CH374695A

CH374695A - Verfahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzmitteln

Info

Publication number: CH374695A
Application number: CH6857359A
Authority: CH
Inventors: Fritz Dr Lindner; Josef Dr Schmidt-Thome
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1958-01-22
Filing date: 1959-01-20
Publication date: 1964-01-31
Also published as: BE575004A; OA02321A

Description

Verfahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzrnitteln
Die Anwendung von Blutplasmaersatzmitteln ist nach wie vor von grösster Bedeutung in Fällen, in denen menschliches Blut oder Plasma in Form von Konserven oder nicht ausreichend zur Verfügung steht. Ein solches Ersatzmittel muss hydrophile Kolloide enthalten, deren Molekülgrösse so eingestellt ist, dass sie mindestens 12 bis 24 Stunden im Kreislauf verbleiben; der kolloidosmotische Druck muss etwa den gleichen Wert wie der von Blutplasma haben; das Ersatzmittel soll nach einigen Tagen aus dem Kreislauf verschwunden und vollständig abgebaut oder ausgeschieden sein. Weiter ist es notwendig, dass ein solches Mittel frei von pyrogenen und antigenen Eigenschaften und in jeder Beziehung gut verträglich ist.

Eine Reihe von Substanzen ist als Plasmaersatzmittel vorgeschlagen worden, z. B. tierisches Blutplasma, Gummiarabikum, Pektine, Polysaccharide wie Dextrane oder Laevane, synthetische Kolloide wie Polyvinylpyrrolidon oder Polyvinylalkohol. Über das Schicksal dieser Stoffe im Organismus und ihre Ausscheidung oder evtl. Speicherung sowie über ihre antigene Wirkung besteht in den meisten Fällen noch keine Klarheit, so dass ihre Anwendung nicht immer unbedenklich erscheint. Es ist weiter vorgeschlagen worden, Gelatinelösungen als Plasmaersatzmittel zu verwenden. Die Gelatine hat vor vielen anderen Ersatzmitteln den Vorteil, dass sie ein Protein ist, das nur geringe antigene Eigenschaften besitzt und durch proteolytische Fermente abgebaut bzw. vom Organismus leicht ausgeschieden werden kann.

Ein Nachteil der Gelatine ist, dass ihre Lösungen bei Zimmertemperatur gelieren können, so dass sie vor der Injektion durch Erwärmen verflüssigt werden müssen, und dass infolge der raschen Ausscheidung die Verweilzeit im Kreislauf zu kurz ist.

Es sind verschiedene Versuche unternommenworden, die Eigenschaften der Gelatine zu verbessern.

Durch hydrolytischen Abbau kann man eine Verringerung der mittleren Molekülgrösse erreichen, so dass bei Zimmertemperatur keine Gelierung mehr auftritt. Solche abgebaute Gelatine wird aber noch schneller ausgeschieden als unbehandelte Gelatine.

Weiterhin hat man Gelatine gehärtet bzw. bzw. ver- netzt, indem man sie mit Aldehyden wie Formaldehyd, Glyoxal und ähnlichen Kondensationsmitteln behandelte und anschliessend oder während der Vernetzungsreaktion hydrolytisch oder oxydativ partiell abbaute, um von den zunächst erhaltenen hochmole- kularen Produkten zu solchen mit einem niedrigeren Molgewicht zu kommen.

Die Endprodukte besitzen eine grössere Zahl ionisierbarer Carboxylgruppen als die Ausgangsgelatine, wodurch der isoelektrische Punkt herabgesetzt und die Löslichkeit verbessert wird. Eine andere Verbesserung wurde durch Umsetzung von Gelatine mit Anhydriden oder Chloriden gewisser Polycarbonsäuren erzielt. Auch hierbei erhält man Produkte mit einem veränderten Verhältnis von freien Amino- zu Carboxylgruppen und damit erhöhter Löslichkeit und gän- stigeren kolloidosmotischen Eigenschaften.

