CH394227A - Process for the biosynthetic production of lysergic acid alkaloids - Google Patents

Process for the biosynthetic production of lysergic acid alkaloids

Info

Publication number
CH394227A
CH394227A CH768260A CH768260A CH394227A CH 394227 A CH394227 A CH 394227A CH 768260 A CH768260 A CH 768260A CH 768260 A CH768260 A CH 768260A CH 394227 A CH394227 A CH 394227A
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
flour
alkaloids
grown
carried out
fermentation
Prior art date
Application number
CH768260A
Other languages
German (de)
Inventor
Boris Chain Ernst
Tonolo Antonio
Bonino Cesare
Original Assignee
Farmaceutici Italia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Farmaceutici Italia filed Critical Farmaceutici Italia
Publication of CH394227A publication Critical patent/CH394227A/en

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system
    • C12P17/183Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system containing an indolo[4,3-F,G]quinoleine nucleus, e.g. compound containing the lysergic acid nucleus as well as the dimeric ergot nucleus

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  

      Verfahren    zur     biosynthetischen        Herstellung    von     Lysergsäurealkaloiden       Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein  Verfahren zur Herstellung von     Lysergsäurealkaloiden     durch     Tiefenkultur    mit neuen Stämmen von     Clavi-          ceps        paspali    Stevens und Hall, aus welchen man  reine     Lysergsäure    auf bekannte Weise erhält.  



  Heutzutage werden die Alkaloide, Derivate der       Lysergsäure,    überwiegend aus     Ergot    gewonnen, das  heisst aus natürlichen     Sclerotien    von     Claviceps        pur-          purea    (Fr)     Tul.-A.        Stoll    et     a1.        (USA-Patentschrift     Nr.

   2 809 920) haben kürzlich über die Herstellung  solcher Alkaloide durch     saprophytische    Oberflächen  kultur eines geeigneten, dem Mutterkorn entnomme  nen Stammes von     Claviceps        purpurea    (Fr)     Tul,    ge  sprochen.  



  Andere Autoren (ABE et     a1:    J.     Agric.        Chem.        Soc.     Japan 25, 1952, Seite 458;     Taber    et     a1.        Canad.    J. of       Microbiology    4, 1959, Seite 611) haben Herstellungs  prozesse der Alkaloide durch     saprophytische    Ober  flächenkultur einiger besonderer     Claviceps-Stämme     beschrieben.

   Jedoch enthalten solche Alkaloide in  ihrem Molekül keine     Lysergsäure    und sind verschie  den von jenen, die man aus natürlichen     Sclerotien     von     Claviceps        purpurea    (Fr)     Tul    erhält.  



  Während all dieser vieljährigen Untersuchungen  hat man erkannt, dass die Herstellung von Alkaloiden  nur durch     saprophytische    Oberflächenkultur nach  einer     Bebrütungszeit    von 20-40 Tagen möglich ist.  Ausserdem ist die Einheitsproduktion so niedrig, so  dass man sie praktisch nicht verwirklichen kann.  



  Vor kürzerer Zeit haben     Spruson    et     a1.    (austra  lische Patentschrift Nr. 34     313/58)    ein Verfahren zur  biosynthetischen Herstellung von     Ergot-Alkaloiden     beschrieben, welche durch Kultivierung von     Claviceps          purpurea        Tul    unter hauptsächlich anaeroben Bedin  gung durchgeführt werden und die eine wesentliche  Verminderung der Zellatmung bewirken.

      Das Verfahren der vorliegenden     Erfindung    er  möglicht die Herstellung von     Lysergsäurealkaloiden     mit hohen Ausbeuten durch     Tiefenkultur    neuer       Claviceps-Stämme,    unter     aeroben        Bedingungen    und  unter Schütteln, ohne eine Verminderung der Zell  atmung zu verursachen; das heisst, die Bildung der       Lysergsäurealkaloide    wird durch eine gewöhnliche,  industrielle Gärung bewirkt.  



  Die neuen Stämme, die für das Verfahren der  vorliegenden Erfindung angewandt werden, sind neue       Stämme    von     Claviceps        paspali    Stevens und Hall. Man  hat gefunden, dass die Art     Claviceps        paspali    Stevens  und     Hall,    die die     Lysergsäurealkaloide    nicht durch       Tiefenkultur    erzeugt, künstlich     virulentiert    werden  kann, um neue Stämme von     Claviceps        paspali    zu er  geben, welche ihrerseits die besagte Herstellung er  möglichen.  



  Die künstliche     Virulentation    geschieht folgender  massen: Der Stamm F. 97 wird der     Sclerotia    entnom  men, die auf     Paspalum        disticum-Pflanzen    gewachsen  ist, welche man in Tivoli (Rom)     gesammelt    und als       Claviceps        paspali    Stevens und Hall identifiziert und       klassifiziert    hat. Keimlinge von     Rogge        var.    Rosen 4 n  werden vor der     Keimung    mit dem Stamm F. 97       beimpft    und dann in     vitro    gezüchtet.

   Die neuen  virulenten Stämme werden aus den     Sclerotien    der  genannten Keimlinge gewonnen.  



  Die Stämme, die das Verfahren der vorliegenden  Erfindung ermöglichen, sind im     Istituto        Superiore          di        Sanitä    -     Viale    Regina     Elena    299 - Rom (Italien)  hinterlegt und mit den folgenden Zeichen benannt  worden: F -140; F - S 13/1; F - 237;F - 240.  



