Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Lysergsäurealkaloiden Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Lysergsäurealkaloiden durch Tiefenkultur mit neuen Stämmen von Clavi- ceps paspali Stevens und Hall, aus welchen man reine Lysergsäure auf bekannte Weise erhält.
Heutzutage werden die Alkaloide, Derivate der Lysergsäure, überwiegend aus Ergot gewonnen, das heisst aus natürlichen Sclerotien von Claviceps pur- purea (Fr) Tul.-A. Stoll et a1. (USA-Patentschrift Nr.
2 809 920) haben kürzlich über die Herstellung solcher Alkaloide durch saprophytische Oberflächen kultur eines geeigneten, dem Mutterkorn entnomme nen Stammes von Claviceps purpurea (Fr) Tul, ge sprochen.
Andere Autoren (ABE et a1: J. Agric. Chem. Soc. Japan 25, 1952, Seite 458; Taber et a1. Canad. J. of Microbiology 4, 1959, Seite 611) haben Herstellungs prozesse der Alkaloide durch saprophytische Ober flächenkultur einiger besonderer Claviceps-Stämme beschrieben.
Jedoch enthalten solche Alkaloide in ihrem Molekül keine Lysergsäure und sind verschie den von jenen, die man aus natürlichen Sclerotien von Claviceps purpurea (Fr) Tul erhält.
Während all dieser vieljährigen Untersuchungen hat man erkannt, dass die Herstellung von Alkaloiden nur durch saprophytische Oberflächenkultur nach einer Bebrütungszeit von 20-40 Tagen möglich ist. Ausserdem ist die Einheitsproduktion so niedrig, so dass man sie praktisch nicht verwirklichen kann.
Vor kürzerer Zeit haben Spruson et a1. (austra lische Patentschrift Nr. 34 313/58) ein Verfahren zur biosynthetischen Herstellung von Ergot-Alkaloiden beschrieben, welche durch Kultivierung von Claviceps purpurea Tul unter hauptsächlich anaeroben Bedin gung durchgeführt werden und die eine wesentliche Verminderung der Zellatmung bewirken.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung er möglicht die Herstellung von Lysergsäurealkaloiden mit hohen Ausbeuten durch Tiefenkultur neuer Claviceps-Stämme, unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln, ohne eine Verminderung der Zell atmung zu verursachen; das heisst, die Bildung der Lysergsäurealkaloide wird durch eine gewöhnliche, industrielle Gärung bewirkt.
Die neuen Stämme, die für das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt werden, sind neue Stämme von Claviceps paspali Stevens und Hall. Man hat gefunden, dass die Art Claviceps paspali Stevens und Hall, die die Lysergsäurealkaloide nicht durch Tiefenkultur erzeugt, künstlich virulentiert werden kann, um neue Stämme von Claviceps paspali zu er geben, welche ihrerseits die besagte Herstellung er möglichen.
Die künstliche Virulentation geschieht folgender massen: Der Stamm F. 97 wird der Sclerotia entnom men, die auf Paspalum disticum-Pflanzen gewachsen ist, welche man in Tivoli (Rom) gesammelt und als Claviceps paspali Stevens und Hall identifiziert und klassifiziert hat. Keimlinge von Rogge var. Rosen 4 n werden vor der Keimung mit dem Stamm F. 97 beimpft und dann in vitro gezüchtet.
Die neuen virulenten Stämme werden aus den Sclerotien der genannten Keimlinge gewonnen.
Die Stämme, die das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen, sind im Istituto Superiore di Sanitä - Viale Regina Elena 299 - Rom (Italien) hinterlegt und mit den folgenden Zeichen benannt worden: F -140; F - S 13/1; F - 237;F - 240.
Die obgenannten Stämme haben folgende morpho logische Eigenschaften: Die in Kartoffel-Glukose- Agar in Petri-Schalen erhaltenen Kolonien haben einen Durchmesser von 1,5-3 cm nach einer Kulti- vierung von 10-15 Tagen bei 27 C.
