden werden an Hand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert. Die Beispiele 1 bis 5 betreffen die Herstellung des   Konzentrats,    die Beispiele 6 bis 8 die Gewinnung des reinen Stoffs.



   Beispiel 1
2400 L Filtrat eines Nährbodens wurden ohne pH Einstellung in einem Gegenstromextraktor mit Butylazetat im Verhältnis 1: 5 extrahiert, und der gewonnene reine Extrakt wurde auf einem Filmverdampfer bei einer Höchsttemperatur von 600C auf ein Volumen von ca. 40 Litern eingedickt. Die weitere Verarbeitung wurde durch Verdampfen des Lösungsmittelrestes in einem Rotations Vakuumverdampfer durchgeführt. Insgesamt wurden 670 g rohen öligen Antibiotikum-Konzentrats gewonnen.



   Beispiel 2
Durch   Filtrieren    von 2400 Litern fermentierten Nährbodens auf einem Rotationsfilter wurden insgesamt 121 kg feuchten Myzeliums gewonnen, das in einem Vakuumtrockner bei einer Höchsttemperatur von 550C getrocknet wurde. Erhalten wurden 23,5 kg trockenen Myzeliums. Dieses wurde fein zermahlen und fünfmal durch Verrühren mit 35 Litern Chloroform 1 Stunde lang extrahiert und nachfolgend filtriert. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden auf einem gläsernen Umlaufverdampfer bei einer maximalen Temperatur von 300C verdampft und der Rest des Lösungsmittels wurde auf einem gläsernen Rotationsverdampfer verdampft. Die Ausbeute war 2136 g rohen öligen Konzentrats des antibiotisch wirksamen Stoffs. Wirkungsgrad 488 Taus. Einh./g.



   Beispiel 3
10 kg feuchten Myzeliums wurden mit Trichloräthylen übergossen, und das Wasser wurde unter ständigem Rühren, bei Rückleitung des organischen Anteils des Destillates, azeotrop abdestilliert. Nach dem Trocknen wurde die Extraktion des entwässerten Myzeliums mit Trichloräthylen wiederholt durchgeführt ähnlich wie im vorhergehenden Beispiel. Durch Eindicken in Vakuum auf einem Umlaufrotationsverdampfer wurden 107,2 g rohen öligen Konzentrats gewonnen.



   Beispiel 4
8,5 kg durch Gefriertrocknung gewonnenen Myzeliums wurden im Soxhlet-Apparat mit Äther extrahiert (ungefähr 6- bis 7facher Wechsel des Lösungsmittels im Extraktionsteil des Apparates) und nach Abdestillieren des Äthers wurden 1050 g öligen Rohkonzentrats gewonnen.



   Beispiel 5
11,2 kg feuchtes durch Filtration fermentierten Bodens gewonnenes Myzelium wurden in 25 Liter Methanol suspendiert, unter Rühren auf 400C erwärmt u. abgesaugt.



  Das abgesaugte Myzelium wurde erneut in weiteren 25 Li  ter Methanol suspendiert, erwärmt und filtriert; der Vorgang wurde noch zweimal wiederholt. Die vereinigten Methanolfiltrate wurden auf einem Vakuum-Umlaufverdampfer eingedickt und der Rest, der sich in zwei Schichten teilte, wurde zweimal mit je 20 Litern Petroläther extrahiert. Durch Abtrennen der Petrolätherschicht und Abdestillieren des Lösungsmittels wurden 113,5 g öligen Antibiotikum-Konzentrats gewonnen.



   Beispiel 6
Auf eine Säule (64X6 cm) von 1,7 kg in Petroläther aufgetragenen Aluminiumoxyds (Akt-II) wurden 160 g öligen Konzentrats in 500 ml Petroläther eingebracht.



  Nach Einsickern in die Säule wurden 3000 ml Petrol äther zur Entwicklung benutzt. Dadurch wurde eine genügende Abscheidung des antibiotisch wirksamen Stoffes von den begleitenden Metaboliten erreicht, von denen ein Teil bereits in das Eluat (blau und violett fluoreszierende Stoffe) übergegangen war. Der Nachweis der einzelnen Zonen wurde in ultraviolettem Licht durchgeführt.