  Die     obgenannten    Stämme haben folgende morpho  logische Eigenschaften: Die in     Kartoffel-Glukose-          Agar    in     Petri-Schalen    erhaltenen Kolonien haben  einen Durchmesser von 1,5-3 cm nach einer Kulti-           vierung    von 10-15 Tagen bei 27 C.

   Sie sind rund  lich, haben einen ununterbrochenen Rand und eine  glatte Oberfläche, ein weissgraues     Luftmycel    und ein  braunes oder dunkles vegetatives     Mycel.    Das samt  artige und manchmal seilähnliche     Luftmycel    setzt  sich entweder aus einfachen oder aus gesammelten       Hyphen    zusammen, welche einen Durchmesser von       3-4.        ,p.    und     Septa    in einer Entfernung von 20-50     ,u     haben und enthält einige fettige Tropfen.

   Das vege  tative     Mycel    ist eine Masse aus kompakten     Hyphen     geformt, deren ursprüngliche Struktur in ein     Pseudo-          parenchym    mit     sclerotischer    Struktur verwandelt  wurde.  



  Die Zellen haben eine     polygone    Form     mit    einem  Durchmesser von 3-4 X 10-15     ,u    und sind dicht  vereint und zeigen eine Anzahl von Tropfen aus  fettigen Substanzen. Die Anwesenheit von     Koniden     oder     Clamydosporen    wurde niemals beobachtet.       Sporenentwicklungen    sind niemals erhalten worden,  auch nicht durch Wechseln des Kohlenstoff- oder  Stickstoffursprungs.  



  Wenn man auf der Oberfläche der Kolonie mit  einer Nadel kratzt, dann zeigt das sich unmittelbar  unter dem     Luftmycel    befindliche vegetative     Mycel     eine rosa oder     fleischähnliche    Farbe. Die     obgenann-          ten    Eigenschaften geben diesen Stämmen ein beson  deres Aussehen, das niemals bei anderen, von     Clavi-          ceps    hergeleiteten Stämmen beobachtet wurde.  



  In der     Tiefenkultur    bildet das     Mycel    Gruppen  kleiner, rundlicher oder unregelmässiger und manch  mal frei verteilter Bällchen in Grösse von 0,1 bis  1 X 0,5 bis 3     ,u,    welche aus durch dicht vereinigte       Hyphen    geformte     Synnemsta    bestehen. Die     Hyphen     haben einen Durchmesser von 3-5     ,u    und sind gerade  mit sehr wenigen seitlichen Abzweigungen. Ausser  dem enthalten die     Hyphen    eine grosse Anzahl fettiger  Tropfen, auch wenn sie im früheren Stadium sind.

    Das in     submerser    Kultur befindliche     Mycel    kann eine  gelbe, braune, graugrüne oder grüne Farbe haben,  entsprechend den verschiedenen Medien und seinem  Alter.  



  Was die Herstellung von     Lysergsäurealkaloiden     betrifft, so beschränkt sich die vorliegende Erfindung  nicht nur auf die Verwendung der beschriebenen  Stämme, sondern sie umfasst auch die     Mutations-          formen    dieser Organismen, die z.

   B. entweder durch  Selektion oder durch Mutation unter Anwendung  von ultravioletten oder Röntgenstrahlen oder durch  verschiedene     Mutationssubstanzen    oder im beson  deren durch entweder mit     Graminaceae    künstlich       infizierten    Keimlingen in     vitro        kultiviert    oder mit       Graminaceae    künstlich     infizierten    Pflanzen in     vivo     oder in     vitro    kultiviert, erhalten werden können.  



  Das     Verfahren    der vorliegenden Erfindung wird  durchgeführt durch Kultivierung irgendeines der oben  beschriebenen Stämme, unter     aeroben        Bedingungen     und in einer     Tiefenkultur,    sowohl in Laborkolben  als auch in industriellen     Fermentiergefässen,    und zwar  in einem     wässrigen    Medium, welches anorganische  Salze,     Stickstoffquellen    und Kohlenhydrate     enthält.       Als anorganische Salze können z. B.

   Chloride  und/oder Nitrate und/oder Karbonate und/oder Sul  fate und/oder Phosphate von Alkali- und     Erdalkali-          metallen,    von Eisen, Zink und Mangan, aber vor  zugsweise     MgS04    und     KH,P04,    verwendet werden.  



  Das Verhalten der in der vorliegenden Erfindung  beschriebenen Stämme in Anwesenheit von     Fe++     und     Zn++    im Medium ist verschieden von dem der  von     Stoll    et     a1.    beschriebenen     Claviceps        purpurea-          Stämme        (USA-Patentschrift    Nr. 2 809 920). Diese  beiden Elemente     vermindern    die     Alkaloiderzeugung     in einer auffallenden Weise.  



  Als Stickstoffquellen können z. B. Ammonium  salze wie     Zitrate,        Tartrate,        Maleate,        Succinate,          Oxalate,        Azetate    und dergleichen verwendet werden;

    ausserdem     Aminosäuren    und deren Mischungen,       Peptide    oder Proteine, deren     Hydrolysate,    Fleisch  extrakte, wasserlösliche Bestandteile von Getreide, wie  Korn oder Weizen;     Getreide-Malz-Extrakt,    Getreide  quellflüssigkeit, Sojabohnenmehl,     Erdnussmehl,        Kicher-          erbsenmehl    und     Baumwollbohnenmehl.     