Sie sind rund lich, haben einen ununterbrochenen Rand und eine glatte Oberfläche, ein weissgraues Luftmycel und ein braunes oder dunkles vegetatives Mycel. Das samt artige und manchmal seilähnliche Luftmycel setzt sich entweder aus einfachen oder aus gesammelten Hyphen zusammen, welche einen Durchmesser von 3-4. ,p. und Septa in einer Entfernung von 20-50 ,u haben und enthält einige fettige Tropfen.
Das vege tative Mycel ist eine Masse aus kompakten Hyphen geformt, deren ursprüngliche Struktur in ein Pseudo- parenchym mit sclerotischer Struktur verwandelt wurde.
Die Zellen haben eine polygone Form mit einem Durchmesser von 3-4 X 10-15 ,u und sind dicht vereint und zeigen eine Anzahl von Tropfen aus fettigen Substanzen. Die Anwesenheit von Koniden oder Clamydosporen wurde niemals beobachtet. Sporenentwicklungen sind niemals erhalten worden, auch nicht durch Wechseln des Kohlenstoff- oder Stickstoffursprungs.
Wenn man auf der Oberfläche der Kolonie mit einer Nadel kratzt, dann zeigt das sich unmittelbar unter dem Luftmycel befindliche vegetative Mycel eine rosa oder fleischähnliche Farbe. Die obgenann- ten Eigenschaften geben diesen Stämmen ein beson deres Aussehen, das niemals bei anderen, von Clavi- ceps hergeleiteten Stämmen beobachtet wurde.
In der Tiefenkultur bildet das Mycel Gruppen kleiner, rundlicher oder unregelmässiger und manch mal frei verteilter Bällchen in Grösse von 0,1 bis 1 X 0,5 bis 3 ,u, welche aus durch dicht vereinigte Hyphen geformte Synnemsta bestehen. Die Hyphen haben einen Durchmesser von 3-5 ,u und sind gerade mit sehr wenigen seitlichen Abzweigungen. Ausser dem enthalten die Hyphen eine grosse Anzahl fettiger Tropfen, auch wenn sie im früheren Stadium sind.
Das in submerser Kultur befindliche Mycel kann eine gelbe, braune, graugrüne oder grüne Farbe haben, entsprechend den verschiedenen Medien und seinem Alter.
Was die Herstellung von Lysergsäurealkaloiden betrifft, so beschränkt sich die vorliegende Erfindung nicht nur auf die Verwendung der beschriebenen Stämme, sondern sie umfasst auch die Mutations- formen dieser Organismen, die z.
B. entweder durch Selektion oder durch Mutation unter Anwendung von ultravioletten oder Röntgenstrahlen oder durch verschiedene Mutationssubstanzen oder im beson deren durch entweder mit Graminaceae künstlich infizierten Keimlingen in vitro kultiviert oder mit Graminaceae künstlich infizierten Pflanzen in vivo oder in vitro kultiviert, erhalten werden können.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durchgeführt durch Kultivierung irgendeines der oben beschriebenen Stämme, unter aeroben Bedingungen und in einer Tiefenkultur, sowohl in Laborkolben als auch in industriellen Fermentiergefässen, und zwar in einem wässrigen Medium, welches anorganische Salze, Stickstoffquellen und Kohlenhydrate enthält. Als anorganische Salze können z. B.
Chloride und/oder Nitrate und/oder Karbonate und/oder Sul fate und/oder Phosphate von Alkali- und Erdalkali- metallen, von Eisen, Zink und Mangan, aber vor zugsweise MgS04 und KH,P04, verwendet werden.
Das Verhalten der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Stämme in Anwesenheit von Fe++ und Zn++ im Medium ist verschieden von dem der von Stoll et a1. beschriebenen Claviceps purpurea- Stämme (USA-Patentschrift Nr. 2 809 920). Diese beiden Elemente vermindern die Alkaloiderzeugung in einer auffallenden Weise.
