Verfahren zur Darstellung von N-Acyl-peptiden
Verfahren zur Herstellung von Peptiden, bei denen die an der Aminogruppe durch Acylreste, wie den Carbobenzoxyrest, den Trifluoracetylrest, den Phthalylrest usw. geschützten Peptide mit freier Carboxylgruppe anfallen, sind insofern vorteilhaft, als die Acylpeptide leicht am Carboxylende um weitere Aminosäuregruppen verlängert werden können.
Zur Gewinnung der freien Peptide braucht man ausserdem nur den die Aminogruppe schützenden Rest zu entfernen, wodurch die bei der Esterverseifung manchmal auftretenden Schwierigkeiten umgangen werden.
Die sogenannten aktivierten Ester (vgl. Fortschritte der Chemie org. Naturstoffe, Band 13, Seiten 495 bis 498) von N-Acylaminosäuren oder N-Acyl-peptiden zersetzen sich beim Lagern nicht, wie dies bei den Acyl-aminosäureaziden oder An-Acyl-peptid-aziden, den Säurechloriden oder den gemischten Anhydriden der Fall ist ; sie sind daher für die Synthese von N Acyl-peptiden von besonderem Interesse. Ihrer Anwendung stehen bisher vor allem zwei Nachteile entgegen. Die Umsetzungen müssen meist in wässrigalkalischem Medium vorgenommen werden, wodurch nicht salzfrei gearbeitet werden kann und der nicht umgesetzte Teil der kostbaren Aminosäuren nur schwer zurückzugewinnen ist und darüber hinaus bei Verwendung leicht abspaltbarer Reste, z.
B. des Trifluoracetylrestes als Aminoschutzgruppen, teilweise Abspaltung dieser Reste eintritt und somit keine einheitlichen Produkte mehr erhalten werden. Zweitens treten bei Verwendung der stark aktivierten Ester, z. B. bei p-Nitrophenylestern, Racemisierungen auf.
Die Verfahren zur Darstellung von Acyl-peptiden mit freier Carboxylgruppe unter Verwendung von aktivierten Estern der N-Acylaminosäuren haben sich daher in der Praxis nicht durchsetzen können.
Es wurde nun gefunden, dass es überraschenderweise gelingt, aktivierte Acyl-aminosäure-ester oder Acyl-Peptidester mit Aminosäuren oder Peptiden in schwachen niedermolekularen aliphatischen Carbonsäuren zu kondensieren. Bei der Durchführung der Kondensation in den genannten Medien werden die vorstehend aufgeführten Nachteile vermieden, da man in Abwesenheit von anorganischen Salzen arbeitet.
Gegen Alkali empfindliche Reste, z. B. der Trifluoracetylrest, werden nicht abgespalten, und Race misierungen finden bei nicht zu hohen Temperaturen nicht oder nur in geringem Umfange statt. Eine Ausnahme bildet lediglich die bei der Kondensation von aktivierten N-Acylaminosäureestern mit O-Ben- zyl-L-serin und S-Benzyl-cystein eintretende Racemisierung.
Als schwache niedermolekulare aliphatische Carbonsäuren kommen solche von 2 bis zu etwa 4 Koh lenstoffatomen in Betracht, wobei den bei Zimmertemperatur flüssigen Verbindungen und im Vakuum unter 100 C abzudestillierenden Säuren der Vorzug zu geben ist. Bei Anwendung von bei Zimmertemperatur festen Carbonsäuren muss die Umsetzung bei solchen Temperaturen durchgeführt werden, bei denen diese Säuren geschmolzen (flüssig) sind. Beispielsweise seien genannt : niedere aliphatische unsubstituierte Monocarbonsäuren wie Essigsäure, Propionsäure, substituierte aliphatische derartige Carbonsäuren wie Methoxyessigsäure.
Als aktivierte Ester können z. B. die Ester von Phenol, Thiophenol, p-Nitrothiophenol, p-Nitrophenol, Cyanmethylalkohol eingesetzt werden. Im letzteren Falle ist darauf hinzuweisen, dass bei der Um setzung Cyanmethylalkohol entsteht, der sich unter Bildung von Blausäure und Formaldehyd zersetzt, so dass die Ester dieses Alkohols wegen der physiologischen Wirkungen der Zersetzungsprodukte und wegen einer möglichen Reaktion des Formaldehyds mit Aminosäuren weniger angezeigt erscheinen.
Als zweite Komponente kann eine Aminosäure oder ein Peptid verwendet werden. Sollten sich die Aminosäure oder das Peptid auch beim Erhitzen nicht sofort vollständig lösen, so ist dies für die Umsetzung ohne Belang. Ailmählich findet die Reaktion statt, und in dem Masse der Umsetzungen gehen die Aminsäuren oder Peptide in Lösung.
Werden als Aminosäuren Verbindungen verwendet, die mehrere Aminogruppen im Molekül enthalten, wie beispielsweise Lysin oder Arginin, so gelingt es bei Einsatz der Aminosäuren in Form ihrer Hydrohalogenide, z. B. Hydrochlorid oder Hydrobromid, eine Umsetzung nur an einem Stickstoffatom zu erzielen. Zweckmässiger ist es jedoch, zur Erzielung einer besseren Ausbeute alle Aminogruppen bis auf eine zu schützen.