  Als Kohlehydrate können z. B. Glukose,     Saccha-          rose,    Stärke,     Dextin,        Sorbit,        Mannit,        Laktose    usw.  verwendet werden.  



  Die Kultur entwickelt sich unter     aeroben    Bedin  gungen in     Tiefenkultur;    sie kann in Kolben und in       Fermentationsgefässen,    gegebenenfalls unter Rühren,  und unter Luft- oder Sauerstoffzufuhr gezüchtet wer  den. Die Gärung findet zweckmässig bei einer Tem  peratur von 22 bis 30  C, vorzugsweise bei 27  C,  und bei einem p14 von 4,2-6, vorzugsweise bei 5,2,  statt. Die Herstellung von Alkaloiden beginnt im all  gemeinen nach einer 2tägigen Kultur und erreicht  ihr Optimum nach 7-9 Tagen.  



  Die Bewertung der Alkaloide kann auf Grund von  Farbtesten durch die Reaktion von     van        Urk        (Pharm.          Weekbled    66, 1929, Seite 473) nach der Extrak  tion folgendermassen durchgeführt werden: Die  Kulturbrühe wird bis zu einem p14 von 8     alkalisiert     und zuerst mit     Chloroform        extrahiert    und dann mit  einer     wässrigen,    sauren Lösung (z. B. 1     %        142S04    oder  2     %    Weinsäure) nochmals extrahiert und dann zur       colorimetrischen    Analyse der Alkaloide verwendet.  



  Zur Abtrennung und Isolierung der Mischung  der erhaltenen Alkaloide werden Extraktionsverfah  ren mit entsprechenden mit Wasser     unmischbaren     Lösungsmitteln, wie Benzol,     Chloroform,        Methylen-          chlorid    und dergleichen oder Absorption mit Absorp  tionsmitteln, wie Holzkohle,     Bentoniten    und derglei  chen, im allgemeinen unter alkalischen Bedingungen,  angewandt.

   Die Mischung, in welcher     Lysergsäure-          amide    und     Isolysergsäureamide    vor allem anwesend  sind, kann dann mit Alkali in bekannter Weise zu       Lysergic-    und     Isolysergsäure        hydrolysiert    werden  (J.     Chem.        Soc.   <I>1934</I> S. 674 und<I>1936 S.</I> 1440).  



  <I>Beispiel 1</I>  Das Verfahren wird in 500     ml-Kolben,    die 100 ml  des entsprechenden Mediums enthalten, durchgeführt.  Die Kolben werden durch     Drehschütteln    geschüttelt      (200     U/min;    Exzentrizität 10 cm). Die beste     Be-          brütungstemperatur    beträgt 27  C. Die entsprechende  Feuchtigkeit ist 85-90%. Die     Kultivierung    wird im  Dunkeln unter     aeroben    Bedingungen durchgeführt.

    Ein Kolben wird mit dem     Mycel    beimpft, welches  man aus der 10 Tage alten     Kartoffel-Glukose-Agar-          Kultur    einer der obengenannten Stämme des     Clani-          ceps        Paspali    Stevens und Hall erhält.  



  Das Nährmedium besteht aus folgenden Sub  stanzen:       Mannit    . . . . 5 %  Bernsteinsäure . . 1 %       KH2P04    . . . .     0,1%          MgS04    ' 7 H20 . . 0,03       Kichererbsenmehl    .<B>0,1%</B>  destilliertes Wasser . Rest  Der     pH-Wert    wird mit wässriger Ammoniak  lösung auf 5,2 eingestellt.  



  Eine homogene Kultur wird im allgemeinen auf  einem     Drehrührer    nach     7-10tägiger        Bebrütung    ge  bildet und besteht aus einer Masse aus verfilzten       Hyphen.   <B>10%</B> dieser Kultur werden zum     Animpfen     für die     Vorgärungskultur    gebraucht, welche in Kolben  mit dem gleichen Medium     durchgeführt    wird. Nach  4     tägiger    Kultivierung werden die     Fermenter    mit 10  des in dem     Vorfermenter    gewachsenen     Mycel    beimpft.  



  Das Gärmedium für die Herstellung der     Alkaloide     hat folgende     Zusammensetzung:          Mannit    . . . . 5  Bernsteinsäure . . 3       KH2P04    . . . . 0,1       MgS04    - 7     H20    . .<B>0,03%</B>       destilliertes    Wasser .     liest     Das     pH    wird mit wässriger     Ammoniaklösung    auf  5,2 gebracht.  



  In diesem Medium erreicht die Durchschnitts  produktion der Alkaloide     1000,ag/ml    nach     7-9tägi-          ger        Bebrütung    unter     aeroben    Bedingungen.  



  10 Liter Kulturbrühe, die man in 110     Labor-          gärgefässen    erhält, werden     filtriert    und das     Mycel    wird  beseitigt, da es nur wenig Alkaloide enthält. Die  filtrierte dunkle Brühe (die ungefähr     1000,ug/ml     Alkaloide enthält) wird mit Lösungen von     NaOH     oder     Na2C03        alkalisiert    und mit 10 Liter einer       Chloroform-Isobutanol-Mischung    (4 :1) extrahiert,  und der organische Extrakt wird wieder     mit    einer       wässrigen    (2 %)     Weinsteinsäurelösung    extrahiert.