Als Stickstoffquellen können z. B. Ammonium salze wie Zitrate, Tartrate, Maleate, Succinate, Oxalate, Azetate und dergleichen verwendet werden;
ausserdem Aminosäuren und deren Mischungen, Peptide oder Proteine, deren Hydrolysate, Fleisch extrakte, wasserlösliche Bestandteile von Getreide, wie Korn oder Weizen; Getreide-Malz-Extrakt, Getreide quellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Kicher- erbsenmehl und Baumwollbohnenmehl.
Als Kohlehydrate können z. B. Glukose, Saccha- rose, Stärke, Dextin, Sorbit, Mannit, Laktose usw. verwendet werden.
Die Kultur entwickelt sich unter aeroben Bedin gungen in Tiefenkultur; sie kann in Kolben und in Fermentationsgefässen, gegebenenfalls unter Rühren, und unter Luft- oder Sauerstoffzufuhr gezüchtet wer den. Die Gärung findet zweckmässig bei einer Tem peratur von 22 bis 30 C, vorzugsweise bei 27 C, und bei einem p14 von 4,2-6, vorzugsweise bei 5,2, statt. Die Herstellung von Alkaloiden beginnt im all gemeinen nach einer 2tägigen Kultur und erreicht ihr Optimum nach 7-9 Tagen.
Die Bewertung der Alkaloide kann auf Grund von Farbtesten durch die Reaktion von van Urk (Pharm. Weekbled 66, 1929, Seite 473) nach der Extrak tion folgendermassen durchgeführt werden: Die Kulturbrühe wird bis zu einem p14 von 8 alkalisiert und zuerst mit Chloroform extrahiert und dann mit einer wässrigen, sauren Lösung (z. B. 1 % 142S04 oder 2 % Weinsäure) nochmals extrahiert und dann zur colorimetrischen Analyse der Alkaloide verwendet.
Zur Abtrennung und Isolierung der Mischung der erhaltenen Alkaloide werden Extraktionsverfah ren mit entsprechenden mit Wasser unmischbaren Lösungsmitteln, wie Benzol, Chloroform, Methylen- chlorid und dergleichen oder Absorption mit Absorp tionsmitteln, wie Holzkohle, Bentoniten und derglei chen, im allgemeinen unter alkalischen Bedingungen, angewandt.
Die Mischung, in welcher Lysergsäure- amide und Isolysergsäureamide vor allem anwesend sind, kann dann mit Alkali in bekannter Weise zu Lysergic- und Isolysergsäure hydrolysiert werden (J. Chem. Soc. <I>1934</I> S. 674 und<I>1936 S.</I> 1440).
<I>Beispiel 1</I> Das Verfahren wird in 500 ml-Kolben, die 100 ml des entsprechenden Mediums enthalten, durchgeführt. Die Kolben werden durch Drehschütteln geschüttelt (200 U/min; Exzentrizität 10 cm). Die beste Be- brütungstemperatur beträgt 27 C. Die entsprechende Feuchtigkeit ist 85-90%. Die Kultivierung wird im Dunkeln unter aeroben Bedingungen durchgeführt.
Ein Kolben wird mit dem Mycel beimpft, welches man aus der 10 Tage alten Kartoffel-Glukose-Agar- Kultur einer der obengenannten Stämme des Clani- ceps Paspali Stevens und Hall erhält.
Das Nährmedium besteht aus folgenden Sub stanzen: Mannit . . . . 5 % Bernsteinsäure . . 1 % KH2P04 . . . . 0,1% MgS04 ' 7 H20 . . 0,03 Kichererbsenmehl .<B>0,1%</B> destilliertes Wasser . Rest Der pH-Wert wird mit wässriger Ammoniak lösung auf 5,2 eingestellt.
Eine homogene Kultur wird im allgemeinen auf einem Drehrührer nach 7-10tägiger Bebrütung ge bildet und besteht aus einer Masse aus verfilzten Hyphen. <B>10%</B> dieser Kultur werden zum Animpfen für die Vorgärungskultur gebraucht, welche in Kolben mit dem gleichen Medium durchgeführt wird. Nach 4 tägiger Kultivierung werden die Fermenter mit 10 des in dem Vorfermenter gewachsenen Mycel beimpft.