Wenn auch die Umsetzung bei Zimmertemperatur durchgeführt werden kann, so wird man doch bei höherer Temperatur arbeiten, um die Reaktionszeit zu verkürzen. Üblicherweise wird man Temperaturen oberhalb etwa 50 C anwenden, im allgemeinen die Umsetzung bei 100-120 C durchführen. Es kann jedoch beim Einsatz empfindlicher Komponenten vorteilhaft sein, die Reaktionstemperatur auf etwa 50 bis etwa 100"C zu begrenzen.
Die Dauer des Erhitzens richtet sich nach den umzusetzenden Komponenten und ist sowohl von der Art des aktivierten Esters, das heisst ob schwach oder stark aktiviert, als auch von der Konstitution der Komponenten abhängig und ist um so länger, je grö- sser die sterische Hinderung ist. Die optimale Reaktionszeit kann aber leicht in einem Vorversuch ermittelt werden. Sie liegt im allgemeinen zwischen einer halben und mehreren Stunden.
So erhält man beispielsweise beim vierstündigen Erhitzen von 1, 95 g Carbobenzoxy-L-leucin-thiophenylester mit 0, 5 g Glycin in 3 cm3 Eisessig 1, 37 g (77, 5"/c.) Carbobenzoxy L-leucyl-glycin. Anderseits ergibt die Umsetzung des sterisch nicht gehinderten Carbobenzoxy-glycin-thiophenylesters mit L-Phenylalanin nach halbstündigem Erhitzen in Eisessig bereits eine Ausbeute von über 73 axa an umkristallisiertem Carbobenzoxy-glycil-L- phenylalanin.
Bei sterisch stark gehinderten Aminogruppen empfiehlt es sich, mit möglichst geringen Mengen Lösungsmitteln zu arbeiten und die Aminosäure im Verlauf von mehreren Stunden portionsweise zuzuführen.
Ein besonderer Vorteil bei dem neuen Verfahren liegt in der Einfachheit der Aufarbeitung. Sowohl das Reaktionsprodukt wie die nicht umgesetzten oder im Überschuss angewandten Komponenten sind leicht zu isolieren. Einen Überschuss an einer Komponente wird man dann nehmen, wenn die andere Komponente ein besonders wertvolles Produkt darstellt und restlos umgesetzt werden soll. Man dampft nach beendeter Reaktion im allgemeinen das Lösungsmittel, vorzugsweise Eisessig, ab. Versetzt man nun mit Essigester, so fällt nicht umgesetzte oder im Überschuss angewandte freie Aminosäure bzw. freies Peptid aus oder kann mit Wasser ausgeschüttelt werden. Das N-Acyl-peptid kann nun dem Essigester mit wässriger Bicarbonatlösung entzogen werden, aus dem es durch Ansäuern in Freiheit gesetzt wird.
Nichtumgesetzter oder im Uberschuss angewandter aktiver Ester bleibt im Essigester und kann daraus durch Eindampfen und Zugabe von Petroläther wieder in kristalliner Form abgeschieden werden. Die Aufarbeitung richtet sich naturgemäss nach den Eigenschaften der angewandten Komponenten und ist dementsprechend zu variieren.
Nach dem neuen Verfahren lassen sich in kurzer Zeit und in einfachster Weise viele Peptide herstellen.
Die Abspaltung der Acylreste zur Gewinnung der freien Peptide wird in bekannter Weise vorgenommen.
Lediglich mit freiem Cystin gelingen die Umsetzungen nicht, weil dieses in den in Betracht kommenden Säu- ren extrem löslich ist. Da auch Nitroarginin und Threonin in den obengenannten unsubstituierten Carbonsäuren sehr schwer löslich sind, empfiehlt sich hier die Verwendung von Methoxyessigsäuren.
Aminosäuren vom Typ des Asparagins und Glutamins, das heisst Verbindungen, die eine Carbamidgruppe enthalten, lassen sich nach dem Verfahren gemäss der Erfindung nicht mit aktivierten N-Acylaminosäureestern umsetzen. Demgegenüber sind die Halbester der Glutaminsäure und der Asparaginsäure als Ausgangsstoffe für die vorliegende Peptidsynthese geeignet. Anderseits gelingt die Umsetzung mit Histidin nicht.
Es sei darauf hingewiesen, dal3 neben der Peptidsynthese eine Acetylierung der freien Aminosäure oder des Peptids in heissem Eisessig verläuft. Diese fällt bei sterisch gehinderten Aminosäuren oder Peptiden kaum ins Gewicht. Ihre Bedeutung kann noch dadurch gemindert werden, dass man einen mehrfachen Uberschuss der aktivierten Esterkomponente verwendet. Wie schon betont wurde, kann ein solcher Überschuss leicht zurückgewonnen werden.
Aus der Messung der Reaktionsgeschwindigkeit der Peptidbildung und der Acetylierung in Eisessig lassen sich die Grenzausbeuten an Acyl-peptiden berechnen, die mit den experimentell gefundenen Werten gut übereinstimmen.
A'nderung der Grenzousbeuten bei verschiedenen Carbobenzoxy-Aminosäure-thiophenylester : Amino- saure-Verhuitytissen
Carbobenzoxy-L-leucyl-Grenzausbeuten an Carbo thiophenylester : L-Leucin benzoxy-L-leucyl-L-ieucin Molverhältnis "der Theorie
1 : 1 44
2 : 1 64
3 : 1 74
4 : 1 79
Carbobenzoxy-L-leucyl-Grenzausbeuten an Carbo thiophenylester : Glycin benzoxy-L-leucyl-glycin
Molverhältnis % der Theorie
1 : 1 70
2 : 1 86
3 : 1 91
4 : 1 93
Um die Vorteile des Verfahrens gemäss der Erfindung näher zu erläutern, sei z.