   Die       wässrige    saure Lösung wird dann unter     Vakuum    und  bei     20-40     C auf ein geringes Volumen     (ungefähr          1/1o    des ursprünglichen Volumens) konzentriert. Diese  Lösung wird     alkalisiert,    mit Chloroform     extrahiert     und das Lösungsmittel wird verdampft. Man erhält  ein weisses, kristallines Pulver, aus welchem man  durch alkalische Hydrolyse     in    bekannter Weise die       Lyserg-    und     Isolysergsäure    erhält.

           Beispiel   <I>2</I>  Die Kultivierung wird mit folgendem Medium  durchgeführt:       Mannit    . . . . 5  Apfelsäure . . . 3       KH2P04    . . . . 0,1       MgS04        *    7     H20    . .     0,03%          destilliertes    Wasser . Rest  Das     pH    wird mit wässriger     Ammoniaklösung    auf  5,2 gebracht.  



  Die     Gärung    wird entsprechend dem     in    Beispiel 1  beschriebenen Verfahren     durchgeführt.    Nach 7- bis  9tägiger     Bebrütung    erreicht die Herstellung der  Alkaloide     1000,ug/ml.        Dieselben    Ausbeuten erhält  man beim Gebrauch     vors    Weinsteinsäure, Zitronen  säure,     Fumarsäure    und     Bernsteinsäure.     



  <I>Beispiel 3</I>  Die     Kultivierung    wird mit folgendem Medium  durchgeführt:       Sorbit    . . . . . 5  Apfelsäure , . . 3       KH2P04    . . . . 0,1       M9S04    -     7H20    . . 0,03  destilliertes Wasser . Rest  Das     pH    wird mit wässriger     Ammoniaklösung    auf  5,2 gebracht.  



  Die Gärung wird entsprechend dem     in    Beispiel 1  beschriebenen Verfahren     durchgeführt.    Nach 7- bis  9     tägiger        Bebrütung    erreicht die Menge der herge  stellten Alkaloide 1000     ssg/ml.     



  <I>Beispiel 4</I>  Die Kultivierung wird mit folgendem Medium       durchgeführt:          Mannit    . . . . 4  Glukose . . . . 1  Bernsteinsäure . . 2 %       KH2P04    . . . . 0,1       MgS04      7     H20    0,03       Kichererbsenmehl    . 0,5       destilliertes    Wasser . Rest  Das     PH    wird mit wässriger     Ammoniaklösung    auf  5,2 gebracht.  



  Die Gärung wird entsprechend dem in Beispiel 1  beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach 7- bis  9tägiger     Bebrütung    erreicht die Menge der erzeugten  Alkaloide 1400-1600     yg/ml.     



  Andere geeignete     Stickstoffquellen    sind: Soja  bohnenmehl,     Erdnussmehl,        Bohnenmehl,    Linsenmehl,       Erbsenmehl,        Kartoffelmehl,        hydrolysiertes    Kasein,       Hefeextrakt.     



  <I>Beispiel S</I>  Die, Gärung     wird    in     Glasfermentern    mit     eitlem          Verhältnis        h/D    von nicht weniger als 3 durchgeführt.      4000     ml    des folgenden Mediums werden in jeden       Fermenter    gefüllt:       Mannit    . . . . 5  Bernsteinsäure . . 3       KH2P04    . . . . 0,1       MgS04        *        7H20    . . 0,03  destilliertes Wasser . Rest  Das     pH    wird mit wässriger     Ammoniaklösung    auf  5,2 gebracht.  



  Die Sterilisation wird in einem     Autoklaven    20 min  lang bei 100  C und 40 min lang bei 120  C durch  geführt. Die     Fermenter    werden belüftet, indem man  Luft vom Boden durch eine Glasfritte eindringen       lässt.    Der Schaum wird durch Hinzufügen von ge  wöhnlichen Antischaum     Agentien    wie 6%iges     Alka-          terge    enthaltendes     Vaselineöl    usw. kontrolliert. Die       Bebrütungstemperatur    wird bei 27  C gehalten.  



  Es wird mit 400     ml    der wie in Beispiel 1 be  schriebenen Kultur     angeimpft.    Nach     4-6tägiger    Kul  tur erreicht die Anzahl der erzeugten Alkaloide ihr  Optimum, wie in Beispiel 4     beschrieben.     



  <I>Beispiel 6</I>  Das     Nährmedium    hat folgende     Zusammensetzung:          Sorbit    . . . . . 5  Bernsteinsäure . . 1       KH2P04    . . . . 0,1       MgS04    -     7H20    . .<B>0,03%</B>       Kichererbsenmehl    . 1       destilliertes    Wasser . Rest  Das     pH    wird     mit    wässriger     Ammoniaklösung    auf  5,2 gebracht.  



  Die Gärung wird wie     in    Beispiel 5 durchgeführt.  Nach     4-7tägiger    Kultur erreicht die Menge der er  zeugten Alkaloide ihr Optimum, wie in Beispiel 4  beschrieben.  



       Beispiel   <I>7</I>  Die Gärung wird in rostfreien     Stahlfermentern,     die eine Höhe von 4 m und einen Durchmesser von  0,2 m haben, durchgeführt. 90 Liter des folgenden  Mediums werden in jeden     Fermenter    gefüllt:       Mannit    . . . . 5  Bernsteinsäure . . 2       K1-12p04    . . . . 0,1       MgS04    '     7H20    . . 0,03       Kichererbsenmehl    . 0,1  destilliertes Wasser . Rest  Das     pH    wird mit wässriger     Ammoniaklösung    auf  5,2 gebracht.  