Das Gärmedium für die Herstellung der Alkaloide hat folgende Zusammensetzung: Mannit . . . . 5 Bernsteinsäure . . 3 KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 - 7 H20 . .<B>0,03%</B> destilliertes Wasser . liest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
In diesem Medium erreicht die Durchschnitts produktion der Alkaloide 1000,ag/ml nach 7-9tägi- ger Bebrütung unter aeroben Bedingungen.
10 Liter Kulturbrühe, die man in 110 Labor- gärgefässen erhält, werden filtriert und das Mycel wird beseitigt, da es nur wenig Alkaloide enthält. Die filtrierte dunkle Brühe (die ungefähr 1000,ug/ml Alkaloide enthält) wird mit Lösungen von NaOH oder Na2C03 alkalisiert und mit 10 Liter einer Chloroform-Isobutanol-Mischung (4 :1) extrahiert, und der organische Extrakt wird wieder mit einer wässrigen (2 %) Weinsteinsäurelösung extrahiert.
Die wässrige saure Lösung wird dann unter Vakuum und bei 20-40 C auf ein geringes Volumen (ungefähr 1/1o des ursprünglichen Volumens) konzentriert. Diese Lösung wird alkalisiert, mit Chloroform extrahiert und das Lösungsmittel wird verdampft. Man erhält ein weisses, kristallines Pulver, aus welchem man durch alkalische Hydrolyse in bekannter Weise die Lyserg- und Isolysergsäure erhält.
Beispiel <I>2</I> Die Kultivierung wird mit folgendem Medium durchgeführt: Mannit . . . . 5 Apfelsäure . . . 3 KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 * 7 H20 . . 0,03% destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach 7- bis 9tägiger Bebrütung erreicht die Herstellung der Alkaloide 1000,ug/ml. Dieselben Ausbeuten erhält man beim Gebrauch vors Weinsteinsäure, Zitronen säure, Fumarsäure und Bernsteinsäure.
<I>Beispiel 3</I> Die Kultivierung wird mit folgendem Medium durchgeführt: Sorbit . . . . . 5 Apfelsäure , . . 3 KH2P04 . . . . 0,1 M9S04 - 7H20 . . 0,03 destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach 7- bis 9 tägiger Bebrütung erreicht die Menge der herge stellten Alkaloide 1000 ssg/ml.
<I>Beispiel 4</I> Die Kultivierung wird mit folgendem Medium durchgeführt: Mannit . . . . 4 Glukose . . . . 1 Bernsteinsäure . . 2 % KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 7 H20 0,03 Kichererbsenmehl . 0,5 destilliertes Wasser . Rest Das PH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird entsprechend dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Nach 7- bis 9tägiger Bebrütung erreicht die Menge der erzeugten Alkaloide 1400-1600 yg/ml.
Andere geeignete Stickstoffquellen sind: Soja bohnenmehl, Erdnussmehl, Bohnenmehl, Linsenmehl, Erbsenmehl, Kartoffelmehl, hydrolysiertes Kasein, Hefeextrakt.
<I>Beispiel S</I> Die, Gärung wird in Glasfermentern mit eitlem Verhältnis h/D von nicht weniger als 3 durchgeführt. 4000 ml des folgenden Mediums werden in jeden Fermenter gefüllt: Mannit . . . . 5 Bernsteinsäure . . 3 KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 * 7H20 . . 0,03 destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Sterilisation wird in einem Autoklaven 20 min lang bei 100 C und 40 min lang bei 120 C durch geführt. Die Fermenter werden belüftet, indem man Luft vom Boden durch eine Glasfritte eindringen lässt. Der Schaum wird durch Hinzufügen von ge wöhnlichen Antischaum Agentien wie 6%iges Alka- terge enthaltendes Vaselineöl usw. kontrolliert. Die Bebrütungstemperatur wird bei 27 C gehalten.