B. erwähnt, dass das Carbobenzoxyglycyl-L-alany'-L-phenylalanY'-gly- cin, erstmals von Kenner und Mitarbeitern (J. Chem.
Soc., London, 1957, Seite 1406) durch Gegenstromverteilung absolut frei von racemisierten Anteilen hergestellt worden ist, während nach dem vorliegenden Verfahren die gleiche Verbindung in einfacher Weise in optisch reiner Form erhalten wird.
Beispiel 1
1, 95 g Carbobenzoxy-L-leucin-thiophenylester und 0, 5 g Glycin werden in 3 cm3 Eisessig 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Hierbei geht das Glycin all mählich in Lösung. Sodann wird die Essigsäure im Vakuum abdestilliert. Man nimmt das Produkt in Essigester auf, schüttelt mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung aus und säuert die Bicarbonatlösung mit konzentrierter Salzsäure bis auf pH 1 an. Hierbei fällt das Carbobenzoxy-L-leucyl-glycin aus und kristallisiert. Es kann abgesaugt, getrocknet und aus Essigester unter Zusatz von Petroläther umkristallisiert werden. Man kann es aber wieder in Essigester aufnehmen, die Essigesterlösung mit Natriumsulfat trocknen, den Essigester fast verdampfen und das Produkt durch Zusatz von Petroläther zur Kristallisation bringen.
Ausbeute : umkristallisiert 1, 37 g (77, 5 /o der Theorie), Schmelzpunkt 112-113oC [a] 255 :-23, 70 (c = 2, 87 in abs. Athanol). Aus der Mutterlauge kann man noch eine geringe Menge gewinnen.
Beispiel 2
3, 01 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 1, 65 g L-Phenylalanin (spez. Drehg.-31, 9 ) werden 30 Minuten in 3 cm3 Eisessig unter Rückfluss erhitzt.
Die Aufarbeitung erfolgt in der in Beispiel 1 angegebenen Weise und liefert 2, 61 g Carbobenzoxy-glycyl L-phenylalanin (73 /o der Theorie), vom Schmelzpunkt 120-122 C. Es fällt noch etwas in Essigester etwas schwerer lösliches Racemat an, da das eingesetzte L-Phenylalanin nur eine spez. Drehung von -31, 9 statt-35 zeigt.
Beispiel 3
0, 70 g N-Trifluoracetyl-L-phenylalanin-thiophenylester und 0, 165g Glycin werden in 2 cm3 Eisessig 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach Aufarbeitung in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise erhält man 0, 42 g (66axa der Theorie) N-Trifluoracetyl-L-phenylalanyl-glycin, das nach einmaligem Umkristallisieren bei 155-157t) C schmilzt.
Das durch Behandeln mit wässrigem Ammoniak, Eindampfen zur Trockne und Digerieren mit hei¯em abs. Alkohol erhaltene freie Dipeptid-L-phenylalanylglycin zeigt die Drehung [a] 23 : + 74, 1 (c = 1, 9 in Wasser).
Beispiel 4
0, 920 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 0, 351 g DL-Valin werden in 2 cm3 Eisessig im Olbad (Badtemperatur 130 C) 1 Stunde lang erhitzt. Der Eisessig wird sodann im Vakuum abdestilliert, der Rückstand mit Essigester und gesättigter Natriumbicarbonatlösung geschüttelt. Aus der Essigesterphase werden 0, 031 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester zurückgewonnen. Die wässrige Phase liefert beim Ansäuern bis auf pH 1 0, 830 g (950/o. der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-DL-valin vom Schmelzpunkt 125-126 C. Beim erneuten Erhitzen wird die Verbindung wieder fest und schmilzt dann nochmals bei 143-144 C.
Beispiel 5
0, 902 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 0, 351 g DL-Valin werden in 2 cm3 Propionsäure 40 Minuten im Ölbad (Badtemperatur 130 C) erhitzt.
Die Aufarbeitung in der in Beispiel 4 angegebenen Weise liefert 0, 828 g (94 /der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-DL-valin.
Beispiel 6
1, 89 g Carbobenzoxy-L-alanin-thiophenylester (6 m, Mol) und 0, 702 g L-Valin (3 m,/Mol) werden in 10 cm3 Eisessig 3 Stunden im Ölbad unter Rückfluss erhitzt. Sodann wird der Eisessig im Vakuum abgedampft. Der Rückstand wird mit Essigester und gesättigter Natriumbicarbonatlösung geschüttelt. Der im Überschuss angewandte Carbobenzoxy-glycin-thio- phenylester wird aus der Essigesterphase durch Verdampfen des Lösungsmittels und Versetzen mit Petrol äther in kristalliner Form zurückgewonnen. Die Natriumbicarbonatlösung liefert beimAnsäuern mitSalzsäure auf pH 1 1, 12g (58 /a der Theorie) Carbo benzoxy-L-alanyl-L-valin, Schmelzpunkt 126-129 C.