  Die Sterilisation wird- in einem anderen geeigneten       Behälter    vorgenommen, so dass die Kulturflüssigkeit  nicht in Berührung mit dem direkten Dampf kommt.  Es wurde nämlich beobachtet, dass die kleinsten  Eisenspuren auf dem Medium eine Verminderung der       Alkaloiderzeugung    verursachen.    Es wird mit 9 Liter der in Beispiel 1 beschrie  benen Kultur     angeimpft.    Die Luft wird vom Boden  her durch eine poröse     Fritte    eingeblasen (1 Volumen       Luft/Liter    Volumen Flüssigkeit/Liter min).  



  Nach     6-9tägiger        Bebrütung    werden die gleichen  hohen in Beispiel 4 genannten Ausbeuten von Alka  loiden erhalten.  



  <I>Beispiel 8</I>  Die Gärung wird in rostfreien     Stahlfermentern,     die 50 Liter des folgenden Mediums enthalten, durch  geführt:       Mannit    . . . . 47o  Glukose . . . . 1  Bernsteinsäure . . 2     3@          KH2P04    . . . .<I>0,12.'</I>       MaS 4        *        7H,0    . .<B>0,03%</B>  destilliertes Wasser . Rest  Das     pH    wird mit wässriger     Ammoniaklösung    auf  5,2 gebracht.  



  Die Gärung wird unter Schütteln und Belüftung  durchgeführt. Nach 6-9     tägiger        Bebrütung    erhält man  hohe Ausbeuten von Alkaloiden, wie in Beispiel 4  genannt.



      Method for the biosynthetic production of lysergic acid alkaloids The present invention relates to a method for the production of lysergic acid alkaloids by deep culture with new strains of Claviceps paspali Stevens and Hall, from which pure lysergic acid is obtained in a known manner.



  Nowadays the alkaloids, derivatives of lysergic acid, are predominantly obtained from ergot, that is, from natural sclerotia of Claviceps purpurea (Fr) Tul.-A. Stoll et a1. (U.S. Patent No.

   2 809 920) recently spoke about the production of such alkaloids by saprophytic surface culture of a suitable strain of Claviceps purpurea (Fr) Tul taken from the ergot.



  Other authors (ABE et a1: J. Agric. Chem. Soc. Japan 25, 1952, page 458; Taber et a1. Canad. J. of Microbiology 4, 1959, page 611) have production processes of the alkaloids by saprophytic surface culture of some special claviceps strains described.

   However, such alkaloids do not contain lysergic acid in their molecule and are different from those obtained from natural sclerotia of Claviceps purpurea (Fr) Tul.



  During all these long-term investigations it has been recognized that the production of alkaloids is only possible by saprophytic surface culture after an incubation period of 20-40 days. In addition, the unit production is so low that it is practically impossible to achieve.



  More recently, Spruson et a1. (Australian Patent No. 34 313/58) describes a process for the biosynthetic production of ergot alkaloids, which are carried out by cultivating Claviceps purpurea Tul under mainly anaerobic conditions and which cause a significant reduction in cell respiration.

      The process of the present invention enables the production of lysergic acid alkaloids with high yields by deep culture of new claviceps strains, under aerobic conditions and with shaking, without causing a decrease in cell respiration; That is, the formation of the lysergic acid alkaloids is brought about by a common, industrial fermentation.



  The new strains used for the method of the present invention are new strains of Claviceps paspali Stevens and Hall. It has been found that the species Claviceps paspali Stevens and Hall, which does not produce the lysergic acid alkaloids by deep culture, can be artificially virulent in order to give new strains of Claviceps paspali, which in turn make the said production possible.



  The artificial virulence occurs as follows: The strain F. 97 is taken from the Sclerotia, which has grown on Paspalum disticum plants which have been collected in Tivoli (Rome) and identified and classified as Claviceps paspali Stevens and Hall. Seedlings of Rogge var. Rosen 4n are inoculated with the F. 97 strain before germination and then grown in vitro.

   The new virulent strains are obtained from the sclerotia of the seedlings mentioned.



  The strains that enable the method of the present invention have been deposited in the Istituto Superiore di Sanita - Viale Regina Elena 299 - Rome (Italy) and have been named with the following symbols: F -140; F - S 13/1; F - 237; F - 240.



  The above-mentioned strains have the following morphological properties: The colonies obtained in potato-glucose agar in Petri dishes have a diameter of 1.5-3 cm after cultivation for 10-15 days at 27 C.

   They are round, have an uninterrupted edge and a smooth surface, a white-gray aerial mycelium and a brown or dark vegetative mycelium. The velvet-like and sometimes rope-like aerial mycelium is composed either of simple or of collected hyphae, which have a diameter of 3-4. , p. and have septa at a distance of 20-50, u and contain some fatty drops.

   The vegetative mycelium is a mass of compact hyphae whose original structure has been transformed into a pseudoparenchyma with a sclerotic structure.



  The cells have a polygonal shape with a diameter of 3-4 X 10-15, u and are densely united and show a number of drops of fatty substances. The presence of conids or clamydospores was never observed. Spore developments have never been sustained, not even by changing the carbon or nitrogen origin.



  If the surface of the colony is scratched with a needle, the vegetative mycelium immediately below the aerial mycelium will be pink or flesh-like in color. The above properties give these strains a special appearance that has never been observed in other claviceps-derived strains.