Die bisher aus Gelatine hergestellten Blutersatz- mittel haben, insbesondere bezüglich der Gleichförmigkeit ihrer Eigenschaften, noch nicht voll befriedigt und sind nicht zu einer allgemeineren Anwendung gekommen.

Es wurde nun gefunden, dass man zu einem brauchbaren Blutplasmaersatzmittel gelangen kann, indem man Kollagenabbauprodukte einem schonenden hydrolytischen Abbau bis zu einer Molekülgrösse von 2000-20000, vorzugsweise 5000-10000, unter wirft, das Hydrolysat mit einem mehrfunktionellen
Isocyanat vernetzt, wobei die angewandte Isocyanat menge geringer ist als diejenige, welche sich aus der
Anzahl der im Hydrolysat vorhandenen Amino- und
Guanidinogruppen errechnet, und vorzugsweise etwa 20-80 O/o dieser Menge beträgt, das so erhaltene Pro dukt auf einen pH-Wert von etwa 7 einstellt und die Lösung durch Salzzusatz isotonisch macht, oder in dem man die Kollagenabbauprodukte zunächst mit einem mehrfunktionellen Isocyanat vernetzt, wobei die angewandte Menge Isocyanat 20-800/0 derjenigen beträgt,

die sich aus der Anzahl der vorhandenen
Amino- und Guanidinogruppen errechnet, hierauf das entstandene Vernetzungsprodukt einem schonenden hydrolytischen Abbau bis zu einer Molekülgrösse von
10000-100000, vorzugsweise 30000-60000, unter wirft, die so erhaltene Lösung auf einen pH-Wert von etwa 7 einstellt und durch Salzzusatz isotonisch macht.

Die Arbeitsweisen unterscheiden sich dadurch, dass die Reihenfolge der Verfahrensschritte vertauscht ist. Während nach der einen Methode das Ausgangs material zunächst zu kleineren Molekülen abgebaut wird, die nun durch ein mehrfunktionelles Iso cyanat wieder zu Molekülen der gewünschten Grösse vernetzt werden, erfolgt nach der zweiten Methode zunächst eine Vernetzung des Ausgangsmaterials zu noch grösseren Molekülen, die nun zu solchen der gewünschten Molekülgrösse abgebaut werden.

Der Effekt der Vernetzung ist nach beiden Ar beitsweisen der gleiche. Die Blockierung von Amino oder Guanidinogrnppen in den Endprodukten durch die Mithilfe des Isocyanats eingeführten Harnstoff brücken bewirkt eine Verschiebung des Verhältnisses von freien Carboxyl-zu Aminogruppen zugunsten der ersteren. Dadurch steigt die Löslichkeit und sinkt die
Gelierfähigkeit. Die durch die Vernetzung neu gebil deten Harnstoffbrücken zwischen verschiedenen Mo lekülen werden unter den angewandten schonenden
Hydrolysebedingungen nicht gespalten; eine Spaltung findet nur zwischen den Peptidbindungen der Protein ketten statt.

Das als Ausgangssubstanz verwendete Material soll frei sein von pyrogenen und sonstigen pharmakologisch wirksamen Bestandteilen; am geeignetsten ist eine möglichst reine Knochengelatine. Uner wünschte anorganische Bestandteile, vor allem Calciumsalze, können durch Dialyse, Elektrodialyse oder am besten durch Behandeln mit einem Inonenaustauscher entfernt werden.

Die Verfahrensprodukte stellen verzweigte Moleküle mit erhöhter Sperrigkeit dar.