Nach dem Umkristallisieren aus Athanol-Wasser schmilzt die Verbindung bei 146-148 C. Nimmt man von den beiden Komponenten je 3 m/Mol und erhitzt in 2 cm3 Eisessig 3 Stunden im Olbad (Badtemperatur 130 C) so beträgt die Ausbeute an Carbobenzoxy L-alanyl-L-valin 0, 67 g (69ego der Theorie).
Beispiel 7
0, 904 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 0, 536 g L-Analin werden in 5 cm3 Eisessig 2 Stunden auf 100 C im siedenden Wasserbad erhitzt. Sodann wird der Eisessig im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit Essigester digeriert. Hierbei fällt nicht umgesetztes Alanin aus. Es wird abfiltriert. Sodann wird das Carbobenzoxy-glycyl-L-alanin mit gesättig- ter Natriumhydrogencarbonatlösung ausgeschüttelt und durch Ansäuern mit Salzsäure in Freiheit gesetzt.
Ausbeute 0, 61 g (7311/o der Theorie) vom Schmelz punkt 131-145 C nach Umkristallisieren aus Essigester. [α] 2D-9, 45O (c = 2, 96 in Alkohol).
Beispiel 8
1, 8 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 0, 54 g Glycin werden in 4 cm3 Eisessig 1/2 Stunde im Ílbad auf 130 C erhitzt. Die in den voranstehenden Beispielen beschriebene analoge Aufarbeitung ergibt 1, 45 g (91 /o der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-glycin vom Schmelzpunkt 175-176 C.
Beispiel 9
1, 0 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 0, 265 g Glycyl-L-leucin werden in 5 cm3 Eisessig 11/2 Stunden im Ílbad (Badtemperatur 130 C) erhitzt. Die entsprechend den voranstehenden Beispielen vorgenommene Aufarbeitung liefert 0, 417 g (78 /o der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-glycyl-L-leucin vom Schmelzpunkt 135-137 C, nach dem Umkristallisieren aus Wasser Schmelzpunkt 146-148 C. [a] 24 : +1, 6 (c = 2, 16 in abs. Athanol). Nach Abspaltung des Carbobenzoxyrestes zeigt das entstandene Diglycyl-L-leucin die richtige optische Drehung [a] 2r0 : -28, 1 (c = 2, 53 in Wasser).
Beispiel 10
1, 8 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 0, 39 g L-Leucin werden in 5 cm3 Eisessig 1 Stunde unter Rückfluss erhitzt. Die entsprechend den voranstehenden Beispielen vorgenommene Aufarbeitung liefert 0, 65 g krist. Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester zurück und 0, 6g (62 /o der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-L-leucin vom Schmelzpunkt 137 bis 138¯ C [α] 28/D : -17,7¯ (c = 2, 38 in 1 n Natronlauge).
Aus den Mutterlaugen werden noch etwa 100/a etwas unreineres Produkt erhalten.
Beispiel 11
1, 39 g N-Trifluoracetyl-L-alanin-thiophenylester und 0, 375 g Glycin werden in 5 cm3 Eisessig 1 Stunde im 130 C warmen Olbad erhitzt. Bei der oben be schriebenen Aufarbeitung erhält man 0, 939 g (77 /o der Theorie) öliges N-Trifluoracetyl-L-alanyl-glycin.
Dieses ergibt bei der in bekannter Weise mit wässrigem Ammoniak vorgenommenen Enttrifluoracetylie rung L-Alanyl-glycin mit der optischen Drehung [a] 2D3 : +49, 3 (c = 2, 86 in Wasser).
Beispiel 12
1, 39 g N-Trifluoracetyl-L-alanin-thiophenylester und 0, 446 g L-Alanin werden in 10 cm3 Eisessig im Ílbad 2 Stunden (Badtemperatur 125 C) erhitzt. Bei der oben beschriebenen Aufarbeitung erhält man
0, 80 g (62, 5"/ ? der Theorie) langsam kristallisierendes N-Trifluoracetyl-L-alanyl-L-alanin. Nach Umkristal lisieren aus Äther Petroläther schmilzt die Verbindung bei 149-151 C.
[α] 28/D : -14,3¯ [α]546: -19,2¯ (c = 2, :-14, in abs. Tetra hydrofuran).
0, 473 g N-Trifluoracetyl-L-alanin-thiophenylester werden zurückgewonnen.
Beispiel 13
3, 01 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 1, 15 g L-Prolin werden in 15 cm3 Eisessig 90 Minuten im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Bei der Aufarbeitung entsprechend Beispiel 1 erhält man 1, 60 g (55 /a der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-Lprolin, das aus Essigester Petroläther umkristallisiert bei 150-151 schmilzt. [α] 23/D : -60,4¯ (c = 2,5 in abs.
Äthanol).
0, 59 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester werden zur ckgewonnen.
Beispiel 14
3, 01 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 1, 49 g L-Methionin werden in 15 cm s Eisessig 2 Stunden im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Nach Abdampfen des Eisessigs unter vermindertem Druck, Aufnehmen in Essigester und Extrahieren des Carbobenzoxy-glycin-L-methionins mit wässriger Natrium bicarbonatlösung kristallisiert das Peptid beim Ansäuern mit Salzsäure aus und schmilzt nach Umkristallisieren aus Essigester Petroläther bei 110 bis ll lo C. Die Ausbeute beträgt 780in der Theorie.
[α] 27 : + 4, 2 (c = 2, 40 in abs. Athanol).