  In deep culture, the mycelium forms groups of small, rounded or irregular and sometimes freely distributed balls in the size of 0.1 to 1 X 0.5 to 3, u, which consist of synnemsta formed by closely united hyphae. The hyphae are 3-5µ in diameter and straight with very few lateral branches. In addition, the hyphae contain a large number of fatty drops, even if they are in the earlier stage.

    The mycelium in submerged culture can be yellow, brown, gray-green, or green in color, depending on the different media and its age.



  As far as the production of lysergic acid alkaloids is concerned, the present invention is not limited to the use of the strains described, but it also includes the mutation forms of these organisms, which z.

   B. either by selection or by mutation using ultraviolet or X-rays or by various mutation substances or in particular cultivated by either Graminaceae artificially infected seedlings in vitro or cultivated with Graminaceae artificially infected plants in vivo or in vitro can be obtained.



  The method of the present invention is carried out by culturing any of the strains described above, under aerobic conditions and in deep culture, in both laboratory flasks and industrial fermentation vessels, in an aqueous medium containing inorganic salts, nitrogen sources and carbohydrates. As inorganic salts, for. B.

   Chlorides and / or nitrates and / or carbonates and / or sulphates and / or phosphates of alkali and alkaline earth metals, of iron, zinc and manganese, but preferably before MgS04 and KH, PO4, are used.



  The behavior of the strains described in the present invention in the presence of Fe ++ and Zn ++ in the medium is different from that of Stoll et al. Claviceps purpurea strains described (U.S. Patent No. 2,809,920). These two elements decrease the alkaloid production in a striking way.



  As nitrogen sources, for. B. ammonium salts such as citrates, tartrates, maleates, succinates, oxalates, acetates and the like can be used;

    also amino acids and their mixtures, peptides or proteins, their hydrolysates, meat extracts, water-soluble components of cereals such as grain or wheat; Grain malt extract, grain swelling liquid, soybean flour, peanut flour, chickpea flour and cotton bean flour.



  As carbohydrates, for. B. glucose, sucrose, starch, dextin, sorbitol, mannitol, lactose, etc. can be used.



  The culture develops under aerobic conditions in deep culture; it can be grown in flasks and in fermentation vessels, optionally with stirring, and with a supply of air or oxygen. Fermentation takes place at a temperature of 22 to 30 C, preferably 27 C, and a p14 of 4.2-6, preferably 5.2. The production of alkaloids generally begins after a 2-day culture and reaches its optimum after 7-9 days.



  The evaluation of the alkaloids can be carried out on the basis of color tests by the reaction of van Urk (Pharm. Weekbled 66, 1929, page 473) after the extraction as follows: The culture broth is alkalized up to a p14 of 8 and first extracted with chloroform and then extracted again with an aqueous, acidic solution (e.g. 1% 142S04 or 2% tartaric acid) and then used for the colorimetric analysis of the alkaloids.



  To separate and isolate the mixture of the alkaloids obtained, extraction methods are used with appropriate water-immiscible solvents such as benzene, chloroform, methylene chloride and the like, or absorption with absorbents such as charcoal, bentonites and the like, generally under alkaline conditions .

   The mixture, in which lysergic acid amides and isolysergic acid amides are mainly present, can then be hydrolyzed with alkali in a known manner to lysergic and isolysergic acid (J. Chem. Soc. 1934 p. 674 and I > 1936 p. </I> 1440).



  <I> Example 1 </I> The process is carried out in 500 ml flasks containing 100 ml of the appropriate medium. The flasks are shaken by rotary shaking (200 rpm; eccentricity 10 cm). The best incubation temperature is 27 C. The corresponding humidity is 85-90%. The cultivation is carried out in the dark under aerobic conditions.

    A flask is inoculated with the mycelium which is obtained from the 10-day-old potato-glucose-agar culture of one of the above-mentioned strains of the Claniceps Paspali Stevens and Hall.



  The nutrient medium consists of the following substances: mannitol. . . . 5% succinic acid. . 1% KH2P04. . . . 0.1% MgS04 '7H20. . 0.03 chickpea flour. <B> 0.1% </B> distilled water. Remainder The pH is adjusted to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  A homogeneous culture is generally formed on a rotary stirrer after 7-10 days of incubation and consists of a mass of matted hyphae. <B> 10% </B> of this culture are used for inoculation for the pre-fermentation culture, which is carried out in flasks with the same medium. After 4 days of cultivation, the fermenters are inoculated with 10 of the mycelium grown in the pre-fermenter.



  The fermentation medium for the production of the alkaloids has the following composition: Mannitol. . . . 5 succinic acid. . 3 KH2P04. . . . 0.1 MgS04 - 7 H20. . <B> 0.03% </B> distilled water. reads The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  In this medium, the average production of the alkaloids reaches 1000. Ag / ml after 7-9 days of incubation under aerobic conditions.



  10 liters of culture broth, which is obtained in 110 laboratory fermentation vessels, are filtered and the mycelium is eliminated as it contains only a few alkaloids. The filtered dark broth (which contains about 1000 .ug / ml alkaloids) is made alkaline with solutions of NaOH or Na2CO3 and extracted with 10 liters of a chloroform-isobutanol mixture (4: 1), and the organic extract is again extracted with an aqueous ( 2%) tartaric acid solution extracted.