Der nach der ersten Arbeitsweise zunächst vorzunehmende Abbau der Kollagenabbauprodukte bzw. der Gelatine kann auf verschiedene Weise vorgenommen werden, z. B. durch saure, alkalische oder fermentative Hydrolyse. Bei Gelatine lässt sich eine besonders schonende Hydrolyse dadurch erreichen, dass man eine wässrige Lösung bei etwa neutraler Reaktion so lange auf eine Temperatur zwischen 60 und 1500, vorzugsweise auf 1200, erhitzt, bis der gewünschte Hydrolysegrad mit einer Molekülgrösse zwischen 2000 und 20000 erreicht ist. Bei einer guten Knochengelatine genügt eine Erhitzungsdauer von etwa 5-6 Stunden auf 1200 im geschlossenen Gefäss für den Abbau bis zu Molekülen der Grösse von 5000-10 000.

Die vorzugsweise verwendete Konzentration der Gelatine bzw. der fertigen Plasmaersatzmittel liegt bei 4 bis 60/0, da dies etwa der Proteinkonzentration im Blut entspricht, doch lässt sich der hydrolytische Abbau und die anschliessende Vernetzung auch mit niedriger oder höher konzentrierten Lösungen durchführen.

Die Reaktion des Hydrolysates mit mehrfunktionellen Isocyanaten kann unmittelbar nach der Hydrolyse in der gleichen Lösung durchgeführt werden. Die Isocyangruppe reagiert unter diesen Bedingungen bevorzugt mit den reaktionsfähigen Aminogruppen bzw.

Amid- oder Guanidinogruppen der Peptidketten unter Bildung von Harnstoffgruppen. Hierdurch findet eine Vernetzung zweier oder mehrerer Polypeptidketten über Harnstoffbrücken zu einem grösseren Molekül statt. Die Reaktion lässt sich bei Anwendung z. B. eines Diisocyanats etwa folgendermassen formulieren:
EMI2.1

EMI3.1

Die Vernetzungsreaktion wird zweckmässig bei neutralem bis schwach alkalischem pH vorgenommen, da in saurer Lösung die Reaktion sehr langsam oder gar nicht vor sich geht. Da bei der Umsetzung die basischen Aminogruppen in sehr schwach basische Harnstoffgruppierungen übergehen, werden vorher als innere Salze vorliegende Carboxylgruppen frei, und das pH verschiebt sich nach sauren Werten.

Es ist daher zweckmässig, durch laufende Zugabe von verdünntem Alkali nach Massgabe des Verbrauchs des Isocyanats das pH nachzustellen und bei einem Wert zwischen 7 und 8 zu halten.

Die Zugabe des Isocyanats erfolgt, zweckmässig unter starkem Rühren der Lösung, entweder direkt oder gelöst in einem organischen, mit Wasser mischbaren, aber gegen Isocyanate indifferenten Lösungsmittel, z. B. Tetrahydrofuran oder Aceton. Die Temperatur der Lösung kann weitgehend - zwischen 0 und 1000 - variiert werden, am zweckmässigsten arbeitet man bei 30". Die Zugabe des Isocyanates wird am besten fraktioniert vorgenommen, wobei der Verlauf der Reaktion an der pH-Anderung bzw. an dem obengenannten Verbrauch von Alkali verfolgt werden kann. Als Isocyanate kommen z. B. in Frage: aliphatische Polyisocyanate, besonders solche vom Typ OCN-(CH2) X-NCO, wobei x in der Grösse von 2-20 liegen kann, oder auch aromatische und hydroaromatische Polyisocyanate.

Die zur Vernetzung günstigste Isocyanatmenge hängt von der Molekülgrösse des Hydrolysats und auch von der Qualität des Ausgangsmaterials ab; sie kann zwischen 10 und 100 /o der durch die NH2 Analyse zu berechnenden Menge liegen. Aus einem Hydrolysat mit Molekülen der Grösse von 5000 bis 10000 werden besonders brauchbare Produkte erhalten, wenn man etwa 30-40 /o der Menge eines mehrfunktionellen Isocyanats anwendet, die sich aus dem Gehalt an Amino- bzw. Guanidinogruppen gemäss der Aminosäurezusammensetzung der Gelatine bzw. aus dem Hydrolysegrad ergibt.

