Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Lysergsäurealkaloiden Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Lysergsäurealkaloiden durch Tiefenkultur mit neuen Stämmen von Clavi- ceps paspali Stevens und Hall, aus welchen man reine Lysergsäure auf bekannte Weise erhält.
Heutzutage werden die Alkaloide, Derivate der Lysergsäure, überwiegend aus Ergot gewonnen, das heisst aus natürlichen Sclerotien von Claviceps pur- purea (Fr) Tul.-A. Stoll et a1. (USA-Patentschrift Nr.
2 809 920) haben kürzlich über die Herstellung solcher Alkaloide durch saprophytische Oberflächen kultur eines geeigneten, dem Mutterkorn entnomme nen Stammes von Claviceps purpurea (Fr) Tul, ge sprochen.
Andere Autoren (ABE et a1: J. Agric. Chem. Soc. Japan 25, 1952, Seite 458; Taber et a1. Canad. J. of Microbiology 4, 1959, Seite 611) haben Herstellungs prozesse der Alkaloide durch saprophytische Ober flächenkultur einiger besonderer Claviceps-Stämme beschrieben.
Jedoch enthalten solche Alkaloide in ihrem Molekül keine Lysergsäure und sind verschie den von jenen, die man aus natürlichen Sclerotien von Claviceps purpurea (Fr) Tul erhält.
Während all dieser vieljährigen Untersuchungen hat man erkannt, dass die Herstellung von Alkaloiden nur durch saprophytische Oberflächenkultur nach einer Bebrütungszeit von 20-40 Tagen möglich ist. Ausserdem ist die Einheitsproduktion so niedrig, so dass man sie praktisch nicht verwirklichen kann.
Vor kürzerer Zeit haben Spruson et a1. (austra lische Patentschrift Nr. 34 313/58) ein Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Ergot-Alkaloiden beschrieben, welche durch Kultivierung von Claviceps purpurea Tul unter hauptsächlich anaeroben Bedin gung durchgeführt werden und die eine wesentliche Verminderung der Zellatmung bewirken.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung er möglicht die Herstellung von Lysergsäurealkaloiden mit hohen Ausbeuten durch Tiefenkultur neuer Claviceps-Stämme, unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln, ohne eine Verminderung der Zell atmung zu verursachen; das heisst, die Bildung der Lysergsäurealkaloide wird durch eine gewöhnliche, industrielle Gärung bewirkt.
Die neuen Stämme, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt werden, sind neue Stämme von Claviceps paspali Stevens und Hall. Man hat gefunden, dass die Art Claviceps paspali Stevens und Hall, die die Lysergsäurealkaloide nicht durch Tiefenkultur erzeugt, künstlich virulentiert werden kann, um neue Stämme von Claviceps paspali zu er geben, welche ihrerseits die besagte Herstellung er möglichen.
Die künstliche Virulentation geschieht folgender massen: Der Stamm F. 97 wird der Sclerotia entnom men, die auf Paspalum disticum-Pflanzen gewachsen ist, welche man in Tivoli (Rom) gesammelt und als Claviceps paspali Stevens und Hall identifiziert und klassifiziert hat. Keimlinge von Rogge var. Rosen 4 n werden vor der Keimung mit dem Stamm F. 97 beimpft und dann in vitro gezüchtet.
Die neuen virulenten Stämme werden aus den Sclerotien der genannten Keimlinge gewonnen.
Die Stämme, die das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen, sind im Istituto Superiore di Sanitä - Viale Regina Elena 299 - Rom (Italien) hinterlegt und mit den folgenden Zeichen benannt worden: F -140; F - S 13/1; F - 237;F - 240.
Die obgenannten Stämme haben folgende morpho logische Eigenschaften: Die in Kartoffel-Glukose- Agar in Petri-Schalen erhaltenen Kolonien haben einen Durchmesser von 1,5-3 cm nach einer Kulti- vierung von 10-15 Tagen bei 27 C.
Sie sind rund lich, haben einen ununterbrochenen Rand und eine glatte Oberfläche, ein weissgraues Luftmycel und ein braunes oder dunkles vegetatives Mycel. Das samt artige und manchmal seilähnliche Luftmycel setzt sich entweder aus einfachen oder aus gesammelten Hyphen zusammen, welche einen Durchmesser von 3-4. ,p. und Septa in einer Entfernung von 20-50 ,u haben und enthält einige fettige Tropfen.
Das vege tative Mycel ist eine Masse aus kompakten Hyphen geformt, deren ursprüngliche Struktur in ein Pseudo- parenchym mit sclerotischer Struktur verwandelt wurde.