   The aqueous acidic solution is then concentrated to a small volume (approximately 1/10 of the original volume) under vacuum and at 20-40 ° C. This solution is made alkaline, extracted with chloroform and the solvent is evaporated. A white, crystalline powder is obtained, from which lysergic and isolysergic acid is obtained in a known manner by alkaline hydrolysis.

           Example <I> 2 </I> The cultivation is carried out with the following medium: mannitol. . . . 5 malic acid. . . 3 KH2P04. . . . 0.1 MgS04 * 7 H20. . 0.03% distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  The fermentation is carried out according to the procedure described in Example 1. After 7 to 9 days of incubation, the production of the alkaloids reaches 1000 μg / ml. The same yields are obtained when using tartaric acid, citric acid, fumaric acid and succinic acid.



  <I> Example 3 </I> The cultivation is carried out with the following medium: sorbitol. . . . . 5 malic acid,. . 3 KH2P04. . . . 0.1 M9S04 - 7H20. . 0.03 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  The fermentation is carried out according to the procedure described in Example 1. After 7 to 9 days of incubation, the amount of alkaloids produced reaches 1000 μg / ml.



  <I> Example 4 </I> The cultivation is carried out with the following medium: mannitol. . . . 4 glucose. . . . 1 succinic acid. . 2% KH2P04. . . . 0.1 MgS04 7 H20 0.03 chickpea flour. 0.5 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  The fermentation is carried out according to the procedure described in Example 1. After 7 to 9 days of incubation, the amount of alkaloids produced reaches 1400-1600 yg / ml.



  Other suitable sources of nitrogen are: soy bean meal, peanut meal, bean meal, lentil flour, pea flour, potato flour, hydrolyzed casein, yeast extract.



  <I> Example S </I> The fermentation is carried out in glass fermenters with an h / D ratio of not less than 3. 4000 ml of the following medium is filled into each fermenter: mannitol. . . . 5 succinic acid. . 3 KH2P04. . . . 0.1 MgS04 * 7H20. . 0.03 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  The sterilization is carried out in an autoclave at 100 ° C. for 20 minutes and at 120 ° C. for 40 minutes. The fermenters are ventilated by letting air in from the bottom through a glass frit. The foam is controlled by the addition of common anti-foam agents such as petroleum jelly containing 6% alkali, etc. The incubation temperature is kept at 27 ° C.



  400 ml of the culture described in Example 1 are inoculated. After 4-6 days of culture, the number of alkaloids produced reaches its optimum, as described in Example 4.



  <I> Example 6 </I> The nutrient medium has the following composition: sorbitol. . . . . 5 succinic acid. . 1 KH2P04. . . . 0.1 MgS04 - 7H20. . <B> 0.03% </B> Chickpea flour. 1 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  The fermentation is carried out as in Example 5. After 4-7 days of culture, the amount of alkaloids produced reached their optimum, as described in Example 4.



       Example <I> 7 </I> Fermentation is carried out in stainless steel fermenters with a height of 4 m and a diameter of 0.2 m. 90 liters of the following medium are poured into each fermenter: mannitol. . . . 5 succinic acid. . 2 K1-12p04. . . . 0.1 MgS04 '7H20. . 0.03 chickpea flour. 0.1 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  The sterilization is carried out in another suitable container so that the culture liquid does not come into contact with the direct steam. It has been observed that the smallest traces of iron on the medium cause a reduction in the production of alkaloid. 9 liters of the culture described in Example 1 are inoculated. The air is blown in from the bottom through a porous frit (1 volume air / liter volume liquid / liter min).



  After incubation for 6-9 days, the same high yields of alkaloids mentioned in Example 4 are obtained.



  <I> Example 8 </I> Fermentation is carried out in stainless steel fermenters containing 50 liters of the following medium: mannitol. . . . 47o glucose. . . . 1 succinic acid. . 2 3 @ KH2P04. . . . <I> 0.12. '</I> MaS 4 * 7H, 0. . <B> 0.03% </B> distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.



  Fermentation is carried out with shaking and aeration. After incubation for 6-9 days, high yields of alkaloids, as mentioned in Example 4, are obtained.

 

Claims (1)