Beispiel 15
3, 01 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 0, 975 g O-Benzyl-L-serin oder die gleiche Menge der D. L-Verbindung werden in 20 cmv Eisessig 90 Minuten im Cilbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Nach Aufarbeitung analog Beispiel 1 erhält man nach Umkristallisieren aus Essigester 0, 94 g (50 /o der Theorie) Carbobenzoxy-glycin-D. L.-O-benzylserin vom Schmelzpunkt 137-137, 5-).
Beispiel 16
18, 9 g Carbobenzoxy-L-alanin-thiophenylester und 4, 5 g Glycin werden in 100 cm3 Eisessig 2 Stunden im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Es wird in üblicher Weise aufgearbeitet. Bei Zugabe von heissem Petroläther zum eingeengten Essigesterextrakt kristallisieren 13, 3 g (82"/ (t der Theorie) Carbobenzoxy-L alanyl-glycin vom Schmelzpunkt 127-128 aus.
25 :-17, 01 (c 2, 65 in abs. Athanol).
Beispiel 17
1, 65 g Carbobenzoxy-glycin-p-nitrothiophenylester und 1, 02 g L-Tryptophan werden in 5 cm3 Eisessig
2 Stunden auf einem siedenden Wasserbad erhitzt. In üblicher Weise wird der Eisessig im Vakuum ver dampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit wässriger Natriumbicarbonatlösung ausge zogen. Die wässrige Phase wird zunächst mit konz.
Salzsäure neutralisiert und sodann mit Eisessig auf einen pH-Wert von 3-4 gebracht. Nach dem Animpfen kristallisieren 1, 1 g (56 /der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-L-tryptophan vom Schmelzpunkt 129 bis 131¯-aus. Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Athanol-Wasser schmilzt die Verbindung bei 141 bis 142. [a] 24 : + 33, 3 (c = 2, 34 in abs.
Athanol).
Beispiel 18
4, 02 g Carbobenzoxy-L-asparaginsäure-ss-methyl- a-p-nitrophenyl-ester und 0, 75 g Glycin werden in 25 cm3 Eisessig 2 Stunden im Ölbad auf 130"erhitzt.
Nach der üblichen Aufarbeitung werden 1, 81 g (54 /o der Theorie) Carbobenzoxy-L-asparagyl-a-glycin-lS- methylester erhalten, der aus Essigester'Petroläther umkristallisiert bei 122 C schmilzt.
Beispiel 19
16 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 7, 0 g Glycyl-glycin werden in 100 cm3 Eisessig 1. Stunden im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Nach der üblichen Aufarbeitung kristallisiert das Carbobenzoxy-diglycyl-glycin aus. Es wird gut mit kaltem Wasser gewaschen. Die Ausbeute an Carbobenzoxy-diglycyl-glycin vom Schmelzpunkt 184 bis 186 C (Zersetzung) beträgt 13, 0 g (76 /o der Theorie).
Beispiel 20
2, 34 g Carbobenzoxy-glycyl-L-leucin-thiophenylester und 0,85 g Glycin werden in 10 cm3 Eisessig 2 Stunden im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C).
Man erhält nach der üblichen Aufarbeitung 1, 46 g (68 /o der Theorie) nicht kristallisierendes Carbo benzoxy-glycyl-L-leucyl-glycin. Durch Entcarbobenzoxylierung durch Erhitzen mit wasserfreier Trifluor- essigsäure entsteht das bekannte Glycyl-L-leucyl-glycin mit [a] 2D :-43, 8" (c = 2, 67 in Wasser).
Beispiel 21 1, 43 g Carbobenzoxy-L-leucin-thiophenylester und 0, 36 g L-Alanin werden in 3 cm3 Eisessig 11 1,', Stun- den im Ölbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Nach der üblichen Aufarbeitung kristallisiert man das Rohprodukt aus Essigester Petroläther um und erhält 0, 58 g (43 /o der Theorie) Carbobenzoxy-L-leucyl-Lalanin vom Schmelzpunkt 150 .
Mg :-24, 6 .
Beispiel 22
8, 58 g Carbobenzoxy-L-alanyl-glycin-thiophenyl- ester und 3, 0 g Glycin werden in 40 cm3 Eisessig 2 Stunden im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C).
Nach der üblichen Aufarbeitung und Umkristallisieren aus Wasser erhält man 6, 58 g (84 /o. der Theorie) Carbobenzoxy-1-alanyl-glycyl-glycin vom Schmelzpunkt 161-163, 1.
[α]25/D-6,1¯.
Zu dem gleichen Tripeptid gelangt man, wenn 9, 34 g Carbobenzoxy-L-alanin-thiophenylester und 3, 93 g Glycyl-glycin in 50 cm3 Eisessig 1 1/2 Stunden im Ílbad erhitzt werden (Badtemperatur 130 C). Die übliche Aufarbeitung liefert 5, 08 g (50019 der Theorie) an Carbobenzoxy-L-alanyl-glycyl-glycin, Schmelzpunkt 155-157 , das nach dem Umkristallisieren aus Wasser ebenfalls bei 161-163 C schmilzt.
Beispiel 23
1, 42 g Carbobenzoxy-L-alanin-thiophenylester und 0, 55 g Diglycyl-L-leucin werden in 5 cm3 Eisessig 90 Minuten im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C).
Hierbei geht das Tripeptid sofort in Lösung. Nach der üblichen Aufarbeitung erhält man das Carbobenzoxy-L-alanyl-glycyl-glycyl-L-leucin als Íl, das beim Stehen kristallisiert. Die Ausbeute beträgt 0, 693 g (68eue der Theorie). Aus Wasser kristallisiert die Verbindung sofort, und zwar als Monohydrat vom Schmelzpunkt 122-123 C.