Die Zellen haben eine polygone Form mit einem Durchmesser von 3-4 X 10-15 ,u und sind dicht vereint und zeigen eine Anzahl von Tropfen aus fettigen Substanzen. Die Anwesenheit von Koniden oder Clamydosporen wurde niemals beobachtet. Sporenentwicklungen sind niemals erhalten worden, auch nicht durch Wechseln des Kohlenstoff- oder Stickstoffursprungs.
Wenn man auf der Oberfläche der Kolonie mit einer Nadel kratzt, dann zeigt das sich unmittelbar unter dem Luftmycel befindliche vegetative Mycel eine rosa oder fleischähnliche Farbe. Die obgenann- ten Eigenschaften geben diesen Stämmen ein beson deres Aussehen, das niemals bei anderen, von Clavi- ceps hergeleiteten Stämmen beobachtet wurde.
In der Tiefenkultur bildet das Mycel Gruppen kleiner, rundlicher oder unregelmässiger und manch mal frei verteilter Bällchen in Grösse von 0,1 bis 1 X 0,5 bis 3 ,u, welche aus durch dicht vereinigte Hyphen geformte Synnemsta bestehen. Die Hyphen haben einen Durchmesser von 3-5 ,u und sind gerade mit sehr wenigen seitlichen Abzweigungen. Ausser dem enthalten die Hyphen eine grosse Anzahl fettiger Tropfen, auch wenn sie im früheren Stadium sind.
Das in submerser Kultur befindliche Mycel kann eine gelbe, braune, graugrüne oder grüne Farbe haben, entsprechend den verschiedenen Medien und seinem Alter.
Was die Herstellung von Lysergsäurealkaloiden betrifft, so beschränkt sich die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Verwendung der beschriebenen Stämme, sondern sie umfasst auch die Mutations- formen dieser Organismen, die z.
B. entweder durch Selektion oder durch Mutation unter Anwendung von ultravioletten oder Röntgenstrahlen oder durch verschiedene Mutationssubstanzen oder im beson deren durch entweder mit Graminaceae künstlich infizierten Keimlingen in vitro kultiviert oder mit Graminaceae künstlich infizierten Pflanzen in vivo oder in vitro kultiviert, erhalten werden können.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durchgeführt durch Kultivierung irgendeines der oben beschriebenen Stämme, unter aeroben Bedingungen und in einer Tiefenkultur, sowohl in Laborkolben als auch in industriellen Fermentiergefässen, und zwar in einem wässrigen Medium, welches anorganische Salze, Stickstoffquellen und Kohlenhydrate enthält. Als anorganische Salze können z. B.
Chloride und/oder Nitrate und/oder Karbonate und/oder Sul fate und/oder Phosphate von Alkali- und Erdalkali- metallen, von Eisen, Zink und Mangan, aber vor zugsweise MgS04 und KH,P04, verwendet werden.
Das Verhalten der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Stämme in Anwesenheit von Fe++ und Zn++ im Medium ist verschieden von dem der von Stoll et a1. beschriebenen Claviceps purpurea- Stämme (USA-Patentschrift Nr. 2 809 920). Diese beiden Elemente vermindern die Alkaloiderzeugung in einer auffallenden Weise.
Als Stickstoffquellen können z. B. Ammonium salze wie Zitrate, Tartrate, Maleate, Succinate, Oxalate, Azetate und dergleichen verwendet werden;
ausserdem Aminosäuren und deren Mischungen, Peptide oder Proteine, deren Hydrolysate, Fleisch extrakte, wasserlösliche Bestandteile von Getreide, wie Korn oder Weizen; Getreide-Malz-Extrakt, Getreide quellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Kicher- erbsenmehl und Baumwollbohnenmehl.
Als Kohlehydrate können z. B. Glukose, Saccha- rose, Stärke, Dextin, Sorbit, Mannit, Laktose usw. verwendet werden.
Die Kultur entwickelt sich unter aeroben Bedin gungen in Tiefenkultur; sie kann in Kolben und in Fermentationsgefässen, gegebenenfalls unter Rühren, und unter Luft- oder Sauerstoffzufuhr gezüchtet wer den. Die Gärung findet zweckmässig bei einer Tem peratur von 22 bis 30 C, vorzugsweise bei 27 C, und bei einem p14 von 4,2-6, vorzugsweise bei 5,2, statt. Die Herstellung von Alkaloiden beginnt im all gemeinen nach einer 2tägigen Kultur und erreicht ihr Optimum nach 7-9 Tagen.