Es wird mit 400 ml der wie in Beispiel 1 be schriebenen Kultur angeimpft. Nach 4-6tägiger Kul tur erreicht die Anzahl der erzeugten Alkaloide ihr Optimum, wie in Beispiel 4 beschrieben.
<I>Beispiel 6</I> Das Nährmedium hat folgende Zusammensetzung: Sorbit . . . . . 5 Bernsteinsäure . . 1 KH2P04 . . . . 0,1 MgS04 - 7H20 . .<B>0,03%</B> Kichererbsenmehl . 1 destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird wie in Beispiel 5 durchgeführt. Nach 4-7tägiger Kultur erreicht die Menge der er zeugten Alkaloide ihr Optimum, wie in Beispiel 4 beschrieben.
Beispiel <I>7</I> Die Gärung wird in rostfreien Stahlfermentern, die eine Höhe von 4 m und einen Durchmesser von 0,2 m haben, durchgeführt. 90 Liter des folgenden Mediums werden in jeden Fermenter gefüllt: Mannit . . . . 5 Bernsteinsäure . . 2 K1-12p04 . . . . 0,1 MgS04 ' 7H20 . . 0,03 Kichererbsenmehl . 0,1 destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Sterilisation wird- in einem anderen geeigneten Behälter vorgenommen, so dass die Kulturflüssigkeit nicht in Berührung mit dem direkten Dampf kommt. Es wurde nämlich beobachtet, dass die kleinsten Eisenspuren auf dem Medium eine Verminderung der Alkaloiderzeugung verursachen. Es wird mit 9 Liter der in Beispiel 1 beschrie benen Kultur angeimpft. Die Luft wird vom Boden her durch eine poröse Fritte eingeblasen (1 Volumen Luft/Liter Volumen Flüssigkeit/Liter min).
Nach 6-9tägiger Bebrütung werden die gleichen hohen in Beispiel 4 genannten Ausbeuten von Alka loiden erhalten.
<I>Beispiel 8</I> Die Gärung wird in rostfreien Stahlfermentern, die 50 Liter des folgenden Mediums enthalten, durch geführt: Mannit . . . . 47o Glukose . . . . 1 Bernsteinsäure . . 2 3@ KH2P04 . . . .<I>0,12.'</I> MaS 4 * 7H,0 . .<B>0,03%</B> destilliertes Wasser . Rest Das pH wird mit wässriger Ammoniaklösung auf 5,2 gebracht.
Die Gärung wird unter Schütteln und Belüftung durchgeführt. Nach 6-9 tägiger Bebrütung erhält man hohe Ausbeuten von Alkaloiden, wie in Beispiel 4 genannt.
Method for the biosynthetic production of lysergic acid alkaloids The present invention relates to a method for the production of lysergic acid alkaloids by deep culture with new strains of Claviceps paspali Stevens and Hall, from which pure lysergic acid is obtained in a known manner.
Nowadays the alkaloids, derivatives of lysergic acid, are predominantly obtained from ergot, that is, from natural sclerotia of Claviceps purpurea (Fr) Tul.-A. Stoll et a1. (U.S. Patent No.
2 809 920) recently spoke about the production of such alkaloids by saprophytic surface culture of a suitable strain of Claviceps purpurea (Fr) Tul taken from the ergot.
Other authors (ABE et a1: J. Agric. Chem. Soc. Japan 25, 1952, page 458; Taber et a1. Canad. J. of Microbiology 4, 1959, page 611) have production processes of the alkaloids by saprophytic surface culture of some special claviceps strains described.
However, such alkaloids do not contain lysergic acid in their molecule and are different from those obtained from natural sclerotia of Claviceps purpurea (Fr) Tul.
During all these long-term investigations it has been recognized that the production of alkaloids is only possible by saprophytic surface culture after an incubation period of 20-40 days. In addition, the unit production is so low that it is practically impossible to achieve.