[a] 23 : 18, 2 (c = 2, 257 in abs. Athanol).
Zu dem gleichen Produkt gelangt man, wenn man 1, 28 g Carbobenzoxy-L-alanyl-glycyl-glycin-thiophenylester und 0, 786 g L-Leucin 70 Minuten in 10 cm3 Eisessig auf 130 erhitzt und in üblicher Weise aufarbeitet. Beim Ansäuern der Bicarbonatlösung kristallisieren 0, 85 g (61% der Theorie) des Carbobenzoxytetrapeptids vom Schmelzpunkt 123-124 C.
[a] 22 :-18,0¯ (c = 2, 03 in abs. Äthanol).
Beispiel 24
4, 45 g Phthalylglycin-thiophenylester und 1, 97 g L-Leucin werden in 20 cm3 Eisessig 1 Stunde lang im Olbad erhitzt (Badtemperatur 135 ). Der Eisessig wird hierauf unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei ein öliger Rückstand verbleibt, der mit etwa 30 cm3 wässriger gesättigter Natriumbicarbonatlösung und Essigester geschüttelt wird. Die wässrige Phase wird tropfenweise mit konz. Salzsäure angesäuert.
Beim Anreiben kristallisieren 3, 7 g (78 /o der Theorie) Phthalyl-glycyl-L-leucin aus. Die Verbindung schmilzt nach Umkristallisieren aus Essigester, Petrol äther bei 157-159 .
[a] 2D :-6, 5 (c = 1, 93 in Athanol).
Beispiel 25
2 g Phthalyl-glycin-thiophenylester und 0, 51 g Glycin werden in 30 cm3 Eisessig 1 Stunde und 50 Minuten im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 135¯C).
Die nach dem vorstehenden Beispiel vorgenommene Aufarbeitung ergibt 1, 65 g (93, 7 /o der Theorie) Phthalyl-glycyl-glycin vom Schmelzpunkt 228-2290.
Beispiel 26
4 g Phthalyl-glycin-thiophenylester und 2, 45 g L Tyrosin werden in 60 cm3 Eisessig im Ölbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Das Tyrosin geht sehr langsam in Lösung. Nach 11 Stunden sind 60 /o, L-Tyrosin noch nicht umgesetzt und werden abfiltriert. Die in üblicher Weise vorgenommene Aufarbeitung liefert 1, 40 g (69 ouzo der Theorie) an Phthalyl-glycyl-Ltyrosin, berechnet auf das umgesetzte Tyrosin. Die Verbindung ist in Essigester sehr schwer löslich. Sie wird aus Athanol/Wasser umkristallisiert und schmilzt nach scharfem Trocknen bei 230 .
[a] 23/D: +94¯ (c = 0, 66 in Athanol).
Beispiel 27
4, 4 g Phthalyl-glycin-thiophenylester und 1, 34 g L-Alanin werden in 15 cm3 Eisessig I 1/1 Stunden auf 130 erhitzt. Die übliche Aufarbeitung liefert 2, 90 g (70% der Theorie) an Phthalyl-glycyl-L-alanin vom Schmelzpunkt 205-207¯.
[a] 23/D : -25,3¯ (c = 1, 4 in Äthanol).
Beispiel 28
4, 45 g Phthalyl-glycin-thiophenylester und 1, 76 g L-Valin werden in 15 cm3 Eisessig 1 Stunde im Öl- bad (Badtemperatur 135 C) erhitzt. Die übliche Aufarbeitung liefert 3, 36 g Phthalyl-glycyl-L-valin (74"/o der Theorie) vom Schmelzpunkt 203-204 C.
[a] :-5, 75 (c = 1, 04 in Athanol).
Beispiel 29
5 g Phthalyl-glycin-thiophenylester und 2, 78 g L Phenyl-alanin werden in 20 cm3 Eisessig 1 Stunde im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 135 C). Die übliche Aufarbeitung liefert 2, 24 g (71, 5 /o, der Theorie) Phthalyl-glycyl-L-phenylalanin vom Schmelzpunkt 194-195 C.
[a] 24 : +56, 8 (c = 1, 23 in Athanol).
Beispiel 30
5 g Phthalyl-glycin-thiophenylester und 3, 42 g L Tryptophan werden in 30 cm3 Eisessig 1 Stunde im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 135¯ C). Die übliche Aufarbeitung liefert 3, 96 g (60, 5% der Theorie) Phthalyl-glycyl-L-tryptophan vom Schmelzpunkt 210 bis 211 .
[a] 26 : +104, 8 (c = 1, 01 in Athanol).
Beispiel 31
4 g Phthalyl-glycin-thiophenylester und 1, 55 g L Prolin werden in 15 cm3 Eisessig 11/4 Stunden im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Die übliche Aufarbeitung liefert 2, 76 g (68 /01 der Theorie) Phthalyl-glycyl-L-prolin vom Schmelzpunkt 195 bis 198 C. Nach Umkristallisieren aus Essigester, Petrol äther schmilzt die Verbindung bei 199-201 C.
[a] 20/D :-57, 5 (c = 0, 91 in Äthanol).