Die Bewertung der Alkaloide kann auf Grund von Farbtesten durch die Reaktion von van Urk (Pharm. Weekbled 66, 1929, Seite 473) nach der Extrak tion folgendermassen durchgeführt werden: Die Kulturbrühe wird bis zu einem p14 von 8 alkalisiert und zuerst mit Chloroform extrahiert und dann mit einer wässrigen, sauren Lösung (z. B. 1 % 142S04 oder 2 % Weinsäure) nochmals extrahiert und dann zur colorimetrischen Analyse der Alkaloide verwendet.
Zur Abtrennung und Isolierung der Mischung der erhaltenen Alkaloide werden Extraktionsverfah ren mit entsprechenden mit Wasser unmischbaren Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Methylen- chlorid und dergleichen oder Absorption mit Absorp tionsmitteln, wie Holzkohle, Bentoniten und derglei chen, im allgemeinen unter alkalischen Bedingungen, angewandt.
Die Mischung, in welcher Lysergsäure- amide und Isolysergsäureamide vor allem anwesend sind, kann dann mit Alkali in bekannter Weise zu Lysergic- und Isolysergsäure hydrolysiert werden (J. Chem. Soc. <I>1934</I> S. 674 und<I>1936 S.</I> 1440).
<I>Beispiel 1</I> Das Verfahren wird in 500 ml-Kolben, die 100 ml des entsprechenden Mediums enthalten, durchgeführt. Die Kolben werden durch Drehschütteln geschüttelt (200 U/min; Exzentrizität 10 cm). Die beste Be- brütungstemperatur beträgt 27 C. Die entsprechende Feuchtigkeit ist 85-90%. Die Kultivierung wird im Dunkeln unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
Ein Kolben wird mit dem Mycel beimpft, welches man aus der 10 Tage alten Kartoffel-Glukose-Agar- Kultur einer der obengenannten Stämme des Clani- ceps Paspali Stevens und Hall erhält.
Das Nährmedium besteht aus folgenden Sub stanzen: Mannit . . . . 5 % Bernsteinsäure . . 1 % KH2P04 . . . . 0,1% MgS04 ' 7 H20 . . 0,03 Kichererbsenmehl .<B>0,1%</B> destilliertes Wasser . Rest Der pH-Wert wird mit wässriger Ammoniak lösung auf 5,2 eingestellt.
Eine homogene Kultur wird im allgemeinen auf einem Drehrührer nach 7-10tägiger Bebrütung ge bildet und besteht aus einer Masse aus verfilzten Hyphen. <B>10%</B> dieser Kultur werden zum Animpfen für die Vorgärungskultur gebraucht, welche in Kolben mit dem gleichen Medium durchgeführt wird. Nach 4 tägiger Kultivierung werden die Fermenter mit 10 des in dem Vorfermenter gewachsenen Mycel beimpft.
Das Gärmedium für die Herstellung der Alkaloide hat folgende Zusammensetzung: Mannit . . . . 5 Bernsteinsäure . . 3 KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 - 7 H20 . .<B>0,03%</B> destilliertes Wasser . liest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
In diesem Medium erreicht die Durchschnitts produktion der Alkaloide 1000,ag/ml nach 7-9tägi- ger Bebrütung unter aeroben Bedingungen.
10 Liter Kulturbrühe, die man in 110 Labor- gärgefässen erhält, werden filtriert und das Mycel wird beseitigt, da es nur wenig Alkaloide enthält. Die filtrierte dunkle Brühe (die ungefähr 1000,ug/ml Alkaloide enthält) wird mit Lösungen von NaOH oder Na2C03 alkalisiert und mit 10 Liter einer Chloroform-Isobutanol-Mischung (4 :1) extrahiert, und der organische Extrakt wird wieder mit einer wässrigen (2 %) Weinsteinsäurelösung extrahiert.
Die wässrige saure Lösung wird dann unter Vakuum und bei 20-40 C auf ein geringes Volumen (ungefähr 1/1o des ursprünglichen Volumens) konzentriert. Diese Lösung wird alkalisiert, mit Chloroform extrahiert und das Lösungsmittel wird verdampft. Man erhält ein weisses, kristallines Pulver, aus welchem man durch alkalische Hydrolyse in bekannter Weise die Lyserg- und Isolysergsäure erhält.