Nach der Vernetzung muss das evtl. zur Lösung des Isocyanats verwendete organische Lösungsmittel aus dem Endprodukt entfernt werden. Dies geschieht am besten durch Destillation im Vakuum, wobei zur Verhinderung des Schäumens eine geringe Menge eines Antischaummittels, wie Octylalkohol, zugesetzt werden kann, das bei der Destillation mit dem Wasserdampf wieder übergeht.

Zur praktischen Anwendung wird die Lösung nunmehr auf ein solches Volumen gebracht, dass sie 56/zig an Protein ist. Dann wird so viel Kochsalz oder physiologisches Salzgemisch zugesetzt, dass eine isotonische Lösung entsteht. Die Lösung wird nunmehr sterilisiert und in Ampullen abgefüllt. Das Sterilisieren kann z. B. durch Filtration oder auch durch 10-20 Minuten langes Erhitzen auf 1200 vorgenommen werden. Falls erwünscht, kann auch durch Gefriertrocknung ein Trockenpulver hergestellt werden, das zur Anwendung wieder in sterilem Wasser gelöst wird.

Da bei der Vernetzung der Kollagenabbauprodukte, vorzugsweise Gelatine, mit mehrfunktionellen Isocyanaten die Viskosität steigt, geliert bei der zweiten Arbeitsweise die Lösung nach einiger Zeit, und eine fraktionierte Zugabe des Isocyanats über eine längere Zeit und eine Nachstellung des pH-Wertes nach der Gelierung ist nicht mehr zweckmässig. Durch mehrstündiges Stehenlassen der Vernetzungslösung nach der Gelierung erreicht man aber auch hier die vollständige Umsetzung des Isocyanats mit dem zu vernetzenden Ausgangsmaterial.

Das Isocyanat kann auch bei der zweiten Arbeitsweise sowohl in einem geeigneten organischen Lösungsmittel als auch direkt unter starkem Rühren zugesetzt werden. Der Abbau der Vernetzungsprodukte wird in der gleichen Weise wie bei der ersten Arbeitsweise bewirkt. Führt man ihn thermisch durch, so hat sich auch hier eine Erhitzungszeit von etwa 5 bis 6 Stunden bei 1200 im geschlossenen Gefäss als am günstigsten erwiesen.

Die nach beiden Arbeitsweisen erhaltenen Verfahrensprodukte sind ausgezeichnete Plasmaersatzmittel und zeichnen sich gegenüber bekannten Mitteln durch eine Reihe von Vorzügen aus. Ihre Lösungen sind vollkommen klar und im Gegensatz zu anderen aus Gelatine hergestellten Ersatzmitteln auch farblos; der Erstarrungspunkt liegt unterhalb von 10 . Das Molekulargewicht der Verfahrensprodukte liegt bei
15000-60000, es kann durch Variation der Herstellungsbedingungen weitgehend den Bedürfnissen der Praxis angepasst werden. Am besten haben sich Produkte mit einem Molekulargewicht von etwa 20000 bewährt. Die Endprodukte besitzen, wie Messungen in der Ultrazentrifuge zeigen, im wesentlichen einheitliche Molekülgrösse.

Im Tierversuch zeigen die Lösungen eine ausgezeichnete Verträglichkeit und besitzen keinerlei toxische Wirkungen. Hierbei ist besonders hervorzuheben, dass mit Produkten vom Molekulargewicht von nur etwa 20000 im Blutaustauschversuch und im Überlebensversuch volle Plasmaersatzwirkung erzielt wird. Ausscheidungsversuche ergaben, dass erst nach 24 Stunden die Hälfte der Substanz aus dem Blut verschwunden und die weitere Ausscheidung innerhalb von 2 bis 3 Tagen vollendet ist. Im Gegensatz hierzu zeigt Gelatine viel ungünstigere Ausscheidungsverhält- nisse und ist schon nach wenigen Stunden im Blut nicht mehr nachweisbar.