  Der wirksame Stoff bildete in der Mitte der Säule eine 30 cm hohe Schicht. Nach Ausstossen des Adsorptionsmittels aus der Säule wurde diese Schicht mechanisch abgetrennt und nach dem Trocknen mit 3 Litern Chloroform eluiert. Durch Eindicken des Extraktes wurden 32,5 g eines in der Kälte sehr viskosen hellgelben Öles mit einer Wirksamkeit von 4325000 E/g gewonnen.



   Durch Kontroll-Dünnschicht-Chromatographie an Silikagel im System Petroläther-Äther-Essigsäure 90: 10: 1 wurden im gewonnenen Antibiotikum noch geringfügige Mengen von Begleitstoffen festgestellt. Durch Impfen mit Kristallen reinen Antibiotikums wurde nach ca. 3 Tagen das erhaltene öl zur Kristallisation gebracht. Nach Übergiessen mit abgekühltem Petroläther, Absaugen und Auswaschen gleichfalls mit abgekühltem Petroläther und Trocknen in Vakuum wird weisses kristallines Antibiotikum mit einem Schmelzpunkt von 49 bis 510C gewonnen.



   Beispiel 7
Zu dem gleichen Ergebnis wie in Beispiel 6 kann man durch Verwendung von Silikagel als Adsorbens und eines Gemisches von Petroläther-Äther 9: 1 als Entwicklungsmittel bei einem Verhältnis des Adsorptionsmittels zum Antibiotikum von 20:1 gelangen.



   Beispiel 8
500 g öliges durch Extraktion gewonnenes Konzentrat wurde bei einem Druck von 0,01 Torr im Kragenkolben (Hickmannskolben) destilliert (Erwärmung in einem Wood-Metall-Bad). In einem Temperaturbereich von 70 bis   1 870C    destillierte insgesamt 231 g reinen gelben öles. Der antibiotisch wirksame Stoff fand sich in einer Fraktion von 120 bis 1400C. Die weitere Destillation musste wegen fortschreitender Zersetzung des Restes im Destillationskolben unterbrochen werden. Die gewonnene Fraktion wirksamen Stoffes enthielt gemäss der in gleicher Weise wie in Beispiel 6 durchgeführten chromatographischen Kontrolle noch eine geringe Menge verschiedener Stoffe.

   Durch wiederholte Hochvakuum Destillation und Auffangen der Fraktion von 128 bis 1320C wurde ein klares hellgelbes Destillat praktisch reinen Antibiotikums gewonnen, das nur Spuren blau fluoreszierender Stoffe enthält. Ausbeute 54 g. 

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH

   Verfahren zur Herstellung eines neuen fungiziden Antibiotikums, dadurch gekennzeichnet, dass Oudemansiella mucida (Schrad. ex Fr. Höhn) in einem flüssigen Nährmedium, das assimilierbaren Stickstoff und Kohlenstoff, sowie Mineralsalze enthält, gezüchtet wird, dass das Fermentationsmedium oder Myzelium mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert wird, woraufhin der Rohextrakt konzentriert und von den Resten des Lösungsmittels befreit wird, und dass das Antibiotikum aus dem Konzentrat isoliert wird.

   UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Rohextrakt im Vakuum eingedampft wird.

   2. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das Konzentrat an Aluminiumoxyd oder Silikagel adsorbiert wird und das Antibiotikum nach der Elution isoliert wird.

   3. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass reines Antibiotikum aus dem Konzentrat durch Destillation gewonnen wird.

   4. Verfahren gemäss Patentanspruch oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass reines Antibiotikum aus dem Konzentrat durch eine Kombination der Destillation mit der chromatographischen Aussonderung gewonnen wird.

   5. Verfahren gemäss Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel aliphatische Alkohole mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, Ester der Essigsäure mit diesen aliphatischen Alkoholen, aliphatische oder cycloaliphatische Kohlenwasserstoffe mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen, chlorierte, aliphatische Kohlenwasserstoffe mit 1 bis 2 Kohlenstoffatomen, aromatische Kohlenwasserstoffe mit 6-7 Kohlenstoffatomen oder aliphatische Ketone mit 3-7 Kohlenstoffatomen verwendet werden.