More recently, Spruson et a1. (Australian Patent No. 34 313/58) describes a process for the biosynthetic production of ergot alkaloids, which are carried out by cultivating Claviceps purpurea Tul under mainly anaerobic conditions and which cause a significant reduction in cell respiration.
The process of the present invention enables the production of lysergic acid alkaloids with high yields by deep culture of new claviceps strains, under aerobic conditions and with shaking, without causing a decrease in cell respiration; That is, the formation of the lysergic acid alkaloids is brought about by a common, industrial fermentation.
The new strains used for the method of the present invention are new strains of Claviceps paspali Stevens and Hall. It has been found that the species Claviceps paspali Stevens and Hall, which does not produce the lysergic acid alkaloids by deep culture, can be artificially virulent in order to give new strains of Claviceps paspali, which in turn make the said production possible.
The artificial virulence occurs as follows: The strain F. 97 is taken from the Sclerotia, which has grown on Paspalum disticum plants which have been collected in Tivoli (Rome) and identified and classified as Claviceps paspali Stevens and Hall. Seedlings of Rogge var. Rosen 4n are inoculated with the F. 97 strain before germination and then grown in vitro.
The new virulent strains are obtained from the sclerotia of the seedlings mentioned.
The strains that enable the method of the present invention have been deposited in the Istituto Superiore di Sanita - Viale Regina Elena 299 - Rome (Italy) and have been named with the following symbols: F -140; F - S 13/1; F - 237; F - 240.
The above-mentioned strains have the following morphological properties: The colonies obtained in potato-glucose agar in Petri dishes have a diameter of 1.5-3 cm after cultivation for 10-15 days at 27 C.
They are round, have an uninterrupted edge and a smooth surface, a white-gray aerial mycelium and a brown or dark vegetative mycelium. The velvet-like and sometimes rope-like aerial mycelium is composed either of simple or of collected hyphae, which have a diameter of 3-4. , p. and have septa at a distance of 20-50, u and contain some fatty drops.
The vegetative mycelium is a mass of compact hyphae whose original structure has been transformed into a pseudoparenchyma with a sclerotic structure.
The cells have a polygonal shape with a diameter of 3-4 X 10-15, u and are densely united and show a number of drops of fatty substances. The presence of conids or clamydospores was never observed. Spore developments have never been sustained, not even by changing the carbon or nitrogen origin.
If the surface of the colony is scratched with a needle, the vegetative mycelium immediately below the aerial mycelium will be pink or flesh-like in color. The above properties give these strains a special appearance that has never been observed in other claviceps-derived strains.
In deep culture, the mycelium forms groups of small, rounded or irregular and sometimes freely distributed balls in the size of 0.1 to 1 X 0.5 to 3, u, which consist of synnemsta formed by closely united hyphae. The hyphae are 3-5µ in diameter and straight with very few lateral branches. In addition, the hyphae contain a large number of fatty drops, even if they are in the earlier stage.
The mycelium in submerged culture can be yellow, brown, gray-green, or green in color, depending on the different media and its age.
As far as the production of lysergic acid alkaloids is concerned, the present invention is not limited to the use of the strains described, but it also includes the mutation forms of these organisms, which z.
B. either by selection or by mutation using ultraviolet or X-rays or by various mutation substances or in particular cultivated by either Graminaceae artificially infected seedlings in vitro or cultivated with Graminaceae artificially infected plants in vivo or in vitro can be obtained.
The method of the present invention is carried out by culturing any of the strains described above, under aerobic conditions and in deep culture, in both laboratory flasks and industrial fermentation vessels, in an aqueous medium containing inorganic salts, nitrogen sources and carbohydrates. As inorganic salts, for. B.
Chlorides and / or nitrates and / or carbonates and / or sulphates and / or phosphates of alkali and alkaline earth metals, of iron, zinc and manganese, but preferably before MgS04 and KH, PO4, are used.
The behavior of the strains described in the present invention in the presence of Fe ++ and Zn ++ in the medium is different from that of Stoll et al. Claviceps purpurea strains described (U.S. Patent No. 2,809,920). These two elements decrease the alkaloid production in a striking way.