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Lysergsäurealkaloiden, dadurch gekennzeichnet, dass eine Submersgärung mit den aus Claviceps paspali Stevens und Hall erhaltenen neuen virulenten Stäm men F-140, F-S 13(l, F-237, F-240 oder ihren Mutanten unter aeroben Bedingungen und in einem anorganische Salze, Stickstoffquellen und Kohle hydrate enthaltenden wässrigen Medium durchgeführt wird, und dass die entstandenen Alkaloide von der Brühe nach Filtrieren des Mycels und unter alka lischen Bedingungen abgetrennt werden, PATENT CLAIM Process for the production of a mixture of lysergic acid alkaloids, characterized in that a submerged fermentation with the new virulent strains F-140, FS 13 (1, F-237, F-240 or their mutants obtained from Claviceps paspali Stevens and Hall) under aerobic conditions and is carried out in an aqueous medium containing inorganic salts, nitrogen sources and carbohydrates, and that the alkaloids formed are separated from the broth after filtering the mycelium and under alkaline conditions, worauf sie entweder durch Extraktion mit Wasser unmischbaren Lösungsmitteln oder mit Absorptionsmitteln weiter gereinigt werden. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man die neuen virulenten Stämme aus Claviceps paspali erhält, welche aus auf Mutter kornkeimen gewachsenen Sclerotien erhalten werden, die vor der Keimung mit Claviceps paspali Stevens und Hall beimpft wurden und dann in vitro gezüch tet worden sind. 2. whereupon they are further purified either by extraction with water-immiscible solvents or with absorbents. SUBClaims 1. The method according to claim, characterized in that the new virulent strains are obtained from Claviceps paspali, which are obtained from sclerotia grown on mother grain germs, which were inoculated with Claviceps paspali Stevens and Hall before germination and then grown in vitro have been. 2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Mutanten der neuen virulenten Stämme aus Claviceps paspali durch Selektion oder Mutation durch Behandlung mit ultravioletten oder Röntgenstrahlen oder im besonderen durch künstliche Infektion entweder von in vitro gezüchteten Graminaceae-Keimen oder von in vivo oder in vitro gezüchteten Graminaceae-Pflanzen erhalten werden. 3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass als bevorzugte anorganische Salze KH2P04 und MgS04 verwendet werden. 4. Method according to claim, characterized in that the mutants of the new virulent strains from Claviceps paspali by selection or mutation by treatment with ultraviolet or X-rays or in particular by artificial infection either of in vitro grown Graminaceae germs or of in vivo or in vitro grown Graminaceae plants are obtained. 3. The method according to claim, characterized in that the preferred inorganic salts used are KH2P04 and MgS04. 4th Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass als bevorzugte Stickstoffquellen Kichererbsenmehl, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Bohnenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, Kartoffel mehl, Malzextrakt und hydrolysiertes Kasein ver wendet werden. 5. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass als bevorzugte Kohlehydrate Glu- kose, Saccharose, Stärke, Mannit, Laktose und Sorbit verwendet werden. 6. Method according to claim, characterized in that chickpea flour, soybean flour, peanut flour, bean flour, lentil flour, pea flour, potato flour, malt extract and hydrolyzed casein are used as preferred nitrogen sources. 5. The method according to claim, characterized in that the preferred carbohydrates used are glucose, sucrose, starch, mannitol, lactose and sorbitol. 6th Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass die Gärung in Tiefenkultur unter Schütteln und unter Belüftung bei einem pH von 4,2 bis 6, vorzugsweise 5,2, und einer Temperatur von 22 bis 30 C, vorzugsweise 27 C, durchgeführt wird. Method according to claim, characterized in that the fermentation is carried out in deep culture with shaking and with aeration at a pH of 4.2 to 6, preferably 5.2, and a temperature of 22 to 30 C, preferably 27 C.
CH768260A 1959-07-07 1960-07-06 Process for the biosynthetic production of lysergic acid alkaloids CH394227A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT1112759 1959-07-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CH394227A true CH394227A (en) 1965-06-30

Family

ID=11134771

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CH768260A CH394227A (en) 1959-07-07 1960-07-06 Process for the biosynthetic production of lysergic acid alkaloids

Country Status (3)

Country Link
AT (1) AT239966B (en)
CH (1) CH394227A (en)
ES (1) ES259457A1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
AT239966B (en) 1965-05-10
ES259457A1 (en) 1961-12-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69720379T2 (en) Process for the preparation of erythritol
DE2415461A1 (en) METHOD FOR GENERATING ALGAE CELLS
DE3029348A1 (en) METHOD FOR PRODUCING L-ASPARAGIC ACID
US3060104A (en) Process for obtaining new alkaloid derivatives of lysergic acids
US3038840A (en) Process for the production of alkaloid derivatives of lysergic acid
CH394227A (en) Process for the biosynthetic production of lysergic acid alkaloids
DE2428957C2 (en) Process for the preparation of desacetoxycephalosporin C
DE1140670B (en) Process for the biosynthetic production of ergot alkaloids
DE2363285B2 (en) Process for the production of 1-malic acid from fumaric acid
DE3706838C2 (en) A novel physiologically active substance which is an aldose reductase inhibitor and a process for its production
DE1617383B2 (en) Process for the production of primycin
DE1792038C3 (en) Process for the preparation of a mixture of approximately equal parts ergotamine and ergocryptine
DE2058371A1 (en) Process for the preparation of 6-aminopenicillanic acid
DE2318650C2 (en) Fermentative production of deacetylcephalosporin C
DE2445615A1 (en) PROCESS FOR THE PRODUCTION OF CEPHALOSPORIN C
US3162640A (en) Alkaloid derivatives of lysergic acids
CH648846A5 (en) METHOD FOR THE PRODUCTION OF MOTHER CORNAL CALOIDS, ESPECIALLY ERGOKORNIN AND BETA-ERGOKRYPTIN.
AT206583B (en) Method of obtaining antibiotics
AT269363B (en) Process for the production of a production strain of a Claviceps purpurea (Fr.) Tul. Culture for the production of ergot alkaloids
DE939397C (en) Process for manufacturing and obtaining a product with antiviral activity
DE1617814C (en) Process for the microbiological production of ergocryptine
AT363179B (en) METHOD FOR PRODUCING NEW ANTIBIOTICS
AT330959B (en) PROCESS FOR THE PREPARATION OF DEACETOXYCEPHALOSPORIN C
DE2524574C3 (en) 5- (p-Hydroxybenzyl) -picolinic acid, process for its preparation and isolation and its use
CH664758A5 (en) METHOD FOR THE PRODUCTION OF CLAVIN MOTHERGRAIN ALKALOIDS.