Die Ursache für diese erwünschte verlängerte Verweilzeit der vernetzten Produkte im Blut liegt darin, dass sie durch Fermente wie Trypsin, Pepsin und Gewebsfermente langsamer gespalten werden als Gelatine. Auch die durch die Vernetzung erhöhte Sperrigkeit der Moleküle trägt zu einer langsameren Ausscheidung bei. Trotzdem konnte im Tierversuch eine Speicherung nicht nachgewiesen werden.

Durch die lange Erhitzungszeit beim Abbau werden geringe Mengen antigen wirkender Stoffe, die evtl. im Ausgangsmaterial noch vorhanden sind, mit Sicherheit zerstört. Dementsprechend konnte in ausgedehnten Anaphylaxie-Versuchen das vollständige Fehlen antigener Eigenschaften erhärtet werden.

Beispiel 1 1 Liter einer 50/oigen wässrigen Lösung von I Kno- chengelatine, hergestellt aus 60 g einer Gelatine mit 15,12Io Feuchtigkeit und 1,68B/o Asche, wird auf einen pH-Wert von 6,9 eingestellt und in einem geschlossenen Gefäss im Dampfautoklaven 5 1/2 Stunden auf 1200 erhitzt. Nach dem Abkühlen auf etwa 90" nimmt man das Gefäss aus dem Autoklaven heraus und lässt auf Zimmertemperatur abkühlen. Die Lösung wird filtriert und mit 9 g reinem Kochsalz versetzt.

Nach Einstellen des pH auf einen Wert von etwa 7 lässt man unter starkem Rühren eine Lösung von 1,66 cm3 Hexamethylendiisocyanat in 25 cm3 Tetrahydrofuran zufliessen, wobei die Temperatur etwa 30O beträgt. Das pH der Lösung wird laufend verfolgt und durch Zugabe von verdünnter Natronlauge auf dem Wert von etwa 7 gehalten. Nach 3 Stunden ist die Reaktion beendet. Zur Entfernung des Tetrahydrofurans wird nunmehr die Lösung unter Zusatz von einigen Tropfen Octylalkohol zur Verhinderung des Schäumens im Vakuum auf etwa die Hälfte eingeengt; hierbei geht auch der zugesetzte Octylalkohol mit über. Man füllt die Lösung mit Wasser wieder auf 1 Liter auf und filtriert gegebenenfalls nochmals.

Die Lösung wird in Flaschen oder Ampullen abgefüllt und dann durch 20 Minuten langes Erhitzen auf 1200 sterilisiert. Der Zusatz von Kochsalz zur Einstellung der Isotonie kann auch schon am Anfang, vor dem Abbau der Gelatine, oder zuletzt, vor der Sterilisation, erfolgen. Anstelle von Tetrahydrofuran kann auch Aceton zur Lösung des Hexamethylendiisocyanats verwendet werden.

Beispiel 2
1 Liter einer 5 0/obigen Gelatinelösung wird wie im Beispiel 1 durch Erhitzen auf 1200 abgebaut. Dann setzt man eine Suspension von 1,66 cm3 Hexamethylendiisocyanat in 30 cm3 Wasser hinzu und lässt unter starkem Rühren bei 30O die Vernetzungsreaktion ablaufen, wobei das pH durch laufende Zugabe von verdünnter Natronlauge auf einem Wert von etwa 7 gehalten wird. Wenn das pH sich nicht mehr ändert, ist die Reaktion beendet. Die Lösung wird, falls notwendig, filtriert, mit 9 g reinem Kochsalz versetzt, in Ampullen oder Flaschen abgefüllt und durch 20 Minuten langes Erhitzen auf 1200 sterilisiert.

Beispiel 3
2 Liter einer 5 l'/0 igen wässrigen Lösung von Knochengelatine werden auf den pH-Wert 7 eingestellt.