As nitrogen sources, for. B. ammonium salts such as citrates, tartrates, maleates, succinates, oxalates, acetates and the like can be used;
also amino acids and their mixtures, peptides or proteins, their hydrolysates, meat extracts, water-soluble components of cereals such as grain or wheat; Grain malt extract, grain swelling liquid, soybean flour, peanut flour, chickpea flour and cotton bean flour.
As carbohydrates, for. B. glucose, sucrose, starch, dextin, sorbitol, mannitol, lactose, etc. can be used.
The culture develops under aerobic conditions in deep culture; it can be grown in flasks and in fermentation vessels, optionally with stirring, and with a supply of air or oxygen. Fermentation takes place at a temperature of 22 to 30 C, preferably 27 C, and a p14 of 4.2-6, preferably 5.2. The production of alkaloids generally begins after a 2-day culture and reaches its optimum after 7-9 days.
The evaluation of the alkaloids can be carried out on the basis of color tests by the reaction of van Urk (Pharm. Weekbled 66, 1929, page 473) after the extraction as follows: The culture broth is alkalized up to a p14 of 8 and first extracted with chloroform and then extracted again with an aqueous, acidic solution (e.g. 1% 142S04 or 2% tartaric acid) and then used for the colorimetric analysis of the alkaloids.
To separate and isolate the mixture of the alkaloids obtained, extraction methods are used with appropriate water-immiscible solvents such as benzene, chloroform, methylene chloride and the like, or absorption with absorbents such as charcoal, bentonites and the like, generally under alkaline conditions .
The mixture, in which lysergic acid amides and isolysergic acid amides are mainly present, can then be hydrolyzed with alkali in a known manner to lysergic and isolysergic acid (J. Chem. Soc. 1934 p. 674 and I > 1936 p. </I> 1440).
<I> Example 1 </I> The process is carried out in 500 ml flasks containing 100 ml of the appropriate medium. The flasks are shaken by rotary shaking (200 rpm; eccentricity 10 cm). The best incubation temperature is 27 C. The corresponding humidity is 85-90%. The cultivation is carried out in the dark under aerobic conditions.
A flask is inoculated with the mycelium which is obtained from the 10-day-old potato-glucose-agar culture of one of the above-mentioned strains of the Claniceps Paspali Stevens and Hall.
The nutrient medium consists of the following substances: mannitol. . . . 5% succinic acid. . 1% KH2P04. . . . 0.1% MgS04 '7H20. . 0.03 chickpea flour. <B> 0.1% </B> distilled water. Remainder The pH is adjusted to 5.2 with aqueous ammonia solution.
A homogeneous culture is generally formed on a rotary stirrer after 7-10 days of incubation and consists of a mass of matted hyphae. <B> 10% </B> of this culture are used for inoculation for the pre-fermentation culture, which is carried out in flasks with the same medium. After 4 days of cultivation, the fermenters are inoculated with 10 of the mycelium grown in the pre-fermenter.
The fermentation medium for the production of the alkaloids has the following composition: Mannitol. . . . 5 succinic acid. . 3 KH2P04. . . . 0.1 MgS04 - 7 H20. . <B> 0.03% </B> distilled water. reads The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.
In this medium, the average production of the alkaloids reaches 1000. Ag / ml after 7-9 days of incubation under aerobic conditions.
10 liters of culture broth, which is obtained in 110 laboratory fermentation vessels, are filtered and the mycelium is eliminated as it contains only a few alkaloids. The filtered dark broth (which contains about 1000 .ug / ml alkaloids) is made alkaline with solutions of NaOH or Na2CO3 and extracted with 10 liters of a chloroform-isobutanol mixture (4: 1), and the organic extract is again extracted with an aqueous ( 2%) tartaric acid solution extracted.
The aqueous acidic solution is then concentrated to a small volume (approximately 1/10 of the original volume) under vacuum and at 20-40 ° C. This solution is made alkaline, extracted with chloroform and the solvent is evaporated. A white, crystalline powder is obtained, from which lysergic and isolysergic acid is obtained in a known manner by alkaline hydrolysis.