Beispiel <I>2</I> Die Kultivierung wird mit folgendem Medium durchgeführt: Mannit . . . . 5 Apfelsäure . . . 3 KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 * 7 H20 . . 0,03% destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach 7- bis 9tägiger Bebrütung erreicht die Herstellung der Alkaloide 1000,ug/ml. Dieselben Ausbeuten erhält man beim Gebrauch vors Weinsteinsäure, Zitronen säure, Fumarsäure und Bernsteinsäure.
<I>Beispiel 3</I> Die Kultivierung wird mit folgendem Medium durchgeführt: Sorbit . . . . . 5 Apfelsäure , . . 3 KH2P04 . . . . 0,1 M9S04 - 7H20 . . 0,03 destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach 7- bis 9 tägiger Bebrütung erreicht die Menge der herge stellten Alkaloide 1000 ssg/ml.
<I>Beispiel 4</I> Die Kultivierung wird mit folgendem Medium durchgeführt: Mannit . . . . 4 Glukose . . . . 1 Bernsteinsäure . . 2 % KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 7 H20 0,03 Kichererbsenmehl . 0,5 destilliertes Wasser . Rest Das PH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach 7- bis 9tägiger Bebrütung erreicht die Menge der erzeugten Alkaloide 1400-1600 yg/ml.
Andere geeignete Stickstoffquellen sind: Soja bohnenmehl, Erdnussmehl, Bohnenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, Kartoffelmehl, hydrolysiertes Kasein, Hefeextrakt.
<I>Beispiel S</I> Die, Gärung wird in Glasfermentern mit eitlem Verhältnis h/D von nicht weniger als 3 durchgeführt. 4000 ml des folgenden Mediums werden in jeden Fermenter gefüllt: Mannit . . . . 5 Bernsteinsäure . . 3 KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 * 7H20 . . 0,03 destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Sterilisation wird in einem Autoklaven 20 min lang bei 100 C und 40 min lang bei 120 C durch geführt. Die Fermenter werden belüftet, indem man Luft vom Boden durch eine Glasfritte eindringen lässt. Der Schaum wird durch Hinzufügen von ge wöhnlichen Antischaum Agentien wie 6%iges Alka- terge enthaltendes Vaselineöl usw. kontrolliert. Die Bebrütungstemperatur wird bei 27 C gehalten.
Es wird mit 400 ml der wie in Beispiel 1 be schriebenen Kultur angeimpft. Nach 4-6tägiger Kul tur erreicht die Anzahl der erzeugten Alkaloide ihr Optimum, wie in Beispiel 4 beschrieben.
<I>Beispiel 6</I> Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung: Sorbit . . . . . 5 Bernsteinsäure . . 1 KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 - 7H20 . .<B>0,03%</B> Kichererbsenmehl . 1 destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird wie in Beispiel 5 durchgeführt. Nach 4-7tägiger Kultur erreicht die Menge der er zeugten Alkaloide ihr Optimum, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Beispiel <I>7</I> Die Gärung wird in rostfreien Stahlfermentern, die eine Höhe von 4 m und einen Durchmesser von 0,2 m haben, durchgeführt. 90 Liter des folgenden Mediums werden in jeden Fermenter gefüllt: Mannit . . . . 5 Bernsteinsäure . . 2 K1-12p04 . . . . 0,1 MgS04 ' 7H20 . . 0,03 Kichererbsenmehl . 0,1 destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Sterilisation wird- in einem anderen geeigneten Behälter vorgenommen, so dass die Kulturflüssigkeit nicht in Berührung mit dem direkten Dampf kommt. Es wurde nämlich beobachtet, dass die kleinsten Eisenspuren auf dem Medium eine Verminderung der Alkaloiderzeugung verursachen. Es wird mit 9 Liter der in Beispiel 1 beschrie benen Kultur angeimpft. Die Luft wird vom Boden her durch eine poröse Fritte eingeblasen (1 Volumen Luft/Liter Volumen Flüssigkeit/Liter min).
Nach 6-9tägiger Bebrütung werden die gleichen hohen in Beispiel 4 genannten Ausbeuten von Alka loiden erhalten.
<I>Beispiel 8</I> Die Gärung wird in rostfreien Stahlfermentern, die 50 Liter des folgenden Mediums enthalten, durch geführt: Mannit . . . . 47o Glukose . . . . 1 Bernsteinsäure . . 2 3@ KH2P04 . . . .<I>0,12.'</I> MaS 4 * 7H,0 . .<B>0,03%</B> destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird unter Schütteln und Belüftung durchgeführt. Nach 6-9 tägiger Bebrütung erhält man hohe Ausbeuten von Alkaloiden, wie in Beispiel 4 genannt.