Dann lässt man unter starkem Rühren 3,32 cm3 Hexamethylendiisocyanat, gelöst in 25 cm3 Tetrahydrofuran, bei 30O zufliessen. Bei der nun stattfindenden Vernetzungsreaktion steigt die Viskosität immer mehr an, bis die Lösung zu einer Gallerte erstarrt; dies ist nach etwa ¸ Stunde der Fall. Das Rühren wird unterbrochen, und man lässt die Lösung noch 15 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Anschliessend wird die Gallerte im geschlossenen Gefäss 5 t/2 Stunden auf 1200 erhitzt. Zu der nun wieder flüssigen Lösung setzt man 18 g Kochsalz hinzu und engt sie zur Entfernung des Tetrahydrofurans im Vakuum auf 213 des Ausgangsvolumens ein. Hierbei kann man zur Verhinderung des Schäumens Octylalkohol zusetzen, der bei der Destillation mit übergeht.

Man füllt die Lösung mit Wasser wieder auf das ursprüngliche Volumen auf, stellt gegebenenfalls den pH-Wert auf etwa 7 ein und füllt dann in Flaschen oder Ampullen ab.

Diese werden durch 20 Minuten langes Erhitzen auf 1200 sterilisiert.

In der gleichen Weise kann man die Vernetzung auch durchführen, wenn man als Lösungsmittel für das Diisocyanat Aceton anstelle von Tetrahydrofuran anwendet und sonst wie oben verfährt.

Beispiel 4
200 cm3 einer 5 /oigen Gelatinelösung vom pH Wert 7,15 werden bei 300 unter starkem Rühren mit 0,32 cm3 Hexamethylendiisocyanat, die in 10 cm3 Wasser suspendiert und durch Turbinieren emulgiert sind, versetzt. Die nach 20 Minuten Rührzeit entstan dene Gallerte lässt man dann ohne Rühren noch einige Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Dann wird durch 5 ¸stündiges Erhitzen im geschlossenen Gefäss auf 1200 abgebaut und die nun wieder flüssige Lösung mit 0,9 ovo Kochsalz versetzt.

Nach Filtrieren und gegebenenfalls Einstellen des pH-Wertes auf etwa 7 füllt man in Flaschen ab und sterilisiert durch 20 Minuten langes Erhitzen auf 1200.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Blutplasmaersatzmitteln, dadurch gekennzeichnet, dass man Kollagenabbauprodukte einem schonenden hydrolytischen Abbau bis zu einer Molekülgrösse von 2000-20000 unterwirft, das Hydrolysat mit einem mehrfunktionellen Isocyanat vernetzt, wobei die angewandte Isocyanatmenge geringer ist als diejenige, welche sich aus der Anzahl der im Hydrolysat vorhandenen Amino- und Guanidinogruppen errechnet, das so erhaltene Produkt auf einen pH-Wert von etwa 7 einstellt und die Lösung durch Salzzusatz isotonisch macht, oder indem man die Kollagenabbauprodukte zunächst mit einem mehrfunktionellen Isocyanat vernetzt, wobei die angewandte Menge Isocyanat 20 bis 80 /o derjenigen beträgt, die sich aus der Anzahl der vorhandenen Amino- und Guanidinogruppen errechnet,

hierauf das entstandene Vernetzungsprodukt einem schonenden hydrolytischen Abbau bis zu einer Molekülgrösse von 10000-100000 unterwirft, die so erhaltene Lösung auf einen pH-Wert von etwa 7 einstellt und durch Salzzusatz isotonisch macht.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man den Abbau der Kollagenabbauprodukte bis zu einer Molekülgrösse von 5000 bis 10000 durchführt.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man 20-80 /o der errechneten Isocyanatmenge verwendet.

3. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man den Abbau des Vernetzungsproduktes bis zu einer Molekülgrösse von 30000 bis 60000 durchführt.