Beispiel 32
1 g Phthalyl-L-phenylalanin-thiophenylester werden mit 0, 195 g Glycin in 5 cm3 Eisessig 1 Stunde im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 135 C). Die übliche Aufarbeitung liefert nach zweimaligem Umkristalli- sieren aus Essigester Petroläther 0, 48 g (53 /o der Theorie) Phthalyl-L-phenyl-alanyl-glycin.
[a] 22/D : 140, 1 (c = 1, 05 in Athanol).
Beispiel 33
5, 3 g N-Trifluoracetyl-L-phenylalanin-thiophenyl- ester und 1, 35 g L-Alanin werden in 15 cm3 Eisessig 2 Stunden im Ölbad erhitzt (Badtemperatur 130 ). Die übliche Aufarbeitung liefert 2, 89g (58% der Theorie) N-Trifluoracetyl-L-phenylalanyl-L-alanin. Die Verbindung wird aus Wasser umkristallisiert und schmilzt bei 165-168 .
[a] 28/D: + 12,2¯ [α] 546 = + 11,75¯ (c= 1, 15 in absolutem Tetrahydrofuran).
Beispiel 34
4, 3 g N-Trifluoracetyl-L-phenylalanin-thiophenylester und 1, 46 g L-Valin werden in 12 cm3 Eisessig 2 Stunden im Ölbad erhitzt (Badtemperatur 130¯ C).
Die übliche Aufarbeitung liefert 2, 65 g (61 ID/o der Theorie) N-Trifluoracetyl-L-phenylalanyl-L-valin. Es wird aus Wasser'Athanol (2 : 1) umkristallisiert und schmilzt bei 175-177¯ C.
[a] 2rS = +16, 5 M. = +17, 4 (c = 1, 15 in ab solutem Tetrahydrofuran).
Es werden 1, 35 g N-Trifluoracetyl-L-phenylalanin-thiophenylester zurückgewonnen.
Beispiel 35
5, 3 g N-Trifluoracetyl-L-phenylalanin-thiophenyl- ester und 1, 97 g L-Leucin werden in 15 cm :) Eisessig 2 Stunden im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 130 C).
Die übliche Aufarbeitung liefert 3, 53 g (63"au der Theorie) N-Trifluoracetyl-L-phenylalanyl-L-leucin.
Die Verbindung wird aus Essigester umkristallisiert und schmilzt bei 184-187 C.
[a] 2r8 = +0, 95 [α]546 =- + 0,95¯ (c = 3, 15 in ab solutem Tetrahydrofuran).
Es werden 1, 91 g N-Trifluoracetyl-L-phenylalanin-thiophenylester zurückgewonnen.
Beispiel 36
5, 3 g N-Trifluoracetyl-L-phenylaianin-thiophenylester und 2, 48 g L-Phenylalanin werden in 15 cyme Eisessig 2 Stunden im Olbad erhitzt (Badtemperatur 135 C). Die übliche Aufarbeitung liefert 4, 15 g (68 duo der Theorie) N-Trifluoracetyl-L-phenylalanyl-L-phe- nylalanin, das nach Umkristallisieren aus Essigester bei 218-219 C unter Zersetzung schmilzt.
[a] 26,5/D = +39, 4 [a] 546 =+ 46,2¯ (c = 2, 32 in absolutem Tetrahydrofuran).
Es werden 1, 08 g N-Trifluoracetyl-L-phenvl- alanin-thiophenylester zurückgewonnen.
Beispiel 37
5, 3 g N-Trifluoracetyl-L-phenylalanin-thiophenylester und 4, 48 g L-Methionin werden in 20 cm3 Eisessig 3 Stunden im Olbad erhitzt (Badtemperatur 130¯ C). Die übliche Aufarbeitung liefert 3, 39 g (58 /o der Theorie) N-Trifluoracetyl-L-phenylalanyl-Lmethionin. Nach Umkristallisieren aus Diisopropyl äther zeigt die Verbindung einen Schmelzpunkt von 177-178¯ C.
[α]26,5/D. = +22,0¯ [α]546 = + 23,9¯ (c =- 2,3 in absolutem Tetrahydrofuran).
Es werden 0, 92 g N-Trifluoracetyl-L-phenylalanin-thiophenylester zurückgewonnen.
Beispiel 38
1, 21 g N-Trifluoracetyl-glycin-cyanmethylester und 0, 75 g L-Leucin werden in 5 cm3 Eisessig 90 Minuten im Ílbad (Badtemperatur 130¯ C) erhitzt. Die bliche Aufarbeitung liefert 0,19 g (12% der Theorie) N-Trifluoracetyl-glycyl-L-leucin vom Schmelzpunkt 177-179 C.
Beispiel 39
0, 85 g Carbobenzoxy-glycin-phenylester und 0, 35 g D. L-Valin werden in 5 cm3 Eisessig 40 Minuten im Ölbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Die übliche Aufarbeitung liefert 0, 38 g (41 /o der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-D. L-valin vom Schmelzpunkt 125-126 C. Die Substanz wird fest und schmilzt bei weiterem Erwärmen erneut bei 143 bis 144) C. Sie kann aus Athanol-Wasser umkristallisiert werden.
Analog verläuft die Darstellung von Carbo benzoxy-glycyl-L-valin, das nur langsam kristallisiert.