Example <I> 2 </I> The cultivation is carried out with the following medium: mannitol. . . . 5 malic acid. . . 3 KH2P04. . . . 0.1 MgS04 * 7 H20. . 0.03% distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.
The fermentation is carried out according to the procedure described in Example 1. After 7 to 9 days of incubation, the production of the alkaloids reaches 1000 μg / ml. The same yields are obtained when using tartaric acid, citric acid, fumaric acid and succinic acid.
<I> Example 3 </I> The cultivation is carried out with the following medium: sorbitol. . . . . 5 malic acid,. . 3 KH2P04. . . . 0.1 M9S04 - 7H20. . 0.03 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.
The fermentation is carried out according to the procedure described in Example 1. After 7 to 9 days of incubation, the amount of alkaloids produced reaches 1000 μg / ml.
<I> Example 4 </I> The cultivation is carried out with the following medium: mannitol. . . . 4 glucose. . . . 1 succinic acid. . 2% KH2P04. . . . 0.1 MgS04 7 H20 0.03 chickpea flour. 0.5 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.
The fermentation is carried out according to the procedure described in Example 1. After 7 to 9 days of incubation, the amount of alkaloids produced reaches 1400-1600 yg / ml.
Other suitable sources of nitrogen are: soy bean meal, peanut meal, bean meal, lentil flour, pea flour, potato flour, hydrolyzed casein, yeast extract.
<I> Example S </I> The fermentation is carried out in glass fermenters with an h / D ratio of not less than 3. 4000 ml of the following medium is filled into each fermenter: mannitol. . . . 5 succinic acid. . 3 KH2P04. . . . 0.1 MgS04 * 7H20. . 0.03 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.
The sterilization is carried out in an autoclave at 100 ° C. for 20 minutes and at 120 ° C. for 40 minutes. The fermenters are ventilated by letting air in from the bottom through a glass frit. The foam is controlled by the addition of common anti-foam agents such as petroleum jelly containing 6% alkali, etc. The incubation temperature is kept at 27 ° C.
400 ml of the culture described in Example 1 are inoculated. After 4-6 days of culture, the number of alkaloids produced reaches its optimum, as described in Example 4.
<I> Example 6 </I> The nutrient medium has the following composition: sorbitol. . . . . 5 succinic acid. . 1 KH2P04. . . . 0.1 MgS04 - 7H20. . <B> 0.03% </B> Chickpea flour. 1 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.
The fermentation is carried out as in Example 5. After 4-7 days of culture, the amount of alkaloids produced reached their optimum, as described in Example 4.
Example <I> 7 </I> Fermentation is carried out in stainless steel fermenters with a height of 4 m and a diameter of 0.2 m. 90 liters of the following medium are poured into each fermenter: mannitol. . . . 5 succinic acid. . 2 K1-12p04. . . . 0.1 MgS04 '7H20. . 0.03 chickpea flour. 0.1 distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.
The sterilization is carried out in another suitable container so that the culture liquid does not come into contact with the direct steam. It has been observed that the smallest traces of iron on the medium cause a reduction in the production of alkaloid. 9 liters of the culture described in Example 1 are inoculated. The air is blown in from the bottom through a porous frit (1 volume air / liter volume liquid / liter min).
After incubation for 6-9 days, the same high yields of alkaloids mentioned in Example 4 are obtained.
<I> Example 8 </I> Fermentation is carried out in stainless steel fermenters containing 50 liters of the following medium: mannitol. . . . 47o glucose. . . . 1 succinic acid. . 2 3 @ KH2P04. . . . <I> 0.12. '</I> MaS 4 * 7H, 0. . <B> 0.03% </B> distilled water. Remainder The pH is brought to 5.2 with aqueous ammonia solution.
Fermentation is carried out with shaking and aeration. After incubation for 6-9 days, high yields of alkaloids, as mentioned in Example 4, are obtained.