Beispiel 40
3, 72 g Carbobenzoxy-glycyl-L-alanin-thiophenyl- ester ([α] 23/D:-68¯ [c=2, 44 in Sithanol], Schmelzpunkt 90-92 C) und 1, 11 g L-Phenyl-alanyl-glycin ( [a] 28 :-10, 3,, [c = 2, 73 in Eisessig], Schmelzpunkt 148 C) werden in 20 cm3 Eisessig 2 Stunden im Öl- bad erhitzt (Badtemperatur 120 C). Sodann wird der Eisessig im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mit wässriger Natriumbicarbonatlösung und Essigester geschüttelt.
Hierbei bleiben 0, 51 g durch intramolekulare Kondensation entstandenes Diketopiperazin vom Schmelzpunkt 255-256 C (Sublimation) aus L Phenylalanyl-glycin ungelöst und werden abgetrennt.
Die wässrige Phase wird mit Salzsäure angesäuert und sodann mehrfach mit Essigester ausgeschüttelt. Die Essigesterlösung wird mit Natriumsulfat getrocknet und der Essigester unter vermindertem Druck verdampft. Hierbei kristallisieren 0, 78 g (32 /o der Theorie) Carbobenzoxy-glycyl-L-alanyl-L-phenylalanyl- glycin aus. Durch Umkristallisieren aus Methanol erhält man farblose Nadeln vom Schmelzpunkt 175O C.
D-31, 9, (c = 2, 6 in Glykolmonomethyläther).
Die Verbindung zeigt somit den gleichen Schmelzpunkt und die gleiche optische Drehung wie eine von G. W. Kenner und Mitarb. (J. Chem. Soc., London, 1957, S. 1406) dargestellte und erst durch mühsame Gegenstromverteilung optisch rein erhaltene Verbindung.
Beispiet 41
3, 01 g Carbobenzoxy-glycin-thiophenylester und 1, 82 g L-Lysinmonohydrochlorid in 15 cm3 Eisessig werden 2 Stunden im Olbad erhitzt (Badtemperatur 130 C). Nach dem Verdampfen des Eisessigs im Vakuum wird der Rückstand zwischen Wasser und Essigester verteilt.
Die wässrige Phase wird mit Natriumacetat abgepuffert und das E-Carbobenzoxy-glycyl-L-lysin wird durch Verrühren mit Kupfercarbonat als Kupferkomplex gefällt. Der Niederschlag wird abfiltriert und in siedendem Wasser mit Schwefelwasserstoff zerlegt.
Nach Abfiltrieren des Kupfersulfids wird unter vermindertem Druck eingedampft. Dabei kristallisiert die Verbindung aus. Nach Zugabe von Athanol wird abgesaugt und getrocknet. Man erhält 0, 24 g (7, 2"/o der Theorie ±-Carbobenzoxy-glycyl-L-lysin vom Schmelzpunkt 234-235 C. Nach Umkristallisieren aus Wasser schmilzt die Verbindung bei 240-242 C.
[a] 23 : + 8, 3
Beispiel 42
1, 02 g Phthalyl-glycin-p-nitrothiophenylester und 0, 27 g L-Alanin werden in 5 cm3 Eisessig 2 Stunden im Ílbad erhitzt (Badtemperatur 125 C). Die üb- liche Aufarbeitung liefert 0, 454g (46 /e der Theorie) Phthalyl-glycyl-L-alanin. Nach Umkristallisation aus Essigester/Petroläther erhält man 0, 426 g (43 O/o der Theorie) vom Schmelzpunkt 205-206 C.
[a] 20 :-25, 9 (c = 1, 1 in Athanol).
Beispiel 43
3, 0 g Carbobenzoxy-L-alanyl-glycyl-glycin-thiophenylester und 1, 42 g L-Alanyl-glycyl-glycin werden in 20 cm3 Eisessig 1 Stunde auf 130 C erhitzt. Nach dem Abdestillieren von Essigsäure und Thiophenol unter vermindertem Druck wird der Rückstand zwischen Wasser und Essigester (unter schwachem Erwärmen) verteilt. Aus der Essigesterlösung lassen sich 0, 35 g nicht umgesetzter Carbobenzoxy-L-alanylglycyl-glycin-thiophenylester zurückgewinnen.
Die wässrige Phase hinterlässt beim Eindampfen einen Rückstand, der beim Versetzen mit heissem Essigester kristallisiert. Die Kristalle werden abfiltriert und in Wasser aufgenommen. Die dabei entstehende schwach braun gefärbte Lösung wird mit wenig Aktivkohle behandelt, filtriert und dann mit einem Ionenaustauscher (H+-Form) behandelt, bis die Ninhydrinreaktion kaum mehr sichtbar ist. Die nun völ- lig farblose Lösung wird filtriert und der Ionenaustauscher mit Wasser gut gewaschen. Aus der so behandelten Lösung kristallisieren beim Einengen 1, 77 g Carbobenzoxy-L-alanyl-glycyl-glycyl-L-alanyl-glycylglycin vom Schmelzpunkt 157-160 C (nach Sintern bei 148 C) aus.
Aus der Mutterlauge lassen sich weitere 0, 79 g des Hexapeptids vom Schmelzpunkt 148 bis 152 C gewinnen. Die Gesamtausbeute beträgt somit 2, 56 g (67 /e der Theorie). Nach Umkristallisieren aus Wasser schmilzt die Verbindung bei 161-163 C (nach Sintern bei 117-118 C.
[a] 22 :-4, 6 (c = 2, 38 in Dimethylformamid).
Die Verbindung kristallisiert mit einem Mol Kristallwasser.